蛋白酶抑制剂

关键词： 蛋白酶 趋势 发病 农药

蛋白酶抑制剂（精选十篇）

蛋白酶抑制剂 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit购于北京艾德莱生物科技有限公司,大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105、植物表达载体pCAM-BIA3301(载体与菌株均为实验室保存),吉育47种子市售,其它分子生物学试剂购于赛默飞世尔科技公司,化学试剂购于北京化工厂,测序与引物合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取

利用CTAB法提取大豆总RNA。

1.2.2 PCR扩增

根据已发表的Soybean protease inhibitor C-II基因(GI:169944)序列,设计1对引物,P1:5′-CCCAAGCTTGGGatggaactgaacctcttcaaaagtg-3′;P2:5′-CGGGATCCCGctag tcatcatcttcatcactggac-3′。以大豆萌发种子总RNA为模板进行反转录,反转录体系为:Template RNA 10μL,Oligo(dT)18 1μL,5×reaction buffer 4μL,Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor 0.5μL,dNTP Mix,10 mmol·L-1each2μL,M-MuLV Reverse Transcriptase 2μL,DEPC-treated water 0.5μL,共计20μL。反转录条件为:37℃60min,70℃10min。以反转录产物为模板进行PCR扩增,在50μL的反应体系中,dNTP 1μL,引物各1μL,模板cDNA0.5μL,Taq酶0.5μL,10×Buffer 5.0μL,MgCl23.5μL,ddH2O 38μL。PCR反应程序:95℃预变性8 min;95℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸40 s,35个循环;72℃延伸10min。

1.2.3 产物的克隆、鉴定与分析

将回收后PCR产物,按3∶1比例与pTOPO-TA vector克隆载体连接并转入感受态大肠杆菌DH5α,并在含有100μg·mL-1的氨苄青霉素的LB固体培养基上进行12h筛选培养。挑取菌斑相同条件下液体培养,取1.5mL培养物提取质粒DNA,提取方案使用碱裂解法,对提取到的质粒使用HindIII+BamH I进行双酶切鉴定,获得重组克隆载体Ptopo-TAPI。序列由北京三博远志生物技术有限责任公司测定完成。

1.2.4 植物表达载体的构建与鉴定

将提取的Ptopo-TAPI质粒与pCAMBIA3301质粒分离,利用Hind III+BamH I进行双酶切,电泳并回收目的片段,按照3∶1的比例将切下并回收的PI目的基因与线性化的pCAMBIA3301载体利用T4DNA Ligase(含5%PEG 4000)进行连接构建pCAMBIA3301PI质粒,连接体系100μL,22℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5α,验证后提取质粒用冻融法转化农杆菌EHA105,构建农杆菌EHA105-pCAMBIA3301PI。

2 结果与分析

2.1 大豆RNA提取电泳结果

CTAB法提取大豆总RNA的OD260/OD280的结果为1.96,进一步进行甲醛凝胶变性电泳,结果(见图1)证实样品的28SrRNA、18SrRNA两带均保持完整。RNA质量合格,可进行后续实验。

2.2 蛋白酶抑制剂基因PI的克隆

以吉育47反转录cDNA为模板,进行PCR扩增。PCR扩增产物电泳结果(见图2),得到约252bp的单一的扩增带,符合预期结果。

2.3 克隆载体Ptopo-TAPI酶切验证

转化后培养物提取质粒DNA,经HindⅢ+BamHⅠ双酶切后电泳结果见图3,条带大小符合理论预期结果。

2.4 生物信息学分析

测序结果分析表明,该基因长度252bp,编码84个氨基酸,Blast同源性比对结果表明与已报道的蛋白酶抑制剂相似度达98%(见表1),可以确定为蛋白酶抑制剂基因。

2.5 表达载体pCAMBIA3301PI的验证

表达载体pCAMBIA3301PI转化后培养物质粒DNA经HindⅢ+BamHⅠ双酶切后电泳结果如图4所示,两条带分别为载体11kbp左右的载体和250bp的目的基因,符合理论预期结果。冻融法转化农杆菌后测序结果显示目的基因为已克隆到的基因。表明表达载体构建成功。

3 结论

本研究综合利用生物信息学技术分析已发表大豆蛋白酶抑制剂基因序列信息,选取高度保守区域合理设计引物,利用优化的PCR体系克隆出大豆吉育47蛋白酶抑制剂基因。分析测序结果与已发表基因信息同源性达98%。

本研究在克隆了吉育47大豆蛋白酶抑制剂基因,保存于克隆载体Ptopo-TAPI中,并构建植物表达载体pCAMBIA3301PI,建立农杆菌工程菌EHA105-pCAMBIA3301PI,对今后选育基因工程抗虫植物新品种将具有广泛的研究与应用价值。

参考文献

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蛋白酶抑制剂 篇2

Kazal型蛋白酶抑制剂结构与功能研究进展

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内,在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用,特别是对蛋白酶活性进行精确调控.其中Kazal型蛋白酶抑制剂是最重要的、研究最为广泛的酶抑制剂之一,该类抑制剂一般由一个或几个结构域组成,每一个结构域具有保守的序列和分子构象,同时发现该类抑制剂与蛋白酶作用的结合部位高度易变,它们大多数暴露于与溶剂接触的环上,其中P1部位是抑制作用的关键部位,抑制剂的专一性由P1部位氨基酸残基的`性质决定,其它残基取代结合部位残基对抑制剂-酶的结合常数有显著的影响.Laskowski算法可直接从Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列推测其与6种丝氨酸蛋白酶之间的抑制常数(Ki).目前在生物体内发现大量的Kazal型蛋白酶抑制剂,并证实其有重要的生物学功能.

作 者：郑青亮 盛清 张耀洲 ZHENG Qing-Liang SHENG Qing ZHANG Yao-Zhou 作者单位：浙江理工大学生命科学学院,生物化学研究所,杭州,310018刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：22(5)分类号：Q81 R373关键词：Kazal 型蛋白酶抑制剂 Laskowski 算法 活性部位

如何正确地使用白蛋白制剂 篇3

1.注射白蛋白制剂能增强人体的免疫力：临床研究发现，能影响人体免疫功能的蛋白是免疫球蛋白。而白蛋白与免疫球蛋白是种类不同的两种蛋白。白蛋白并不能参与机体抗体的形成。因此，说注射白蛋白制剂能增强人体的免疫力纯属无稽之谈。而且当人们大量地注射白蛋白制剂时，该药中的一些生理活性物质（如微量内毒素、血管舒缓素等）还可引起人体免疫功能的下降。

2.注射白蛋白制剂能补充更多的营养：对于代谢正常的人来说，通过注射白蛋白制剂来补充营养与吃普通的高蛋白食品并没有什么差别，而且弊多利少。这是因为医疗用的白蛋白制剂中不仅缺乏一些人体必需的氨基酸，而且这些白蛋白被人体分解后，其再利用率是相当低的，甚至还可能促使人体自身的白蛋白分解。美国联合保健联盟也规定：“对于需要营养支持的病人来说，白蛋白制剂不能作为其蛋白质的补充来源。”

3.白蛋白制剂可用于治疗各种危重病人：目前，还没有证据证明白蛋白制剂对治疗各种危重病人具有特殊的作用。现在很多医生或患者家属都把白蛋白制剂作为一种万能的药物应用在各种危重病人身上，这不但增加了患者的额外支出，而且对其身体也有害无益。

另外，还有一些人认为白蛋白制剂属于血液制品，使用这类制品容易感染肝炎、艾滋病等传染病。其实，这种担心是完全没有必要的。目前临床上使用的人血白蛋白制剂都要在60摄氏度的高温下进行10个小时的病菌灭活。在这种条件下，肝炎、艾滋病等病菌均已丧失了传染性。同时，白蛋白制剂中不含有抗原，不会与人体出现排斥反应，因此使用白蛋白制剂要比使用血浆或全血更安全。

由此可见，白蛋白制剂只是一种临床上常用的药物，它既不是包治百病的神药，也不是营养补品，更不是某些疾病的传染源。那么，白蛋白制剂究竟有哪些作用呢？

1.可用于扩张血容量：临床研究发现，人血浆胶体渗透压的70%～80%是靠白蛋白来维持的。5克白蛋白维持胶体渗透压的作用相当于100毫升的全血。同时，白蛋白的扩容作用是晶体物质（如氯化钠等）的5倍，而且比晶体物质的扩容速度更快，所需要的量也更少。因此，白蛋白制剂非常适合在抢救急性低血容量患者（如因烧伤、创伤而大量失血的患者）时使用。此外，患有严重腹泻、肝硬化、肺水肿或进行了肝移植、血浆置换的患者若同时伴有低蛋白血症，也可首选白蛋白制剂作为扩容的药物。需要注意的是，由于过量地使用白蛋白制剂进行扩容可导致人体出现脱水、机体循环负荷增加、充血性心力衰竭和肺水肿等病症，并可加重肾脏的衰竭，因此人们在使用白蛋白制剂进行扩容时必须符合其适应症的规定，千万不可盲目使用。

