分离纯化技术

关键词： 槲寄生 纯化 多糖 活性

分离纯化技术（精选十篇）

分离纯化技术 篇1

关键词：分离纯化,课程,设计

行业发展产生人才需求,课程组教师经过对重庆市生物制药行业人才需求进行调研,发现企业需要大量的高技能的生物制药工艺员。在调研的过程中发现,生物制药生产过程由生物反应、分离纯化、药物制剂岗位群组成。分离纯化在生产过程中的主要作用是把反应液中的绝大多数杂质除去,避免药物在使用过程中出现副作用和药害。由此可见分离纯化是生产安全无毒副作用药品的必经过程,开发生物制药分离纯化技术这门课程是非常有必要的。

1 课程定位

1.1 课程定位

为了使课程体系能够满足生产过程需要,课程组按照从典型工作任务到行动领域的转换,从行动领域到学习领域的转换,再将学习领域设置为学习情境,建立了生物制药技术专业课程体系。同时基于认识论和方法论,按照产品生产流程先后顺序进行学习领域的序化,构建了生物制药技术专业课程体系。

专业课程体系是从生产过程中得来的,要对课程进行定位,就要知道课程在生产过程中发挥什么样的作用。整个生物制药生产过程中,通过上游和中游解决原料来源问题,而原料要变成最终符合药典要求、可以销售的药品必须经过分离纯化,将原料中的绝大多数杂质除去。由此可见,分离纯化是实现从原料到产品的一个必须的环节。另一方面,在实现产业化的过程中,下游过程是生物制药实现产业化的关键和瓶颈。由此可见,分离纯化技术不论是在工艺方面还是实现经济效益方面,对于企业来讲都是至关重要的。因此我们将本课程定位为生物制药技术专业的核心课程,培养分离纯化工艺员。

1.2 与其他课程的相关性

在整个专业课程体系中,生物制药分离纯化技术是前修专业基础课、后继核心专业课衔接的桥梁,前修课程主要有生物化学、微生物学、生物制药设备、发酵技术等,后继课程有生物制药工艺、毕业设计、顶岗实习等。

2 课程教学目标

知识目标:能够熟悉常用生物药物分离纯化技术及原理;掌握关键设备的构造、原理、使用及维护要求;了解常用药物的理化性质。

技能目标:能读懂产品提取工艺流程;能看懂主要设备简图,平面布置图;能正确分析并对原料液进行预处理;能进行工作溶液基本计算、称量和配制;能熟练应用各种常用分离纯化技术。

素质目标:具有严谨求实、自律、刻苦向上等良好的职业素质;具有拓展、创新等可持续发展的能力;具有获取信息、语言表达、团结协作、社会交往等综合素质。

3 教学内容

3.1 客观性

从专业培养目标出发,对重庆市生物制药行业生产过程进行分析,归纳出了典型工作任务,分离纯化岗位所需的知识、技能和素质,同时结合职业资格标准,选取能够有针对性的训练岗位工作能力的教学情境。选取的课程内容是从分离纯化岗位实际出发,具有很强的适用性。

3.2 合理性

针对高职学生的思维特点,将生产过程中的真实工作任务转化成了学习型工作任务,将岗位所需的理论知识分散到了具体的学习情境中,使学生在真实情境下进行学习,在完成典型任务的过程中掌握相关知识,激发学生的兴趣和思维,也就是说岗位需要什么样的理论知识,学生就学什么样的理论知识,真正做到了理论知识必须、够用,强调实践技能的培养;理论知识的总量并没有发生变化,只是排序的方式发生变化。教学内容从岗位实际操作出发,突出了操作技能的训练,在课时安排上,理论与实践课时比例1:1。

3.3 实用性

经过对整个生物药物生产过程进行调研,分析得出生物药物的分离纯化工艺流程都是从预处理工段开始,经过初步纯化、高度纯化到成品加工结束。课程组设计的学习情境,每一个都来自于实际生产过程中完整的工艺流程,在相同的工艺流程重复了几遍之后,学生对生物制药分离纯化工艺流程将会非常清楚。

不同产品其工艺流程虽然相同,但是在相同的工段,却采取了不同的分离纯化技术,将几个学习情境中相同工段的技术综合起来,就能覆盖这个工段的大部分技术。四个工段的技术综合起来,学生就能掌握整个生物制药分离纯化技术。由此可见,不同产品的分离纯化,只是将四个工段中的技术进行不同的组合。学生毕业后,即使从事的是不同产品的分离纯化,也能够轻松应对。

为了使学生与生产过程进行零距离接触,课程组在教学内容中引入岗位职业技术标准,生产过程中每个分离纯化岗位都有操作规范,由此构成了分离纯化岗位职业技术标准。按照规范进行技能训练,增强学生的适应能力。

4 教学设计

课程组的教学设计理念是:校企合作共同开发课程,使学习内容与工作内容一致;以工作任务为中心构建课程内容,使学习过程与工作过程一致;教学实施过程中突出学生的主体地位,强调“能力为本”,使学生学会工作。

4.1 教学整体实施方案

教学内容的组织和安排遵循学生的认知规律和职业成长规律,按照认知实习—完成学习型工作任务—完成岗位工作任务的顺序来进行。使学生的职业能力和职业素养在由认知到完成真实的工作任务过程中逐步提高。其中校内学习情境的组织按照由简单到复杂的方式进行序化,同时兼顾所涵盖的生产岗位呈递进和包含的关系。

4.2 理论与实践教学实施方案

突出学生的主体地位。完全按照企业中试的生产过程来设计,分为任务组织、任务策划,任务实施,结果评估四个阶段。

任务组织阶段,教师下发工作任务书,通过录像、实物或引导性提问激发学生学习兴趣,激励学生自学。任务策划阶段,学生通过查阅资料、小组讨论的方式制定生产方案,并以主题报告的形式展示生产方案,教师对生产方案进行评审,提出整改意见,学生修改方案。任务实施阶段,各小组自主实施生产,教师适时引导,提供咨询与帮助。任务实施后,对结果进行评估,通过自评、互评分析产品质量,教师根据生产中出现的问题组织学生讨论,解决问题,并对各学生的表现给出教师评价。在实施过程中,要设计教师教学方案和学生学习方案两部分内容。完成本课程所有学习情境后,学生形成了工作对象信息收集、选择工作方法和手段,制定工作路线,协调配合完成工作任务,检查工作过程结果,评价工作效果等固定不变的方法能力,形成了与未来职业要求对接的能力。

4.3 教学效果的评价方案

课程实施结束后,学生对课程的掌握情况,从知识、技能和综合素质三方面来进行评价。

具体在实施过程中,知识掌握程度采用终结考核的方式来进行;技能评价和综合素质评价分解到了学习情境中,教师依据学生在完成工作任务过程中表现出来的实训操作技能熟练程度给予技能评价,对学生在完成工作任务的过程中表现出来的团结合作精神以及协调配合能力给予综合素质评价。通过这样的评价方式,综合考查了学生的专业能力、方法能力和社会能力。

5 教学方法与手段

5.1 教学方法与运用

教学过程中,不同的阶段,采用不同的教学方法,任务组织阶段,主要采用任务驱动法和讲授法;任务策划阶段,采用小组讨论法,任务实施阶段采用角色扮演法、演示法等;结果评估阶段采用引导法、互评法、案例分析法等教学方法。通过这些教学方法,培养学生团队协作精神、实际工作的能力,也锻炼了学生获取信息的能力,发现问题,解决问题的能力。

5.2 教学手段与运用

课件制作方面,利用各类素材,如图片、Flash动画,操作录像等。采用真实设备图片、设备工作原理动画展示,把枯燥的工作原理、复杂的设备结构表现为动态变化过程。同时利用课程网络资源组织教学,建立了比较丰富的教学资源。为学生的自主学习创造了良好的教学平台。

6 教学条件与满足

6.1 实训条件

本课程拥有分离提取实训室和生物制药工艺实训室等实训场所,拥有分离纯化岗位所需的大部分仪器,可满足校内教学需求。课程组一直注重校外实习基地的建设,自2005年以来先后在重庆市5家行业企业建立了校外实习基地,为学生提供岗位训练和生产环境,在认知实习、顶岗实习、毕业就业方面发挥了重要作用。

6.2 师资条件

进行本课程的教学,需要有具备生物化工、生物化学、生物技术、药物分析等学科知识的师资队伍,经过多年建设,课程组建立了一支爱岗敬业、综合素质高、结构合理、能够满足教学需求的团队。

7 课程建设

聘请行业专家作为课程顾问,共同开发了生物制药分离纯化技术课程,编写出学生用教材,按照生产过程要求组织教学内容,具有显著的职业技术教育特色。同时课程在建设过程中,建立了比较完整的教学资源,课程标准、电子教材、电子教案、电子课件、习题库、学习指南、视频课程等均已上网,给校内外学生创建了一个良好的平台。

