醇脱氢酶（精选八篇）
醇脱氢酶 篇1
醇脱氢酶( Adh,EC. 1. 1. 1. 1) 属于氧化还原酶,能够可逆地将醇类氧化成醛或者酮［1］。醇脱氢酶的辅酶通常为NAD+或NADP,但是目前也发现依赖于PQQ的新型醇脱氢酶［2］。醇脱氢酶在自然界中广泛存在,古菌、细菌和真核生物中都有醇脱氢酶的报道［3］。醇脱氢酶参与一系列的细胞代谢过程,如类固醇、视黄色、脂肪酸、醇类和醛类等物质的代谢［4］。除此之外,醇脱氢酶还被发现具有多种细胞生理功能,如与人类的器官病变和疾病发生相关［5］; 与冬麦的木质素合成［6］、与葡萄藤叶对环境压力适应相关［7］等。根据醇脱氢酶序列、作用底物和辅酶的不同,可以将醇脱氢酶划分为6 个类型［8］。醇脱氢酶是重要的功能酶,已被广泛应用于工业、医药、食品等诸多行业［9 － 11］。
虽然目前对醇脱氢酶研究较多,但深海来源的醇脱氢酶却少有研究。作者从印度洋深海沉积物中分离并鉴定了一株假单胞菌( Pseudomonas sp.IOFA1)［12］。对该菌株研究发现其具有高效降解甲醛的能力。转录组分析结果发现,包括醇脱氢酶Adh在内的多种关键酶参与该菌株对甲醛的降解［13］。因此本文对IOFA1 菌株Adh酶活性质的研究,有助于了解IOFA1 菌株对甲醛的降解机制,同时也为Adh应用打下了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
Pseudomonas sp. IOFA1 菌株分离自印度洋深海沉积物,并保存在中国典藏培养物保藏中心( CCTCC,保存编号为M2010280) 。4 种宿主菌( E.coli BL21( DE3) 、BL21 Star( DE3) 、p Lys S和Rosetta)均为作者实验室保藏。
1. 1. 2 试剂
DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、X - gal、PCR试剂等为Ta KaRa产品; DNA凝胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒为北京百泰克公司产品; Ni2 +柱His - 蛋白纯化试剂盒为Thermo公司产品; 质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品; T - A克隆连接试剂盒为Ta KaRa公司产品。蛋白胨、酵母粉为Difico公司产品; IPTG、Tris、丙烯酰胺为Sigma公司产品,其他化学试剂均为国产分析纯试剂。
1. 1. 3 仪器
高温蒸汽灭菌锅,HVE - 50,日本Hirayama公司; PCR扩增仪,北京东胜公司; Mini Spin台式离心机,德国Eppendorf公司; Power Pac电泳仪,美国Bio- RAD公司; 超声细胞破碎仪,美国SONICS公司;常温恒温培养摇床,上海市离心机械研究所。
1. 1. 4 培养基
LB培养基: 每升液体LB培养基含有10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g氯化钠; 固体LB培养基另加1. 5% 琼脂。需要时添加终浓度为100 μg / ml氨苄青霉素。
1. 2 方法
1. 2. 1 adh基因的PCR扩增
根据Pseudomonas sp. IOFA1 基因组( Genbank No. LGRH00000000 ) 中adh的ORF序列设计一对PCR扩增引物: 正向引物为5 ’- GGAATTCATGAAAGCAATCGTGTACAACGG - 3 ’( 斜体部分为EcoR Ⅰ 酶切位点) ; 反向引物为5 ’ -CCCAAGCTTTCAGGCCGCAGGCTTGAGCAC- 3 ’( 斜体部分为Hind Ⅲ 酶切位点) 。以Pseudomonas sp. IOFA1 菌株基因组DNA为模板进行adh基因的扩增,50 μl的PCR体系如下: 10 × buffer 5 μl; Forward和Reverse引物各10 pmol / L; 10 mmol / L d NTP2 μl; Ex Taq DNA聚合酶0. 5 μl; 模板DNA 1 μl; 双蒸水定容至50 μl。PCR反应条件为: 94℃ 预变性3min,然后进入以下循环: 94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃90s,共进行30 个循环,最后72℃ 延伸10 min。
1. 2. 2 表达菌株E. coli - p ET43. 1a - adh的构建
adh基因扩增产物由PCR产物纯化试剂盒回收后利用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切反应并回收目的DNA片段,与同样经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的表达载体p ET43. 1a于16℃条件下连接12 h。
通过氯化钙法制备4 种宿主的感受态细胞( E.coli BL21 ( DE3 ) 、BL21 Star ( DE3 ) 、p Lys S和Rosetta) 。将上述连接产物通过化学转化法导入大肠杆菌细胞中,随后将重组菌体涂布于LB琼脂固体平板上( 含有100 μg /ml的氨苄青霉素) ,37℃ 培养12 h。抽提重组质粒并采用EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 进行双酶切鉴定,挑取阳性克隆进行测序验证。
1. 2. 3 重组Adh蛋白的诱导表达
挑取E. coli - p ET43. 1a - adh单菌落至5 ml LB ( 含有100 μg / ml的氨苄青霉素) 液体培养基中,37℃ 培养过夜。按1∶ 100 比例转接1 ml菌液至100ml液体LB ( 含有0. 2% 的葡萄糖,100 μg / ml的氨苄青霉素) 培养基中,180 r/min、37℃振荡培养2 ~ 3h至OD600= 0. 6,培养基中加入IPTG至终浓度为0. 2 mmol / L,于16℃ 继续振荡培养16 h后,12 000 g离心10 min收集菌体用于Adh蛋白的纯化。
1. 2. 4 重组Adh蛋白的纯化
采用镍离子亲和层析柱法纯化含6 × His标签的重组Adh蛋白,所有的纯化步骤都在4℃ 条件下进行,将上述收集得到的菌体,用20 mmol/L Tris/HCl( p H 8. 0 ) 重悬后,通过超声法裂解细胞并离心去除不溶物。取上清液与镍离子亲合层析柱孵育结合,在清洗多次后,用洗脱缓冲液( 250 mmol/L咪唑溶于PBS溶液中,p H 7. 4) 洗脱获得重组Adh蛋白。用SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS - PAGE) 检测洗脱重组蛋白。
1. 2. 5 Adh活力的测定
采用NAD+法测定Adh醇脱氢酶活性。辅酶NAD+存在两种形式,即氧化形态的NAD+和还原形态的NADH。醇脱氢酶作用过程中将H+脱下传递给NAD+,使其成为NADH。NADH在波长260 nm和340 nm处各有一吸收峰,而NAD+则只在波长260 nm处有吸收峰。根据这一特性,可以通过测定样品在波长340 nm处吸光值的变化来测定醇脱氢酶的活性。
反应体系为1 ml: 磷酸钾缓冲液( p H 7. 5) 50mmol / L,NAD+1. 62 mmol / L,酶液50 μl,混匀后37℃ 温浴1 min,最后加入20 μl乙醇,迅速轻摇混匀,反应5 min后记录样品在波长340 nm处的吸光值。醇脱氢酶的活性单位定义为: 一分钟催化产生1 nmol NADH所需的酶量定义为一个国际单位( U) 。
按照以下公式计算酶活:
其中A是样品在波长340 nm处的吸光值变化;B是反应中可溶蛋白的含量; C是反应时间,6. 22 ×10－ 3是每1 nmol NADH在340 nm波长处的吸光系数。
1. 2. 6 Adh的酶学性质分析
1. 2. 6. 1 最适温度
设置一系列酶反应温度: 0℃、10℃、20℃、25℃、30℃ 、37℃ 、42℃ 、52℃ 、60℃ 、70℃ ,测定不同反应温度下孵育30 min后的酶活力,以酶活最高值为100% ,计算其余的相对酶活,确定酶的最适反应温度,每组样品设置3 次重复。
1. 2. 6. 2 最适p H
配制一系列不同p H的缓冲液: 柠檬酸/柠檬酸钠( p H 3. 02、4. 01、5. 04、6. 05) 、Tris/HCl( p H 7. 03、8. 02) 、Na OH / Gly( p H 9. 01) 。分别用以上缓冲液配制反应体系,然后测定不同p H条件下孵育30 min后的酶活性。以酶活最高者为100% ,计算其余的相对酶活,确定酶的最适p H,每组样品设置3 个重复。
1. 2. 6. 3 热稳定性
酶液分别于不同温度( 30℃、40℃、50℃) 孵育20 min、40 min、60 min,待冷却后分别测定残余酶活力。以未孵育酶液的酶活为100% ,计算其余的相对残余酶活。每组样品设置3 次重复。
1. 2. 6. 4 金属离子对酶活力的影响
酶反应体系中分别添加终浓度为0. 5 mmol/L的Ni+、Li+、Co2 +、K+、Cu2 +、Mg2 +、Ca2 +、Mn2 +Zn2 +、Na+离子,孵育30 min后测定样品中Adh酶活。以无添加金属离子时的酶活为100% ,计算其余的相对酶活。除Cu SO4、Zn SO4外,其余金属离子均为氯盐形式。每组样品设置3 次重复。
2 结果与分析
2. 1 脱氢酶基因adh的序列分析
根据基因预测结果,从Pseudomonas sp. IOFA1基因组中发现一段全长为1 140 bp,编码醇脱氢酶的开放阅读框( ORF) ,命名该ORF为adh基因。adh基因编码一个由380 个氨基酸残基组成、预计分子质量为41. 8 k Da的蛋白。通过Blast N和Blast P比对分析发现,adh的基因和蛋白序列与Pseudomonas属其他菌株的醇脱氢酶/ 谷胱甘肽依赖醛脱氢酶具有较高的同源性( > 95% ) ,但与其他物种已发现的醇脱氢酶/谷胱甘肽依赖醛脱氢酶同源性较低( < 81%) ,最相近的其他物种同源蛋白为Erwinia billingiae strain Eb661 的醇脱氢酶蛋白[GI:299060424]［14］,其基因和蛋白序列同源性分别为72%与81% 。选取Blast P结果中与Adh氨基酸序列同源性较高的3 条序列,与Adh进行多重氨基酸序列比对,结果发现Adh氨基酸序列中存在着保守的MDR( medium - chain dehydrogenase/reductase) 超家族特征结构域并含有催化锌结合位点及结构性锌结合位点,这也进一步验证了Adh为醇脱氢酶蛋白( 图1) 。
根据醇脱氢酶序列、作用底物和辅酶的不同,可以将醇脱氢酶划分为6 个类型［8］。从NCBI数据库( National center for biotechnology information) 中选取分属于不同类型的醇脱氢酶序列,采用邻接法构建系统发育树。如图2 所示,在进化树上Adh与属于第3 类型的醇脱氢酶聚为一类,表明Adh为醇脱氢酶第3 类型蛋白。
注:用于比对的醇脱氢酶序列分别来自Pseudomonas sp.IOFA1、Pseudomonas putida KG-4(gi|816873226)、Pantoea stewartii subsp.indologenes(gi|687259268)和Acetobacter tropicalis(gi|754392708)。阴影部分代表不同序列之间的同源氨基酸。星号和方框分别标示醇脱氢酶的催化锌结合位点和第二个锌结合位点)。Note:The alcohol dehydrogenases used for multiple alignments are from Pseudomonas sp.IOFA1,Pseudomonas putida KG-4(gi|816873226),Pantoea stewartii subsp.indologenes(gi|687259268)and Acetobacter tropicalis(gi|754392708).The identical amino acids areshaded.The catalytic zinc and secondary zinc binding sites are indicated with asterisk and box,respectively.