2.可补充血浆中的白蛋白含量：有研究显示，人体血浆中的白蛋白含量每下降2.5克/升，该人死亡的危险性就会增加24%～56%。因此，白蛋白制剂常用于治疗各种能导致人体内白蛋白减少的疾病，如慢性肝炎、肝硬化、慢性肾病、肿瘤和营养不良等。同时，白蛋白制剂在治疗低蛋白血症引起的水肿（如脑水肿、肺水肿、肝硬化腹水等）方面有很好的作用。这是因为当人体血浆中的白蛋白含量小于30克/升、血浆蛋白含量小于52克/升时，就可导致人体出现水潴留。而白蛋白能迅速提高人体血浆的胶体渗透压，把组织间隙中多余的水分吸收到血管中。此类出现水潴留的患者若同时使用利尿剂(如速尿等)来促进体内水分的排出，即可达到快速消除水肿的目的。需要注意的是，患有肝硬化、门脉高压等疾病的人不可过快或过多地使用白蛋白制剂，否则可导致食道静脉和（或）胃底静脉的破裂出血。

蛋白酶抑制剂 篇4

关键词：基质金属蛋白酶,基质金属蛋白酶抑制剂,肿瘤侵袭,肿瘤转移

恶性肿瘤的进程包括:正常细胞某些基因的改变、恶性表型的形成、侵袭邻近正常组织、远距离及全身组织扩散 (转移) 。据临床统计, 约有80%以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移, 故此方面的研究一直受到很多人的关注。其中, 对基质金属蛋白酶类及其组织抑制因子的研究最多。

1 MMPs、TIMPs的一般特性

1.1 基质金属蛋白酶 (MMPs)

M M P s是一组蛋白水解酶。根据作用底物的不同把M M P s分为6类。

1.2 基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs)

T I M P s是多基因家族的编码蛋白。它是M M P s的天然抑制剂, 在肿瘤组织与间质细胞中均可表达。

2 TIMPs、MMPs的功能及其在肿瘤侵袭转移中的作用

2.1 MMPs的功能

2.1.1 降解细胞外基质ECM是肿瘤转移的主要屏障, MMPs

通过降解E C M及基底膜, 使肿瘤细胞沿基底膜缺损和基质空隙侵入周围组织及血管。

2.1.2 在新生血管形成中的作用

肿瘤血管形成的机制有:已有血管的出芽生殖;骨髓中内皮细胞前体的动员;淋巴管转变而成[1]。在这一过程中, MMPs除了在基底膜降解、细胞运动和管腔形成中起重要作用, 还能使多种生长因子释放增多[1]。

2.1.3 对细胞凋亡的作用

有研究表明MMP-7能降解细胞膜上的Fas配体, 促进肿瘤生长, 还能分解胰岛素样生长因子结合蛋白释放IGF-I, 促进肺癌、乳腺癌、肠癌等的生长[2]。

2.1.4 对细胞增殖的作用多种MMPs对肿瘤细胞增殖有促进作用。

2.2 TIMPs功能

2.2.1 抑制MMPs活性

研究表明, TIMPs对MMPs的抑制作用既有一定的交叉性又有特定的选择性, 在调节细胞外基质的代谢中起重要作用。

2.2.2 对血管生长的作用

研究表明TIMP-2可通过减少VEGF释放而抑制乳腺癌血管生长, TIMP-3通过抑制VEGF与受体K D R的结合而抑制血管生长[3]。

2.2.3 对细胞凋亡的作用TIMPs家族不同成员对不同的细胞

系凋亡的作用是不相同的。

2.2.4 对细胞增殖的作用

有研究表明TIMP-1能刺激红细胞系和肿瘤细胞系的增殖, 也能促进动脉平滑肌细胞增殖。T I M P-2也具有红系增生活性。

2.3 MMPs、TIMPs与肿瘤的侵袭和转移

M M P的活性上调与肿瘤侵袭、转移有关, T I M P是M M P的天然抑制物, 可下调M M P s活性。在正常生理状态下, M M P与T I M P协同产生, 维持动态平衡, 这种平衡关系是维持E C M内环境稳定和完整的决定因素, 也就是说M M P在肿瘤浸润中所起的作用取决于两者间的比例关系。当活化的M M P s与T I M P s的平衡关系受到破坏, 趋向有利于ECM降解的一边, 且失去可调控性, 则提示有肿瘤侵袭和转移的可能性。

3 MMPs与TIMPs在肿瘤诊断、预后中的作用

M M P s是肿瘤发展过程中的重要酶类, 几乎在所有的肿瘤组织中均呈高表达。许多研究表明, M M P s的表达与肿瘤的分化程度分期等有关, 可用作诊断及判断预后的指标。在大肠癌患者局部肿瘤组织中的M M P-9表达与肿瘤的临床分期、浸润深度及淋巴结转移的关系密切, 其表达越高, 肿瘤的侵袭转移潜能越强, 恶性程度越高, 预后越差。

T I M P s作为M M P s的抑制剂, 与肿瘤发生、侵袭和转移密切相关, 也是肿瘤诊断的一项有效指标。有研究证实在胰腺癌中, T I M P-3的表达明显下降或不表达, 可以作为胰腺癌的早期诊断指标, 具有较好的敏感性和特异性[4]。

随着TIMPs与MMPs的平衡关系在肿瘤发病过程中被重视, 有人提出M M P/T I M P似乎更能作为肿瘤浸润转移的一个预后指标。

4 MMPs、TIMPs与肿瘤的治疗

4.1 合成基质金属蛋白酶抑制剂 (MMPIs)

M M P I s是一种低分子合成物, 结构与作用底物的M M P s结合区域相似, 能与M M P s的锌活性位点可逆性结合, 竞争性抑制其水解活性。巴马司他 (Batimastat BB-94) 是较早研制出的合成基质金属蛋白酶抑制剂。大量的动物模型试验表明, M M P I s能有效地抑制肿瘤的生长和转移, 与细胞毒性药物联用能增强药物的作用。目前, 大多数学者仍然在进行进一步研究, 并乐观的认为基质金属蛋白酶抑制剂终会成为有效的抗肿瘤药。

4.2 TIMPs在治疗中的应用

TIMPs是MMPs的天然抑制剂, 研究发现肿瘤组织中TIMPs的表达增高能抑制肿瘤的生长和转移。近来, TIMPs基因活体内转染治疗肿瘤技术, 已作为一种新的基因治疗法大量用于体外试验及动物模型体内试验。Rigg AS等通过腺病毒载体将TIMP-1和TIMP-2分别导入荷瘤 (人胰腺癌) 裸鼠体内肿瘤组织, 结果表明肿瘤的生长及侵袭性都受到抑制, 与对照比较生存期明显延长。人们已试图将T I M P s制剂用于肿瘤的治疗, 并取得一定效果。同时在肿瘤的基因治疗方面, TIMPs也显示出其独特的优越性, 因为其只需转染有限的细胞便足以阻止基底膜及E C M的降解, 故其对肿瘤治疗有潜在价值。

4.3 疫苗治疗

M M P s尤其是M M P-2在肿瘤生长转移中有重要作用, 因此有研究人员设想利用主动免疫打破M M P-2的免疫耐受也可以成为肿瘤治疗的一种有效方法。Su JM, Wei YQ等将鸡同源MMP-2作为抗原转入小鼠体内, 结果发现小鼠血清中自身抗体生成增加, 对M M P-2及M M P-2前体均有抑制作用。

总之, 研究MMPs及TIMPs与肿瘤的侵袭转移的关系已为我们人类认识肿瘤进程的机理提供了有力的依据, 随着这一领域研究的深入, 将为临床肿瘤的诊断预防提供可信的指标, 也为临床治疗肿瘤提供新的策略与方向。

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蛋白酶抑制剂 篇5

【所属类别】国家法律法规

【文件来源】国家食品药品监督管理局

蛋白同化制剂、肽类激素进出口管理办法（暂行）

（国家食品药品监督管理局令第25号）

《蛋白同化制剂、肽类激素进出口管理办法（暂行）》经过国家食品药品监督管理局、中华人民共和国海关总署、国家体育总局审议通过，现以国家食品药品监督管理局局令顺序号发布。本办法自2006年9月1日起施行。

国家食品药品监督管理局 中华人民共和国海关总署

局长：邵明立 署长：牟新生

国家体育总局

局长：刘鹏

二○○六年七月二十八日

蛋白同化制剂、肽类激素进出口管理办法（暂行）

第一条 为规范蛋白同化制剂、肽类激素的进出口管理，根据《 中华人民共和国药品管理法》、《 中华人民共和国海关法》、《 反兴奋剂条例》等法律、行政法规，制定本办法。

第二条 国家对蛋白同化制剂、肽类激素实行进出口准许证管理。

第三条 进口蛋白同化制剂、肽类激素，进口单位应当向国家食品药品监督管理局提出申请。

第四条 进口供医疗使用的蛋白同化制剂、肽类激素，进口单位应当报送以下资料：

（一）药品进口申请表；

（二）购货合同或者订单复印件；

（三）《进口药品注册证》（或者《医药产品注册证》）（正本或者副本）复印件；

（四）进口单位的《药品经营许可证》、《企业法人营业执照》、《进出口企业资格证书》（或《对外贸易经营者备案登记表》）、《组织代码证书》复印件；药品生产企业进口本企业所需原料药和制剂中间体（包括境内分包装用制剂），应当报送《药品生产许可证》、《企业法人营业执照》、《组织代码证书》复印件；