8 结语

分离纯化技术 篇2

1.1课程设计理念

结合学生情况、教学资源等实际，课程设计上力求达到可操作性、科学性和规范性。以职业岗位需要的知识技能为课程设计的依据，按照企业实际药物分离纯化生产过程进行教学，依次讲授基本原理、萃取技术、蒸馏技术、色谱分离技术、膜分离技术、固液分离技术、固相析出技术、干燥技术和电泳技术。合理的教学内容是实现教学目标的保证，药物分离与纯化技术课程涉及一些工程计算等工程性比较强的内容，学生可以把这些知识作为兴趣课后学习，而在课堂上要精选分离纯化基础原理、技术等教学内容，以“必需、够用”为原则，并且适当引入新技术，拓宽学生的视野。减少知识的抽象性，多采用实物、模型、多媒体等直观教学的形式，探索现场教学模式，提高教学效果。要为学生学习和掌握技能奠定必要、足够的理论基础，同时注意理论知识的把握程度，不一味强调理论知识的重要性和完整性，在淡化理论的同时根据实际工作需求培养学生的实践技能。

1.2积极引导启发鼓励

学生认识不到课程的重要性主要是因为没有明确的职业规划，对未来职业的具体工作过程不了解，意识不到课程内容在以后工作中的作用。适当给学生介绍药品生产工作岗位的具体任务流程，同时建立生产工艺技术与质量控制的概念，让学生认识到药物分离与纯化技术在整个制药过程中的关键性地位。在传授知识的同时还要注重培养学生良好的学习习惯，利用课后时间与学生接触，多去理解学生的感受，给予他们积极的鼓励和建议。

1.3合理导入适当拓展

上好课的前提是备好课，不仅要选用合适的教材，还要提前了解学生相关知识基础和理解接受能力，在课堂教学中要随时观察学生反应，以合理的速度引导学习，顺利完成教学任务。绪论作为教学的开始，是该课程的第一堂课，其教学效果不仅直接影响到教师后续的教学，也影响到学生对该课程的学习。绪论中对整个课程的导入很关键，以后讲授每个章节时对章节的导入也很重要，良好的导入能激发学生的兴趣，改善教学效果。与飞速发展的科学技术相比，教材的内容总是滞后的，教学内容不能局限于教材。教师要关注最近研究进展，把学科发展前沿的技术介绍给学生。还可以自己的科研经验作为教学素材，让学生了解科学的研究方法和过程。例如薄层色谱是实验室广泛应用的分离纯化方法，其原理、操作在课本中都会有详细的介绍，但在实际科研过程中会遇到很多问题，而这些问题的解决方法是在课本里面学不到的，教师可以把这些经验归纳出来，传授给学生。另外还要补充一些GMP的相关知识，从整体上介绍药物从研发到制成成品的过程，让学生有一个整体的认识。

1.4方法多样合理搭配

本课程理论深奥抽象，与日常生活关系不大，在教学中如果仅用语言和板书进行讲述，缺乏形象直观的展示，学生会对很多知识点理解困难，对学习失去兴趣。多媒体课件可以展示各种图片、动画、影像资料，比传统教学方式更为直观。它能使复杂、抽象的理论简单化、形象化，还能解决实验条件不足的问题，开阔学生眼界、拓宽知识面。由于教学资源的限制，实验室条件很难跟上先进仪器设备的发展，也不可能具备所有的制药机械，借助多媒体可以将新技术、新设备直观的展示给学生，展示完整的工艺流程，加深印象。但多媒体包含知识量大，授课速度快，学生注意力容易分散，所以多媒体不能代替传统教学方法。教师在用多媒体授课的同时用板书将知识点进行归纳，适当提问，有利于教师和学生之间的互动交流，控制授课节奏，给学生留出消化和吸收知识的时间。教学方式有很多种，要合理搭配，取长补短。

1.5适当举例激发兴趣

教材编写通常采用的是学术用语，如果整节课都进行原理性知识的讲解，很多学生会感到迷茫，课堂气氛会陷入枯燥、沉闷的状态。应该适当调整方式，联系日常生活、生产和科研，增强课堂学习的趣味性、实用性及先进性。这样不仅能够加深学生对相关知识的理解，为课堂教学增加活跃的气氛，也让学生认识到课程的重要性，激发学习积极性。在讲授每章节的内容时，为减少学生对新知识的陌生感，激发其求知欲，可以将教学内容与实际生活中的一些情景结合起来，将抽象的知识点变成学生感兴趣的内容。例如在讲授膜分离时，让学生看到实验室最常见也最简单的滤纸过滤；在环境保护方面，让学生了解如何用液膜法处理废水；为学生介绍在进行海水淡化时用到的电渗析技术；也给学生介绍海带（生物膜）富集碘的原因。

1.6重视实验校企结合药物分离与纯化技术是一门实践性很强的学科，学生要在实训实践中学习并掌握相关的知识与技能。但目前受实训学时和条件的限制，实验内容的安排多为验证性实验。学生只要按照教师给出的步骤按部就班的操作，无需思考就能得到结果，这种实训模式不利于学生培养解决实际问题的职业能力。在开展实训之前要鼓励学生自己查阅文献资料，设计实验过程，验证理论知识，提高学生实际动手能力和分析问题、解决问题及独立工作的能力。近年来新技术、新设备不断涌现，迅速渗透到生产中的各个领域。除了在课堂上给学生介绍企业岗位职责要求和最新的分离纯化技术信息之外，教师还应与企业技术人员密切合作，组织学生参观药品生产企业，让学生参与药品生产中遇到的实际问题，了解书本和实际生产上的差距，弥补书本知识的局限性，开拓学生眼界。

1.7过程考核发挥导向作用

传统的考核结果往往只考虑期末卷面成绩，这样不利于调动学生的积极性，很容易忽略学生在平时课堂中的表现和创新能力的培养。本课程的考核方式为：学生期末总成绩（百分制）=期末考试卷面成绩（50%）+课堂出勤及回答问题表现（20%）+小论文撰写（10%）+实训操作（20%）。考核方式从四个方面进行综合测评，不仅重视结果，更重视过程。小论文的撰写要求学生选择自己感兴趣的一种分离纯化技术，查阅文献资料，设计一个具体的方案，将这种技术应用到实际的生产中。另外要求学生对课程有所反馈，提出自己的意见和建议。

2.小结

猪肝组织核酸的分离纯化及鉴定 篇3

关键词:核酸;DNA;RNA;地衣酚显色法;二苯胺显色法

中图分类号:Q503;Q52文献标识码:A文章编号:1007-273X(2009)08-0007-03

核酸通常与蛋白质结合形成核蛋白存在于细胞中,是生命的基本物质之一,具有储存、传递生物体遗传信息的功能,也是蛋白质合成不可缺少的物质,在生物的生长、遗传、变异等生命过程中起着重要的决定作用。核酸分为两大类—核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。

核酸的基本组成单位是核苷酸,是由众多的核苷酸缩合而成的多聚核苷酸。核苷酸经过水解可以得到含氮碱、戊糖和磷酸。

真核生物基因组DNA和RNA广泛应用在动、植物的遗传育种基因图谱的构建、品种鉴定、物种形成和系统演化等方面的研究中,无论是基因工程,还是蛋白质工程,核酸分子都是这些技术应用所涉及的主要对象,所以DNA和RNA的分离与提取是分子生物学研究中重要的基本技术[1]。

1材料和方法

1.1材料

供试材料为冷冻的新鲜剪碎猪肝4g[2]。所用试剂为SC缓冲溶液:2.94g柠檬酸钠和9.0g氯化钠溶于1L蒸馏水(用盐酸调pH值至7.0);5% SDS溶液;地衣酚试剂:先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液,实验前以此溶液为溶剂配成0.1%地衣酚溶液;氯化钠;95%冷乙醇;氯仿;异戊醇。

1.2猪肝DNA和RNA的提取

1.2.1DNA的提取①取新鲜猪肝捣碎液,装入离心管,平衡,4 000r/min离心10min,除去上层;②下层加入SC溶液5mL混匀,同上离心,除去上层;③下层沉淀转移入三角瓶,加入SC溶液20mL,SDS溶液3mL混匀,5mL氯仿/异戊醇混匀,固体氯化钠2g边加边混,充分振荡30min,4 000r/min离心20min;④小心取出离心管,观察有3层,取出上层水相;水相加入等体积氯仿/异戊醇振荡10min,4 000r/min离心20min;⑤取上清,加等体积95%冷乙醇,边加边顺一个方向搅,玻璃棒上缠绕的DNA用少量80%乙醇洗一次,置小离心管于4℃冰箱中待用[3,4]。

