液质联用

液质联用（精选八篇）

液质联用篇1

关键词：氯雷他定,离效液相色谱-质谱法,药代动力学

氯雷他定属第二代组胺H1受体拮抗剂类抗过敏药,对外周组胺H1受体具有高度选择性亲和力,主要用于治疗季节性、常年性过敏性鼻炎,急、慢性荨麻疹等过敏性皮肤病。因其不易透过血脑屏障且与中枢组胺H1受体亲和力极低,故无中枢抑制、抗胆碱能作用及心血管毒性等不良反应。其特点是起效快、作用强、维持时间长、不良反应少而轻微。

作者采用高效液相色谱质谱(LC-MS)法,测定人血浆中氯雷他定的浓度,并对其人体药动学进行了研究。

1 仪器与试药

2010 A型单重四极杆质谱仪(APCI源,日本岛津公司),LC-10 ADvp液相色谱输液泵(日本岛津公司),LC-MS Solution 3.0数据处理系统(日本岛津公司)。

氯雷他定片(10mg,批号:20060601,深圳海王药业公司)。氯雷他定对照品(纯度99.6%,批号:040103,北京深文科技开发有限责任公司提供);地西泮(内标,纯度99.5%,批号:040520,北京深文科技开发有限责任公司提供)。

甲酸(色谱纯,天津市光复精细化工研究所),甲醇(色谱纯,美国天地公司),乙腈(色谱纯,美国天地公司)。

2 色谱系统条件

Kromasil C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm,大连中汇达公司),C18保护柱(10mm×4.6mm,大连中汇达公司);流动相:甲醇-乙腈-0.1%甲酸(4:4:92);流速:0.8ml/min;柱温:室温。

离子源为大气压化学电离源(APCI),接口温度为400℃,CDL温度250℃,加热块温度200℃,雾化气(N2)流量2.5 L/min,干燥气(N2)流量2.0L/min,检测电压1.6kV,正离子方式检测,扫描方式为选择离子检测(SIM),用于定量分析的离子分别为m/z 383.00(氯雷他定)和m/z 284.95(地西泮)。

3 血浆样品处理方法

取血浆样品500μl置10 ml具塞离心管中,依次加入甲醇50μl,内标溶液(40μg/L地西泮甲醇溶液)25μl,碱化试剂(2mol/L氢氧化钠水溶液)50μl,混匀,加提取溶剂乙醚-正己烷(体积比为1.5:1.0) 3.0ml,涡旋3min,离心(4 000r/min)5min,分取上清液置另一试管中,于40℃空气流下吹干,残留物加流动相200μl,超声1 min,涡旋1min,离心(12 000r/min)3min,取上清液20μl进样分析。

4 专属性

分别取6名受试者的空白血浆500μl,按“3”项下方法(不加内标溶液)操作,进样20μl,得色谱图a;将一定浓度的氯雷他定对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中,依同法操作,得色谱图b,氯雷他定和地西泮(内标物)的保留时间分别为2.42min和2.79min。取受试者口服给药后的血浆样品,同法操作,得色谱图c。结果表明,空白血浆中的内源性物质和代谢物不干扰血浆中氯雷他定和地西泮的测定。

a.空白血浆;b.空白血浆+氯雷他定+内标c.受试者服药后血浆样品+内标;1-氯雷他定;2-地西泮.

5 标准曲线的制备与线性范围

取空白血浆500μL,加氯雷他定标准系列溶液50μl,配制成相当于氯雷他定血浆质量浓度为0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0μg/L的模拟血浆样品按“3”项下方法操作,每一质量浓度进行双样本分析,进样20μL,记录色谱图,以氯雷他定质量浓度为横坐标,氯雷他定与地西泮(内标物)的峰面积比值为纵坐标,用加权(w=1/x2)最小二乘法[1]进行回归运算,求得的直线回归方程即为标准曲线。氯雷他定的典型回归方程为:Y=0.114X+0.0061,r=0.9997(n=7)。根据标准曲线,氯雷他定的线性为0.25～40.0μg/L,定量下限为0.25μg/L。

6 精密度与准确度

取空白血浆500μl,按“3”项下方法制成氯雷他定低、中、高3个质量浓度(氯雷他定质量浓度分别为0.5、10.0、32.0μg/L)的质量控制(QC)样品,每一质量浓度进行6样本分析,连续测定3天,根据当日的标准曲线,计算QC样品的质量浓度,将QC样品的结果进行方差分析,求算本法的准确度与精密度,结果见表1。实验数据表明,日内、日间精密度(RSD)均小于15.0%,准确度(RE)在±5.0%以内。

7 提取回收率和稳定性考察

取空白血浆500μl,按“3”项下方法制备氯霄他定低、中、高3个浓度(氯雷他定分别为0.5、10.0、32.0μg/L)的模拟血浆样品,每一质量浓度进行6样本分析。同时,另取空白血浆500μl,除不加标准系列溶液和内标溶液外,其他按“3”条方法操作,残留物以相应浓度的氯雷他定标准系列溶液溶解,进样分析,获得相应峰面积(3次测定的平均值)。氯雷他定在0.5、10.0、32.0μg/L3个质量浓度的血浆样品提取回收率分别为66.0%、65.9%、61.2%,内标提取回收率65.4%。作者考察了氯雷他定血浆样品室温放置24 h,血浆样品经历3次冷冻-解冻循环以及-20℃冷冻45d的稳定性。结果表明氯雷他定血浆样品的稳定性合乎要求。

8 药代动力学研究

按临床试验的各项要求,选择18名男性健康受试者(年龄20～25岁,体重56～70 kg,身高165～180 cm),采用开放、随机、交叉、单剂量给药方式。试验前2周及试验期间停用其他任何药物,在试验期间禁忌烟、酒、含咖啡因的饮料。受试者在试验开始前均签署知情同意书,试验方案经医学伦理委员会审批同意后实施。

受试者于试验前一天晚9:00开始禁食,试验日清晨空腹给药,一次性口服氯雷他定片20mg,服药后2h后自由饮水,4h和9h后进食统一的标准餐,医院医生同时进行严格的临床监护,以保证受试者的安全。自服药前(0 h)和服药后0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24、36h由肘正中静脉取血5ml,分离血浆,-20℃保存待测。