（五）《进口药品注册证》（或者《医药产品注册证》）持有者如委托其他公司代理出口其药品的，需提供委托出口函。

上述各类复印件应当加盖进口单位公章。

第五条 因教学、科研需要而进口蛋白同化制剂、肽类激素的，进口单位应当报送以下资料：

（一）药品进口申请表；

（二）购货合同或者订单复印件；

（三）国内使用单位合法资质的证明文件、药品使用数量的测算依据以及使用单位出具的合法使用和管理该药品保证函；

（四）相应科研项目的批准文件或相应主管部门的批准文件；

（五）接受使用单位委托代理进口的，还需提供委托代理协议复印件和进口单位的《企业法人营业执照》、《进出口企业资格证书》（或《对外贸易经营者备案登记表》）、《组织代码证书》复印件。

上述各类复印件应当加盖进口单位公章。

第六条 境内企业因接受境外企业委托生产而需要进口蛋白同化制剂、肽类激素的，除需报送本办法第五条第一款第（一）项、第（三）项、第（五）项规定的资料外，还应当提供已向所在地省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门备案的证明文件。

上述各类复印件应当加盖进口单位公章。

第七条 国家食品药品监督管理局收到进口申请及有关资料后，应当于15个工作日内作出是否同意进口的决定；对同意进口的，发给药品《进口准许证》；对不同意进口的，应当书面说明理由。

第八条 进口单位凭国家食品药品监督管理局核发的药品《进口准许证》向允许药品进口的口岸海关申报，海关凭药品《进口准许证》验放。进口蛋白同化制剂、肽类激素无需办理《进口药品通关单》。

第九条 进口供医疗使用的蛋白同化制剂、肽类激素（包括首次在中国销售的），进口单位应于进口手续完成后，及时填写《进口药品报验单》，持《进口药品注册证》（或者《医药产品注册证》）原件（正本或者副本）、药品《进口准许证》原件，向进口口岸（食品）药品监督管理部门报送下列资料一式两份，申请办理《进口药品口岸检验通知书》：

（一）《进口药品注册证》（或者《医药产品注册证》）（正本或者副本）和药品《进口准许证》复印件；

（二）进口单位的《药品生产许可证》或者《药品经营许可证》复印件，《企业法人营业执照》复印件；

（三）原产地证明复印件；

（四）购货合同复印件；

（五）装箱单、提运单和货运发票复印件；

（六）出厂检验报告书复印件；

（七）药品说明书及包装、标签的式样（原料药和制剂中间体除外）。

上述各类复印件应当加盖进口单位公章。

第十条 口岸（食品）药品监督管理部门接到《进口药品报验单》及相关资料，审查无误后，将《进口药品注册证》（或者《医药产品注册证》）（正本或者副本）原件、药品《进口准许证》原件交还进口单位，并应当于当日向负责检验的口岸药品检验所发出《进口药品口岸检验通知书》，附本办法第九条规定的资料一份。

口岸药品检验所接到《进口药品口岸检验通知书》后，应当在2个工作日内与进口单位联系，到存货地点进行抽样，抽样完成后，应当在药品《进口准许证》原件第一联背面注明“已抽样”字样，并加盖抽样单位的公章。

第十一条 因教学、科研需要而进口的蛋白同化制剂、肽类激素以及境内企业接受境外企业委托生产而需要进口的蛋白同化制剂、肽类激素，予以免检。

第十二条 有下列情形之一的，口岸（食品）药品监督管理部门应当及时将有关情况报告国家食品药品监督管理局：

（一）口岸（食品）药品监督管理部门根据《药品进口管理办法》（国家食品药品监督管理局、海关总署令第4号）第十七条规定，不予发放《进口药品口岸检验通知书》的；

（二）口岸药品检验所根据《药品进口管理办法》第二十五条规定，不予抽样的。

口岸（食品）药品监督管理部门对符合前款规定并已进口的全部药品，应当采取查封、扣押的行政强制措施，并于查封、扣押之日起7日内作出准予退运决定，通知进口单位按照本办法规定的蛋白同化制剂、肽类激素出口程序办理药品《出口准许证》，将进口药品全部退回原出口国。

进口单位收到准予退运决定之日起10日内不答复或者未明确表示退运的，已查封、扣押的药品由口岸（食品）药品监督管理部门监督销毁。

第十三条 进口的蛋白同化制剂、肽类激素经口岸药品检验所检验不符合标准规定的，进口单位应当在收到《进口药品检验报告书》后2日内，将全部进口药品流通、使用的详细情况，报告所在地口岸（食品）药品监督管理部门。

口岸（食品）药品监督管理部门收到《进口药品检验报告书》后，应当及时采取对全部药品予以查封、扣押的行政强制措施，并在7日内做出是否立案的决定。

进口单位未在规定时间内提出复验或者经复验仍不符合标准规定的，口岸（食品）药品监督管理部门应当作出准予退运决定，通知进口单位按照本办法规定的蛋白同化制剂、肽类激素出口程序办理药品《出口准许证》，将进口药品全部退回原出口国。进口单位收到准予退运决定之日起10日内不答复或者未明确表示退运的，由口岸（食品）药品监督管理部门监督销毁。

经复验符合标准规定的，口岸（食品）药品监督管理部门应当解除查封、扣押的行政强制措施。口岸（食品）药品监督管理部门应当将按照本条第二款、第三款、第四款规定处理的情况及时报告国家食品药品监督管理局，同时通告各省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门和其他口岸（食品）药品监督管理部门。

第十四条 国内药品生产企业、经营企业以及医疗机构采购进口蛋白同化制剂、肽类激素时，供货单位应当提供《进口药品注册证》（或者《医药产品注册证》）复印件、药品《进口准许证》复印件和《进口药品检验报告书》复印件，并在上述各类复印件上加盖供货单位公章。

第十五条 出口蛋白同化制剂、肽类激素，出口单位应当向所在地省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门提出申请，报送下列资料：

（一）药品出口申请表；

（二）进口国家或地区的药品管理机构提供的进口准许证正本（或者复印件及公证文本）。

如进口国家或地区对蛋白同化制剂、肽类激素进口尚未实行许可证管理制度，需提供进口国家的药品管理机构提供的该类药品进口无需核发进口准许证的证明文件（正本）以及以下文件之一：

1.进口国家或地区的药品管理机构提供的同意进口该药品的证明文件正本（或者复印件及公证文本）；

2.进口单位合法资质的证明文件和该药品用途合法的证明文件正本（或者复印件及公证文本）；

（三）购货合同或者订单复印件（自营产品出口的生产企业除外）；

（四）外销合同或者订单复印件；

（五）出口药品如为国内药品生产企业经批准生产的品种，须提供该药品生产企业的《药品生产许可证》、《企业法人营业执照》及药品的批准证明文件复印件；

出口药物如为境内企业接受境外企业委托生产的品种，须提供已向所在地省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门备案的证明文件复印件；

（六）出口企业的《企业法人营业执照》、《进出口企业资格证书》（或《对外贸易经营者备案登记表》）、《组织代码证书》复印件。

上述各类复印件应当加盖出口单位公章。

第十六条 按照本办法第十二条、第十三条规定退运的，申请药品《出口准许证》时，应当提供下列资料：

（一）出口国原出口单位申请退货的证明材料；

（二）药品《进口准许证》。

第十七条 省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门收到出口申请及有关资料后，应当于15个工作日内作出是否同意出口的决定；对同意出口的，发给药品《出口准许证》；对不同意出口的，应当书面说明理由。

对根据本办法第十六条规定申请办理药品《出口准许证》的，发证机关应当在药品《出口准许证》上注明“原货退回”字样。

第十八条 出口单位凭省、自治区、直辖市（食品）药品监督管理部门核发的药品《出口准许证》向海关办理报关手续。海关凭药品《出口准许证》验放。

第十九条 进出口单位在办理报关手续时，应多提交一联报关单，并向海关申请签退该联报关单。海关凭药品《进口准许证》、《出口准许证》在该联报关单上加盖“验讫章”后退进出口单位。海关按照出证的相关规定收取工本费。

进出口完成后1个月内，进出口单位应当将药品《进口准许证》、《出口准许证》的第一联、海关签章的报关单退回发证机关。

取得药品进出口准许证后未进行相关进出口贸易的，进出口单位应当于准许证有效期满后1个月内将原准许证退回发证机关。

第二十条 药品《进口准许证》有效期1年。药品《出口准许证》有效期不超过3个月（有效期时限不跨）。

药品《进口准许证》、《出口准许证》实行“一证一关”，只能在有效期内一次性使用，证面内容不得更改。因故延期进出口的，可以持原进出口准许证办理一次延期换证手续。

第二十一条 药品《进口准许证》、《出口准许证》如有遗失，进出口单位应立即向原发证机关书面报告挂失。原发证机关收到挂失报告后，通知口岸海关。原发证机关经核实无不良后果的，予以重新补发。