1.2.2RNA的粗提①接上面的第一步,在上清中加入等体积的氯仿/异戊醇置于带塞烧瓶中振荡,冰浴30min;②将混合物转移至1.5mL EP管中,4℃、12 000r/min离心15min,将上清液移至另一EP管中;加异丙醇,在冰上放置15min,

3 000r/min离心10min,得到RNA沉淀[5,6]。

1.3核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色

D-核糖核酸+浓盐酸+地衣酚——反应显绿色

D-2-脱氧核糖核酸+酸+二苯胺——反应显蓝紫色

1.3.1 DNA显色1mL SC溶液溶解DNA,然后转移到50mL离心管中,用9mL 0.01mol/L NaOH溶液溶解,4 000r/min离心10min,上清转移到试管中备用。各取上述1mL DNA溶液于两只试管中,其中一只里面加入3mL地衣酚试剂,然后置沸水中20min,观察颜色反应;另外一只试管中加入2mL二苯胺试剂,60℃条件下反应1h,观察颜色反应。

1.3.2RNA显色将RNA沉淀用2mL蒸馏水溶解,然后转移至2只试管中,每只1mL。其中一只试管中加入3mL地衣酚试剂,然后置沸水中20min,观察颜色反应;另外一只试管中加入2mL二苯胺试剂,60℃条件下反应1h,观察颜色反应。

1.4核酸的定量和纯度测定

紫外分光光度法(此法要求核酸纯度很高,1个吸光度值相当于50μg/mL双螺旋DNA;除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测,A260/A280比值,纯的DNA为1.8,RNA为2.0,样品中含有蛋白质和苯酚时,A260/A280比值降低。);定糖法(DNA糖部分为脱氧核糖,RNA糖部分为核糖,分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法);定磷法(核酸的磷酸部分)。

1.4.1二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂,生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸,而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖,与二苯胺试剂反应生成蓝色物质,在595nm波长处有最大吸收(见图1)[5]。DNA在40～400μg范围内,光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。

1.4.2 DNA吸光度的测定①A260测定:以H2O作为空白,取上清测A260值后确定稀释倍数,使A260值在2.0左右(DNA此时的浓度约为100μg/mL。(由于二苯胺法的测定范围是40~400μg/mL DNA,所以DNA浓度如果太小会影响测定结果)。②A280测定:A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8,RNA为2.0。如果样品中混有RNA,则比值大于1.8;如果样品中混有蛋白质,则比值小于1.8。

所用的DNA溶液为前面提取后溶解的DNA样品。

1.4.3DNA标准曲线的制作和样品测定DNA标准曲线的制作加样见表1。

按表1加完各试剂后,充分混匀。于60℃水浴中保温1h,冷却后于595nm波长处以0管为空白调零,测定各管光密度(OD595)。以DNA的含量为横坐标,光密度(吸收值)为纵坐标,绘制标准曲线。(注:待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。)

1.4.4DNA含量计算 以样品的光密度,根据标准曲线计算出相对应DNA含量,并同紫外法测定的值进行比较。(注:二苯胺试剂具有腐蚀性,且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色,操作中应防止洒出;比色时,比色杯外面一定要擦干净。)

2结果与分析

2.1猪肝DNA及RNA的分离提取

2.1.1核酸分离的原则核酸存在于多种细胞,因此,分离方法复杂多样。因各种DNA、RNA含量的差异、核酸的纯度及量的要求不同,因此,在实验前应对所采用的方法有所选择。总的说来,核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上,利用苯酚等有机溶剂抽提(核酸溶于缓冲液,即水相),分离,纯化;利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀,收获核酸。

2.1.2DNA和RNA分离的基本原理根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离,然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白,使核酸释放出来,再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出,达到分离DNA和RNA的目的。

在0.14mol/L的氯化钠溶液中,RNA核蛋白溶解度大,而DNA核蛋白溶解度小;相反在1mol/L的氯化钠溶液中,DNA核蛋白的溶解度大,而RNA核蛋白的溶解度小,从而使DNA和RNA核蛋白分开。

2.1.3核酸分离的一般步骤①溶解细胞:溶解细胞的方法包括十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)加NaOH、蛋白酶和用超声波破碎等方法。②有机溶剂抽提:利用SDS溶液提取的目的是使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的。③沉淀:为了除去分离过程中残留的有机溶剂,常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸,再通过离心回收核酸,然后用80%乙醇洗涤沉淀,除去多余的盐,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。试剂盒:目前开发了许多商品化的核酸分离柱,可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA,其分离原理有的是利用核酸的分子量差异,有的是利用所需分离的核酸的特点将其特异性结合达到分离、回收的目的。④传统的酚、氯仿、异戊醇在抽提中的作用:a.酚:有效的使蛋白质变性,不能完全的抑制RNA酶的活性,能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH>7.8,以防止DNA分配到有机相。结晶酚要在182℃下重蒸去除醌类等氧化产物,这些物质能够引起磷酸二酯键的断裂或促进核酸交联。b.氯仿:纯酚的比重为1.07,有机相和水相有时很难分开。加入氯仿(比重为1.47)可以避免这一问题。同时,酚有时会微溶于水。可以用氯仿将水相中的酚去除。c.异戊醇:减少泡沫的产生。

2.2核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色实验

DNA脱氧核糖的显色反应中加地衣酚试剂的试管反应后呈茶色,加二苯胺试剂的试管反应后呈蓝色。反应机理是DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解,产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ酮基戊醛,后者与二苯胺试剂反应成蓝色化合物,其反应为:DNA→ω-羟基-γ酮基戊醛→蓝色复合物,所以我们的结果与理论是一致的,对于加入地衣酚的试管,我们认为地衣酚主要是与RNA发生反应,所以我们看到的茶色可能只是地衣酚加热后的颜色,或者是DNA溶液和地衣酚加热后的共同的颜色。

RNA核糖的显色实验结果表明加地衣酚试剂的试管反应后呈浅绿色,加二苯胺试剂的试管反应后呈黑色。RNA与浓盐酸共热时发生降解,产生的核糖又可转变糖醛,在FeCl3或CuCl2催化下,糖醛与3,5-二羟基甲苯(地衣酚、苔黑酚)反应形成绿色复合物,实验结果观察到为浅绿色,符合理论结果,颜色稍浅,可能是浓度过低,试液被稀释的结果,或者是酸度不够没有加催化剂的影响。对于加入二苯胺试剂的试管,我们认为二苯胺试剂主要是与DNA发生反应,所以我们看到的黑色可能只是二苯胺试剂加热后的颜色。

2.3核酸的定量和纯度测定

2.3.1DNA标准曲线的制作和样品测定按照表1的顺序加入样品反应得到DNA标准曲线样品测定的结果(见表2),以DNA的含量为横坐标,光密度(吸收值)为纵坐标,绘制标准曲线(见图2)。

2.3.2DNA含量的计算由图2所作的DNA标准曲线可知,DNA含量与OD595的关系为:

OD595=0.0022×c(DNA)浓度

实验中样品1为DNA原液,样品2为稀释1倍的DNA溶液。将OD595值0.274和0.174分别代入上面的公式,可求得样品1、样品2中的DNA含量分别为124.54μg/mL和79.09μg/mL。由紫外分光光度法得,1个吸光度值相当于50μg/mL双螺旋DNA,我们测得稀释一倍的DNA溶液吸光度值为1.734,所以其DNA含量为50μg/mL×1.734=86.7μg/mL,则原液DNA含量为86.7μg/mL×2=172.4μg/mL。

由实验结果得知,通过DNA标准曲线测得的DNA含量比紫外分光光度法测得的值要低,由于而在我们的实验过程中很难保证这一点,所以我们认为通过DNA标准曲线测得的DNA含量值更为可信。而且,紫外分光光度法对核酸纯度要求很高,但测得的A260/A280比值为1.727,纯的DNA为1.8,说明样品中混入了蛋白质,可能是在DNA的分离纯化中,没有将蛋白质除尽的缘故。

3讨论

(1)在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物而存在——核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白。核蛋白在水溶液和各种电解质溶液中有一定的溶解度,所以在前面研磨步骤将损失一部分核酸。因此应避免加入大量的水进行研磨,以减少核蛋白的溶解。

(2)核酸酶降解核酸所带来的误差。脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的存在导致了一些核酸降解成为了核苷酸,在水中溶解后被弃去。防止该误差的主要方法有两种,一是选取核酸酶含量较低的材料,如小牛胸腺细胞等;二是降低酶活性,保证操作在低温下进行,以此来抑制酶的活性。