临床观察受试者空腹单剂量口服20mg氯雷他定片后,一般情况良好,整个试验过程中,无明显不良反应发生。

测得18例健康受试者单剂量口服氯雷他定片20mg后,平均血药浓度-药时曲线见图2。

求得受试者口服20mg氯雷他定片的主要药代动力学参数如表2所示。

9 讨论

有关血浆中氯雷他定的测定方法国内外均有报道,包括荧光检测法[2]、高效液相色谱法[3]、气相色谱质谱联用法[4]和液相色谱质谱联用法[5,6,7]等。作者采用HPLC-MS法测定血浆中氯雷他定的质量浓度,与文献相比,本法分析时间短,3.4min之内即完成一次测定,均优于文献报道的方法。此外,文献中为缩短分析时间和优化峰形,大多采用了复杂的流动相,本法流动组成简单易配,其中适当加入较小比例的乙腈,有利于优化峰形和氯雷他定与血浆中内源性杂质的分离,提高最低定量限的同时降低了对仪器的损耗。同时血浆样品预处理采用液液萃取法,操作简便快速。因此,该法适于快速准确且高灵敏度地对氯雷他定的药动学及生物等效性进行研究。

从实验数据结果可以看出,AUC和个体间差异较大,文献[2]报道可能原因为人体内氯雷他定在细胞色素P450酶系3A4和2D6酶作用下转化为去乙氧酰基氯雷他定(descar-boethoxyloratadine),而此两种酶活性存在较大的个体差异。此外,文献[8]报道氯雷他定的难溶性也可能是原因之一。实验结果与文献一致,提示临床用药应引起注意。

参考文献

[1] 钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J].药物分析杂志,1996;16(5) :343～346

[2] 徐晓杰,尚尔鑫,裘福荣,等.氯雷他定血药浓度的HPLC荧光检测法及生物等效性研究[J].药学学报,2004;39(2) :123～126

[3] 阮邹荣,袁虹,孙凌.反相高效液相色谱法测定人血浆中氯雷他定浓度[J].药物分析杂志,2002;22(4) :296～298

[4] Martens J. Determination of loratadine and pheniramine from human serum by gas chromatography-mass spectrometry [J]. J Chromatogr B, 1995; 673 (2) : 183～188

[5] Sun J G, Wang GJ,Wang W,et al. Simultaneous deter-ruination of loratadine and pseudoephedrine sulfate in human plasma by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry for pharmacokinetic studies [J]. J Pharm Biomed Anal, 2005; 39 (1-2) : 217～224

[6] 田媛,张尊建.复方氯雷他定缓释微丸胶囊的药代动力学与相对生物利用度[J].中国药科大学学报,2006;37(1) :49～53

[7] 温预关,代军,廖日房,等.氯雷他定口腔崩解片人体生物等效性研究[J].中国药学杂志,2007;42(2) :139～142

液质联用篇2

【关键词】广东土牛膝；液质联用；泽兰素；12,13-二羟基泽兰素

广东土牛膝为菊科植物华泽兰Eupatorium chinense L.的干燥根，具有清热解毒，凉血利咽等功效，临床上用于白喉，咽喉肿痛，感冒高热，麻疹热毒，肺热咳嗽；外伤肿痛，毒蛇咬伤等，该药材标准收载于《广东省中药材标准》（第一册）中[1]。近年来，国内不少学者对其化学成分和药理作用进行深入研究[2]，发现其中有效成分主要为黄酮类成分，而目前广泛应用的高效液相色谱/电喷雾串联质谱联用技术（HPLC/ESI-MSn）对广东土牛膝中的成分分析研究鲜有报道。

1仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent ChemStation操作系统；Acquity Quattro premier XE超高效液相色谱质谱联用仪LC/ms/ms；EYELA旋转蒸发仪；KQ2200超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；色谱柱：Water BEH C18（50mm×2.1mm×1.7μm））。

1.2 试药广东土牛膝（产地：广东、广西，均购自东莞市中药饮片有限公司）；泽兰素对照品、12，13-二羟基泽兰素对照品（自制，由中山大学药学院徐新军教授提供）；正己烷（分析纯，广州化学试剂厂）、三氯甲烷（分析纯，广州化学试剂厂）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；硅胶G（100~200目，青岛海洋化学试剂厂）、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶。

2方法与结果

2.1色谱条件以Water BEH C18（50mm×2.1mm×1.7μm）为固定相；以甲醇（A）-10mmol/L乙酸铵（B）为流动相梯度洗脱（见表1）；流速为0.25ml/min；柱温为30℃；进样量为10μL。

2.2质谱条件扫描方式为负离子扫描；离子源为电喷雾离子源；检测方式：多反映监测（MRM），电离电压为3.5kV，源温：110℃，雾化温度：350℃，雾化气：800L/h，锥孔气：50L/h；各监测离子见表2。

2.3提取和纯化取干燥的广东土牛膝，粉碎成粗粉，取该粉末0.5g，置100mL锥形瓶中，加入甲醇25mL超声提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣溶解于2mL70%甲醇中，加入预先处理好的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱（直径1.5cm，高20cm）上，用150mL70%甲醇进行洗脱，收集后面100mL洗脱液，水浴蒸干，残渣溶解加5mL甲醇溶解，得到样品溶液。分别精密吸取对照品和样品溶液10μL注入HPLC系統，进行HPLC-ESI-MSn分析。

2.4结构鉴定以泽兰素和12,13-二羟基泽兰素为对照品，用HPLC-ESI-MSn在上述色谱条件下对广东土牛膝有效部位的化学成分进行定性分析，检测到与2种对照品保留时间一致的2种化合物（以下称化合物a和b）的准分子离子峰[M-H]，由准分子离子峰确定其相对分子质量，结合二、三级质谱的碎片信息，通过与泽兰素和12,13-二羟基泽兰素对照品的相关数据信息进行对照。结果表明，样品溶液准分子离子峰和碎片峰数据与两种对照品分别完全一致，即广东土牛膝中含有泽兰素和12,13-二羟基泽兰素两种黄酮类成分。结果见图1-4。

注：泽兰素和化合物a色谱图中，离子碎片流图173.1（上）、158.1（中）和总离子流图215.2（下）；12,13-二羟基泽兰素和化合物b色谱图中，离子碎片流图231.3（上）、216.2（中）和总离子流图249.2（下）

3讨论

现代药理学表明，广东土牛膝具有抗菌[3]、中和毒素和抗炎镇痛作用，与泽兰素和12，13-二羟基泽兰素的药理作用相同，因此，笔者认为该方法能很好地作为快速识别广东土牛膝中有效化学成分的手段。

参考文献

[1]广东省食品药品监督管理局. 广东省中药材标准（第一册）[S]. 广东：广东科技出版社，2004

[2]张丹雁，王宏，赖秀珍. 广东土牛膝化学成分的初步研究[J]. 中国民族民间医药杂志，1999

[3]曾品会. 土牛膝根对白喉杆菌的抑制和对动物实验的观察[J]. 广东中医，1959

作者简介：谢仕伟，男，（1981-），广东广州人，中山大学硕士研究生毕业，主管药师，现任东莞市食品药品检验所科研负责人，研究方向为天然药物分析

液质联用篇3

液质联用技术主要采用液相色谱作为分离系统,质谱作为检测系统,从而有效实现色谱与质谱的优势互补,有效提升它们的分离能力、灵敏度以及选择性。此外,液质联用技术还能够提供相应的对照谱图,大大简化了分析试验的步骤。就目前而言,液质联用技术在我国已经发展得相对成熟,被广泛应用到了食品、环境及药物分析的各个领域。本文主要对液质联用技术在食品安全检测中的应用进行了阐述。