第二十二条 药品《进口准许证》、《出口准许证》由国家食品药品监督管理局统一印制。

第二十三条 以加工贸易方式进出口蛋白同化制剂、肽类激素的，海关凭药品《进口准许证》、《出口准许证》办理验放手续并实施监管。确因特殊情况无法出口的，移交货物所在地（食品）药品监督管理部门按规定处理，海关凭有关证明材料办理核销手续。

第二十四条 保税区、出口加工区及其他海关特殊监管区域和保税监管场所与境外进出及海关特殊监管区域、保税监管场所之间进出的蛋白同化制剂、肽类激素，免予办理药品《进口准许证》、《出口准许证》，由海关实施监管。

从保税区、出口加工区及其他海关特殊监管区域和保税监管场所进入境内区外的蛋白同化制剂、肽类激素，应当办理药品《进口准许证》。

从境内区外进入保税区、出口加工区及其他海关特殊监管区域和保税监管场所的蛋白同化制剂、肽类激素，应当办理药品《出口准许证》。

第二十五条 个人因医疗需要携带或邮寄进出境自用合理数量范围内的蛋白同化制剂、肽类激素的，海关按照卫生主管部门有关处方的管理规定凭医疗机构处方予以验放。

第二十六条 除本办法另有规定外，供医疗使用的蛋白同化制剂、肽类激素的进口、口岸检验、监督管理等方面，参照《药品进口管理办法》有关药品进口的规定执行。

第二十七条 本办法所称进口供医疗使用的蛋白同化制剂、肽类激素，是指进口的蛋白同化制剂、肽类激素拟用于生产制剂或者拟在中国境内上市销售。

进口单位：是指依照本办法取得的药品《进口准许证》上载明的进口单位。

出口单位：是指依照本办法取得的药品《出口准许证》上载明的出口单位。

第二十八条 本办法自2006年9月1日起施行。国家食品药品监督管理局2004年9月30日发布的《关于蛋白同化制剂和肽类激素进出口管理的通知》（国食药监安〔2004〕474号）同时废止。

蛋白酶抑制剂 篇6

摘 要：目的：探讨运动和低氧影响骨骼肌生长的分子调控机制。方法：SD大鼠分为6组：1) 28 d组，包括对照组、常氧运动组、低氧暴露组、高住低训组；2) 复氧7 d组，包括低氧暴露复氧7 d组、高住低训复氧7 d组，每组6只。常氧运动组进行4周的跑台运动。低氧暴露组白天与对照组在常氧下生活，晚上在氧浓度13.6%低氧舱内低氧暴露12 h；复氧7 d组进行低氧暴露后复氧7 d。高住低训组每天运动后1 h进行低氧暴露。实验后取腓肠肌称重，采用western blot测定mTOR蛋白表达。结果：1) 28 d常氧运动后骨骼肌mTOR蛋白表达明显上降（p<0.05）；2) 28 d高住低训后骨骼肌mTOR蛋白表达明显下降（p<0.05），复氧7 d后显著回升（p<0.05）。结论：运动和低氧调节骨骼肌mTOR蛋白表达，提示高住低训抑制骨骼肌生长可能与运动、低氧调控骨骼肌mTOR信号并影响蛋白翻译过程有关。

关键词：低氧；高住低训；翻译调控；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）

中图分类号：G804.2

文献标识码：A

文章编号：1007-3612(2008)08-1073-03

On the Living-High-Training-Low Restraining mTOR Protein Expression of Skeletal Muscle in Rats

HE Dao-yuan1, ZENG Fan-xing2, WANG Wei-ming1

(1.College of Physical Education, Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei China; 2.Beijing Sports University,Beijing 100084,China)

Abstract:Objective: to research the effect of exercise and hypoxia on

skeletal muscle growth and its mechanism of molecular regulation. Methods: SD rats were divided into 6 groups:(1) 28-days groups, included control group, normoxic exercise group, hypoxic exposure group, living high training low (HiLo) group.(2) 7-days reoxygen groups, included 7 days of reoxygen groups after hypoxic exposure,7 days of reoxygen groups after HiLo. Normoxic exercise group were carried out treadmill running for 4 weeks. Hypoxic exposure group were treated with 13.6% concentrations of oxygen for 12 h/day under normobaric conditions in hypoxic chamber. 7 days of reoxygen groups were treated with 7 days of reoxygen after hypoxic exposure. HiLo group were exposed to hypoxia following 1 hour after exercise. After gastrocnemius muscle weighing, mTOR expression in gastrocnemius muscle were tested with the method of western blot. Results: 1) After exercisefor 28 days, mTOR protein expression in muscle increased significantly（p<0.05）;2) After living high training low for 28 days, mTOR protein expression in muscle decreased significantly（p<0.05）, but increased significantly after 7 days reoxygen（p<0.05）. Conclusions: exercise and hypoxia regulate mTOR signal. HiLo repress muscle growth, and its mechanism may be the way of regulation of mTOR signal and protein translation in skeletal muscle by exercise and hypoxia.

Key words: hypoxia; living-high-training-low(HiLo); translation regulation; mammalian target of rapamycin (mTOR）

低氧运动抑制肌肉生长会导致骨骼肌丢失及力量下降等问题，但具体机制不清楚。肌肉生长的调控与基因表达的调控有关，基因表达的调控主要包括转录的调控和翻译的调控。翻译是连接基因组和蛋白组的桥梁，翻译的调控是基因表达的调控的重要环节。

大量的细胞培养实验表明低氧抑制蛋白合成，与mTOR信号有关。而低氧运动影响骨骼肌蛋白合成，但其机制不清楚。为了阐明低氧运动对蛋白合成的调控机制，本研究测试了高住低训大鼠骨骼肌mTOR蛋白表达变化，我们假设运动后mTOR蛋白表达增加，低氧及运动后mTOR表达下降。

1 材料和方法

1.1 动物及分组 健康雄性、SPF级2月龄的SD大鼠(许可证号：SCXK(京)2002-0001 动物编号：0068277)，体重180～200 g，由北京大学医学部实验动物中心提供。昼夜节律人工控制光照(光照时间为07:00-19:00)，环境温度(23±2)℃，动物自由取食及饮水，饲养一周后用于实验。实验动物随机分组，共分为6组：对照组（C）、常氧运动组（E）、低氧暴露组（H）、高住低训组（HL）；低氧暴露组、高住低训组又分为28 d组和复氧7 d组，每组6只。

1.2 运动与低氧暴露模型 运动组先进行适应性训练6 d，坡度为5°，速度分别为10 m/min、15 m/min、20 m/min，进行强度递增的适应运动，每日1次，每次30 min；然后进行正式跑台运动：上坡跑，跑台坡度5°，速度20 m/min，60 min/次, 6次／周。常氧运动组大鼠在适应性运动后进行正式跑台运动4周，高住低训组运动4周（28 d组）或5周（复氧7 d组）。对照组均不运动，其生活条件与运动组相同。

采用间歇低氧暴露方式进行低氧暴露。使用人工低氧舱（美国Hypoxic Systems tent-1型低氧帐篷）模拟氧浓度13.6%（相当于海拔高度3 500 m）低氧环境。打开低氧仪，让低氧帐篷内的氧浓度降到13.6%，并稳定1 h后，将大鼠放入，进行低氧暴露。低氧暴露组白天生活在常氧环境，晚上进行低氧暴露12 h（20:00-8:00）。高住低训组于每天运动后1 h同时于同一低氧环境进行相同持续时间的低氧暴露。28 d低氧暴露组低氧暴露28 d，复氧7 d组在低氧暴露28 d后出低氧舱后剩余7 d不再进行低氧暴露。对照组、常氧运动组为常氧环境，不进行低氧暴露。

1.3 组织匀浆及总蛋白含量测定 大鼠低氧暴露后即刻取材。对大鼠进行25%乌拉坦腹腔麻醉，腹主动脉取血后，取右侧后肢完整腓肠肌，去筋膜和脂肪等，称重。用于匀浆的肌肉样品，被切成重约100 mg大小，加10倍体积（1 mL）的预冷的匀浆缓冲液于玻璃匀浆器中冰上匀浆，静置10 min，转移至1.5 mL EP中。12 000 g 4℃ 离心10 min。取上清，用于总蛋白含量测定及western blot测定。

总蛋白含量采用BCA测试方法，按试剂盒（PIERCE）说明进行。

1.4 免疫印迹 取1份（100 μg）肌肉匀浆上清液，加入等体积的SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min，使蛋白变性。将变性后的蛋白全部上样，最右边的一泳道加蛋白质标准。在5%的浓缩胶以20 mA恒流，10%的分离胶（或7.5%的分离胶）以40 mA恒流的条件下电泳约2 h。电泳结束后取出凝胶，采用湿转的方法将凝胶上的蛋白转移到NC膜上。转膜结束后把NC膜放入含5% BSA（w/v）的封闭液培养皿中，于室温轻摇1 h进行封闭。取出膜，装入保鲜膜袋中，将用封闭液适当稀释过的一抗（mTOR为1:1 000购自cell signal）加入到NC膜，4℃振荡孵育过夜封闭。将一抗孵育过的NC膜用TBST洗3次，15 min/次。取出NC膜，装入保鲜膜袋中，将适当稀释过的辣根酶标记山羊抗兔IgG（1:2 000，中杉金桥ZB-2 301)加入到NC膜，室温振荡孵育1 h。将二抗孵育过的NC膜用TBST洗3次，15 min/次。用ECL发光试剂（Santa Cruz No. sc-2048）发光，底片曝光，显影、定影，扫描仪扫描，测定目的条带光密度值。结果采用待测样品目的条带光密度与对照光密度比较相对值。