(3)在碱性溶液中溶解RNA后加HCl时,溶液呈酸性,有小部分DNA此时也被水解掉了。可以之前利用氯仿-异戊醇法或苯酚法去除蛋白质,然后在溶解RNA后就可以直接把上清液分离出来。

地衣酚法测RNA反应原理是:当RNA与浓盐酸共热时.即发生降解.形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe2+或Cu2+催化下,成鲜绿色复合物,反应产物在670nm处有最大吸收。所以,地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,己糖持续加热产生的羟甲基糠醛,以及DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。另外,RNA浓度在10~100μg/mL范围内,光吸收与RNA浓度成正比,其中所用标准液浓度为100μg/mL,笔者认为采用50μg/mL,RNA待测液浓度再稀释一倍,所测结果再利用线性关系计算会更准确些[4]。

(4)提取基因组DNA要保证其一级结构的完整性,排除其他生物大分子(蛋白质、多糖、脂类等)以及RNA分子的污染,并且不存在过高浓度的有机溶剂和金属离子,以避免化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏和对后续的酶反应产生抑制作用;同时,应尽量简化操作步骤,以减少提取过程中有害因素对核酸的破坏。该试验使用SDS破坏细胞膜、核膜,使蛋白质变性,有效去除核酸分子结合的蛋白质,从而游离出核酸,它主要用来抑制核酸酶的活性,避免DNA被降解;加入氯仿也是为了使核蛋白变性,促使DNA分子释放,有效抑制核酸酶活性,去除带有poly(A)长链的RNA。该试验所用试剂均为常见的化学试剂,不需要昂贵的生物试剂;试验仪器要求低,操作简单,完成一次提取过程仅需5～6h[1]。

参考文献:

[1]韩芬霞.猪肝脏基因组DNA提取与纯化的研究[J].安徽农业科学,2006(16):3980-3981.

[2]夏艳萍,贺捷,库热西·玉素甫. 组织DNA分离、纯化与鉴定的质控和优化[J]. 新疆医科大学学报,2005(4):376.

[3]袁建刚,熊伟军.从动物组织制备高分子量高纯度DNA的一种简便方法[J]. 生理科学,1982(7):31.

[4]萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南第2版.[M].北京科学出版社,1995. 463-469,921-963.

[5]刘桂芬.从动物组织细胞中提取线粒体DNA的方法[J].中国医科大学学报,1994(6):618-619.

分离纯化技术 篇4

技术特点

本课题对中药槲寄生中多糖的含量测定、提取工艺、分离纯化方法、单糖组成及结构进行了初步研究, 并测试了精制多糖的抗菌、抗氧化活性。通过单因素、正交试验法优化了提取条件, 确定了提取槲寄生多糖的最佳方法与工艺, 膜分离得槲寄生多糖组分VPS-Ⅰ (<10KD) 、Ⅱ (10~50KD) 、Ⅲ (>50KD) , 经DEAE-52离子交换色谱分离槲寄生多糖组分 (VPS-Ⅲ) 获得四种多糖, 即VPS-Ⅲ-A、VPS-Ⅲ-B、VPS-Ⅲ-C、VPS-Ⅲ-D。对VPS-Ⅲ-C采用Sephadex G-200凝胶色谱、UV、IR证实是一纯酸性多糖, TLC检测含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖。

产品用途

槲寄生多糖组分对OH有一定的清除效果, 对大肠杆菌有一定的抑菌效果。

单位:江苏科技大学科技服务部

地址:江苏省镇江市梦溪路2号

邮编:212003

分离纯化技术 篇5

2011年10月25日由中国医药化工网和北京中企纵横科技有限公司主办的2011（第三届）医药化工分离纯化技术发展与工艺优化研讨会在杭州孔雀大厦大酒店四层蓝孔雀厅隆重召开。中国医药工业研究总院副院长、研究员，上海交通大学药学院副院长，本届大会主席陈代杰研究员担任大会主持人。会议共有参会用户100人左右，中国色谱网（www.sepu.net）作为本届大会支持单位、合作媒体，参加了会议。

大会开幕式

本届大会主席张玉奎院士

本届大会主席陈代杰研究员

中国医药化工网执行副总经理苏沛先生

大会开幕式由中国医药化工网技术总监张明女士（教授级高级工程师）主持。中国科学院院士，中国分析测试协会副理事长，中国化学会色谱专业委员会主任，大连化学物理研究所研究员，本届大会主席张玉奎院士；中国医药工业研究总院副院长、研究员，上海交通大学药学院副院长，本届大会主席陈代杰研究员；中国医药化工网执行副总经理苏沛先生分别在开幕式上致辞。

格林兰生化设备有限公司

环球分析测试仪器有限公司

梅特勒-托利多自动

天津博纳艾杰尔科技有限公司

力扬企业有限公司

本届大会共有参展企业6家，分别是：天津博纳艾杰尔科技有限公司、梅特勒托利多、环球分析测试仪器有限公司、格林兰生化设备有限公司、力扬企业有限公司等。

分离纯化技术 篇6

关键词：苦皮藤种素C；HP20大孔树脂；纯化；HPLC

中图分类号： O657.7+2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0246-02

苦皮藤（Celastrus angulatus）为卫矛科南蛇藤属植物，别称苦树皮、马断肠等，广泛分布于陕西省、河南省、湖北省等地[1]。苦皮藤的根、茎、叶、果实、种子是天然的杀虫剂，同时也是重要的中药资源，民间用其根皮、茎皮、树叶防治蔬菜及各种作物虫害已有相当长的历史[2]。研究表明，苦皮藤种子中所含的主要杀虫活性成分为4-H-β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物，其中苦皮藤种素C（angulateoid C）是杀虫活性成分之一[3-4]，其结构如图1所示。

[FK（W9][TPWMJ1.tif]

苦皮藤种油对黄守瓜、菜粉蝶等多种害虫具有拒食作用，对赤拟谷盗等储粮害虫有较强的忌避作用，对玉米象有明显的致死、杀卵作用。大孔吸附树脂的比表面积较大，吸附性能良好，经不同极性的洗脱剂洗脱可以达到分离纯化化合物的目的，具有设备简单、操作方便、易于再生、产品纯度高等优点，特别适合天然产物的分离纯化[5-8]。本研究采用大孔树脂法分离纯化苦皮藤种素C，旨在为开发利用苦皮藤资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，0.5 μm）；CP214型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；SHA-C型水浴恒温振荡器（常州冠军仪器制造有限公司）；HP20型大孔树脂、SP825型大孔树脂均购自日本三菱化学公司；AB-8型大孔树脂、D101型大孔树脂均购自天津市光复精细化工研究所；甲醇，色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；乙醇，医用纯（新乡市三伟消毒制剂有限公司）。

苦皮藤种素C标准品（笔者所在实验室自制）；苦皮藤种子采自湖北省恩施土家族苗族自治州，经河南农业大学朱长山教授鉴定。

1.2 方法

1.2.1 HPLC色谱条件

采用高效液相色谱法检测苦皮藤种素C含量，色谱流动相：甲醇-水（80 ∶20）；检测波长：232 nm；柱温：25 ℃；流速：2.0 mL/min；进样量：10 μL。

1.2.2 标准品溶液的制备

精密称取苦皮藤种素C标准品10.0 mg，用甲醇定容至50 mL，摇匀后得苦皮藤种素C标准品溶液。

1.2.3 标准曲线绘制

精密量取上述标准品溶液0.05、0.50、1.00、2.50、5.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别取以上溶液及标准品溶液10 μL注入液相色谱仪中，在波长232 nm处测定峰面积。以溶液浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得回归方程：y=12 377x-5 305.5，r=0.999 9，线性范围为1～200 μg/mL，检出限为05 μg/mL（S/N=3），平均加样回收率为105.8%，RSD为1.31%。

1.2.4 上样液制备 称取苦皮藤种子2 500 g，粉碎，于 80 ℃ 水浴中以石油醚为溶剂回流提取3次，3次所加石油醚的体积分别是种子质量的3、2、2倍，抽滤、合并滤液，60 ℃ 下减压浓缩，除去溶剂得苦皮藤种油834.5 g。

2 结果与分析

以苦皮藤种素C的含量、浸膏得率为指标，对大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的工艺条件进行优化。考察上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂用量等因素对HP20大孔吸附树脂分离纯化苦皮藤种素C效果的影响。

2.1 大孔树脂型号的选择

取6.0 g上样液，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C的浓度。取预处理过的HP20、AB-8、SP825、D101树脂各5.0 g置于锥形瓶中，各加入6.0 g上样液，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，吸附平衡后，过滤、减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度。在达到吸附平衡的树脂中加入50 mL 95%乙醇，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，进行解吸。达到解吸平衡后，过滤，用30 mL 95%乙醇洗涤，合并洗涤液、滤液，减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度，结果见表1。吸附率（q）及解吸率（E）计算公式如下：