注: 用邻接法对分属于不同类型的醇脱氢酶进行进化树分析。星号指示 Adh 的位置; 分支树上的数字代表 1 000 次计算中的 boot-strap值。Note:The tree was constructed by the neighbour-joining method.Asterisk indicates the position of Adh.Numbers indicating bootstrap valuesof 100 trials are shown.
2. 2 醇脱氢酶Adh的诱导表达及纯化
将adh基因克隆到原核表达载体p ET43. 1a中,并导入到4 种不同的感受态细胞E. coli BL21( DE3) 、BL21 Star ( DE3) 、p Lys S和Rosetta中进行Adh诱导表达的优化。 SDS - PAGE结果表明,在IPTG诱导后,4 种宿主样品中都出现一条对应于Nus - Adh - 6x His重组蛋白位置的蛋白条带( 图3,箭头所示约102 k Da) ,而在未诱导的重组菌株中未出现该条带,从而表明Adh在4 种宿主中都成功得到异源表达。其中Adh融合蛋白在Rosetta中表达量较高,且大部分存在于破碎上清中( 图3B) ,因此选取Rosetta中表达的Adh融合蛋白进行镍柱亲和纯化。SDS - PAGE结果表明,裂解上清液经Ni2 +亲合层析柱纯化后得到单一重组Adh条带( 图4) 。
注:A:M为蛋白marker;泳道1~4分别为:BL21-p ET43.1a-adh未诱导总蛋白、诱导后总蛋白、诱导后破碎上清、诱导后破碎沉淀;5~8分别为BL21 star-p ET43.1a-adh未诱导总蛋白、诱导后总蛋白、诱导后破碎上清、诱导后破碎沉淀。B:泳道M为蛋白marker;泳道1~4分别为:Rosetta-p ET43.1a-adh未诱导总蛋白、诱导后总蛋白、诱导后破碎上清、诱导后破碎沉淀;5~8分别为p Lys S-p ET43.1a-adh未诱导总蛋白、诱导后总蛋白、诱导后破碎上清、诱导后破碎沉淀。箭头指示重组Adh蛋白的位置)。Note:A:Lane M,protein marker;Lane 1-4:BL21-p ET43.1a-adh,not induced;induced(total protein);induced(Supernatant);induced(precipitate);Lane 5-8:BL21 star-p ET43.1a-adh,notinduced;induced(total protein);induced(Supernatant);induced(precipitate).B:Lane M,protein marker;Lane 1-4:Rosetta-p ET43.1a-adh,not induced;induced(total protein);induced(Supernatant);induced(precipitate);Lane 5-8:p Lys S-p ET43.1a-adh,not induced;induced(total protein);induced(Su-pernatant);induced(precipitate).The arrow indicates the positionof Adh band.
注: M 为蛋白 marker; 泳道 1 ～ 3 分别为三次洗脱的 Adh 融合蛋白,箭头指示重组Amy608蛋白的位置。Note:Lane M,protein marker;Lane 1-3:Three different elutions ofrecombinant Adh protein,The arrow indicates the position of Adhband.
2. 3 重组Adh蛋白的基本性质分析
2. 3. 1 Adh的最适作用温度
Adh最适反应温度为42℃ ,在37 ~ 52℃ 范围内能够保留80% 以上的酶活力,属于中温酶( 图5) 。此外,Adh在0 ~ 37℃ 范围内能保留50% 以上的酶活力,尤其是在低于10℃ 的低温环境下仍保有约55% 的酶活力,表现出良好的低温适应性,可能与其来源菌株对海洋低温环境条件的适应相关。
2. 3. 2 Adh的最适作用p H
Adh最适作用p H为5. 0,在p H 4 ~ 6 时具有较高的活性,表明Adh为酸性酶。此外,Adh在p H 6~ 9 范围内仍具有一定的酶活性( 20% 最高酶活力)( 图6) 。
2. 3. 3 Adh的热稳定性
Adh在30℃ 条件下具有较好的热稳定性,在30℃ 下孵育1 h后,仍保有约85% 以上的酶活( 图7) 。Adh在较高温度时( 40℃ 、50℃ ) ,热稳定性较差,孵育1 h即丧失大部分的酶活力。
2. 3. 4 金属离子对Adh酶活力的影响
Zn2 +、Na+在终浓度为0. 5 mmol/L时对Adh有明显的激活作用,尤其是Zn2 +可使Adh的酶活显著提高11% ( 表1) 。根据文献报道,第三类醇脱氢酶需要结合Zn2 +来行使他的催化活性［1］,因此我们的实验结果也支持这一结论。相反,Ni+、Li+、Co2 +、K+、Cu2 +、Mg2 +、Ca2 +、Mn2 +对Adh具有抑制作用,其中Mg2 +、Li+对Adh的抑制效果较明显。
3 讨论
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida IOFA1 是从印度洋深海沉积物中分离获得的具有高效降解甲醛能力的菌株。我们的实验发现,IOFA1 能够耐受高达10 mmol/L的甲醛［13］,其甲醛耐受性要明显优于其他报道的甲醛耐受菌株,如E. coli［15］、Bacillus［16］、Burkholderia［7］、Thermococcus［18］和其他Pseudomonas putida菌株［19］。对IOFA菌株的转录组分析结果显示IOFA1 的高甲醛耐受性可能与其甲醛降解关键酶的活性相关,如甲醛歧化酶、醇脱氢酶、甲醛脱氢酶等。
我们的研究结果发现重组Adh蛋白在大肠杆菌Rosetta菌株中的表达效果要优于其在其他3 种大肠杆菌宿主中的表达效果。Rosseta菌株是携带氯霉素抗性质粒的大肠杆菌衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子( AGG,AUA,AGA,CUA,CCC,GGA) 对应的tRNA,能够提高外源基因的表达。而我们对adh的序列分析发现,adh的基因序列含有多种稀有密码子( AUA、AGA、CUA、CCC、GGA) ,因此Rosseta菌株能够有效地表达重组Adh蛋白。
虽然目前对醇脱氢酶的研究较多,但目前国内外尚未有深海来源的醇脱氢酶的相关报道。酶学性质分析结果发现,IOFA1 的Adh蛋白最适温度为42℃ ,与其他微生物来源的醇脱氢酶如Acetobacter pasteurianus ( 45℃ )［20］、Gluconobacwr oxydans DSM2003 ( 30℃ )［21］、Acetobacter sp. CCTCC M209061［22］类似都属于中低温酶,但不同的是IOFA1 的Adh在低温环境尤其是在0℃ 下仍具有较高的酶活力,表现出较好的低温适应性。Adh的最适p H为5. 0,在酸性环境中具有较高的活性,这与Acetobacter pasteurianus ( p H 4. 0 )［20］、Gluconobacwr oxydans DSM2003 ( p H 5. 5 )［21］、Haloarcula marismortui ( p H3. 0)［23］类似都属于酸性酶。本研究成功克隆表达了深海假单胞菌的醇脱氢酶基因,重组的Adh蛋白在中低温和酸性环境中具有较高的活性,这些特殊的性质有利于Adh在中低温环境中的广泛应用。
摘要：[目的]对来自印度洋深海的一株假单胞菌醇脱氢酶(Adh)进行序列分析和酶活性质分析。[方法]首先以同源比对和进化树聚类为手段分析该酶序列信息。其次,在E.coli宿主中进行重组表达和镍柱亲和纯化后,对重组醇脱氢酶的酶活性质进行进一步地研究。[结果]结果显示Adh蛋白与其它物种已知醇脱氢酶的氨基酸序列最高相似性为81%,分属于第三类醇脱氢酶蛋白。酶学性质分析表明,重组酶Adh的最适作用温度为42℃,表现出良好的中低温适应性;最适p H值为5.0,在p H 4~6时具有较高的活性,表明Adh为酸性醇脱氢酶。Zn~(2+)、Na+在终浓度为0.5 mmol/L时对Adh有明显的激活作用,尤其是Zn2+可使Adh的酶活显著提高11%。[结论]实现了adh基因在大肠杆菌的高效表达,为Adh的应用提供了理论依据。
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量 篇2
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
12级临本二班 吕梦月 许力飞
王雅琦 王明华 马翔 张宇 王帅
实验目的：乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量 实验原理：
分离：加蛋白质抑制剂：竞争性或非竞争性抑制蛋白酶活性；防止蛋白酶分解；除核酸：利用核酸和蛋白质在链霉素磷酸酶中溶解度不同除去核酸；去盐 ：超滤液筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过度介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤液膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。等电点测定法的原理：在等电点时蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子静电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互作用之间的作用减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