液质联用的原理

液质联用技术也被称为液相色谱-质谱联用技能,其分离系统为液相色谱,检测系统为质谱。样品在质谱及流动部分经过分离之后,能够被离子化,再经过质谱质量分析器从而将离子碎片依据质量数进行分开,通过检测器之后,便可以得到相应的质谱图。液质联用技术的优势

结果真实可靠

液质联用技术具有较为广阔的检测范围和较高的分析能力,即便是样品在色谱柱上没有安全分离,其也能通过特征离子将色谱图分辨出来,并在系统图库中找出相应的化合物,大大提升了分析结果的精准性和可靠性,同时还简化了分析步骤和分析时间。

准确定量分析

与以往液相色谱法一致,运用液质联用技术也是通过色谱峰的峰面积及保留时间来对标准样品进行比较来定量的。然而在以往的液相色谱中,因为分离,一个色谱峰往往受到各种因素的影响导致对化合物定量的不准确。为避免出现这类问题,可以在进行液质联用定量分析过程中使用多离子监测图或者与之相对应的特征离子色谱图,从而达到降低干扰、准确定量的效果。

液质联用技术在食品安全检测中的应用分析

液质联用技术在农药残留分析中的应用

农药在现代农业中使用越来越普及,不仅包含传统增肥剂、杀虫剂等,还包含生长促进剂以及除草剂等种类。近年来,农药及其农用化学品的大量使用给人们的健康生活产生严重影响,农产品中残留的农药问题成为当前人们关注的焦点,为此各国相继制定了很多标准予以限制。通常情况下,可以采用气象色谱-质谱法对农药残留进行检测,但是这种方法对于那些难以挥发或者热不稳定的农药并不适用。虽然液相色谱法能够有效分离难以挥发及热不稳定的化合物,比如:利谷隆、敌草隆等除草剂,但因荧光检测器及紫外线检测器的限制,导致其无法处理复杂的食品农药残留检测。为此,液质联用技术则能够有效解决这一问题。

液质联用技术在兽药残留分析中的应用

随着经济全球化以及动物源性食品国际贸易的不断发展,重大食品污染事件的发生次数逐步增加,加剧了人们对动物源性食品质量问题及安全问题的担心,并对消费者的消费信心产生严重影响。其中导致动物源性食品存在安全问题的一个重要因素就是兽药残留。一旦食品中的饲料添加剂或者兽药出现超标的情况,那么食用后就会对人身健康产生严重后果。当前,抗生素、呋喃类、激素类及转基因类等成为国际上比较关注的残留药物。

液质联用技术在食品添加剂分析中的应用

所谓的食品添加剂指的是为提升食品品质、防腐性及满足加工工艺的需要在食品中加入天然或者化学合成物质的总称,主要包含防腐剂、色素、甜味剂、营养剂、抗氧化剂以及兴奋剂等类别。在给人类带来食品多样性的同时,食品添加剂也对人体产生一定的毒性,使用量多大极易影响身体健康。为此,在对食品添加剂的使用过程中,需要对相关卫生标准予以明确指定,除了对其名称、类别、使用范围、残留量及最大使用量。在对食品添加剂的应用过程中,液质联用技术能够对其的定性定量及类型同时予以检测。最近几年以来,食品安全中的苏丹红色素事件成为人们关注的焦点。

液质联用技术在食品污染物分析中的应用

随着经济的发展和工业的不断进步,环境污染问题越来越严重,环境中的化学毒害物质带来严重污染。此外,食品中的微生物代谢和繁殖也会产生一系列对人体有害的物质。最近几年以来,微生物对食品造成污染问题及食品包装物的污染问题的发生频率一直居高不下,引起人们对食品安全的担忧。

液质联用技术在食品中微量元素分析中的应用

众所周知,在食品中含有大量与人体健康有着密切联系的微量元素。为此,食品安全问题不仅局限于食品污染或者药物残留问题,其微量元素的有害元素形态及有害浓度阈值也会对人体健康产生一定影响。这些有毒的微量元素在经过不同途径进入食物链中后,会以各种形态进行富集,达到一定程度就会对食品安全构成威胁。所以,对食品中微量元素的形态进行分析并对其生物的有效性进行研究对食品营养进行评价及食品安全控制有着十分重要的现实意义。

结语

液质联用篇4

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪 (美国Waters公司) ;Xevo G2 QTof四级杆飞行时间串联质谱仪 (美国Waters公司) , 配有电喷雾离子源-Loc kspray和Masslynx V4.1工作站;Milli-Q纯水机 (美国Millipore公司) ;XW-80A旋涡混合器 (上海精科实业有限公司) ;GL-21MC微机控制高速冷冻离心机 (湘仪离心机仪器有限公司) ;Mini-14K微型高速离心机 (杭州奥盛仪器有限公司) ;MDF-U4186S超低温冰箱 (日本Sanyo公司) ;乙腈、甲醇 (色谱纯, 德国Merck公司) ;甲酸 (色谱纯, 美国Fluka公司) ;亮氨酸脑啡肽 (美国Sigma-Aldrich公司) 。

为排除性别因素的影响选用清洁级雄性豚鼠 (50只) , 体质量250~350 g, 由长沙市开福区东创实验室动物科技服务部提供。采用眼眶采血法取血后经4℃、3 000 r/min离心10 min分离血清, 立即于-80℃冻存备用。

1.2 方法

1.2.1 样本前处理

血清样本室温解冻后, 取100μL血清加入400μL甲醇涡旋混匀, 快速震荡30 s, 静置10 min后, 13 000 g、4℃离心15 min, 转移上清液置样品瓶内, 待测。此外, 由各样本上清液等容混合后的溶液作为质控样品 (QC) 参与分析[8,9,10]。

1.2.2 色谱条件

Waters Acquity BEH C18色谱柱 (2.1 mm×50 mm, 1.7μm) ;流动相:0.1%甲酸水溶液 (A) -乙腈 (B) ;梯度洗脱 (0~4 min:B 5%→30%;4~6 min:B 30%→40%;6~8 min:B 40%→40%;8~12 min:B 40%→60%;12~18 min:B 60%→95%;18~20 min:B 95%→95%;20~21 min:B 95%→5%;21~23 min:B 5%→5%) ;流速:0.3 m L/min;柱温:40℃。