结果表明，HP20型大孔吸附树脂对苦皮藤种素C具有较好的吸附作用且容易被洗脱，故选用HP20型大孔树脂进行研究。

2.2 最佳上样量

取4份预处理好的HP20型大孔树脂各50.0 g装柱，分别按树脂与药材质量比为1 ∶1.8、1 ∶3.0、1 ∶4.2、1 ∶5.4比例上样。在洗脱速度相同的条件下，先用40倍柱体积40%乙醇洗脱，除去部分杂质，再用90倍柱体积 60%乙醇洗脱，并将60%乙醇洗脱液减压蒸干，HPLC分析苦皮藤种素C含量。以苦皮藤种素C含量、浸膏得率为考察指标，确定最佳上样量，结果见表2。

3 结论与讨论

本研究表明，HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的最佳工艺为：按树脂与药材质量比为1 ∶3.0上样，先用40倍柱体积40%的乙醇洗脱，再用90倍柱体积60%的乙醇洗脱。苦皮藤种素C为苦皮藤种子的主要活性成分，因此分离纯化苦皮藤种子中的苦皮藤种素C具有重要意义。采用HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C方法简单可行，能较好地纯化苦皮藤种素C，可作为工业上富集纯化苦皮藤种素C的一种方法。

参考文献：

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志：第45卷第3分册[M]. 北京：科学出版社，1999：102.

[2]柯治国，南玉生，卢令娴. 植源昆虫拒食剂苦皮藤的研究进展[J]. 武汉植物学研究，1993，11（3）：265-271.

[3]Cheng C Q，Wu D G，Liu J K . Angulatueoids A-D，four sesquiterpenes from the seeds of celastrus angulatus[J]. Phytochemistry，1992，31（8）：2777-2780.

[4]王国亮，南 蓬，龚复俊，等. 新倍半萜酯——苦皮藤酯1的结构鉴定[J]. 科学通报，1990（15）：1156-1158.

[5]徐 耀.不同型號大孔吸附树脂对草珊瑚黄酮的富集作用[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：262-265.

[6]张 旭，王锦玉，仝 燕，等. 大孔树脂技术在中药提取纯化中的应用及展望[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：286-290.

[7]孙 健，岳瑞雪，钮福祥，等. 紫甘薯花青素的大孔树脂动态吸附工艺优化[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：227-229.

[8]李 华，赵振贵，李 丹，等. 大孔树脂对大豆异黄酮的吸附性能研究[J]. 郑州大学学报：工学版，2011，32（2）：19-22.

分离纯化技术 篇7

关键词：穿山龙,化学成分,分离纯化,研究进展

穿山龙是薯蓣科薯蓣属多年生藤本植物,别名穿地龙、地龙骨等。在我国有悠久的药用历史,现代药理研究表明穿山龙有调节免疫、改善心血管功能、镇咳、平喘、祛痰等多种作用。穿地龙中的薯蓣皂苷元为合成激素的主要原料之一,而皂苷类化合物为心脑血管药物地奥心血康重要组成成分,穿山龙的药用价值越来越受到重视。现就穿山龙主要化学成分、分离纯化工艺研究现状综述如下。

1 化学成分

1.1 甾体皂苷

穿山龙甾体皂苷类化合物主要包括水溶性和水难溶性两类甾体皂苷,水难溶性皂苷主要代表为薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷、延龄草皂苷等。都述虎等[1]从中分离得到两个化合物,分别为水难溶性的薯蓣皂苷元-3-O-{α-L-鼠李糖(1-2)-[β-D-葡糖糖(1-3)] }-β-D-葡糖皂苷以及水溶性的薯蓣皂苷元-3-O-[α-L-鼠李糖(1-3)-α-L-鼠李糖(1-4)]-α-L-鼠李糖(1-4)]-β-D-葡糖皂苷(穿龙薯蓣皂苷Dc)。李锐等[2]采用HPLC-ESI-MS/MS分析了穿龙薯蓣中的皂苷成分,得到5个化合物,如Dioscoresides A,Dioscoresides C,Hypoglaucine A等。康利平等[3]采用硅胶柱色谱从中分离得到4个化合物,分别为:薯蓣皂苷,纤细薯蓣皂苷,26-O-β-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羟基-呋甾-△5(6)-烯-3β,26-二羟基-3-O-{[α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)]-α-L-吡喃鼠李糖基(1-4)}-β-D-吡喃葡萄糖苷和26-O-β-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羟基-呋甾-△5(6)-烯-3β,26-二羟基-3-O-{[α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)]-α-L-吡喃鼠李糖基(1-3)}-β-D-吡喃葡萄糖苷,张家勇[4]等对穿龙薯蓣水溶性化合物进行研究,结果分离得到14个化合物,包括3个甾体皂苷,3个酚苷化合物以及其他成分。舒艳[5]等从中分离得到14个化合物,包括甾体皂苷12个和二苯庚烷化合物2个,其中大多甾体皂苷化合物具有良好的抗癌活性。

1.2 其他成分

吉林大学卢丹等[6]对穿龙薯蓣地上部分进行化学成分研究,利用多种色谱技术分离鉴定了10个化合物,主要为菲类化合物。陈帅等[7]利用GC-MS分析地上脂溶性部分成分共分离出30多种化合物,经过与质谱标准谱比较检索出13中主要化合物,结果含量较高的主要成分为高级烷烃化合物。王昭晶等[8]采用水提醇沉再经色谱分离纯化得到2个粗多糖组分。张黎明等[9]采用改进后的“分离法加工薯蓣植物”分离出其中的水溶性皂苷及水不溶性皂苷,同时还分离出淀粉及纤维素。

综上所述,关于穿龙薯蓣植物的化学成分的研究,近年加强了对水溶性化合物的分离鉴定。对于整体植物的综合开发利用也初见端倪,对其综合开发利用提供了基础。

2 分离纯化研究进展

2.1 提取分离

2.1.1 皂素提取工艺进展

穿山龙是皂素工业生产主要原料之一,早期多采用酸解法直接生产,该工艺存在环境污染严重等问题,近年新工艺注重其清洁生产。赵宗梁等[10]将穿龙薯蓣首先分离纤维素、淀粉和皂苷复合物,然后对皂苷复合物酸水解获取皂素,工艺酸用量减少80%、废水量减少75%,废水COD 值只有传统工艺废水的56%,大幅降低污染程度。目前生物酶解技术[11]提取皂素有望替代传统酸解技术,如这一技术成熟应用于皂素工业,将有利于解决我国皂素工业高酸、高COD污染问题,实现清洁生产。

2.1.2 皂苷提取工艺进展

张国锋等[12]对穿龙薯蓣总皂苷提取工艺的可行性进行了研究,总皂苷和水溶性总皂苷为指标,结果发现0.5%碱和70%乙醇溶液浸渍法提取3次,每次12 h,效果最好;胡湘春等[13]研究穿龙薯蓣总皂苷的提取条件,结果皂苷最佳提取酒精度、最适温度和最佳时间分别为95%乙醇,50 ℃提取6 h,皂苷得率2.4%。袁毅等[14]采用改进后的“分离法加工薯蓣植物”,得到穿龙薯蓣水溶性皂苷及水不溶性皂苷,结果水溶性皂苷提取率为0.33%,不溶皂苷提取率为1.02%。李国华等[15]对比了超微粉碎对穿山龙薯蓣皂苷溶出量的影响,通过实验比较浸泡30 min,泡12 h,回流30 min以及超声提取工艺,结果发现超微粉碎后最佳提取工艺为:50%乙醇,10倍量水,超声20 min,薯蓣皂苷元得率2.0%。而王昌利等[16]通过超声技术提取薯蓣皂苷,得到最佳工艺为:穿山龙粗粉以50%乙醇浸泡36 h,1 MHz频率超声波处理30 min,渣重复处理一次,该法省时、节能、提取率高。

2.2 纯化

穿龙薯蓣成分复杂、结构相近分离纯化困难较大,目前新技术有大孔树脂法和色谱法。

2.2.1 大孔树脂法

大孔吸附树脂分离技术是20世纪60年代继离子交换树脂后的分离新技术,大孔树脂理化性质稳定,不溶于水、酸、碱及常用有机溶剂。它既可以通过表面作用和形成氢键来产生吸附作用,同时因其本身的孔状结构兼具筛选作用,这使大孔树脂具有吸附,富集,分离不同母核结构化合物的功能。近年广泛用于天然产物的分离纯化和中药复方,显示出良好的应用前景。