提纯：醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
鉴定：乙醇脱氢酶可将乙醇分解生成乙醛
定量：SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：1.在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS(阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。3.蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验试剂与器材：
器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐 缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
实验步骤：
分离：1.细胞破碎：将10g肝组织用剪刀剪碎，放入研钵中,加入0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液4ml研磨成糊状，再加2ml0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液,搅匀，然后将所得的物质过滤，取滤液。2.添加蛋白质抑制剂：在盛有研磨液的试管中加入5ml磷酰胺素，震荡40度水浴中保温30min。3.除核酸：逐滴加入1%~2%的链霉素硫酸盐，直至沉淀不再产生。进行过滤除去沉淀。4.盐析：逐滴加入硫酸铵溶液直至蛋白质不再沉淀。进行过滤取其沉淀部分，并加入适量磷酸盐缓冲液直至蛋白形成6ml糊状物。5.去盐：将上述溶液放入超滤装置中，使蛋白质和小分子物质分离开，将大分子物质分离开并加入一定量磷酸盐缓冲液直至糊状物形成6ml。6.等电点沉淀法：在上述溶液中加入一定量0.02mol/L盐酸边加入边搅拌，一边用PH剂测量使其PH值调至5.4，然后倒置离心机中6000r/min离心15分钟，倒掉上清液，再在此溶液中加入6ml去离子水，震荡使下部的沉淀重新溶解，并以0.1mol/mL的氢氧化钠将其PH值调至8.6.重复进行两次。
提纯：醋酸纤维膜电泳：1电泳槽与薄膜的制备（1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择：用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s—30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。（2）电泳槽的准备：根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。
2、点样用钝头镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液，无光泽面向上平放在点样板上，点样时用点样器沾少许经分离的肝脏研磨液，再将点样器轻轻印在点样区内，样品线长度一般为1.5cm，宽度一般不超过3mm.使经分离的肝脏研磨液完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线，用同样的方法对标准乙醇脱氢酶溶液进行点样。
3、电泳 用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。如图1-2-9所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。通电10min—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50min—60min。电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。
4、染色与漂洗用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5％氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。凝胶层析法：1.凝胶准备 称取5g交联葡聚糖G-25,倾入锥形瓶中,加蒸馏水约60ml溶胀,搅动后静置.待凝胶沉积后,用倾注法除去浮于表面的细粒,重复3次.将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜,以达平衡.2.装柱 取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支,垂直装好.加入缓冲液,打开出口,将气泡赶出,关闭出口.然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高,将 2
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内,再打开出口,使液体流出,继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液,柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止.床面上覆盖3ml缓冲液,关闭出口,在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸,使层析柱稳定5～10min后,接储液瓶,打开出口,用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡,最后关闭出口.3..上样,洗脱 打开平衡好的层析柱出口,使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口.吸混合物样品0.5ml左右,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品,切勿搅动床面.然后打开出口,使样品进入床内,直至床面重新露出.同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小,而样品又完全进入床内),当少量洗脱液将流入床面时,加入多量的洗脱液,但注意切勿搅动床面凝胶,连接储液瓶进行洗脱.4.分部收集 根据电泳方法进行的结果可得乙醇脱氢酶为第N条带，用自动部分收集器,以5滴/min,5min/管的速度进行收集.并且观察柱上的色带,待第N柱液体流下时,再继续收集两管透明的洗脱液作为空白,关闭出口.即可收集到提纯后的乙醇脱氢酶。再进行醋酸纤维膜电泳进行一遍看看是否纯净，若不纯净则重复进行凝胶交换柱层析法进行提纯。
鉴定：将提纯后的乙醇脱氢酶中放入一定量酒精，并加入氧化亚铜并加热，观察是否有砖红色沉淀。
定量：1.安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意事项：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
2.配胶：根据待测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶和浓缩胶浓度，按下表配制：
3.制备凝胶板： ①分离胶制备： 按表配制12%分离胶。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液。混匀后用注射器抽取3.2~3.5ml凝胶液，加至长、短玻璃板间的缝隙内(立即清洗注射器及针头)。再用滴管取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入约3~4mm高，以进行水封。30~60min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。②浓缩胶的制备：按表配制3%浓缩胶(待分离胶聚合后再加AP/TEMED)，混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合。
待凝胶凝固后，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将Tris-Gly电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。4.样品处理及加样 蛋白质标样及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/ml，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用(处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合)。一般加样体积为10~15l。如样品较稀可适量增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部(双手操作，避免伤及凝胶)，待所有样品槽内都加完样品后即可开始电泳。5.电泳将直流稳压电泳仪开关打开，将电流调至10~20mA(稳流)开始电泳。待蓝色染料(溴
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