1.5 统计处理 实验结果用均数士标准差表示。全部统计学分析均采用SPSS 11.5统计软件进行，组间比较采用方差分析，以P<0.05表示差异具有显著性。

2 结 果

2.1 低氧暴露和运动对大鼠骨骼肌质量的影响 常氧运动、低氧暴露及高住低训对大鼠腓肠肌重量影响见表1。常氧运动组、低氧暴露组及高住低训组28 d后肌肉质量显著低于常氧安静组，其中高住低训组最低，低氧暴露组其次，常氧运动组最小（p<0.05）。与复氧前比，低氧暴露后复氧７ d，大鼠腓肠肌重量又显著回升；高住低训后复氧７ d，大鼠腓肠肌重量也显著回升（p<0.05）。

2.2 低氧暴露和运动对大鼠骨骼肌质量的影响 实验各组中都检测到了289kD处蛋白条带，表明mTOR存在着表达（图1）。

持续28 d的变化。28 d后常氧运动组mTOR蛋白表达显著上升，增加49.1%（p<0.05）；低氧暴露组和高住低训组，mTOR蛋白表达明显下降，分别为86.6%，92.1%（p<0.05）（表1）。

注：结果为平均数±标准差，n=6，a表示与对照相比有显著差异，p<0.05；b表示与E组相比HL组有显著差异，p<0.05；c表示与H组相比HL组有显著差异，p<0.05；d表示与同组28 d比有显著差异，p<0.05。

复氧7 d的变化。与28 d低氧暴露组比，低氧暴露再复氧7 d组mTOR表达显著升高，为410%（p<0.05）；高住低训再继续复氧运动7 d，mTOR表达比7 d前显著增加，上升267%（p<0.05）（表2）。

注：结果为平均数±标准差，n=6，a表示与对照相比有显著差异，p<0.05；b表示与E组相比HL组有显著差异，p<0.05；c表示与H组相比HL组有显著差异，p<0.05；d表示与同组28 d比有显著差异，p<0.05。

3 分析讨论

3.1 高住低训后骨骼肌质量下降 本研究发现，28 d高住低训导致肌肉质量显著下降，复氧7 d后肌肉质量显著回升，表明高住低训对骨骼肌生长友明显的抑制。这可能与低氧和运动两种因素都有关。有报道大鼠6周的低氧暴露和低氧训练时肌肉重量下降^［1］，本实验也观察到安静低氧暴露导致肌肉含量显著下降。运动对肌肉质量影响与运动方式有关^［2］，一般抗阻力运动导致肌肉的肥大，而耐力运动对肌肉的肥大没有明显的作用。我们的研究表明运动28 d耐力运动后肌肉含量也有一定程度的下降，但幅度比高住低训小。

肌肉质量的下降表明低氧运动影响蛋白代谢。因为肌肉质量的下降包括液体成分和蛋白的丢失，因而蛋白的状况会受影响。

3.2 高住低训后骨骼肌mTOR蛋白表达下降 mTOR即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其活性可被一种链霉菌的衍生物雷帕霉素（rapamycin）所阻断。许多学者认为mTOR是目前除了AMPK之外的又一个对能量敏感的感受器，能监测细胞内AMP浓度的变化。在细胞的生长、分化、增殖、迁移和存活上扮演了重要的角色。mTOR是一种大分子蛋白质，分子量为289 kDa，由2 459个氨基酸分子组成。mTOR蛋白氨基酸组成非常保守，人、大鼠的mTOR之间有95%的氨基酸一致^［3］。

mTOR可以感受细胞能量状况（AMP/ATP）、环境中营养状况以及生长因子刺激信号传递途中的PI3K信号。激活后的mTOR再将信号传递给下游三种主要靶蛋白p70S6K、4E-BP1、eIF4G，这些靶蛋白是蛋白质合成的重要调控因子，能激活蛋白质的合成。因此mTOR对于蛋白质翻译起始复合物的形成、核糖体的生成以及多肽链的延伸等蛋白质翻译过程正常进行起着至关重要的作用。

一些研究表明，运动及电刺激等引起肌肉负荷增加会刺激骨骼肌mTOR磷酸化及总蛋白表达^［4］。Parkington^［5］报道对坐骨神经进行高频电刺激后即刻趾肌中mTOR磷酸化增加3.4倍（p<0.01）,胫骨前肌中没有变化；6 h后趾肌和胫骨前肌mTOR磷酸化都保持较高水平。2003年Bolster^［6］研究了急性阻力运动后PKB/mTOR信号通道各时相的变化情况。结果表明在急性阻力运动后腓肠肌内PKB、mTOR、p70s6k的磷酸化在运动恢复后10 min达到了峰值，此时与对照相比PKB磷酸化增加282%、mTOR增加240%、p70s6k 增加292%。Leger等^［7］人发现,8周抗阻运动后mTOR磷酸化水平分别显著增加44%,在停止运动8周后,mTOR磷酸化水平保持在较高水平。分析上述引起骨骼肌mTOR来磷酸化及总蛋白水平上升的刺激因素发现，这些因素都与促进骨骼肌肥大相关。有关耐力运动对mTOR蛋白表达的影响甚少。有关耐力运动后骨骼肌mTOR水平研究很少，由研究表明老年小鼠3个月耐力运动后小鼠腓肠肌总mTOR水平增加^［8］，与上述结果一致，本研究显示２８ d常氧运动组mTOR蛋白表达显著上升，增加49.1%（p<0.05），表明耐力运动后骨骼肌总mTOR水平上升。分析上述的研究发现mTOR表达可能与运动方式由关，即能促进骨骼肌的肥大抗阻力运动可能是刺激mTOR水平的运动方式。我们所采用的运动方式虽然为大鼠跑台运动，但这种运动方式也能促进骨骼肌蛋白合成^［9］。

低氧暴露抑制机体蛋白质合成^［10］。低氧抑制蛋白质合成可能因为低氧暴露降低ATP浓度，导致蛋白质合成抑制；低氧训练对蛋白质合成代谢的影响的机制不太清楚，可能存在多种作用途径。吸入体内的氧浓度高低和低氧暴露时间的长短可能直接的调节骨骼肌蛋白质的合成。O2浓度对蛋白质合成非常重要，蛋白质的生物合成特别是起始阶段是一个非常耗能的过程，缺氧会导致肌细胞利用氧的减少，能量缺乏，使骨骼肌蛋白质的合成受阻。运动后的恢复期对蛋白合成代谢的影响至关重要，因为运动期蛋白分解加强合成抑制，而运动后恢复其蛋白合成加强，分解减弱。低氧运动后的的低氧环境可能导致恢复不充分影响蛋白合成。有研究表明低氧抑制蛋白翻译过程，而mTOR参与其中^［11,12］。但有关研究主要为细胞研究，即采用细胞培养的方法对生长中细胞mTOR信号的影响，而有关活体研究的海很少报道。我们研究对象为大鼠，结果显示大鼠低氧暴露28 d后骨骼肌mTOR表达下降86.6%，复氧mTOR表达显著升高，为410%（p<0.05），表明低氧暴露对mTOR表达有明显的抑制作用，研究结果与细胞实验的结果是相符的。本研究提示低氧对大鼠骨骼肌生长的抑制机制可能与mTOR信号变化有关。

目前还没有任何有关低氧复合运动对mTOR信号影响的报道^{［13，14］}。我们首次研究了低氧复合运动对mTOR表达的影响。结果表明28 d高住低训组mTOR蛋白表达明显下降，为92.1%（p<0.05），在复氧7 d后继续运动，mTOR表达又显著回升，上升267%（p<0.05）。研究结果表明高住低训显著抑制mTOR表达，提示低氧运动对大鼠骨骼肌生长的抑制机制可能通过抑制mTOR表达而调控蛋白的翻译过程。

4 结 论

耐力运动28 d后大鼠骨骼肌mTOR蛋白表达明显增加。28 d高住低训导致肌肉质量显著下降，复氧7天后肌肉质量显著回升，骨骼肌生长被明显抑制。28 d高住低训后骨骼肌mTOR蛋白表达明显下降，复氧7 d后又显著回升。提示高住低训调控骨骼肌生长的分子机制可能在于通过运动、低氧影响mTOR蛋白表达进而调控骨骼肌蛋白翻译过程。

参考文献：

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［4］ 贺道远,曾凡星.运动与骨骼肌mTOR信号传导通路研究现状［J］.中国运动医学杂志,2006,25(5):117-119.

［5］ Parkington JD, Siebert AP, LeBrasseur NK. Differential activation of mTOR signaling by contractile activity in skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2003,285: R1086-R1090.

［6］ Bolster DR, Kubica N, Crozier SJ, Williamson DL, Farrell PA, Kimball SR, Jefferson LS. Immediate response of mammalian target of rapamycin (mTOR)-mediated signaling following acute resistance exercise in rat skeletal muscle［J］. J Physiol, 2003,553:213-220.