张黎明等[17]报道了采用大孔树脂法富集穿龙薯蓣水溶性皂苷,结果该方法富集纯化后的总固体物中皂苷纯度达26.1%。Yin等[18]采用两步大孔树脂色谱技术对穿龙薯蓣皂苷进行纯化,首先工艺的第一步以D101初步分离纯化,使薯蓣皂苷纯度从9.35%提高到85.64%,所得产品溶于水后再以D900大孔树脂二次纯化,经两次树脂纯化后最终产品纯度达96.55%,该法因只使用含水乙醇作为洗脱剂,工艺安全、绿色无污染。张小飞等[19]以穿龙薯蓣中总皂苷为考察指标,优选出D-101型树脂对总皂苷具有最佳分离性能,工艺参数为:径高比1:8,流速2 BV·h-1,4 BV的70%乙醇为洗脱剂。

2.2.2 高速逆流色谱法

高速逆流色谱技术(High speed countercurrent chromatography,HSCCC)是一种新型色谱技术。与高效液相色谱法相比,它没有固相载体作固定相,从而克服固相载体对样品的吸附、污染和峰拖尾等缺点,样品回收率高,上样量可从毫克到数十克,尤其适合于天然产物的分离制备,在医药领域得到广泛应用。

Yin等[20]先以大孔树脂富集穿龙薯蓣皂苷,梯度洗脱后收集70%醇洗部分,该部分采用高速逆流色谱技术以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(2:5:2:5)为洗脱剂,一步分离可以得到高纯度薯蓣皂苷,该方法方便、节约有机溶剂适合薯蓣皂苷的分离纯化。

3 结 语

多糖的生物活性及分离纯化 篇8

1多糖的生物活性

1.1抗肿瘤活性。用于抗肿瘤的多糖类药物多数都是无毒的,它们通常不直接作用于癌症细胞,而是通过激活体内的免疫系统来达到抗癌的作用,即通过促进淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的分化、成熟和繁殖,同时活化网上内皮系统和补体,促进各种细胞因子的生成来抑制肿瘤细胞的生长或诱导肿瘤细胞的凋亡。目前,在国内外应用于肿瘤治疗的多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、灵芝多糖等,枸杞多糖、人参多糖、白菜果胶多糖也正在研究中[1]。经研究表明,不止β-葡聚糖具有抗癌活性,α-葡聚糖也具有抗癌活性。

1.2降血糖作用。多糖作为降糖药物有望出现在临床应用中。多糖是十个以上的单糖通过缩合去水后以糖苷键形式结合的多聚糖,它不但不会像单糖和寡糖一样引起血糖升高,而且还可以起到降低血糖的作用。有研究证明,多糖的降糖机理并不是增加胰岛素的分泌,而是通过提高肝脏中己糖激酶、葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性,同时降低血浆甘油三酯及胆固醇的水平来达到降糖的目的,还有一些多糖可以作为β-受体激动剂,加速糖的氧化利用,完成降糖的目的。目前,有很多种具有降糖作用的多糖被发现,它们分别是从小豆、沙蒿籽、植物羽叶白头树及高等真菌等自然界存在的物种中提取的多糖[2]。

1.3抗病毒作用。目前发现有抗疱疹病毒、抗流感病毒、抗艾滋病病毒作用的多糖。此类多糖通过干扰病毒表面的糖蛋白gp120对淋巴细胞表面CD4受体的结合;抑制病毒抗原的表达;抑制病毒逆转录酶的活性来完成抗病毒的作用。抗病毒多糖中硫酸根的存在及多寡对其抗病毒活性产生影响。目前以及确定具有抗病毒作用的多糖很多,但是结构汇总都含有可以抗凝血的硫酸根,比如具有抗疱疹病毒做的硫酸化半乳聚糖及可以选择性抑制单纯性疱疹病毒及合胞体的生成的硫酸化盐藻类多糖-墨角藻多糖和硫酸木聚糖;还有有望成为发展中国家预防性传播艾滋病的硫酸化K5多糖[3]。当然,也有不含硫酸跟的抗病毒多糖,例如具有明显抗流感病毒作用的念珠藻多糖、具有明显抗艾滋病病毒左右的从玫瑰花中获得的多糖[4]。

1.4抗炎作用。多糖因为可以选择性的粘附病原体,阻断微生物病原体对靶细胞的吸附,从而具有消炎和抗感染的作用。近些年来已经有多种多糖类消炎药进入到临床试验阶段,糖类有望成为第二代抗炎药物。

1.5抗补体作用。作为人体重要免疫防御系统之一的补体系统一旦被过度激活将引起重症非典型肺炎、风湿性关节炎等多种疾病。目前临床上尚无安全有效的抑制补体系统的药物。但是多糖的出现,为寻找抗补体活性化合物提供了一个新的方向。

2多糖的分离纯化

分离和纯化从来都是很难被区别开来的定义,因为很多时候,分离的时候就已经在纯化了,而在纯化过程中会进一步分离,所以本文将分离纯化结合在一起讲。对于多糖的纯化过程就是将分离的到的混合多糖纯化为单一的多糖。以下是对常用的多糖纯化方法进行的说明。

2.1分步沉淀法。多糖根据分子量的不同会表现出在乙醇或丙酮中溶解度不同,分离沉淀法就是依据多糖的这个特性进行分离的,分子量越大的多糖在乙醇或丙酮中的溶解度越小,逐步增加乙醇或丙酮的量可以将不同分子量的多糖分别沉淀[5,6,7,8]。分步沉淀的关键就是控制靠乙醇或丙酮的浓度,避免共沉淀的发生。目前,分步沉淀法因为方法简单而常常被应用于保健品的开发中。

2.2盐析法。盐析法是利用在一定浓度的盐溶液中不同分子量的多糖溶解度不同的性质,对多糖进行分离提纯的一种方法。次方法多用于蛋白的提纯,早期是云芝多糖就是用此方法纯化的。此方法虽然成本低但是容易产生共沉淀。

2.3有机盐沉淀法和季铵盐沉淀法。有机盐沉淀法可用于植物和微生物中粘多糖和蛋白多糖的提取。主要原理是利用单宁酸与多糖可形成有机盐复合物而沉淀析出。季铵盐沉淀法跟有利于分离酸性多糖及中星高分子量多糖。主要原理是利用长链季铵盐可与多糖形成络合物的性质[9,10,11]。

2.4金属络合物法。铜盐络合法和氢氧化钡络合法是多糖的纯化中最常用的方法,主要是利用多糖能与铜、钡、钙和铅离子形成络合物的性质[12]。

2.5柱层析法。多糖的纯化最多用的方法就是柱层析法,目前常用的柱层析法有纤维素柱层析、离子交换柱层析、凝胶柱层析和亲和层析。

2.6超离心法。在强大的离心力场的作用下,不同分子量的多糖有不同的沉降速度而将不同的多糖分离。

2.7超滤法。是利用分子筛的原理,使强压力下不同大小和形状的多糖通过超滤膜,从而实现不同多糖的分离。但由于超滤膜对多糖的吸附严重,一般将此方法应用于多糖的分离提纯[13,14]。

多糖的分离提纯很复杂,方法也很多,在实践中根据实际情况选择最优的方法最为重要。

摘要：本文主要阐述了多糖在抗肿瘤、降血糖、抗病毒、抗炎和抗补体方面的生物活性,并对多糖的分离纯化方法做了简单的陈述。

三羟甲基乙烷分离纯化的实验研究 篇9

三羟甲基乙烷的分离提纯是一个重要的工艺过程。由于合成三羟甲基乙烷的技术路线不同, 主要操作步骤也不同。在利用康尼查罗反应还原中间加成物时, 工艺过程包括反应低温加成和升温歧化反应、中和、浓缩、提取、蒸馏、结晶、过滤和烘干, 或反应液浓缩后用有机溶剂恒沸蒸馏脱水、蒸溶、冷却、结晶、过滤和烘干;在用还原剂还原中间加成物时, 分离操作较简单, 反应液经浓缩、结晶、离心、过滤和烘干就可得到产物[2,3]。比较容易实行的方法是利用康尼查罗反应还原中间加成物, 此方法最重要的步骤是产物的分离。有效的分离方法关系到产品质量和工艺的经济性。一般的分离方法是采用有机溶剂分离、喷雾干燥、溶剂提取、离子交换树脂分离等[2], 本文采用乙二酸、无水乙醇等简单溶剂实现了TME的分离纯化, 实验步骤简便, 易操作。

合成TME的催化剂主要有无机碱和有机碱, 常用的无机碱有氢氧化钠和氢氧化钙, 有机碱有三乙胺等[9], 采用这些单一的催化剂一般产率较低。本文采用氢氧化钙和少量三乙胺作为复合催化剂, 通过优化得到适宜的反应条件为∶n (甲醛) ∶n (丙醛) =4.0∶1.0;n (氢氧化钙) ∶n (丙醛) =1.2∶1.0;缩合反应温度25℃, 反应时间为1h;Cannizzaro反应温度35℃, 反应时间为3h, 通过气相色谱分析三羟甲基乙烷产率可达90.4%。少量加入三乙胺有利于提高反应的选择性和TME的产率, 并对产品品质有利。