酚蓝)迁移至距凝胶底部约1cm时关闭电源。6.染色及脱色取出玻璃板，先用注射器取水从两侧小心冲洗使之松动，再用取胶板轻轻将短玻璃板撬开移去(必要时同时用水冲洗)，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。7.相对分子量计算用直尺分别量取各蛋白质条带中心以及溴酚蓝条带中心距分离胶顶端的距离，按下式计算：相对迁移率 = 样品迁移距离(cm)/ 染料迁移距离(cm)以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
实验结果：
由此次实验可推理的，将乙醇脱氢酶提纯纯净，则可得其可乙醇进行脱氢生成醛，且可得此物质的相对分子质量为141000.实验讨论：
1.并非所有蛋白质都能用此法测定其分子量。已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的，包括电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1本身带有大量正电荷，尽管结合有正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响：其分子量是21,000，但用本法测定的结果却是35,000。因此有必要至少用两种方法来测定未知样品的分子量，以便互相验证。2.有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，本法测定的只是其亚基或单条肽链的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，以便与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。3.此次实验为推理实验，则不知是否纯正，所以要进行检测，而检测的方法是醋酸纤维蛋白膜进行检测即可知道含有几种蛋白质，用标准液进行对比就可知道乙醇脱氢酶的排列顺序是什么，则就知道在凝胶交换柱层析法的分离顺序，如若分离不彻底即要反复进行。就可分离出较纯正的乙醇脱氢酶。然后进行检测其活性和相对分子质量。
注意事项：
1进行研磨操作时，研钵应放在不易滑动的物体上，研杵应保持垂直。研钵中盛放固体的量不得超过其容积的1／3。洗涤研钵时，应先用水冲洗，耐酸腐蚀的研钵可用稀盐酸洗涤。研钵上附着难洗涤的物质时，可向其中放入少量食盐，研磨后再进行洗涤。2.加入链霉素磷酸盐时要适量，不要大量一次加入。3.装柱后要检查柱床是否均匀,若有气泡或分层的界面时,需要重新装柱.4.流速不可太快,否则分子小的物质来不及扩散,随分子大的物质一起被洗脱下来,达不到分离目的.附：本次实验思路
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
原料选取：饥饿24小时后的肝脏
↓
分离：细胞破碎（捣碎）→添加蛋白质抑制剂（丝氨酸蛋白质抑制剂）→除核酸（沉淀法
1％-2％的链霉素硫酸盐）→盐析（硫酸铵）→去盐（超滤）→等电点沉淀法（PI=5.4-5.8）↓
提纯：检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净看乙醇脱氢酶的带的顺序、凝胶交换柱层析法提纯、检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净再进行提纯
↓
鉴定：加入乙醇分解鉴定
↓
定量：SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
实验清单
实验试剂与器材：器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐 缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
乳酸脱氢酶同工酶检测初探 篇3
关键词：乳酸脱氢酶同工酶,临床意义,检测,初探
1 LDH同工酶特点
乳酸脱氢酶 (LDH) 是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶, 在人血清中有5种同工酶, 均由4个35KD的亚基组成, LDH的亚基可以分为两型:骨骼肌型 (M型) 和心肌型 (H型) 。M、H亚基的氨基酸组成有差别, 其免疫抗体无交叉反应。两种亚基以不同比例组成五种四聚体即为一组LDH同工酶, 根据电泳时不同的泳动速度, 把速度最快的定名为LDH1 (H4) , 其余相应定名为LDH2 (H3M) 、LDH3 (H2M2) 、LDH4 (HM3) 及LDH5 (M4) 。LDH同功酶的分布有明显的组织特异性, 所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。正常人血清中LDH2>LDH1。如有心肌酶释放入血则LDH1>LDH2, 利用此指标可以观察诊断心肌疾病。
2 LDH同工酶检测的临床意义
LDH虽几乎存在于所有组织中, 但不同组织中同工酶组成不同。心脏以LDH1为主, 而横纹肌以及肝脏、血小板以LDH5为主;肺、脾以LDH3为主, 脑、肠、淋巴与内分泌腺也含有LDH3。成年健康人LDH2>LDH1>LDH3>LDH4>LDH5或LDH2>LDH3>LDH1>LDH4>LDH5。因此可根据乳酸脱氢酶同工酶分布的组织特异性的特点, 辅助进行病理来源的判断。
2.1 在急性心肌梗塞、心肌损伤、心肌病病人LDH检测中, 早期血清
中LDH1和LDH2活性均升高, 但LDH1增高更早、更明显, 导致LDH1/LDH2的比值升高。患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病LDH1也可升高。
2.2 肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时LDH5都会升高。
2.3 患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病LDH1也可升高。
2.4 恶性病变时LDH3常增高。
2.5 在急性心肌梗塞 (AMI) 检测及心脏诊疗中应用
LDH升高而且LDH1明显升高, 见于心肌损伤、急性心肌梗塞、心肌病。有测定表明:LDH1百分比在心肌梗塞型冠心病组与心肌炎组、不稳定型心绞痛型冠心病组和非心脏病对照组间具有显著性差别, 而它在心肌炎组、不稳定型心绞痛型冠心病组和非心脏病对照组间则无显著性差别。因此, 对临床上有心肌损伤的心脏病, LDH1可作为检测疗效、判断预后的生化指标[1]。当心肌损伤时, 主要是释放LDH1, 其次是LDH2, 因此LDH1/LDH2比值对AMI诊断的敏感性为47.7% (21/44) , 特异性为97.1% (34/35) 。从实验结果的统计分析和8例心脏手术病人LDH1动态检验结果也表明, 对临床上有心肌损伤的心脏病LDH1可作为检测疗效、判断预后的生化指标[2]。另有人对肾病综合征出血热患者的心肌损伤情况进行测定, 对正常组与对照组进行了AST、CK、CK-MB、LDH1的测定, 结果:对照组明显高于正常对照组, 因此患者心肌酶升高, 提示心肌损伤与预后密切相关[3]。
此外, 作为心肌酶谱中常用指标的α-羟丁酸脱氢酶实际上是利用α-酮丁酸取代丙酮酸作为底物时所测的LDH活性。由于LDH的H亚基对此底物亲和力大, 故HBDH基本反映LDH1和LDH2的活性, 其检测的灵敏度和专一性略高于LDH, 但总活性不及LDH1同工酶。
2.6 在其他疾病诊疗中的应用
乳酸脱氢酶的同工酶在其他诊疗中的应用主要是根据整个同工酶谱的测值进行判断。例如某些恶性肿瘤以LDH3升高为主, 同时LDH1、LDH2下降 (LDH3>LDH1) , 也可常见LDH5升高;阻塞性黄疸常有LDH4>LDH5;病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌可见LDH5明显升高且LDH5>LDH4;肌肉损伤与肌萎缩常可见LDH5升高, 特别是肌萎缩可达到正常上限的10倍。
3 乳酸脱氢酶同工酶的检测方法与比较
目前用于同工酶检测的方法主要有化学抑制法、免疫抑制法、热变性法、电泳法、亲和层析法。用于乳酸脱氢酶同工酶检测的方法主要有化学连续监测速率法, 可用的抑制物包括羟基化合物、高氯酸盐和硫氰酸胍, 还有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法等等。
几种方法相比较均各有优缺点:电泳法优点是准确可靠, 能够了解整个LDH同工酶谱的情况, 因而信息全面, 缺点是灵敏度差, 而且操作时间长, 对于心梗这种急性发作的疾病, 不能及时报告是一种致命缺陷。离子交换层析法的结果也十分准确, 但操作时间同样很长。而用化学检测速率法和免疫法则可以弥补这一缺陷, 可以快速的实现检测, 而且标本用量少。但同前两种方法相比, 特异性较差。有数据是化学法显然成本更低, 因而目前应用较广泛。
4 小结
乳酸脱氢酶同工酶1用于AMI的诊断其特异性要远远高于总LDH和羟丁酸脱氢酶, 同时因CK-MB生物半寿期较短, 对于一些临床症状不明显的病人, 可能错过捕获期, 而LDH1在血液中持续时间长且本身就能反映心肌的损伤, 因此与CK-MB配合更能提高诊断效率。综上所述, 选择合适的方法配合合适的指标检测LDH同工酶的活性, 有助于多种疾病特别是AMI的诊断与预后。
参考文献
[1]杨国锋, 陈晓舟, 江木林.乳酸脱氢酶同工酶分析在心脏病诊疗中的探讨[J].宁夏医学杂志, 2001, 23 (8) :453-455.