1.2.3 质谱条件

电喷雾离子源采用正离子模式 (ESI+) 检测;毛细管电压 (capillary voltage) 3.5 k V, 锥孔电压 (sampling cone) 45 V, 离子源温度 (source temperature) 110℃, 脱溶剂气温度 (desolvation temperature) 330℃, 锥孔气流量 (cone gas flow) 50 L/h, 脱溶剂气流量 (desolvation gas flow) 600 L/h, 萃取锥孔 (extraction cone) 4.0 V;每0.2 s采集1次谱图;数据采集范围:100~1 000 m/z;为确保质量的准确性和重复性, 应用亮氨酸-脑啡肽溶液 (leucine enkephalin, [M+H]+=556.2771 Da) 作为锁定质量 (lockmass) 。

1.3 统计学方法

将由上述UPLC-QTof/MS平台分析得到的数据导入Masslynx V4.1软件, 经峰识别、峰对齐和基线矫正等前处理后再进行多维统计分析。

2 结果

2.1 血清前处理方法的选择

样品前处理在代谢组学实验中十分重要, 它决定着样品的信息含量、准确性及柱残留情况[11]。本实验比较了乙腈、甲醇两种常用的有机溶剂处理血清样本的方法, 结果显示, 当甲醇达到4倍体积时较乙腈相比, 不仅沉淀蛋白的效果充分均匀, 同时又保证了检测的信息量, 见图1。因此, 最终确定以4倍体积甲醇作为血清样本沉淀的处理溶剂。

2.2 质谱条件的优化

本试验采用的Waters Acquity液质联用仪配有ESI离子源和四级杆飞行时间质谱检测器。为获得尽可能多的碎片信息和较高的响应值, 最大限度地减少质谱信号中的噪音影响, 还需对质谱条件进行优化。考虑到血清样品成分非常复杂, M/Z较小碎片的信号强度比较大, 容易对有用信息造成干扰, 就采用M/Z范围在100~1 000的正离子全扫描模式, 以提高有用信号的信噪比。对样品离子化影响较大的参数主要有毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气流量、锥孔气流量、脱溶剂气温度、离子源温度等, 根据文献调研和预实验摸索在ESI+模式下分别对上述各参数进行了多组条件下的比较, 具体如下:毛细管电压 (3 000、3 500和4 000 V) ;锥孔电压 (15、30、45、50和65 V) ;源温 (100、110和120℃) ;去溶剂化温度 (300、330和350℃) ;去溶剂化气流 (500、600和750 L/h) ;锥孔气流 (40、50和60 L/h) [12,13]。通过综合比较正离子模式下各项参数改变时血清代谢物出峰数量及强度的变化, 筛选出本课题研究用的血清样品离子化的最佳质谱条件, 具体见1.2.3。

2.3 流动相的优化

血液提取样本的代谢组学通常使用乙腈-水体系进行分析, 考虑到弱酸性条件有利于正离子模式下样品的离子化, 本实验流动相采用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶剂系统, 并在不同梯度条件下进行洗脱。结果见图2, 条件6 (参照1.2.2部分) 的梯度洗脱方法能够获得较好的分离效果而且分析时间相对较短, 因此将其确定为梯度洗脱条件。

2.4 方法学考察

2.4.1 仪器精密度

取同一样本, 按照1.2.2处理样品后连续进样6次得到代谢指纹图谱, 随机选取其中9个峰以考察保留时间、峰面积和峰强度。保留时间RSD均小于1%、各峰面积和峰强度RSD均小于10% (见附表) , 说明在样本分析期间仪器的精密度良好, 满足分析要求。

2.4.2 血清样本24 h稳定性

取同一样本, 按照1.2.2处理样品后, 分别于0、2、5、8、12和24 h进样检测, 所得图谱叠加情况见图3A, 保留时间和离子响应稳定。为了考察含量较低化合物的精密度, 对色谱图进行了局部放大 (见图3) , 同样发现保留时间基本保持不变, 峰强度差异也很小, 说明该血清样品溶液至少在24 h内保持稳定。

2.4.3 血清样本冻融循环稳定性

对同一份血清样本分别进行1、2、3、4次冻融处理 (每组重复处理2次) , 考察冻融循环后样品的稳定性。具体步骤如下:从-80℃冰箱取出1份血清样本室温下解冻, 吸取100μL进行样品制备, 再将剩余的血清继续冻存于超低温冰箱, 第2天使用同样的方法进行实验, 如此重复4次。将检测结果进行主成分分析 (PCA) , 从其三维得分图 (见图4) 中可看出, 经3、4次冻融后的样本明显与前2次发生了较大偏移, 提示在进行血清样本分析时, 冻融次数最好不超过2次。

2.5 数据可靠性分析

由于运用非靶向代谢组学方法得到的总离子流图受到标准品定位的限制, 同时液质联用分析平台本身存在过强的背景信号干扰, 重现型及线性响应易受到影响, 因此其可靠性试验主要是运用模式识别方法, 对大批量的样本进行代谢组学分析时穿插质量控制样本 (QC) 监测所得数据的可靠性[9,14]。整个实验过程中共检测15个质控样本, 样品分析前连续测定10次QC样本, 使系统达到平衡, 往后每分析10个血清样本时即穿插1次QC样本的检测。图5是在正离子检测模式下, 将15次QC样本经UPLC-QTof/MS检测的结果进行PCA分析后, 各样本在第一主成分上的投影结果。结果表明, 分析系统通过对前10次质控样本的检测逐渐达到平衡, 之后5次质控样本的检测提示分析系统在样品分析过程中能保持相对平稳, 因此, 认为本批样品分析结果可靠。

3 结论

液质联用篇5

1 材料

1.1 药品与试剂

OA标准品 (中国药品生物制品鉴定所批号:110709-200505) , 内罗红霉素 (roxithromycin, ROX, 中国药品生物制品检定所, 批号130351-0608) , 甲醇 (色谱纯) , 试验用水为乐百氏纯净水, 其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

岛津LCMS-2010A液-质谱联用仪, 含自动进样器、在线脱气系统、柱温箱、二元梯度泵, Sigma 3K30台式超高速冷冻离心机。

1.3 动物

SD大鼠, 雄性, 体重 (200±20) g, 南昌大学医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 质谱条件

色谱柱:Shimadzu Pack VP-ODS C18 5μm×150mm×2.0mm I.D;流动相:乙腈∶水 (含0.1%冰醋酸铵) =53∶47 (v/v) ;流速:0.2m L/min柱温:35℃;采集方式:选择性离子监测;离子极性:负离子;离子化方式:电喷雾离子化;检测对象:齐墩果酸M/Z=455.70;罗红霉素M/Z=734.30;检测电压:1.5k V, 雾化气体流速2.0L/min;曲型脱溶剂装置温度250℃;加热块温度250℃。