1 合成路线

2 实验部分

2.1 主要试剂和仪器

试剂为甲醛、丙醛、三乙胺、乙二酸、甲酸、无水乙醇, 均为分析纯试剂;氢氧化钙 (化学纯) 。仪器为集热式控温磁力搅、拌器、熔点测定仪、福立9790气相色谱, 毛细管柱Se-30 (30m×0.25nm×0.25μm) 。

2.2 实验方法

反应的副产物分析:本文采用氢氧化钙和少量三乙胺作为复合催化剂, 获得了较高的产率。反应完成后, 溶液中还有甲酸钙等副产物需要进一步分离才能得到比较纯净的TME产品。在传统的三羟甲基乙烷的缩合反应中, 主反应的过程如下:

CH3CH2CHO+HCHO—CH3CH (CH2OH) CHO (1)

CH3CH (CH2OH) CHO+HCHO—CH3C (CH2OH) 2CHO (2)

CH3C (CH2OH) 2CHO+HCHO+NaOH—CH3C (CH2OH) 3+HCOONa (3)

HCOOH+NaOH—HCOONa+H2O (4)

化学反应方程式 (1) 、 (2) 为丙醛与甲醛之间的醇醛缩合反应 (俗称第一步反应) , 生成物为2, 2-二羟甲基丙醛;化学反应方程式 (3) 为2 , 2-二羟甲基丙醛与甲醛之间的Cannizzaro反应 (俗称第二步反应) , 生成物为三羟甲基乙烷, 同时有副产物甲酸钠生成, 两步反应在同一个反应器中连续进行, 所需的反应条件是在水介质中、在碱性条件和一定的温度下进行, 合并上述化学反应方程式得总化学反应方程式:

CH3CH2CHO+3HCHO+NaOH—CH3C (CH2OH) 3+HCOONa (5)

在缩合工序中还存在着以下主要的副反应, 化学反应方程式分别为式 (6) — (10) 。副反应式 (6) 甲醛自身缩合反应的发生是显而易见的, 甚至与主反应同步发生, 只能通过优化缩合工艺条件来抑制该副反应的生成。副反应式 (7) 、 (8) 丙醛的自身缩合反应生成2-甲基-3-羟基戊醛与2-甲基-2-戊烯醛。反应式 (9) 、 (10) 是甲醛与丙醛的缩合反应生成2-羟甲基丙醛与甲基丙烯醛。因此, 制备三羟甲基乙烷反应的副产物主要有甲醛自身缩合产物:甲醇与甲酸;丙醛的自身缩合产物:2-甲基-2-羟基戊醛与2-甲基-2-戊烯醛;甲醛与丙醛的缩合反应产物:2-羟甲基丙醛与甲基丙烯醛等, 可见三羟甲基乙烷的缩合过程是一个非常复杂的过程。

2HCHO+NaOH—CH3OH+HCOONa (6)

2CH3CH2CHO—CH3CH2CH (OH) CH (CH3) CHO (7)

2CH3CH2CHO—CH3CH2CH=C (CH3) CHO+H2O (8)

CH3CH2CHO+HCHO—CH3CH (CH2OH) CHO (9)

CH3CH2CHO+HCHO—CH3CH=CHCHO+H2O (10)

用无水乙醇分离三羟甲基乙烷:副产物的沸点比三羟甲基乙烷 (TME) 低。甲醇CH3OH的分子量为32.04, 无色澄清易挥发液体, 沸点为64.5℃。甲酸HCOOH的分子量为46.03, 无色透明油状发烟液体, 沸点为100.5℃。2-甲基-2-戊烯醛CH3CH2CH=C (CH3) CHO为无色液体, 沸点为136—137℃。甲基丙烯醛CH3CH=CHCHO分子量为70.09, 属于不饱和醛, 是无色可燃性液体, 易挥发, 沸点104.1℃。三羟甲基乙烷 (TME) 熔点为200—203℃, 可见副产物的沸点比三羟甲基乙烷的熔点都低。因此, 反应完成后, 将反应后的混合液采用减压蒸馏的方法除去水分和低沸点的副产物, 剩余固体中则只含有产品TME和副产物甲酸钙。甲酸钙是无机盐, 沸点高, 减压蒸馏后与产品混在一起。由于甲酸钙不溶于无水乙醇而TME溶于无水乙醇, 将剩余固体加入无水乙醇中经简单过滤即可除去甲酸钙;再将三羟甲基乙烷的无水乙醇溶液进行减压蒸馏, 蒸馏出无水乙醇, 即可得到TME产品。经气相色谱归一化法分析, 产品的出峰时间和标准样品的出峰时间完全一致, 所得到的TME产品的纯度为99.2%, 收率为83.4%。经过滤的甲酸钙为无毒白色结晶或粉末状的固体, 溶于水, 可用作饲料添加剂。甲酸钙在动物体内经生化作用而游离出甲酸, 有效地降低了胃肠道中的pH值, 起到维持肠道中适度酸的作用, 有利于激活胃蛋白酶源, 提高饲料养分的消化率, 并有抑菌防腐作用;而收集的无水乙醇可回用, 继续用于产品的分离。

用乙二酸和无水乙醇分离三羟甲基乙烷:由于乙二酸熔点为101℃, 稍溶于冷水, 易溶于热水。因此, 当反应结束后加入乙二酸热溶液时, 调节溶液的pH值为中性, 使溶液中的甲酸钙转变为乙二酸钙。因为乙二酸钙不溶于水, 可过滤除去乙二酸钙。如将剩余溶液减压蒸馏除去水分和副产物, 可得到产品。经气相色谱归一化法分析, 所得到的TME产品的纯度为97.8%, 收率为86.4%。如果要得到更纯净的TME产品, 可采用无水乙醇重结晶即可得到较纯净的产物。三羟甲基乙烷在无水乙醇中的溶解度 (g/100g溶剂, 25℃) 为27.9。采用无水乙醇重结晶后, 所得产品经气相色谱归一化法分析, 所得到的TME产品的纯度为99.5%, 收率为81.6%。经过滤的乙二酸钙为白色结晶性粉末, 不溶于水和乙酸, 溶于稀硝酸和盐酸, 200℃时完全失水;灼烧时转变成碳酸钙或氧化钙, 可用做分析试剂;在分离稀土金属时用作载体, 可用于草酸盐的合成, 也可用于陶瓷上釉、制草酸等。

3 结果与讨论

采用无水乙醇分离纯化得到的TME产品纯度为99.2%, 收率为83.4%。采用乙二酸分离纯化后再经无水乙醇重结晶, 所得到的TME产品的纯度为99.5%, 收率为81.6%。经分离纯化后得到的TME产品经熔点测定仪分析, 产品熔度在185—200℃之间, 将所得到的产品与TME标准样品混合均匀再次测定熔点, 所得熔点值与制备的产品一致, 所以再次判断所得到的产品为纯物质TME。

参考文献

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[3]阮德水, 贺洛夫, 张太平, 等.三羟甲基乙烷的制备[J].化学试剂, 1995, 17 (2) ∶116-117.

[4]李发学, 张广平, 吴丽莉, 等.三羟甲基乙烷/新戊二醇二元体系的DSC研究[J].纺织学报, 2004, 5 (25) ∶59-61.