[2]程文伟, 孟庆义, 杭荣华.乳酸脱氢酶同工酶LDH1/LDH2比值在急性心肌梗塞诊断中的意义[J].中国危重病急救医学, 2001, 13 (10) :601-603.
醇脱氢酶 篇4
乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase,LDH) 是一种糖酵解酶,是体内能量代谢过程中一个重要的酶类, 它以氧化型辅酶 Ⅰ ( nicotinamide adenine dinue- leofide,NAD + ) 为辅酶,是最早发现的同工酶。 自1959年Markert首次发现LDH具有多种分子形式的同工酶以后,人们对该酶的研究不断深入。精子中LDH主要集中于中后部的线粒体鞘上,通过呼吸作用给精子提供能量［4］。因此,LDH与精子运动及存活的供能过程有密切关系。
目前,有关LDH的研究主要集中在家蚕、鱼类以及人类中,而在家畜尤其是绵羊精子中关于LDH活性的研究还鲜有报道。试验采用酶动力学分光光度法通过检测超低温冷冻保存前后小尾寒羊精子内LDH活性的变化探讨冷冻保存对精子LDH活性的影响及与精子活率的关系,以期为提高绵羊精子冷冻保存效果和正确评估精子质量提供理论参考。
1材料
1. 1主要试剂
甘油、D - ( + ) - 葡萄糖、蔗糖、青霉素、链霉素,美国Sigma公司生产; 柠檬酸钠、氯化钠、纯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、0. 2% Triton X - 100、Grace’s medium,均为国产分析纯。
1. 2主要仪器
高速离心机( 型号为ZONKIA) ,浙江中佳公司生产; 紫外可见分光光度计( 型号为HC - 2518、TU - 1810 PC / SPC) ,普析通用公司生产; 显微镜( 型号为CKX31) ,OLYMPUS公司生产。
2方法
2. 1稀释液的配制
基础液的成分和剂量,见表1。煮沸消毒后置于4 ℃ 冰箱保存。使用前取基础液80 m L,加20 m L新鲜卵黄,青霉素、链霉素各10万单位配制成保存稀释液; 再取上清液94 m L加甘油6 m L,配制成冷冻稀释液。
取Na H2PO40. 062 3 g,Na2HPO40. 414 g,用少量的超纯水溶解后定容至20 m L,用酸度计测量,配制成p H值约为7. 4,浓度为0. 1 mol/L的磷酸盐缓冲液。
取丙酮酸钠0. 029 7 g,加入15 m L超纯水,配制成18 mmol/L丙酮酸钠。
取还原型辅酶Ⅰ( NADH) 0. 057 5 g,加入15 m L超纯水,配制成5. 4 mmol/L NADH溶液。0. 1 mol/L磷酸盐缓冲液配制,临用前现配,置于棕色瓶中4 ℃ 保存。
2. 2精液的采集与常规品质的评定
选取膘情中等、体质健康、性欲旺盛的同一只小尾寒羊种公羊,采用常规采精方法采集精液。采出精液后立即在37 ℃ 条件下进行常规品质评定,要求原精液密度达到密级,活率在0. 8以上,无异常气味,色泽乳白用于试验。
2. 3精液的冷冻保存与解冻
2. 3. 1精液的稀释与平衡精液经常规检查后,将符合要求的新鲜精液根据活率和密度按3 ~ 6的比例,在35 ℃条件下用冷冻稀释液进行等温稀释,混匀后在室温条件下用0. 25 m L的塑料细管进行分装并封口。裹8 ~ 10层纱布置于4 ℃冰箱中平衡2 ~ 3 h。
2. 3. 2精液的冷冻与保存将平衡好的精液细管置于自制冷冻漂浮器上( 距离液氮表面2. 0 ~ 2. 5 cm, 温度在 - 80 ~ - 110 ℃ 之间) 熏蒸10 min,投入液氮中保存。
2. 3. 3精液解冻从液氮罐中取出精液细管,迅速浸入39 ~ 40 ℃ 水浴中,轻轻摇动直至融化10 ~ 15 s。
2. 4精子活率的评定
将稀释精液摇匀后,取中层精液10 μL,滴于37 ℃ 恒温板上等温预热的载玻片上,盖片后置于配有37 ℃ 恒温台的显微镜下放大400倍检查精子1 000个以上,分别计算呈直线运动的精子数和精子总数,计算精子活率。
2. 5 LDH活性的测定
2. 5. 1 LDH提取精液总LDH粗提液: 取稀释的精液120 μL置于离心管中,加入0. 2% Triton X - 100 360 μL抽提20 min,然后在4 000 r / min条件下离心30 min,保留上清液,待测。
精清中LDH粗提液: 取稀释的精液120 μL置于离心管中,加入360 μL自制稀释液在2 000 r/min条件下离心20 min,保留上清液,待测。
精子中LDH粗提液: 上一步所 得沉淀加 入0. 2% Triton X - 100 360 μL抽提20 min,然后在4 000 r / min条件下离心30 min,保留上清液,待测。
2. 5. 2 LDH活力的测定采用酶动力学分光光度法测定LDH活性。反应体系: 0. 1 mol/L磷酸盐缓冲液( p H值为7. 4) 2. 78 m L,18 mmol/L丙酮酸钠0. 1 m L,5. 4 mmol / L NADH 0. 1 m L。 该混合液在25 ℃ 水浴保温后转至比色皿中,在25 ℃ 条件下测定光密度值。测定时加入20 μL精子或精浆样品,迅速颠倒数次混匀,以缓冲液为空白对照记录340 nm处的光密度改变。每隔0. 5 min或1 min记录1次,共计6次,计算每分钟光密度改变,即△OD340 / min( 见表2) 。
m L
2. 6计算
计算公式推导如下: NADH在340 nm波长处的物质的量的消光系数为6. 22 × 1 000( 1 cm光径) , OD340 / min/ ( 6. 22 × 1 000) 即为反应液物质的量的每分钟变化速率,该值乘以l 000 000为微物质的量的浓度变化速度,再乘以反应体积0. 003 L则为底物( 或产物) 的1 μmol变化率。采用毫国际单位,酶活力计算公式为: 酶活力( m U/m L) = △OD340 / min/6. 22 × 3 000 × 样品稀释倍数。
2. 7数据的统计分析
试验数据相关性分析采用SPSS 10. 0统计软件包,差异显著性分析采用Excel软件中数据分析工具库进行描述统计、t检验和方差分析。试验重复5次以上。
3结果与分析
采用酶动力学分光光度法对精液、精子及精浆中LDH活性进行检测,结果表明,冷冻保存后绵羊精液总LDH活性[( 18. 40 ± 7. 85) U/m L]和精子LDH活性[( 5. 91 ± 2. 16 ) U/m L]与冷冻前[( 24. 89 ± 8. 21) U / m L、( 10. 80 ± 4. 95) U / m L]相比极显著降低( P < 0. 01) ,而精浆中LDH活性则极显著升高( P < 0. 01) ,表明冷冻保存对绵羊精液LDH活性造成严重影响。冷冻前后精子活率与LDH活性均呈极显著正相关( P <0. 01) ,表明LDH活性的高低与精子活率密切相关,可以作为绵羊精液品质评价的新指标。因此, 对冻融精子LDH活性的检测具有重要意义,见表3。
4讨论
LDH存在于哺乳动物发育成熟的睾丸和精子细胞中,与精子的生成代谢、获能和受精有密切关系,是精子能量代谢的一个关键酶。瞿桂玉等［5］研究表明,LDH可以作为衡量猪精液品质的一个指标,并且能够反映经稀释液处理体外保存后精子的活力情况。 而LDH活性高低的变化与1次输精受胎率的变化趋势相一致,也就是说LDH可以反映公猪的繁殖力情况。邓顺美等［6］测定不育症精子LDH研究表明,测定精子LDH活性比单纯测定精浆LDH的活性更能反映精液的质量。说明酶活力的大小确切反映了精子的完整性和能育性,通过这些酶活力的测定就能准确地评定精液的质量。
注: 同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著( P < 0. 01) ; 同列数据肩标**表示差异极显著( P < 0. 01) 。
试验通过酶动力学分光光度法建立了绵羊精液LDH检测方法,该方法采用紫外分光光度计,利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用,对物质进行定量、定性及结构的分析,所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。测定LDH活力,在基质液含丙酮酸钠及NADH中添加一定量的LDH提取液,观察NADH在反应过程中340 nm处光吸收值的减少,减少越多则LDH活力越高。
试验结果表明,冷冻后精浆LDH活性与冷冻前相比有极显著升高( P < 0. 01) ,而精子所含的LDH活性在冷冻后极显著降低( P < 0. 01) 。说明冷冻保存对精子的结构与功能造成了损伤,这可能是由于: 1) 精子在冷冻、解冻过程中因冰晶的形成与消失对精子造成机械性损伤,精子膜中的类脂蛋白从细胞的结构中分离开来,使细胞膜原有的空间构象发生改变,此时位于精细胞上的酶释放到精浆中,因此精子中的酶活性下降、精浆中的酶活性上升,导致精子受精能力下降［7］。2) 精液经过冷冻保存后精子线粒体受到损害,尾部中段产生空穴,使得轴丝和线粒体鞘突变,导致线粒体上酶被破坏,精子LDH活性降低［8］。此外,精液总LDH活性与冷冻前相比极显著降低( P < 0. 01) ,表明冷冻保存过程对LDH活性造成严重损伤。
试验结果还表明,冷冻前后精子活率与LDH的活性均有较好的线性关系,且两者均为极显著正相关( P < 0. 01) ,即LDH活性越高,精子活率越高。表明LDH活性与精子活率密切相关,可以作为绵羊精液质量评估的可靠指标。这与林金杏等［9］和瞿桂玉等［10］的研究结果相一致。试验采用的酶动力学分光光度法具有快速、易操作、周期短、干扰少等优点,值得推广。
参考文献
[1]徐振军,闫长亮,郭成,等.小尾寒羊精液冷冻保存技术的研究[J].中国畜牧杂志,2006,42(21):9-11.