2.2 血浆样品的处理

取0.1m L血浆, 精密加入20μL内标ROX, 40μL 0.1mol/L Na2CO3溶液, 混匀后加4.0m L乙酸乙酯, 振荡4min, 4500rpm离心10min, 取上清液3.0m L, 置50℃干浴锅中氮气挥干, 以0.3m L甲醇溶解残渣, 再经18000 rpm离心10 min后, 取5μL进样, 用峰面积进行定量分析。

3 结果

3.1 色谱行为

血浆中杂质对测定无明显干扰, ROX峰保留时间为1.9min, OA峰保留时间为1.5min。专属性色谱图见图1。

3.2 线性范围及最低定量下限

取离心管数支, 分别精密加入不同量的OA标准溶液20μL, 再加入空白血浆180μL, 涡旋混匀成25, 50, 100, 200, 400, 600, 1200ng/m L标准含药血浆, 按“2.2”项操作, 记录色谱图, 计算OA峰面积和内标峰面积的比值, 计算OA面积 (Aa) 和内标峰面积 (Ai) 的比值f。以f对c作回归计算, 得回归方程:Y=0.01343X-0.06263 (r=0.9997) 。线性范围为:25~1200ng/m L按上述条件测得OA在血浆中的最低定量限为25ng/m L。

3.3 回收率及精密度试验

配制浓度为50、400、1000 ng/m L OA标准血样, 按本文“2.2”项操作, 每一浓度制备并测定5个样品, 3d连续制备并测定3个分析批。计算其回收率及精密度符合要求

3.4 稳定性试验

精密配制含OA50、400、1000ng/m L的标准血样, 分别经由血样处理后室温放置0、6、12h及在-20℃冷冻保存3d后测定血样中OA的浓度, 考察其稳定性, 结果表明稳定性良好。

4 结论

本文建立并优化了大鼠血清中齐墩果酸浓度的高效液相色谱-质谱联用测定法。方法快速简便, 灵敏度高, 重现性和专属性好。

参考文献

[1]陈新谦, 金有豫, 汤光.新编药物学[M].15版.北京:人民卫生出版社, 2003:470.

液质联用篇6

1957年实现了气相色谱与质谱的串联应用, 1977年液相色谱-质谱联用仪正式投放市场生产。1989年J.B.Feen开发了电喷雾离子化技术 (electro spray ionization, ESI) 。20世纪80年代诞生的大气压离子化接口 (Atmosphere Pressure Interface, API) 技术对于生物质谱有了迅速的发展。1999年API接口的LC/MS/MSQ/TOF投放市场。近年来的质谱技术与液相色谱和毛细管电泳等高效分离技术的串联应用, 在极性强、低挥发的复杂难分离混合物方面取得了进步, 大大提高了色谱-质谱联用的分离效率, 从而使得色谱-质谱联用技术在临床检验领域得以广泛的使用。

2 质谱原理

质谱是使分子带电, 相同物质形成固定的质荷比, 之后利用不同的选择技术达到检测目的。按选择方式不同可以质谱分为以下类型:

四极杆质谱仪 (QMS) 直接对质荷比进行选择, 定量能力突出, 但分辨能力不足, 其他相近质荷比物质或同位素对结果产生干扰。没有串级能力, 定性能力不足。

三重四级杆 (QQQ) 提供了串级功能, 可以在高电压下让样品撞击惰性气体分子, 从而形成固定子离子碎片, 拥有选择反应检测扫描 (SRM) 、多反应检测扫描 (MRM) 、单离子检测扫描 (SIM) 、中性丢失 (Neutral loss) 等功能, 可以很好的定性, 也对特征基团的结构研究有很大帮助。同时它的定量能力非常强, 拥有较好的定性能力, 但同样容易受到相近质荷比物质的干扰。

飞行时间质谱仪 (TOFMS) 利用不同质荷比在电场中飞行时间不同进行检测, 分辨能力非常好, 可以排除同位素干扰, 而且质荷比上限高。它也是速度最快的质谱, 每秒可以进行2～100张高分辨全扫描谱图。QTOF串联了QMS为质量过滤器, 能提供更好的定性能力。

离子阱 (Ion trap) 利用电场或磁场将离子捕获在一定范围内, 逐渐增大射频电压, 从而让质荷比从小到大的离子逐次排出并记录获得质谱图, 可以很方便的进行多级质谱分析, 物质结构鉴定能力强。拥有了QMS的QTrap具备了多级串联功能, 同时具备了中性丢失、MRM、SRM功能, 非常适合解析未知结构样品。串联了TOP的离子阱-飞行时间质谱 (Trap TOF) 以3D离子阱作为质量选择器, 结合了离子阱的多级质谱和飞行时间质谱的高分辨能力, 同时具有了串级和高分辨能力, 适合定性未知未知样品。

3 电离源离子化机制

电喷雾电离 (ESI) , 溶液中样品流出毛细管喷口后, 在雾化气和强电场作用下, 溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发, 电场增强, 离子向液滴表面移动并从表面挥发, 产生单电荷或多电荷离子。

大气压化学电离 (APCI) , 流动相和样品流经电离源时, 通过电晕针放电, 使溶剂电离, 形成气体等离子体, 样品经过等离子体时, 通过质子转移电离成离子。APCI是软电离, 产生单电荷峰, 很适合测定极性弱的小分子化合物。

4 液相色谱-质谱串联技术在临床检测的优势

早期开发了很多高效液相色谱检测方法, 但是介于检测器检测方法的限制, 不能对分离物进行很准确的定性, 需要把检测物与标准品出峰时间进行比对。对仪器的稳定性和日常维护有很高要求, 而且生物样品成分非常复杂, 有时会出现保留时间相同或非常相近的不同物质, 造成假阳性。对于一些物质紫外、荧光、电化学特征不明显的物质, 也没有很好的办法对其进行检测。随着液相色谱-单极质谱串联技术的诞生, 可以对物质质荷比进行检测, 较好的解决了检测物检测特征不明显的问题, 但是生物样品存在分子量相同结构功能不同物质, 而且在电喷雾离子化过程中会出现倍数电荷现象, 对临床检测结果产生影响。随着飞行时间质谱、离子阱和多级串联质谱的诞生, 很好的解决复杂生物分子定性问题。四级杆质谱有选择能力同时具备很好的定量能力, 三重四级杆质谱引入二级质谱形成串联后拥有多种扫描方式 (SRM、MRM、SIM、Neutral loss) 提供更加丰富的分子信息, 而且通过多反映监测模式可以快速的对目标分子进行定量。飞行时间质谱有很高的分辨率, 对于同位素分析提供很大帮助。离子阱的多级质谱分析对复杂分子定性分析能力有很大提高。