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翡翠贻贝多糖的分离纯化及单糖组成 篇10

1 材料

翡翠贻贝粗多糖(PVPS)为实验室自制，翡翠贻贝于2011年6～8月购于湛江市霞山区东风市场。

2 方法

2.1 多糖的分离纯化

2.1.1 DEAE-52纤维素阴离子交换层析

方法参照文献[5,6,7,8]，经热水浸提、醇析、脱脂、除蛋白和色素后，冷冻干燥得到PVPS干品，按液料比为10∶1把样品溶于去离子水中，离心(10000 rmp,10 min)取上清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤。取10 mL粗多糖溶液上样后以去离子水平衡，然后以0.0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L的NaCl溶液分段洗脱，每个梯度收集20只管，每支管的收集时间为10 min，流速为0.5 mL/min。

2.1.2 Sephadex G-100分子筛层析

具体方法参照文献[9,10]，经DEAE-52纤维素阴离子交换层析后的样品，经过透析脱盐冷冻干燥，按液料比5∶1溶解，上样5 mL以去离子水洗脱，按0.5 mL/min的流速收集10 min，收集洗脱峰透析冻干。

2.2 纯度检测

2.2.1 多糖的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳

参照文献方法[11,12]，采用不连续垂直平板电泳，分离胶浓度为7%，浓缩胶浓度为4%，电极缓冲液0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液(pH=10.0)。加样量为10μL，分离胶电泳时，用100 V恒压，指示剂进入分离胶后用180 V恒压，电泳约5 h，电泳结束后，剥胶，进行多糖PAS染色处理。

2.2.2 紫外光谱扫描

用去离子水配制成50 mg/mL的多糖溶液，在紫外扫描分光光度计于200～600 nm处扫描检测。

2.3 傅里叶红外吸收光谱

参照文献方法[13,14]，取冷冻干燥的粗多糖2mg，采用KBr压片法上傅里叶变换红外光谱仪，扫描范围为4000 cm-1～500 cm-1。

2.4 核磁共振1H NMR谱分析

参考文献方法[15,16]，取10 mg样品溶于重水D2O，参考标准为DSS(外标)，德国Bruker公司的AVANCE DRX 400的400兆超导核磁共振仪。

2.5 单糖组成的GC-MS分析

2.5.1 多糖水解

取50 mg纯化多糖，加入2 mol/L H2SO4加热回流6 h，冷却，用饱和Ba(OH)2溶液中和至中性，过滤，清液浓缩定容至10 mL。

2.5.2 多糖水解产物的乙酰化

水解后的多糖，彻底蒸干其中水分，加入70 mg盐酸羟胺，5 mL吡啶，于90℃水浴加热1 h，取出稍冷，加入5 mL醋酸酐，再于90℃水浴加热1 h，冷却，加10 mL水破坏醋酸酐，用氯仿萃取乙酰化产物，氯仿萃取液用水洗涤，无水硫酸钠脱水，清液通氮气浓缩定容至1 mL，进行GC-MS分析。

2.5.3 GC-MS检测

色谱柱为DB-1(15 m×0.2 mm,0.33μm)弹性石英毛细管柱，柱温初温100℃，以10℃/min程序升温至280℃，保持10 min。载气He，柱前压70 kPa，分流比10∶1，溶剂延迟2 min，进样量1.0μL,EI离子源，电子能量70 eV，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300 V,GC-MS接口温度280℃，质量扫描范围29～500 amu，以峰面积归一化法计算相对含量。

3 结果与分析

3.1 DEAE-cellulose 52纤维素阴离子交换层析

用硫酸-苯酚检测多糖的洗脱曲线如图1所示，每支管取100μL加水到1 mL，加6%的苯酚0.5 mL和2.5 mL的浓硫酸，冷却后于490 nm处测吸光值。

经过DEAE-cellulose 52纤维素阴离子交换层析[17]之后，PVPS出现2个峰，分别为PVPS-1和PVPS-2，在第20～24只管出现了1个小峰PVPS-1，由于含量较低，未做收集。在第34～48管出现第2个峰PVPS-2，为了避免收集组分不纯，只收集了35～45管，合并相同组分，用分子量为8000～14000的透析袋磁力搅拌透析48 h，透析后冷冻干燥，置于-20℃保存。

3.2 Sephadex G-100分子筛层析洗脱曲线

经过Sephadex G-100分子筛层析柱洗脱曲线如图2所示，PVPS-2出现2个峰，说明PVPS-2存在2个组分，分别命名为PVPS-2A和PVPS-2B，在第9～13管之间出现第1个峰PVPS-2A，为了避免收集组分不纯，因此只收9～12管，在第14～22管之间出现第2个峰PVPS-2B，收集管号为16～20管，合并相同组分，磁力搅拌透析48 h，脱去小分子物质和NaCl，再用PEG-6000包埋浓缩，将浓缩后的样品组分冷冻干燥，放于-20℃下保存。

3.3 PAS染色结果

电泳结果如图3所示，从上图可以看出粗PVPS的条带从加样孔一直拖到分离胶的最底部分，说明成分比较复杂而且分子量分布广，PVPS-2B不存在拖尾现象，且可以看出一条较明显的条带。右边的PVPS-2A也没有拖尾现象，说明该样品已达到电泳纯。由于分子量比较大，所以不存在明显的条带，但和粗样品相比，拖尾现象非常少，说明已经达到一定纯度[12]。

3.4 紫外光谱扫描

PVPS-2A的紫外扫描如图4所示，该成分在280 nm附近有微小的吸收峰，推测该个组分可能是一种糖蛋白，有待后续结构测定的验证，在260 nm处附近没有吸收峰，说明不含有核酸类物质。PVPS-2B扫描结果如图5所示，该组分在280 nm和220 nm处均没有吸收峰，说明不含有蛋白和核酸类物质，是一个比较纯的组分，从电泳中可以得到验证。

3.5 傅里叶红外吸收光谱分析

PVPS-2A红外扫描如图6所示，该糖在多糖特征吸收峰的值为：3468.3 cm-1和3401.2 cm-1,2892.35 cm-1,1370 cm-1。推测该多糖可能还有氨基化合物，这与前面的紫外分光光度法相互印证。1652.8 cm-1处的吸收峰可能是水分子的吸收峰;1200～1000 cm-1处的一组吸收峰为C-O键的变角振动843 cm-1处有吸收峰，890 cm-1附近无吸收峰说明不含β端基差向异构，因此PVPS-2A是α构型;在963.18 cm-1是吡喃糖的非对称性伸缩振动吸收，因此该糖为α-吡喃糖[18,19]。

PVPS-2B红外扫描结果如图7所示，该糖在多糖特征吸收峰的值为3431.73 cm-1、2935.3 cm-1、1352.67 cm-1;2141.55 cm-1有吸收峰，可能是空气中的CO2干扰;在953.20 cm-1和在890 cm-1无特征吸收峰，说明也是α-吡喃糖。

3.6 核磁共振1H NMR谱分析[20]

1H NMR谱图主要解决多糖结构中糖苷键构型问题，C2～C6上质子信号堆集在4.0～4.8 ppm范围内，且有溶剂峰干扰，难以解析，故主要看在4.8～5.5 ppm的C1上质子信号。α型吡喃糖C1上质子超过5.0 ppm，而β型则小于5.0 ppm，借此可将两类加以区别，呋喃糖C1上质子化学位移为5.4 ppm左右，这是呋喃糖环区别于吡喃糖环的主要特征。

PVPS-2A和PVPS-2B的1H NMR谱图如图8、图9所示，4.712 ppm的峰谱为水峰，2种组分在4.8～5.5之间，只有1个明显峰，峰尖分别是5.276 ppm和5.243 ppm，说明这2种糖都为α型，5.4 ppm附近无谱峰，表明这2种多糖，都是吡喃糖，这与前面的红外光谱分析，相互印证彼此结论。2组分在3.2～4 ppm间的峰谱均为C2～C6上质子信号堆积产生，不易解释。

3.7 单糖组成

实验以核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖作为标准样品，分别过GC-MS，其结果图谱如图10、图11和图12所示。

从表1，图11、图12中可以看出，2种组分几乎都含有作为标样的单糖，含量有所区别，主要以木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖为主，PVPS-2A和PVPS-2B中上述4种单糖的总和达到93.74%和93.35%，鼠李糖和阿拉伯糖含量比较低，分别是3.78%和4.22%，只有少量的核糖，分别为0.82%和0.60%。

4 结论和讨论

4.1 讨论

在粗多糖的纯化过程中，洗脱盐浓度，层析管长度和直径、流速、每管收集体积以及缓冲液的pH值都会对DEAE-cellulose 52纤维素阴离子交换层析的洗脱曲线造成影响，因此，摸索出一种最佳的洗脱方法，对于整个纯化过程起着决定性的作用，实验的洗脱方法还不算最佳，有待Sephadex G-100分子筛层析进一步纯化。

在多糖的纯化检测过程，聚丙烯凝胶电泳时由于分离胶的浓度偏高，大分子量的多糖物质很难进入分离胶，因此分离胶浓度要求做得低，大分子量的多糖才能进入泳道。实验尝试过分离胶浓度做到5%，但由于胶本身过于柔软，染色过程中会出现破损，不便于操作。

在红外和核磁共振检测过程中，样品检测出还存有一定量的水峰，对于其它官能团的峰型有一定影响，给分析带来难度。

在单糖组成的分析过程中，水解时间和浓度比较难掌握，浓度太小，谱峰过小不便分析，单糖的种类只有7种，可能还有一些微量的单糖未被检出。

4.2 结论

过DEAE-cellulose 52纤维素阴离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析纯化后的多糖组分PVPS-2A和PVPS-2B，以紫外扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，其纯度已达到电泳纯度。

在红外扫描和核磁共振波谱的检测中，相互印证了2种组分的构型都是α-吡喃糖，其中PVPS-2A可能是一种糖胺聚糖。