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醇脱氢酶 篇5
1 对象与方法
1.1 对象
选择肺癌患者42例 (肺癌组) , 其中鳞状细胞癌21例, 腺癌15例, 小细胞肺癌6例。42例中男26例, 女16例, 年龄32~74岁, 平均53岁。42例均经肺CT、纤维支气管镜检查和病理切片证实为肺癌, 并且未进行治疗 (指手术切除、放疗、化疗等) 。肺癌按照TNM分期Ⅱ期18例、Ⅲ期12例、Ⅳ期12例。患者无心脏病史, 心电图及超声心动图检查均未发现异常, 对照组为40例健康志愿者, 其中男25例, 女15例, 年龄23~63岁, 平均41岁。
1.2 方法
清晨抽取空腹静脉血检测LDH, LDH使用 (意大利BIOTECNICA公司产BT 224型) 半自动生化分析仪, 用北京中生公司的成套试剂, 采用连续监测法测定, 以>240 U/L为增高。肺癌的诊断靠纤支镜活检后病理 (有明确分型) 确定, 均符合WHO的诊断标准。统计学处理采用 (SPSS10.0软件, χ2检验, 以P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 肺癌患者LDH值与正常对照组的比较
试验结果表明, 肺癌组血清LDH为345.38±8.56μ/L, 对照组为204.32±3.78μ/L。两组比较差异有显著意义, P<0.05。
2.2 LDH水平与肺癌组织学分型的关系
试验结果表明, 肺癌不同组织学分型之间比较, LDH值差异无显著意义, P>0.05 (表1) 。
2.3 LDH水平与肺癌临床分期的关系
试验结果表明, LDH水平与肺癌的病期有关, Ⅲ、IV期肺癌LDH值与Ⅱ期患者比较明显升高, P<0.05 (表2) 。
3 讨论
乳酸脱氢酶是糖酵解过程中的重要酶类, 主要分布在人体肺、肾、心、肝等组织器官内。当这些组织病变时, 细胞损伤释放出LDH, 使血清测定值增加。用血清LDH测定值判断时, 首先要排除心梗、急慢性肝功能损害、外部损伤等情况。运动及锻炼也会影响血清LDH测定, 检查前应充分体息, 避免过多运动。肺部肿瘤的增大会影响肺功能, 理论上存在肿瘤的增长使机体组织缺氧加重, 造成血清LDH升高, 但这一点与肿瘤增长自身代谢产生的LDH升高不违背, 因此, 我们认为血清LDH用于比较肺癌分期并不矛盾。肺部炎症、胸水、气胸、肺气肿等会影响肺功能, 肺结核、真菌等感染可直接造成肺组织细胞的坏死, 以及结节病等形成的肉芽肿病变也会使血清LDH升高。本组实验研究选择的肺癌组病人均无肝脏、心脏疾病, 也无急性炎症表现。而且采用损伤很小的纤维支气管镜明确病理, 这样就排除了其它非肿瘤因素的影响, 更加准确。研究发现[2]肿瘤组织的糖酵解高于正常组织, 因而参与糖酵解的重要酶类乳酸脱氢酶也增高, 最高可达正常值的6倍。肿瘤细胞坏死、代谢加速、细胞膜通透性改变等原因, 致使癌组织的酶释放至血液, 因此, 血清中LDH活性增高。肺癌组连续监测LDH值明显高于对照组, 有显著性差异, 与报道相符。但王小卫等[3]报告的160例肺癌患者中, 只有23.8%的病例LDH高于正常值, 因此, 并非癌症患者的血清LDH一定高于正常范围, 而连续监测LDH变化则显示出血清LDH常随着肿瘤进展逐渐升高。本研究中II期与III、IV期之间血清LDH值差异有显著性 (P<0.05) , 说明早期肺癌与中晚期肺癌之间糖酵解方面有很大差别, 还发现随着肺癌程度的加重, 即原发肿块增大、淋巴结转移、远处转移及恶性胸膜腔积液的产生, 血清LDH呈逐渐升高趋势。肺癌患者不同病理学分型, 鳞癌、腺癌和小细胞癌二组之间相比较, 尽管肿瘤的恶性程度有差别, 但LDH值差异无显著意义, P>0.05, 表明肺癌血清中LDH水平与肺癌的病理分型无关。
关键词：原发性肺癌,乳酸脱氢酶,生化检查
参考文献
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醇脱氢酶 篇6
采用抑制差减杂交技术(suppression subtraction hybridization,SSH)分析重组酵母菌在分泌表达麻黄碱时相对于原始菌株高表达基因时,分离得到一段424 bp的乙醇脱氢酶基因(alcohol dehydrogenase,Adh)片段。已有研究表明麻黄碱和伪麻黄碱在麻黄属植物(Ephedra)中合成的前体物质为L-苯丙氨酸[3],通过功能分析,表明Adh在酵母中参与酪氨酸的代谢途径,而酪氨酸和L-苯丙氨酸有着共同的合成前体物质,并且酪氨酸代谢途径和L-苯丙氨酸代谢途径也密切相关[4]。
乙醇脱氢酶广泛存在于原核和真核生物中,在一些生物的次生代谢产物合成中起到作用[5,6]。乙醇脱氢酶基因主要以基因家族的形式存在于真核生物中,其表达水平和酶活性受外界环境因子影响较大[7,8],这表明在代谢过程中乙醇脱氢酶的调控是一个非常复杂的系统[9]。而从产麻黄碱重组酵母菌中分离得到的乙醇脱氢酶基因片段,参与酵母具体的代谢过程以及是否在麻黄碱生物合成过程中起到调控作用,都需要进一步验证。本文首次从重组酵母中克隆到一个乙醇脱氢酶基因的cDNA,并通过对其序列进行生物信息学分析,对研究重组酵母菌中麻黄碱生物合成代谢调控机制具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
产麻黄碱转基因重组酵母菌Ar_Han0458和大肠杆菌感受态E.coli DH5α,由新疆大学离子束生物技术中心保存。克隆载体pGEM-T购自Promega公司。
1.1.2 试剂
RNAiso Reagent,3′-Full RACE Core Set Ver 2.0和5′-Full RACE Kit购自大连宝公司,凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司,引物合成及DNA序列测定委托上海英骏生物技术公司完成,其它化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 基因特异性引物的设计
通过对前期利用SSH技术获得424 bp Adh基因片段的核苷酸序列设计3’和5’RACE (rapid-amplification of cDNA ends)嵌套式引物F1、F2和R1、R2各一对。
F1:5′-CATCGTTCCAATCTTATGTGCTGA-3′ ;
F2:5′-GTTTCTGTTGCTGAAGCTGCTATT-3′ ;
R1:5′-GGTAGCGTTTTGGATAGCTTCAAC-3′;
R2:5′-ACCTGGTTTCAAATCAGCGG-3′。
1.2.2 重组酵母菌总RNA的提取
将液氮中保存重组酵母菌体倒入研钵中,加液氮多次研磨至细粉状,分装于1.5mL离心管中,加入1mL RNAiso Reagent,并按照Takara RNAiso Reagent RNA提取试剂盒的操作说明书提取酵母菌总RNA。利用754分光光度计测定计算RNA浓度,1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测质量。
1.2.3 3′ 和5′ RACE扩增Adh 3′ 和5′ 端序列及测序
按照Takara 3′-Full RACE Core Set Ver 2.0试剂盒说明书对Adh基因3′ 末端进行扩增。用试剂盒中3′ RACE Adaptor对酵母总RNA进行反转录。反转录结束后,以F1和3′ RACE Outer Primer为引物,对反转录产物进行Outer PCR反应。将第一轮Outer PCR产物稀释50倍作模板,以F2和3′ RACE Inner Primer为引物,进行Inner PCR反应。
按照Takara 5′-Full RACE Kit试剂盒说明书对Adh基因5′ 末端进行扩增。分别采用Alkaline Phosphatase(CIAP) 、Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP )对总RNA进行去磷酸化和“去5′ 帽子”结构处理。处理后的RNA与5′ RACE Adaptor进行连接,并用9碱基的随机引物进行反转录。以R1和5′ RACE Outer Primer为引物,对反转录产物进行Outer PCR反应。将第一轮Outer PCR产物稀释50倍作模板,以R2和5′ RACE Inner Primer为引物,进行Inner PCR反应。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
分别将3′ 和5′ RACE扩增目的条带回收产物与T-载体连接,连接产物转大肠杆菌DH5α感受态细胞,用含有50mg/ml氨苄青霉素的LB 固体培养基进行蓝白斑筛选,阳性克隆经质粒PCR鉴定确认后,送至上海英骏生物技术公司测序。
1.2.4 序列的生物信息学分析
序列的比较、翻译等在DNAMAN生物软件上进行,将所得序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.Gov/BLAST)中进行Blastn同源比对,并用MEGA4软件以邻位相连法构建系统进化树[10]。
2 结果与分析
2.1 重组酵母菌总RNA的提取与检测
重组酵母菌总RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1显示,26S、18S和5S rRNA条带明显。26S rRNA与18S rRNA的亮度接近2:1,RNA 质量较好,紫外分光光度计检测RNA纯度较高,可用于3′ 和5′ RACE扩增的反转录试验。
2.2 3′ RACE扩增乙醇脱氢酶3′ 末端序列