5 氨基酸筛查

氨基酸在人体中有很重要的作用, 与很多代谢有关, 多肽和蛋白质的合成的基础物质, 区别于糖类和脂肪的物质, 与生命活动有着密切的关系.其代谢过程出现紊乱会导致疾病的[1], 如尿素循环中的酶缺陷会导致尿素合成障碍, 血氨升高, 而过量的血氨具有神经毒性[2]。从新生儿筛查角度, 时间是很重要的因素, 对于大多数氨基酸代谢疾病的新生儿, 最初的氨基酸筛查是正常的, 但随着饮食、蛋白质和的合成和一些其他因素导致氨基酸浓度偏离正常值[3]。有些疾病在新生儿可以临床观察的到, 但是有些症状不明显, 而且筛查结果会被新生儿饮食、样品收集时间和方法很多因素影响[4]。虽然串联质谱是中很好的检测方法, 但也不能保证100%精确。

用质谱技术分析滤纸采集的血样品的方法开发于1990年, 最初的方法是利用单级质谱测量样品中苯丙氨酸 (Phe) 含量, 其导致苯丙酮尿症的发病[5]。这种方法的建立代表质谱技术这在氨基酸检测方面的可行性, 同时滤纸采血分析也是一种别于传统的液体分析方法。

6 样品采集

采取新生儿血标本是筛查工作的最基本第一步, 但是也是最重要的一步, 对之后的筛查结果产生重要影响。采血采用国际上统一的Guthrie法。采血滤纸要求与标准滤纸一致, 厚度、质地、吸水性、渗水性必须相等而且均一性很高的特制纯棉滤纸。因为新生儿筛查是采用微量分析法进行的一次性检查, 要求灵敏度和精确性很高。多数实验室采用国际认可的Schleicher&Schuell 903特种滤纸, 可以很好的保证筛查质量。采血时间要在新生儿出生72h, 而且吃足6次奶后进行, 否则有可能在无蛋白负荷的情况下出现PKU筛查阴性。采血部位为婴儿足跟内侧或外侧, 为了使血流充分, 可按摩和热毛巾热敷婴儿足, 在酒精消毒后用采血针刺穿, 弃掉第一滴血后收集之后的血, 并且使血充分渗透到滤纸背面, 过程中应避免挤压采血而引起溶血, 不要直接接触造成人工污染, 。同时要求每个婴儿采3个血斑, 每个血斑直径不小于10mm。采血完成后将滤纸平放在清洁处自然晾干, 然后装入塑料袋, 并在4℃冰箱保存, 定期统一送到实验室进行检测。

7 样品处理与测试

用打孔器在滤纸血斑打直径为5.5mm圆片, 放入PV管中, 加入200μL甲醇萃取, 振荡15min, 离心后取100μL上清液加入另一个PV管, 氮气吹干.加入100μL HCL-正丁醇, 在超声恒温水浴65℃酯化30min, 氮气吹干, 向PV管中加入100μL甲醇上机测试[6]。

所有的α-氨基酸都产生甲酸这个中性分子, 用质谱MS/MS分析需要对氨基酸进行衍生化以增加电离, 通常做法是加入正丁醇超声恒温水浴。经过丁酯化的α-氨基酸在碰撞诱导电离 (CID) 后产生一个102Da的中性分子丁酰甲酸 (HCOOC4H8) , 使用中性丢失扫描可以很准确的对其定量。而精氨酸需要进行NL 161Da扫描;瓜氨酸和鸟氨酸需要进行NL 119Da扫描;甘氨酸产生56Da碎片[7]。

8 苯丙酮尿症筛查

在新生儿筛查中开展最为广泛的是苯丙酮尿症筛查, 病因是由于肝脏中苯丙氨酸羟化酶缺乏或者活性减低从而导致苯丙氨酸代谢障碍的一种遗传疾病。苯丙酮尿症又分为经典型苯丙酮尿症, 由于苯丙氨酸羟化酶缺乏导致的;另外一种是四氢生物蝶呤 (BH4) 缺乏症, 由于苯丙氨酸羟化酶的辅助酶BH4缺失造成。

早期利用Phe作为PKU的唯一指标, 从而容易导致结果的假阳性[8], 为了减少这种现象, 现在使用Phe与Tyr的摩尔比值作为检测指标。从转化过程来看, 苯丙氨酸脱氢酶的缺失会阻碍Phe转化为Tyr, 因此Tyr主要是通过饮食摄入, 但这并不能保证体内Tyr的浓度, 会导致随着时间的增长Tyr的浓度反而降低, Phe的浓度升高, 因而Phe与Tyr的摩尔比值要比单一的Phe浓度更具有临床意义。

但采取Phe与Tyr的摩尔比值并不能完全消除假阳性, 由于Tyr的溶解度不好, 通过静脉注射给新生儿的氨基酸中Tyr的含量很少, 这导致了检测中Tyr没有伴随着Phe升高而升高导致结果异常[9]。这种假阳性可以通过采集时间的改变而消除。

另外一种情况是新生儿的酶活性不高, 影响肝功能, 或者是采血滤纸过饱和影响到结果。这时可以检测血中全氨基酸, 因为采血引起的结果异常导致全部氨基酸量的改变, 从而使Phe与Tyr的摩尔比值合理。

当然, 如果利用体外补充氨基酸的方法, 会导致血中氨基酸一定程度的升高[10], 例如Leu、Ala等, 有可能导致Phe的升高, 但由于Tyr溶解度的问题使其浓度提高不明显, 这引起了Phe与Tyr的摩尔比值的升高, 从而引起假阳性。这时通过测量Phe与Leu的摩尔比值, 就可以消除PKU的可能性。

9 质谱筛查面临的挑战

9.1 费用问题, 液相色谱质谱联用仪费用很高, 人员培训和日常消耗也很大, 需要精心维护。

9.2 新生儿筛查的主要挑战是建立能够避免假阳性和最小化假阳性的分

析临界值, 通常假阳性占到异常结果的90%, 对新生儿家庭造成心理压力和费用压力。这需要平衡好假阳性的接受程度和诊断疾病的需要, 还要对可能产生假阳性的因素如:出生体重低、早产、营养修饰等。

摘要：第一个应用于临床的新生儿筛查的氨基酸代谢病是苯丙氨酸障碍, 导致苯丙酮尿症, 需要早期筛查和治疗, 否则引起严重的精神发育迟滞。之前新生儿筛查主要采用细菌抑制法、酶免疫吸附实验等, 一种方法针对一种疾病, 而且分析周期长, 假阳性高等缺点。而液质联用具有高选择性、速度快、检出限低和多种离子选择模式, 可以很大程度扩展筛查范围, 而且可以一次实验同时筛查多种疾病, 大大提高筛查效率。

关键词：液质联用技术,新生儿,氨基酸筛查

参考文献

[1]Shintaro I, Stephen VD, Kazutaka S, et al.Determination of metabolic flux changes during fed-batch cultivation from measurements of intracellular amino acids by LC-MS/MS[J].J Biotechnology, 2007, 128 (1) :93-111.