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［13］ 刘霞，曾凡星，叶鸣.低氧运动对骨骼肌胰岛素受体亲和力的影响［J］.北京体育大学学报，2007，30（5）：633-635.

蛋白酶抑制剂 篇7

关键词：肾小球滤过率,血清胱蛋白酶抑制剂C,尿素氮,肾功能

血清胱蛋白酶抑制剂C (Cys C) 是一种低分子蛋白质, 是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。近年来, 较多研究发现血液中Cys C可能是一种更好的反映肾小球滤过率 (GFR) 的理想指标。现检测血液Cys C的浓度与肾小球滤过率 (GFR) 、尿素氮 (BUN) 、血清肌酐 (Scr) 、肌酐清除率 (Ccr) 进行比较, 报道如下。

1资料与方法

1.1 一般资料

选择2007年3月-2009年5月住院患者101例, 男48例, 女53例, 年龄8～71 (39.69±16.99) 岁, 均被证实有肾脏疾病。按肾功能分4组:肾功能正常组 (A组) 34例 (GFR>80ml/min) , 肾功能不全代偿组 (B组) 31例 (GFR 50～80ml/min) , 肾功能不全失代偿组 (C组) 27例 (GFR 20～50ml/min) , 肾功能衰竭组 (D组) 9例 (GFR<20ml/min) 。

1.2 方法

各组抽取静脉血, 应用全自动生化分析仪测定BUN、Scr。采用ELISA试剂盒测定Cyst C。采用Cockcroft-Cault公式计算Ccr, 计算GFR。

1.3 统计学方法

计量资料以$\overline{x}\pm s$表示, 组间比较采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

各组Cys C、BUN、Scr、Ccr、GFR检测结果见表1, 各组Cyst C、Scr异常情况见表2。

注:与D组比较, *P<0.01;与C组比较, #P<0.01;与B组比较, △P<0.01

注:与D组比较, *P<0.05, #P<0.01;与C组比较, △P<0.05, ▲P<0.01;与B组比较, ☆P<0.01

3讨论

应用GFR测定肾功能是精确的标准, 但限于多种原因, 未能应用于临床。用Scr或Ccr来评价GFR, 但由于人体肌肉量、代谢、年龄以及肾脏病严重时肾小管能部分分泌Cr等情况, 影响血Scr浓度进而影晌其精确性。为此, 寻找新方法来测定肾功能以利于临床诊断, 是众所关心的问题。Cyst C相对分子质量较低, 以恒定速率释放入血, 完全从肾小球滤过, 在肾小管中几乎完全被重吸收和降解, 肾小管也不分泌Cys C, 所以血清中的Cys C的浓度主要由GFR决定, 且不受性别、饮食、炎性反应、肌肉以及感染等因素的影响[1], 可以作为反映肾小球滤过功能的指标。现在有报道认为Cys C是反映肾脏功能受损更早更好的指标[2], 本文的数据分析也说明此点。

实验结果显示:血清Cyst C逐渐升高反映GFR的降低, Cyst C与GFR有直线关系, 呈负相关。肾功能损害早期检出GFR下降的灵敏度Cyst C优于Scr。因此, 检测Cyst C浓度对于发现早期肾脏功能损害是非常有价值的。总之, 血清Cyst C浓度是临床上评估GFR的可靠、敏感的指标, 其测定方法操作简便, 重复性良好, 目前受到广泛地推荐。

参考文献

[1]李玉艳.胱抑素C在临床中的应用进展[J].国际检验医学杂志, 2006, 27 (9) :812-813.

蛋白酶抑制剂 篇8

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C, Cys C) 是一种低分子量分泌性蛋白质, 所有有核细胞均可合成并很快分泌到细胞外, 无组织特异性, 可分布于肺、肝、肾、胃、肠、胰及胎盘等几乎全身所有脏器组织, 在脑脊液和精液中浓度最高, 受“管家基因”的调节, 产生速率恒定, 最重要的生理功能是参与细胞内外蛋白水解的调控, 保护细胞免受不适当的内源性或外源性蛋白酶水解。目前Cys C的检测方法很多, 包括单向免疫扩散法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法、放射免现自动化分析。

2 Cys C与肾功能

2.1 一项新的肾功能检测指标

理想的估计肾小球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR) 的内源血清物质应该具备以下特性:以恒定速率释放入血流, 不受年龄、性别和一些病理状态的影响, 不与蛋白质结合;通过肾小球自由滤过;不被肾小管重吸收入血或分泌;肾脏是唯一排泄途径。Cys C产生速率恒定, 不受性别、年龄、肌肉质量、体表面积、饮食、炎症、肝功能及血脂等因素的影响, 血清中的Cys C几乎全部由肾小球滤过, 不被肾小管重吸收和分泌, 在近端肾小管上皮细胞被分解代谢。因此血清Cys C是诊断早期肾功能损害较理想的标志物。Dharnidharka等[1]总结了46篇有关Cys C研究论文的荟萃分析, 表明其与GFR的相关性、诊断GFR下降的灵敏度、特异性均明显优于肌酐 (creatinine, Cr) 。

2.2 血清Cys C水平的影响因素

由于Cys C受“管家基因”的调节, 生成速率恒定, 目前仅确定少数情况对血清Cys C水平有影响。大量糖皮质激素升高血清Cys C水平, 而中少量糖皮质激素似乎不改变血清Cys C水平。另外, 有报道甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退改变血清Cys C浓度, 因此, 当Cys C作为肾功能标志物时可能要考虑甲状腺因素。甲状腺功能对血清Cys C水平的影响仍是反映GFR的改变, GFR随着基础代谢率改变。

2.3 Cys C与药物剂量调整

调整通过肾脏排泄药物的剂量要依据肾功能的下降程度。因此, 正确估计患者的肾功能以适当调整药物剂量是非常重要的。肌酐清除率 (creatinine clearance rate, Ccr) 和GFR的预测公式广泛应用, 然而, 以往的研究表明用血清Cr浓度作为老年人肾功能的标志时常常高估了肾功能。这会致使临床用药时给予不必要的高药物剂量, 这样治疗成本升高并且可能引起不良反应。因此, Cys C更适合调整主要通过肾脏清除药物的剂量。

3 Cys C与心血管疾病

心血管疾病是目前致死率最高的疾病之一。近年关于血管重构的酶学已逐渐成为研究的热点, Cys C作为其中重要的一种, 在心血管疾病的发生、发展中起着重要的作用。

3.1 Cys C与高血压病

高血压病会引起肾功能损害, 其发生率随病程长短呈逐年增高趋势, 高血压病患者中轻度肾损害较常见, 但现用的肾功能检查指标不能发现早期肾损害。Bhavasar[2]对866例高血压病患者的血清Cys C和Cr进行检测, 得出高血压病患者血清Cys C增高而Cr正常者在所有高血压病患者中所占比例达24.1%。所以, 通过检测高血压病患者的血清Cys C有助于发现血清Cr正常的早期肾功能损害。Watanade等[3]调查研究了血清Cys C水平与原发性高血压患者肾脏、心脏和血管等终末器官损害的关系, 60名原发性高血压患者参与了该研究, 结果显示血清Cys C与24h平均收缩压相关 (r=0.308, P=0.0167) , 与左心室质量指数相关 (r=0.528, P<0.0001) , 与血管内膜-中膜厚度相关 (r=0.539, P<0.0001) , 证明了血清Cys C水平是原发性高血压患者终末器官损害的早期指标。

3.2 Cys C与冠心病

目前基础研究证明动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程, 发病机制涉及细胞外基质降解与血管壁重构。炎症可刺激血管平滑肌细胞分泌组织蛋白酶S、K等, 使这类具有促弹性组织离解特性的半胱氨酸蛋白酶在动脉损伤处过度表达。最近越来越多的研究发现, 在血管平滑肌细胞中有该组织蛋白酶抑制剂Cys C的表达, Cys C可通过人类多核细胞趋化性的抑制而在人类免疫防御中起作用。然而在动脉粥样硬化及腹主动脉瘤的损伤处Cys C的表达则严重减少。为了以蛋白酶/抗蛋白酶比例失衡的观点评价血清Cys C在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用, 董巧玲等[4]探讨了血清期血清Cys C水平 (0.78±0.15) 与不稳定型心绞痛 (0.89±0.22) 、对照组 (0.84±0.21) 相比明显降低 (P=0.028) , 但急性心肌梗死发病1周后 (1.28±0.20) 接近正常, 甚至有所增高 (P=0.04) 。急性心肌梗死患者早期血清Cys C浓度的显著降低, 在一定程度上可为临床诊断急性心肌梗死提供参考。