按照Takara 3′-Full RACE Core Set Ver 2.0试剂盒说明书对Adh基因3′ 末端进行扩增。以F1和3′ RACE Outer Primer为引物,对反转录产物进行Outer PCR反应,凝胶电泳检测无特异性条带。F2和3′ RACE Inner Primer为引物,以稀释了50倍的Outer PCR产物为模板,进行Inner PCR反应,凝胶电泳检测Inner PCR反应结果如图2所示,得到400bp左右大小条带,回收目的条带进行测序。
2.3 5′ RACE扩增乙醇脱氢酶5′ 末端序列
按照Takara 5′-Full RACE Kit试剂盒说明书对Adh基因5′ 末端进行扩增。与3′ RACE实验相同,第一轮Outer PCR反应没有扩增出特异性条带。以R2和5′ RACE Inner Primer为引物,以稀释了50倍的Outer PCR产物为模板,进行Inner PCR反应,PCR扩增获得到650 bp左右大小的条带(图3),回收目的条带进行测序。
2.4 测序结果与序列分析
将3′ 和5′ RACE结果进行测序,测序结果与利用前期利用SSH分离得到的乙醇脱氢酶基因片段进行拼接,获得一段长度为1 245 bp的序列,含有一个完整的ORF(开放阅读框),编码375个氨基酸,其中1～37 bp为5′ 非翻译区,1 163～1 245 bp为基因3′ 非翻译区。Blast同源比较结果显示,该序列与Candida boidinii酵母ADH3基因同源性最高为85%,氨基酸序列与Kluyveromyces lactis乙醇脱氢酶的同源性为85%。比对的结果表明所克隆到的片段确为Adh基因,并在GenBank注册,登录号为JF293468。
利用ProtParam对蛋白质理化性质进行分析,推导出蛋白质的理论分子质量40.005kD,理论等电点为6.99,其中甘氨酸(Glycine)、缬氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)和亮氨酸( Leucine)含量较高,分别占氨基酸总数的10.4%、9.3%、8.8%和8.5%。利用InterPro数据库(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)对得到的乙醇脱氢酶氨基酸残基进行蛋白质功能位点预测,结果显示该序列有两个氧化还原酶的催化结构域和一个NAD辅酶的结合域。氨基酸序列59～166和209～337位分别是氧化还原酶的催化结构域,并各包含有一个zinc结合位点,氨基酸序列205～324位为NAD辅酶的结合域。
将重组酵母菌Adh序列与genbank中数据进行比对,从中得到4种来源于不同酵母菌,与Adh基因同源性最高的基因序列信息。其种类及登录号分别为:Candida boidinii,AB125902.1、Pichia anomala,AJ841789.2、Kluyveromyces lactis,XM_455899.1和Vanderwaltozyma polyspora XM_001642889.1。将4个基因同重组酵母菌Adh序列进行同源比对,并构建进化树(图4),通过进化树分析,发现重组酵母菌Adh和Candida boidinii Adh3基因序列同源性较高。
3 讨论
本试验在利用抑制差减杂交技术研究产麻黄碱重组酵母菌在分泌表达麻黄碱时高表达基因时,分离得到一段乙醇脱氢酶基因片段,并根据序列信息,采用RACE技术,在重组酵母菌内克隆出Adh基因全长,并对获得的乙醇脱氢酶进行生物信息学分析。利用从重组酵母中获得的乙醇脱氢酶序列信息,对KEGG数据库进行Blast检索,显示乙醇脱氢酶在酵母当中参与酪氨酸代谢、脂肪酸代谢、糖酵解和次生代谢产物合成代谢途径。而以现有的结果很难判断重组酵母菌中乙醇脱氢酶具体参与的代谢途径。
已有研究表明乙醇脱氢酶表达水平和酶活性受外界环境因子影响较大,环境因子的微小变化可能也会影响其表达水平的变化。离子束注入后导致菌体乙醇脱氢酶的调控机制发生变化;重组酵母菌表达麻黄碱对菌体产生了胁迫;外源基因的导入,导致菌体代谢途径的重构和细胞周期发生了变化,这些因素都有可能造成乙醇脱氢酶的高表达。那么本实验所分离的高表达乙醇脱氢酶在重组酵母中的具体功能,以及该酶与麻黄碱生物合成代谢途径的关系还有待进一步验证。
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醇脱氢酶 篇7
微生物处理技术具有费用低、不产生二次污染、适用范围广等优点,被认为是比物理和化学处理方法更具发展前途的高新技术[1,2,3]。目前关于柴油生物处理的报道主要侧重于环境温度为30℃左右条件下的研究。但是在东北地区年平均气温在10℃以下,并且地下水的温度较低,年变化小于0.1℃。因此,应用微生物低温降解柴油的前景广阔,不仅可用于寒冷地区土壤和地表水的生物修复,而且可用于温暖地区地下水及化工废水中有机污染物的降解[4,5,6,7]。微生物对柴油污染物的降解或转化从脱氢开始,可以利用脱氢酶的活性反映微生物降解柴油的活性[8,9,10],所以脱氢酶的活性在柴油的降解过程中至关重要。
本工作研究了在低温(10℃)下,反应时间、柴油初始质量浓度、混合菌液加入量等因素对柴油降解过程中脱氢酶活性的影响,为该混合菌群在实际生物修复中的应用提供理论依据。
1 实验部分
1.1 实验材料
实验用0#柴油取自长春市某中国石化加油站。
从石油污染土壤中富集、驯化得到含A菌、H菌、LD2菌、N1菌、N2菌、T2菌6种优势菌的混合菌群。其中A菌为酵母菌,革兰氏阳性;H菌为球菌,革兰氏阳性;LD2菌、N1菌、N2菌、T2菌为杆菌,革兰氏阴性。经rDNA基因序列分析及系统分类鉴定,A菌为耶氏酵母菌(Yarrowia sp.),H菌为红球菌(Rhodococcus sp.),LD2菌为不动杆菌(Acinetobbacter sp.),N1菌、N2菌为假单胞菌(Pseudomonas sp.),T2菌为新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)。
无机盐液体培养基:P(K2HPO4) 1 550 mg/L,p(NaH2P04) 850 mg/L,p((NH4)2S04) 2 000 mg/L,P(MgCl2·6H2O) 100 mg/L,p(乙二胺四乙酸)10 mg/L,p(ZnSO4·7H2O) 2.0 mg/L,p(CaC12·2H2O) 1.0 mg/L,p(FeSO4·7H2O) 5.0 mg/L,p(NaMoO4·2H2O) 0.2 mg/L,p (CuSO4·5H2O)0.2 mg/L,p(CoCl2·6H2O) 0.4 mg/L,p(MnCl2·2H2O) 1.0 mg/L,pH 7.0。
混合菌在无机盐液体培养基中,以柴油为碳源(柴油质量浓度450 mg/L),低温下培养并保存。
1.2 试剂和仪器
正己烷:色谱纯;其他试剂均为分析纯。
HZQ-F160型振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;BS4202S型Sartorius电子分析天平、PB-10型pH计:德国赛多利斯集团;CX21型Olympus电子显微镜:日本奥林巴斯公司;721型分光光度计:上海光学仪器五厂;Agilent 6890型气相色谱仪、Agilent MSD5973N型质谱检测器:美国Agilent公司。
1.3 实验方法
在恒温10℃的条件下,向150 mL一定初始质量浓度的模拟柴油废水(柴油废水)中加入一定量混合菌液(混合菌浓度为1×107个/mL),摇床转速120 r/min,反应一定时间后,取样测定柴油质量浓度和脱氢酶的活性。
1.4 分析方法
按照超声波萃取法及半挥发性有机物的气相色谱-质谱法,用正己烷对柴油废水进行液-液萃取(正己烷与废水体积比为1:5),萃取后有机相过无水硫酸钠柱后进行气相色谱-质谱联用分析[11],测定柴油质量浓度。
采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑法[12,13,14,15]测定脱氢酶的活性。脱氢酶活性定义为单位体积反应液中混合菌于(37±1)℃、无光条件下,单位时间内将无色2、3、5-氯化三苯基四氮唑还原成红色三苯基甲的质量。
2 结果与讨论
2.1 柴油质量浓度和脱氢酶活性随反应时间的变化
在柴油初始质量浓度为450 mg/L、混合菌液加入量为10 mL的条件下,柴油质量浓度、脱氢酶活性随反应时间的变化见图1。为进一步确定柴油的降解效果以及微生物的活性,分别测定柴油废水pH和DO的变化。柴油废水pH、DO随反应时间的变化见图2。
●柴油质量浓度;■脱氢酶活性
●柴油废水pH;■DO
由图1可见:反应进行4天后,柴油质量浓度为29.8 mg/L,混合菌对柴油的降解率为93.4%;脱氢酶的活性先增大后减小,在第2天达到最大值,为35.6 mg/(L·h),由此可见在柴油降解的后期脱氢酶的活性可能受柴油质量浓度的影响而逐渐降低。
由图2可见,柴油废水pH和DO的变化趋势是一致的,均为先减小后增大。由此可以推断柴油在前2天的降解过程中生成大量的酸,导致pH降低;而柴油降解的后期由于柴油质量浓度的降低以及酸性物质的进一步降解,pH又出现了升高的趋势。DO的变化与脱氢酶活性的变化有着密切的联系,脱氢酶的活性越高,呼吸消耗的氧气也就越多,DO越小。
2.2 柴油初始质量浓度对柴油降解情况的影响
在混合菌液加入量为10 mL的条件下,柴油初始质量浓度对反应过程中柴油质量浓度和脱氢酶活性的影响分别见图3和图4。
柴油初始质量浓度/(mg·L-1):·100;■300;▲600;♦900
柴油初始质量浓度/(mg.L-1):●100;■300;▲600:♦900