[2]杨艳玲, 孙芳, 钱宁, 等.尿素循环障碍的临床和实验室筛查研究[J].中华儿科杂志, 2005, 43 (5) :331-334.

[3]Uttam G, Majed D.Expanded newborn screening of inherited metabolic disorders by tandem mass spectrometry:Clinical and laboratory aspects[J].Clinical Biochemistry, 2006, 39 (4) :315-332.

[4]Donald HC, Theodore AK.A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing[J].Clinical Biochemistry, 2005, 38 (4) :296-309.

[5]Lehotay DC, Hall P, Lepage J, et al.LC–MS/MS progress in newborn screening[J].Clinical Biochemistry, 2011, 44 (1) :21-31.

[6]Mariella Z, Lorena G, Franco Z, et al.Method for the quantification of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening by HPLC–ESI–MS/MS[J].J Chromatography B, 2006, 831 (1-2) :267-273.

[7]W.A.Huub Waterval, Jean L.J.M.Scheijen, Marjon M.J.C.Ortmans-Plotman, et al.Quantitative UPLC-MS/MS analysis of underivatised amino acids in body fluids is a reliable tool for the diagnosis and follow-up of patients with inborn errors of metabolism[J].Clinica Chimica Acta, 2009, 407 (1-2) :36-42.

[8]Ji-Seon J, Hee-Jung S, Yong-Moon L, et al.Determination of phenylal-anine in blood by high-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection to diagnose phenylketonuria[J].J Chromatography A, 2009, 1216 (30) :5709-5714.

[9]A.MacDonald, J.C.Rocha, M.van Rijn, et al.Nutrition in phenylke-tonuria[J].Molecular Genetics and Metabolism, 2011, 104 (Suppl) :S10-S18.

液质联用篇7

1 中药分析中液质联用技术的应用

使用LC-MS对中药的柴胡皂苷类的化学成分进行研究, 其所得到的结果, 总会体现为总离子流图的不同化合物与多级质谱图23个化合物进行确定。而对静脉注射输液用的木酚素进行其中药成份的分析, 我们使用HPLC/ESI-MS/MS对不同的生物碱裂解进行, 药效保留的时间, 质荷比、多级串联生物质谱数据等进行研究分析, 所得到了18种生物碱成份。

使用UPLC-ESI LTQ Orbitrap质谱对三芪进行化学成份的分析得知, 精确的对其相对分子量信息与多级质谱的信息结合光谱行为, 我们研究分析出其内的39个成份组成, 通过以上的例子我们可以看出, 使用液相色谱 (LC-TOF-MS) 进行全描扫的方式, 可以更好的对分子量进行精确的测量, 这种对中药成份的测量方式, 可以准确的应用于对中药成份的分析, 与对中药化合物的结构鉴定过程中。

2 中药质量上的控制与研究

对中药进行质量的控制, 是指对中药的成份或是具有指标性特征的成分进行其成份的定性与相关含量的确定, 我们根据相关的研究分析可知, 中药功效检测, 不是由一个或几个指标所组成的, 而且其中具有许多不同的成份所共同组成的, 另外, 中药单个的药效指标控制向多指标发展, 是现在对中药进行质量控制的重要发展趋势。

通过使用HPLC-MS对中药的质量控制可以根据其检测的优势, 在进行中药的药效分析中, 发挥其检测上的优势, 例如, 在进行参甘冠心合剂的检测中, 这种中药是用来进宪冠心病与心绞痛的治疗方剂, 成份内含有黄酮类、苯丙素苷类等相关化学成份群, 我们通过使用相-三重四极杆质谱联用技术, 对参甘冠心合剂中的多种中药成份进行分析测定, 这就解决了单个指标性成分测试的不足, 实现了多种成分进行定量测定。

3 药代动力学研究

我们进行中药的药代动力学研究, 就是为了检测生物样品中所存在的一些微量成份, 还在微量成份中所包含的原药与代谢物等, 通过对LC-MS进行分析与研究, 以它特殊的鉴定优势, 能够达到生物样品分析中的要求, 同时也可以测定我组分浓度的复合制剂样品, 与此同时, 还能够对代谢物进行定性。在中药药代动力学的研究中LC-MS逐渐成为不可缺少的工具, 了解氧化苦参碱转化为苦参碱在体内的数量, 有利于在临床给药时, 在药物剂量和药物发挥药效的掌握。通过采用液相-串联质谱 (LC/MS/MS) 法来测定, 测定ig和iv氧化苦参碱后氧化苦参碱和代谢产物苦参碱的血药浓度和ig及iv苦参碱后苦参碱的血药浓度, 对氧化苦参碱在食蟹猴体内的转化率和代谢特征进行了具体的分析与研究。

使用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱议测定决明子蒽醌类成分, 其中橙黄决明素、黄决明素、决明素和1-去甲基决明素为在大鼠血浆中浓度, 根据这些指数进行药代动力学的研究, 这个指数反映了大鼠体内吸收决明子的全部过程, 血清样品使用UP-LC/TOF-MS进行分析, 调查了双龙方也就是人参和丹参中人参皂苷、丹参酚酸在大鼠体内药代动力学两种参数, 测定出10种成分的峰浓度为双龙方中丹参素、丹参酚酸G、丹参酚酸K、丹参酚酸M、人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、RD、M-Rb1、M-Rd, 从中清楚了双龙方中有效部分是人参总皂参总酚酸在大鼠体内的药代动力学规律, 为临床合理用药提供了参考依据。

4 中药的代谢分析和研究

使用LC-MS进行中药代谢物的分析时, 因这种技术的分析具有选择性大、灵敏性较高的特点, 可以得到化合物信息较多。对于药物代谢药物的内源化学物的分离与建东具有有利的作用, 也是对中药代谢物进行分析识别的最为直接与有效的方式。

例如, 黄连解毒汤对于鼠具有解毒与清热的作用, 其治疗的效果明显, 我们使用LC-FT-ICR-MS法, 对其大鼠服用后, 其血浆内所含的药量, 进行样品的检测, 确定其内的结构, 对其样品进行检识。通过分析与研究可知, 检测样品共有38份血液样本, 其中的22份样品, 其原形成份中具有16种代谢物, 这些存在的代谢物中, 除了M11是一相的代谢产物外, 其他的代谢产物多以在大鼠体内存在。其中也包括葡糖醛酸和硫酸化产物的存在, 采用LC-IT-TOF-MS对大鼠体内所含有的藤黄酸的代谢物在胆汁中的含量进行检测, 其检测结果显示, 藤黄酸快速地代谢成为三个代谢物, 识别出的代谢物分别是3, 4-双氢藤黄酸、10-羟基藤黄酸和9, 10-环氧藤黄酸。