另外, 在动脉粥样硬化中, 可以发现全身性的活性转化生长因子 (transforming growth factor-β, TGF-β) 减少, 且损伤局部对有活性的TGF-β有依赖性, 这可能解释为什么在损伤局部Cys C浓度较低, 并且通过TGF-β的治疗可以刺激Cys C的分泌, 从而与组织蛋白酶的降解作用相抗衡, 并可以抑制动脉粥样硬化过程的进展。这就引发了临床对TGF-β在心血管疾病中的应用产生极大的兴趣, 有望成为动脉粥样硬化治疗的新方法。TGF-β能抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞的迁移和增殖, 具有抑制动脉粥样硬化过程的特征。直到目前为止, TGF-β是唯一得到证明能刺激血管平滑肌细胞中Cys C转录和分泌的细胞因子, 有人推测可能TGF-β的抗动脉粥样硬化作用归结于Cys C产生的增加, 从而恢复早期动脉粥样硬化病变中组织蛋白酶和它们主要抑制剂之间的平衡。

3.3 Cys C与动脉瘤

如前所说, Cys C在血管损伤后出现血清水平降低, 进一步的研究还发现其浓度与疾病的严重程度呈负相关。Shi等[5]通过超声法观察122例患者颈动脉内膜-中膜厚度及腹主动脉直径, 同时采用免疫染色法与免疫杂交法测定了血清Cys C的水平, 结果发现血清Cys C水平与腹主动脉直径呈负相关, 而与内膜-中膜厚度无相关性, 经过体表面积校正后, 两者负相关关系仍然存在。Lindholt等[6]对151例腹主动脉瘤患者进行了接近3年的随访, 测定了其中142例患者血清Cys C、Cr和C-反应蛋白水平 (C-reactiveprotein, CRP) , 发现血清Cys C的水平与腹主动脉瘤的扩张程度呈负相关 (r=-0.22) , 经年龄、吸烟、舒张压、肾功能、C-反应蛋白水平和腹主动脉瘤瘤体大小校正后, 这种负相关关系仍然存在, 提示可能由于缺乏Cys C导致组织蛋白酶相对占优势, 加速了动脉瘤的进展。这些研究表明了半胱氨酸蛋白酶/蛋白酶抑制剂之间的平衡在动脉瘤形成中起着重要的作用。

3.4 Cys C的预测因子作用

近年来, 有研究发现Cys C对某些心血管疾病的发生发展及预后可能有预测作用。

Luc等[7]开展了一项有关Cys C与冠心病相关性的前瞻性调查研究, 共纳入了9758例50~59岁的非冠心病人群为研究对象, 研究终点为急性心肌梗死、心绞痛发生、心源性死亡, 随访5年期间159例发生急性心肌梗死或心源性死亡, 154例发生心绞痛, 结果发现Cys C水平跟第一次缺血性心血管事件明显相关, 在纠正了传统的冠心病危险因素 (包括年龄、高血压、糖尿病、吸烟、体重指数、血脂) 之后这种相关性仍然存在, 但是在加入了CRP这一因素后这种相关性被弱化;Johnston等[8]曾在健康成年人群中用高敏感性分析仪测量时发现, 轻度升高的血清Cys C和CRP水平之间成正相关, CRP轻度升高正是成人及儿童的动脉粥样硬化和慢性肾功能衰竭相关的慢性炎症状态的特征, Cys C应该参与了动脉粥样硬化的炎症过程。Koenig等[9]则对1033例30~70岁的冠心病患者开展另外一项较大规模的研究, 随访33.5个月, 对比Cr、Ccr、Cys C对第二次冠心病事件发生率的预测价值, 结果发现对出现第二次冠心病事件的患者中仅有Cys C水平与之明显相关, 多因素回归分析表明高Cys C水平可以作为冠心病患者再次发生事件的一个预测因素。

Jernberg等[10]对急性冠状动脉综合征 (acute coronary syndrome, ACS) 人群进行随访调查研究, 以评价Cys C对ACS预后的临床价值, 该研究纳入726例以急性胸痛为症状入院的可疑和确定的ACS明显相关, 提出临床单纯检测Cys C水平对ACS分层有较高的临床价值。Shlipak等[11]开展了另外一项共纳入4637例老年人的队列研究, 结果表明Cys C水平可以作为一项独立于性别、年龄等危险因素之外的预测高龄心血管疾病患者全因死亡率的指标, 同时其对肾功能损伤预测的敏感性明显优于Cr。另外ACS患者肾功能不全的发生对其预后有很大影响, 但是目前Cr和GFR值检测肾功能不全的不敏感性限制了它们作为预测因子的价值。Suwaidi等[12]一项荟萃分析纳入了全球4个大型ACS研究共37925个试验样本, 发现合并肾功能不全的ACS患者跟更高的死亡率和非致死性心肌梗死的发生明显相关, 而Cys C水平正是反映肾功能损伤的一个敏感指标。这可能是Cys C水平可以作为一项ACS患者预后判断指标的重要原因之一。

心力衰竭是多种心血管疾病的最后归宿和主要杀手, 近年来有关Cys C水平对心力衰竭发生及预后的预测价值的研究报道也很多。Shlipak等[13]对高龄心衰患者前瞻性调查, 随访平均6.5年发现Cys C水平每增加0.35mg/L, 心衰患者的死亡率就增加31%, 可以作为该人群预后判断的一种新的有力指标。Lassus等[14]一项关于Cys C水平和急性心衰的研究发现, 与传统预测冠心病患者发生急性心衰的指标相比, Cys C水平大于1.30mg/L可以作为预测患者未来12个月内发生急性心衰或者死亡的一项很有价值的生化指标。因此, Cys C水平跟心衰的关系其实也是Cys C水平可以作为其对多种心血管疾病预后判断的一项指标的机制所在。

4 总结

血清Cys C是一种较理想的评价GFR的指标, 目前其检测分析已实现全自动化且操作简便, 有希望在临床得到广泛应用。Cys C参与了心血管系统疾病诸多的病理、生理过程, 它的作用机制涉及抗炎、抑制酶与激素前体的活性等, 而且由于它产生的恒定性, 有可能在某些心血管疾病中成为诊断与检测的分子指标。当然, Cys C与心血管疾病的关系还需要更深入的研究, 以进一步明确其作用的确切机制。

摘要：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一种低分子量的肾小球滤过率内源性标志物, 大量研究表明它在体内产生速率稳定, 影响因素极少, 是反映早期肾小球滤过功能受损的一项较理想的指标, 近年来研究发现它在指导许多心血管疾病的诊断及治疗中有潜在的临床意义。

蛋白酶抑制剂 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

实验组选择本课题组2006～2008年使用二甲基苯并蒽(DMBA)涂抹金黄地鼠舌体建立的舌癌模型存档标本,其中涂抹4、8、12、16、20、24周各为一组,每组5例,共计30例;将上述标本切片行HE染色,在显微镜下观察。确定原位癌11例,进展期舌癌19例(包括浸润癌13例,转移癌6例);有淋巴结转移者17例,无淋巴结转移者13例。每例均按癌巢大小取取癌中组织(肿瘤中心区)、癌周组织(肿瘤边缘区);对照组取上述组织块中的正常组织各1块,共计30例。

1.2 试剂

兔抗人MMP-1、TIMP-1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;SP超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

HE染色法,光镜下观察切片,确定组织的病理分级:原位癌、浸润癌、转移癌。应用ABC免疫组织化学染色方法分别检测舌癌标本各取材部位中MMP-1、TIMP-1的定位及表达情况。

1.4 结果判断

MMP-1、TIMP-1均采用半定量积分法:以胞质内出现黄色颗粒状物质为阳性,根据肿瘤细胞胞浆染色的程度及染色细胞百分率进行评分:基本不着色者为0分;着色淡黄色为1分;棕色为2分;深棕色为3分。着色细胞占计数细胞百分率:≤5%为0分;6%～25%为1分;26%～50%为2分;≥51%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘,为MMP-1、TIMP-1表达强度积分。≤1分为阴性(-);2～3分为弱阳性(+);4～5分为中等阳性(++);≥6分以上为强阳性(+++)。免疫组化ABC法进行结果判断,用已知阳性切片作阳性对照,以PBS代替一抗作空白对照,以正常血清代替一抗作阴性对照。

1.5 图像分析

采用image-pro plus全自动图像分析系统,观察、检测以上2种染色切片,在200倍放大下随机选取5个测定域,分别测定MMP-1和TIMMP-1表达的数密度(目标数/统计场面积)[2]。

1.6 统计学方法

所得数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差表示,等级资料采用秩和检验。计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-1和TIMP-1蛋白在舌癌黏膜固有层中的表达

MMP-1在舌癌黏膜固有层的阳性表达率为90.0%(27/30),其中(+++)表达为43.3%(13/30),(++)表达为26.67%(8/30),(+)表达为20.0%(6/30),其阳性表达主要位于细胞浆内。TIMP-1在舌癌黏膜固有层的阳性表达率为86.7%(26/30),其中(+++)表达为33.3%(10/30),(++)表达为26.7%(8/30),(+)表达为26.67%(8/30),其阳性表达主要位于细胞浆内。MMP-1和TIMMP-1蛋白在实验组中的表达与对照组(阳性率分别为10.0%和13.33%)相比,差异有高度统计学意义(P<0.01)。在癌中、癌周组织中MMP-1和TIMP-1蛋白的表达比较,差异均有高度统计学意义(均P<0.01)),见表1。

2.2 MMP-1和TIMMP-1蛋白表达的关系

随着周龄的增加,舌癌标本组织中的MMP-1和TIMP-1的表达均增强,二者与舌癌大小无关(P>0.05),而与舌癌分化程度、有无转移等差异有高度统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表2。