由图3可见,当柴油初始质量浓度为100,300,600,900 mg/L时,反应4天后柴油质量浓度分别为3.3,12.6,37.2,67.8 mg/L,混合菌对柴油的降解率分别为%.7%,95.8%,93.8%,92.5%。进一步验证了该混合菌适用于不同初始质量浓度的柴油污染修复。
由图4可见:在不同柴油初始质量浓度条件下,脱氢酶活性的总体变化趋势均为先升高再降低;柴油初始质量浓度为100 mg/L时,反应1天后脱氢酶的活性达到最高值7.8 mg/(L·h),但远低于其他柴油初始质量浓度条件下的脱氢酶活性;反应第1天,柴油初始质量浓度分别为300,600,900 mg/L时,对应的脱氢酶活性分别为23.8,28.0,27.4 mg/(L·h),不同柴油初始质量浓度对应的脱氢酶活性相差不大;反应进行到第2天后,柴油初始质量浓度越高,对应的脱氢酶活性越高。
2.3 混合菌液加入量对柴油质量浓度和脱氢酶活性的影响
在柴油初始质量浓度为450 mg/L的条件下,混合菌液加入量对柴油质量浓度和脱氢酶活性的影响分别见图5和图6。
混合菌液加入量/mL:●1;■5;▲10;♦15;20
混合菌液加入量/mL:●1;■5:▲10:♦15:2
由图5和图6可见:当混合菌液加入量为5 mL时,反应2天后脱氢酶的活性达到最高值,为39.6mg/(L·h),反应4天后柴油质量浓度为25.1mg/L,混合菌对柴油的降解率为94.4%;当混合菌液加入量为1 mL时,柴油的降解速率明显降低,脱氢酶活性缓慢升高后降低;混合菌加入量由5 mL增至20 mL时,柴油的降解速率相差不大。这是因为接种量过小,会引起前期菌体生长缓慢[16],初期柴油降解速率较低,脱氢酶活性增加缓慢;接种量过大时使细菌很快处于贫营养状态,生长代谢受到一定程度的限制,同样不利于柴油降解速率的增加。
3 结论
a)低温下混合菌对柴油具有较强的降解能力,在柴油初始质量浓度为450 mg/L、混合菌液加入量为5 mL的条件下,混合菌以柴油为惟一碳源,反应2天后脱氢酶活性的最高值达39.6 mg/(L·h),反应4天后柴油质量浓度为25.1 mg/L,混合菌对柴油的降解率为94.4%。
b)在柴油降解过程中,柴油初始质量浓度对脱氢酶活性产生一定影响。在柴油初始质量浓度为100 mg/L时,脱氢酶的活性始终较低;在柴油初始质量浓度为300,600,900 mg/L时,反应第1天脱氢酶的活性相差不大,随反应时间的延长,柴油初始质量浓度越高,对应的脱氢酶活性越高。
摘要：研究了低温(10℃)下混合菌降解柴油过程中脱氢酶活性在不同反应时间、柴油初始质量浓度、混合菌液加入量等条件下的变化情况。实验结果表明:在柴油初始质量浓度为100 mg/L时,脱氢酶的活性始终较低;在柴油初始质量浓度为300,600,900 mg/L时,反应第1天脱氢酶的活性相差不大,随反应时间的延长,柴油初始质量浓度越高,对应的脱氢酶活性越高;在柴油初始质量浓度为450 mg/L、混合菌液加入量为5 mL的条件下,反应2天后脱氢酶的活性达最高值39.6 mg/(L·h),反应4天后柴油质量浓度为25.1 mg/L,混合菌对柴油的降解率为94.4%。
醇脱氢酶 篇8
1资料与方法
1.1临床资料
1.1.1病例选择中国中医科学院广安门医院2013年10月—2014年6月心内科 住院高血 压患者160例,男性68例,女性92例,年龄80岁~93岁(83.63岁±2.39岁)。根据同型半胱氨酸水平不同,将患者分成两组组,其中Hcy>10μmol/L为H型高血压[5]组83例,男38例,女45例;Hcy≤10μmol/L非H型高血压组(2组)77例,男30例,女47例。两组患者均签署知情同意书。
1.1.2诊断排除标准高血压病诊断标准根据《2010年中国高血压指南》[6]规定:未服用降压药物的 情况下,收缩压(SBP)≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 KPa) 和或舒张压(DBP)≥90 mmHg为高血压。排除继发性高血压、伴发急性脑血管病、严重心律失常、急性心肌梗死、严重心力衰竭、严重肝肾功能不全、严重感染,以及免疫系统疾病的患者。
1.2方法
1.2.1常规生化 指标、同型半胱 氨酸、乳酸脱氢 酶 (LDH)检测方法 常规生化 指标检测 谷丙转氨 酶 (ALT)、谷草转氨 酶 (AST)、血糖 (GLU)、总胆固醇 (TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、肌酐 (Cr)、尿素氮 (BUA)、血尿酸 (UA)等生化指标,仪器为日本YMPUS AU400全自动生化分析仪。同型半胱氨酸检测采用酶循环法通过全自动生化分析仪进行。乳酸脱氢酶检测采用常规琼脂糖电泳法。
1.2.2体重指数(BMI)计算方法根据《中国成人超重和肥胖预防控制指南》[7]规定。
1.2.3统计学处理全部数据录入Epidata软件,采用SPSS20.0软件分析,计量资料用均数±标准差( ±s)表示;多组样本,满足方差齐性,采用方差分析;相关性分析,若计量资 料服从正 态分布,采用Pearson相关分析;等级资料 或不满足 正态分布 相关性使 用Spearman相关系数 表示 ;多因素分 析采用二 元Logistic回归分析。P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组患者临床资料等比较(表1)
2.2相关性分 析行Spearman相关性分 析显示, LDH、UA、ALT均与高血压伴高同型半胱氨酸血症存在相关性(见表2)。且LDH水平与Hcy存在线性相关。
2.3二元Logistic回归分析以高血压伴高同型半胱氨酸为因变量,1=高同型半胱氨酸血症,0=非高同型半胱氨酸血症;行二元Logistic回归分析显示,乳酸脱氢酶为高血压伴高同型半胱氨酸即H型高血压的独立影响因素。
3讨论
伴血浆Hcy升高(>10μmol/L)的原发性高血压称为“H型高血压”,我国高血压患者高达2亿,其中75%的高血压患者伴有Hcy水平升高,Hcy升高是脑血管事件、缺血性心脏病的重要危险因素之一[8,9]。高血压及高Hcy血症对于心脑血管疾病的共同作用环节均涉及血管内皮细胞功能障碍、血管平滑肌细胞增殖、 血脂异常、凝血系统 异常及胰 岛素抵抗 等多个方 面[10]。
朱子龙等[11]研究高龄脑梗死合并H型高血压患者颈动脉粥样硬化特征,选择患者112例,分为H型高血压组48例,非H型高血压患者64例,均行颈部血管超声检查,结果显示H型高血压组颈动脉粥样硬化斑块C级比例明显低于对照组,E级比例明显高于对照组,认为高龄脑梗死并H型高血压患者发生严重颈动脉粥样硬化比率高。谈晓牧等[12]研究认为,高Hcy可以损害脑梗死后血管再生和侧支循环形成;可能通过损伤血管内皮、促进血液凝固、减少内源性血管扩张剂的产生或生物利用、促进动脉平滑肌细胞增生,增加泡沫细胞形成等多重作用机制损害血管,引起血管闭塞, 再次发生脑梗死。胡海雷等[13]研究发现,H型高血压患者循环内皮祖细胞数量、迁移和分泌能力较非H型高血压患者进一步下降,并且该变化可能与血浆Hcy水平升高有关。研究发现[14],高血压和高同型半胱氨酸血症可引起认知功能障碍,导致血管性痴呆的发生, 且待患者达血管性痴呆的诊断标准时,常已错过重要的早期干预治疗阶段。
LDH是一种在各血细胞或组织中进行物质代谢的酶类,随着细胞的不断更新或破坏可释出少量而进入血液。研究发现[15],LDH同工酶/总酶的比值可作为心肌梗死的诊断、疗效观察指标的同时,也可作为不稳定型心绞痛型冠心病、心肌炎等有心肌损伤的心脏病的诊断与疗效观察指标。Barron等[16]首次提出,血小板计数和血清乳酸脱氢酶变化可以很好地预测凝血功能异常。相关研究表明[17],乳酸脱氢酶与妊娠期高血压疾病的病变程度呈正相关,可作为评价妊娠期高血压疾病病情严重程度的指标。
本研究显示,LDH水平与Hcy存在线性 相关,并且经二元Logistic回归分析,LDH为H型高血压的独 立影响因素,两者关系 密切。 可能的原 因为血浆 中Hcy水平增高,刺激血管壁造成动静脉血管壁的损伤, 加重了内皮细胞的凋亡,导致细胞破坏LDH升高,当细胞受到损伤,机体细胞 缺血缺氧,造成乳酸 堆积, LDH升高,损伤越重 释放量越 多,导致了恶 性循环。 LDH或许可以成为老老年H型高血压的一项预测因子及疾病控制指标。
对于老老年H高血压患者,如新版2010中国高血压防治指南所强调的,降压同时要降Hcy;该指南还提出血管紧张素转换酶抑制剂/叶酸固定复方的特色性治疗方案[18]。相关研究也表明ACEI类降压药物联合叶酸不仅能降压,而且能降低高Hcy的血浓度,有效降低心血管事件的发生率[19]。
但目前对于老老年H型高血压患者,尚无针对性的治疗方案,本研究或许可以为老老年H型高血压的治疗提供一定的思路,但其中的内在机制还不十分清晰,需要进一步大规模前瞻性临床研究及相关基础实验研究。
摘要：目的 研究老老年H型高血压患者乳酸脱氢酶水平及两者之间的相关性。方法 选取老老年高血压患者160例,检测同型半胱氨酸及乳酸脱氢酶水平,根据血浆同型半胱氨酸测得的值,分成两组,其中高同型半胱氨酸组为1组,83例;非H型高血压组为2组,77例。比较两组临床资料及乳酸脱氢酶的差异。结果 乳酸脱氢酶水平1组(190.66±55.11)mmol/L>2组(171.40±44.17)mmol/L,Spearman相关性分析显示:乳酸脱氢酶水平与老老年H型高血压之间存在显著相关性(r=0.173,P=0.032),且乳酸脱氢酶与同型半胱氨酸之间存在线性相关;二元Logistic回归分析显示,乳酸脱氢酶水平为老老年H型高血压的独立影响因子。结论 老老年H型高血压与乳酸脱氢酶之间存在显著相关性。