5 代谢组学研究

代谢组学是指, 当生物系统受到来自体外的刺激与干扰后, 对其内源性代谢物所产生的整体性与个体性的变化, 通过对其变化的规律进行掌握的科学, 这也是对生物代谢进行研究方法的证明。进行检测的样本, 可以是生物所产生的体液、细胞培养和组织细胞提取物和组织等。基于核磁共振光谱 (NMR) 、质谱 (MS) 为核心的检测分析。Q-TOF质谱仪可以觚析未知化合物, 所以适合寻找及鉴定与疾病有关的标志物结构。

参考文献

液质联用篇8

氯霉素是一种有效的广谱抗生素。其化学结构为对硝基-D-苏阿糖型-二氯乙酰氨基-1,3-丙二醇,易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙醇等有机溶剂,其结构中有苯环等效发色基团存在,在275~280 nm处有最大紫外吸收峰。对于很多种类的真菌、霉菌等,氯霉素都具有很强的抑制作用,在海产养殖业曾被广泛应用。但由于低浓度的氯霉素药物残留会诱发多种致病菌如大肠杆菌、沙门菌等的耐药性,还会引起人体粒状白细胞缺乏症、骨髓造血功能、障碍性贫血等其他恶性血液性疾病,对人体健康构成潜在性的危害,引起世界许多国家和地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素在动物组织中不得检出。

本文参考《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20756-2006),将该方法引入到实验室,测定海产品中氯霉素含量,分析了测定海产品中氯霉素含量的步骤和方法带来的不确定度,并对测量氯霉素含量不确定度进行了评定。

1实验部分

1.1试剂与仪器

高效液相色谱质谱联用仪:LCMS-8030(日本岛津公司);液相色谱柱:C18;电子分析天平:XS205(METTELER TOLEDO);氯霉素标准物质:纯度99.0%(Dr.E公司)。

1.2测定方法

取鱼、虾肌肉组织用肉类组织粉碎机粉碎。然后称取样品5 g(精确至0.01 g),置于50 m L离心管中,加入15 m L 1%氨化乙酸乙酯,5 g无水硫酸钠,均质提取30 s,4000 r/min离心5 min。重复提取1次,合并上清液,定容50 m L,取10.0 m L乙酸乙酯提取液在45℃浓缩至干,用流动相复溶解并定容至2.0 m L,过0.22μm滤膜,上机进行测定。测量流程如图1所示。

1.3数学模型

测定海产品中氯霉素含量按(1)公式计算。

式(1)中,X为试样中氯霉素含量,μg/kg;c为在标准曲线拟合读取的氯霉素样品溶液浓度,μg/L;V为样品最终定容体积,m L;m为样品的称样量,g;r为回收率。

1.4测量不确定度来源

结合样品的处理过程和仪器测定过程,分析测量不确定度主要有以下的来源:样品取样的随机性和在称样是用到电子分析天平,其测量的随机误差构成样品称样量的不确定度;用来校准未知样浓度的标准拟合曲线的不确定度;定容体积引入的不确定度;提取、浓缩、转移过程的误差;仪器精密度和重复性引起的不确定度;LC/MS仪器测定及校准引入的不确定度;标准溶液配制所产生的不确定度。测定氯霉素含量的步骤及不确定度来源见图2。

2不确定度评定

2.1氯霉素标准工作溶液浓度的不确定度

氯霉素标准工作溶液配制方法为:准确称取氯霉素标准物质0.010 0 g,置于含有少量甲醇100 m L容量瓶中,溶解后用甲醇溶解定容,得到氯霉素标准储备液,浓度为100 mg/L;然后取1.0 m L氯霉素标准储备液,置于100 m L容量瓶中并用甲醇定容。

氯霉素标准使用溶液的浓度按式(2)计算。

式(2)中,配制氯霉素标准使用液溶液浓度用C(m g/L)表示;v1为移取1.0 m L氯霉素标准储备液体积,v2为两次定容的体积相乘。

2.2称量过程物质带来的不确定度

2.2.1称取氯霉素标准物质质量带来的不确定度

由于称取氯霉素标准物质采用精度为0.000 1 g的电子分析天平,这个不确定度是由电子分析天平校准不确定度引入,对测定结果的影响很小,可以忽略不计。

2.2.2氯霉素标准物质含量的不确定度。

因为没有绝对纯的物质,氯霉素标准物质的绝对含量不可能为100%,按照购买有资质机构提供的氯霉素标准物质证书,显示氯霉素含量的不确定度为:u(m)=0.5%。

2.2.3容量瓶定容体积的不确定度

使用前对容量瓶进行检定,根据具有资质的机构给出的检定证书,100m L容量瓶的不确定度为:u1(V1)=u2(V3)=0.05 m L;

同样,1.0 m L可调移液器具有资质的机构给出的检定证书显示不确定度为:u3(V2)=0.034 m L。

综合上述的各个因素,氯霉素溶液浓度的不确定度为整个标准物质配制过程合成相对标准不确定度,结果为:

2.3液质联用仪测量引入的不确定度

液质联用仪测量引入的不确定度可根据液质联用仪校准证书提供:U=5%,k=2,液质联用仪测量引入的相对不确定度为:u(S1)=5%/2=0.025。其中,引入的为以下几个方面:自动进样器;仪器的调谐校准;雾化器的雾化效率稳定性;质量传输稳定性;质量漂移的准确性;标准工作溶液的不确定度等。由于标准和样品测定同样受到B类不确定度影响,液质联用仪测定氯霉素含量主要是有拟合标准曲线引入不确定度。

2.4样品称量引入的不确定度

称样5.00 g,天平的检定证书给出MPE为±0.05 g,取矩形分布,导致的不确定度为:

2.5前处理操作过程引入的不确定度

依据所述方法,对加标样品做6次前处理平行实验,测定结果重复性的相对标准偏差为:RSD(%)=5.19%,由前处理操作过程引入的相对标准不确定度即为相对标准偏差RSD(%)=0.051 9%在不确定度公式中用urel(rep)表示。

3合成相对标准不确定度

将上述的整个检测流程引入的不确定度,计算测定水产品中氯霉素的合成相对标准不确定度为:

在根据标准不确定度的公式得到:

4扩展不确定度与测量结果表示

根据扩展不确定度的定义,取包含因子k=2时,则测定水产品中氯霉素含量扩展不确定度为:U=k×u(W)=0.58μg/kg。

用国家标准方法GB/T 20756-2006,测定结果含量为5.0μg/kg时,氯霉素测量结果应表述为:W=(5.0±0.58)μg/kg,k=2。

5结语

对氯霉素测量结果不确定度贡献较大的分量有前处理操作过程引入的不确定度和液质联用仪测量引入的不确定度。水产品中氯霉素含量为5.0μg/kg时,氯霉素测量结果应表述为:W=(5.0±0.58)μg/kg,k=2.测量结果的扩展不确定度为0.58μg/kg(k=2)。