3 讨论

在生理情况下,细胞外基质(ECM)在维持正常组织结构与功能及细胞生长、分化过程中起到非常重要的作用。大量研究表明,它不再被认为是静止不动的,而是处在不断代谢更新、降解重塑的动态平衡中。近来在研究有关ECM合成和降解的代谢平衡调节中,引人注目的是MMPs和TIMPs两个酶系统的作用。ECM的主要成分由胶原纤维和弹性纤维构成,MMP-1在这一过程中起着分解胶原纤维的作用。TIMP-1除了是MMP-1的天然抑制剂外,还对所有类型MMPs均有抑制作用。在生理情况下,它可参与细胞外基质的改建及影响细胞生长[3]。本实验对照组的MMP-1、TIMMP-1含量差异无统计学意义(P>0.05),亦证明了二者同时存在于细胞的生理情况下,可参与细胞外基质的改建及影响细胞生长。

MMPs和TIMPs与肿瘤的发生、发展密切相关:大部分肿瘤中均可检测到MMPs和TIMPs的表达异常。有研究表明,在头颈部鳞癌中,肿瘤细胞可通过分泌MMPs降解细胞外基质,促进肿瘤的侵袭转移并影响患者的转归和预后[4]。本研究从表1中可发现MMP-1随着舌癌的进展,其癌中心区域高表达性愈来愈高(P<0.01),说明舌癌发生转移的趋势越来越高;当MMP-1表达为(++)～(+++)时,癌周围区组织的MMP-1表达比癌中心区表达要高,这是由于随着舌癌的进展,癌体积逐渐变大,癌中心区域会产生缺血性改变,中心区细胞缺血,减少分泌MMP-1的同时,还会分泌缺氧诱导因子(HIF-1)等细胞因子,诱导新生血管形成[5],而新生血管的发生必须侵及基底层到达癌体,此时癌周围区域受到缺血、细胞因子等因素刺激会使MMP-1分泌就会迅速升高,以溶解胶原纤维,促使新生血管的形成[6]。MMP-1增多的同时,TIMP-1也会相应增多,这是机体的应答机制,原位杂交也发现MMP的mRNA主要分布在肿瘤边缘的间质细胞中,或同时分布在瘤细胞和间质中[7],造成这种不同分布的机制可能就是由于肿瘤血管生成的需要,也说明MMP-1具有促血管生成的作用。但是从表1来看,虽然MMP-1和TIMP-1皆升高,但是后者的升高的程度较小。这主要是由于MMP家族有激活的级联效应[8],导致20周以后MMP-1表达明显升高。通过表2可以发现MMP-1和TIMP-1的表达与肿瘤大小无关(P>0.05),但与肿瘤的淋巴结转移、分化程度等具有密切联系(P<0.01),这是由于MMP-1参与破坏基底层的胶原纤维,以利于舌癌的转移,这与低分化细胞分泌高表达的MMP-1观点相一致[9]。Gunduz等[10]通过研究口腔纤维化,发现TIMP-1在纤维化的病损比正常高,可能MMP-1会使细胞外基质的合成和堆积增加,高表达的TIMP-1对MMP-1的抑制作用,从而破坏MMPs与TIMP的动态平衡,TIMP-1在口腔黏膜下纤维化的成纤维细胞中表达,随着口腔黏膜纤维化的严重程度加大而增加,因此TIMP-1可能与口腔黏膜纤维化的病理过程有关[11]。MMP-1和TIMP-1在舌癌的发生、发展过程中所起的作用不仅是通过降解细胞外基质和基底膜,促进肿瘤侵袭转移的,而且还可以促进肿瘤组织中新生血管的形成,增强了肿瘤侵袭能力和转移能力,抑制MMP-1具有抑制肿瘤侵袭转移和血管生成的双重作用。

饲料中胰蛋白酶抑制剂的抗营养作用 篇10

1 胰蛋白酶抑制剂的分布及分类

胰蛋白酶抑制剂, 又被称作抗胰蛋白酶因子, 分子式为C284H432N84O79S7。 是一种具有生理活性功能的小分子量的蛋白质。 胰蛋白酶抑制剂在豆类植物中分布最为广泛, 在谷类作物、油料作物以及一些其他作物中也有分布, 散布于这些作物的各个部位, 主要存在于植物的贮藏器官, 如种子、块根和块茎中。 但在作物的种子中存在最为广泛。

大豆胰蛋白酶抑制剂是目前被研究探讨得最多的胰蛋白酶抑制剂。 其根据氨基酸序列同源性分为KTI类抑制剂和BBI类抑制剂。 KTI类抑制剂分子内只有一个活性中心, 只对胰蛋白酶直接地、单一地起作用;BBI类抑制剂分子内有两个活性中心, 可分别与胰蛋白酶和糜蛋白酶结合。

2 胰蛋白酶抑制剂的抗营养作用

2.1 降低胰蛋白酶的活性胰蛋白酶抑制剂的本质为可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽。 胰蛋白酶抑制剂可以与小肠液中胰蛋白酶、 糜蛋白酶结合生成无活性复合物, 消耗和降解胰蛋白酶, 导致胰蛋白酶的活性降低甚至丧失, 直接影响动物体内蛋白质的消化和利用过程。 蛋白质是一切生命的物质基础, 蛋白质的消化和利用受阻, 动物体将无法利用蛋白质来维持正常的生长发育和进行新陈代谢。

2.2 造成动物的胰腺代偿性增大因胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂结合后随粪排出体外而减少, 小肠中胰蛋白酶数量下降, 刺激了胆囊收缩素分泌量增加, 促使肠促胰酶肽分泌增多, 反馈引起胰腺机能亢进, 促使胰腺分泌更多的胰蛋白酶原补充到肠道中。 胰蛋白酶的大量分泌造成了胰腺的代偿性增生和肥大, 导致消化吸收功能失调和紊乱, 严重时还出现腹泻。

2.3 影响动物体代谢及生长胰蛋白酶内有丰富的含硫氨基酸, 当出现这种内源补偿性分泌和排泄后, 必然会造成体内含硫氨基酸内源性散失, 从而加剧了因豆类饼粕含硫氨基酸短缺而造成的体内氨基酸失调或代谢不平衡, 使动物生长受到阻碍, 甚至发生疾病;此外, KTI还能明显影响动物的生长, 影响氮的消化、吸收和沉积、饲料转化率及动物的增重效果。KTI因为引起胆囊排空速度增加, 而降低脂肪的吸收。

3 饲料中胰蛋白酶抑制剂的去除

3.1 热处理法热处理法是当前应用最广泛的方法之一, 失活操作方便:如蒸汽处理, 加水蒸煮, 干热烘焙, 介质加热, 微波辐射, 微粒化处理和挤压蒸煮等。目前已知的大多数胰蛋白酶抑制剂本质为蛋白质或其结合体, 因此在经过一定程度的加热后可使其变性失活, 从而消除其在饲料中对动物的影响。加热的温度、时间、饲料粒度大小和水分含量等因素都会影响胰蛋白酶抑制剂因受加热处理而失活的程度。

热处理也存在着一定的缺陷, 比如长时间高温加热会降低饲料中的蛋白质的营养价值, 而且一些抗营养因子抗热性还很强, 不能够使其完全失活。

3.2 化学处理法研究表明, 通过使用一些化学处理方法, 可使大豆中的胰蛋白酶抑制剂灭活。 此类方法的作用机理一般都是利用无机化学试剂破坏胰蛋白抑制剂分子结构中的的二硫键, 从而改变胰蛋白酶抑制剂的分子结构而氨基酸组成却不发生明显变化, 从而达到灭活的目的。 但是化学处理法存在化学试剂残留的问题, 对原料存在不良影响。

3.3 酶处理法研究人员尝试去用某些特异性酶来处理大豆中的胰蛋白酶抑制剂, 已有一定程度的效果;也有研究人员尝试用枯草杆菌蛋白酶去对脱脂大豆粉进行水解, 但是实验结果总是时将胰蛋白酶抑制剂与其他蛋白质同时水解。

酶处理法也存在一定缺陷: 由于蛋白酶专一性不同, 不同蛋白酶对大豆胰蛋白酶抑制剂钝化效果差别很大;同时由于蛋白酶来源及容易失活, 因而其应用成本是主要问题。 因此, 用酶处理法来去除胰蛋白酶抑制剂的处理方法目前仍处于探索阶段, 尚未应用于日常生产中, 有待继续发展。

4 小结

综上所述, 饲料中的抗营养因子胰蛋白酶抑制剂严重影响动物对蛋白质的消化利用, 同时引起对动物的生长抑制和使某些动物引起胰腺肥大问题。 我们应结合对胰蛋白酶抑制剂的去除方法并通过实践应用, 来消除饲料中胰蛋白酶抑制剂的抗营养作用。

关键词：饲料,胰蛋白酶抑制剂,抗营养作用

参考文献

[1]于炎湖.饲料中胰蛋白酶抑制剂的研究状况[J].饲料工业, 2001, 6:1-4.

[2]金蓓, 等.大豆胰蛋白酶抑制剂研究概况[J].粮食与油脂, 2005, 6:3-6.