分泌表达（精选九篇）
分泌表达 篇1
血管能抑素(Canstatin)是一种新的血管生成抑制因子,我们前期的研究证明血管能抑素N端(Canstatin-N)能够通过抑制新生血管的增殖[1]。研究生产重组Canstatin-N蛋白是深入研究开发Canstatin-N作为治疗血管增生性疾病的药物的前提。毕赤酵母具有营养要求低、繁殖迅速和分泌极少量自身蛋白而有利于表达产物的纯化等有特点[2,3]。三磷酸甘油醛脱氢酶启动子是组成型强启动子[4]。本项目首先研究用毕赤酵母的GAP启动子调控,在毕赤酵母中组成型分泌表达Canstatin-N。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和细胞
毕赤酵母菌株GS115和毕赤酵母表达质粒pGAP9K由中山大学罗进贤教授实验室提供。人脐静脉细胞(ECV304)购自中山大学细胞中心。
1.1.2 主要试剂和设备
EcoRⅠ(50U/μl)、NotⅠ(50U/μl)是Takala公司产品;T4 DNA连接酶(5U/μl)是Promentas公司产品;G418由Sigma公司生产。实验所用的试剂均为分析纯。 PCR引物由北京华大公司合成;DNA序列测定由上海生物工程公司完成。
PCR仪:Bio-RAD公司产品,型号 Biometra;电转仪:Bio-RAD公司产品,型号 Micropulaer;荧光显微镜:ZEISS公司,型号 AX 10。
1.1.3 培养基
培养基的配置按照Invitrogen公司提供的操作手册[5],用LB培养基培养大肠杆菌,用YPD培养基培养毕赤酵母。
1.2 方法
1.2.1
质粒DNA的提取、限制性DNA内切酶酶切、粘末端DNA的连接和质粒DNA的转化:均参照文献[6]的方法。
1.2.2 将毕赤酵母表达载体转化于毕赤酵母和筛选毕赤酵母重组子
按照Invitrogen公司提供的操作手册用山梨醇制备感受态毕赤酵母细胞,用电压1 500V,电阻200Ω将毕赤酵母表达质粒pGAP9K-can-N转化于P.pastoris GS115。筛选高G418抗性重组子[7]作为工程菌。
1.2.3 发酵毕赤酵母工程菌
将构建的毕赤酵母工程菌GS115(pGAP9K-can-N)接种于YPD培养基,30℃振荡培养16～18h至A600=2～6作为种子液。然后将种子液按照1/50的接种量转种于新的YPD培养基中,30℃摇床发酵2d。每24h取样1次。将上清液进行SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况。
1.2.4 血管内皮细胞凋亡实验
血管内皮细胞凋亡实验是应用DeadEndTM Fluorometric TUNEL System (Promega)试剂盒进行,实验方法按照试剂盒的说明书进行。
细胞凋亡实验应用DeadEndTM荧光TUNEL系统(Promega公司)试剂盒,并用荧光显微镜观察结果。具体操作和结果分析是按照试剂盒说明。实验原理是细胞凋亡发生的DNA裂纹与DeadEndTM荧光TUNEL系统反应显示荧光,然后通过荧光显微镜检测。实验组的每个测试加入0.125μg Canstatin-N蛋白,而对照组的每个测试加入等体积的PBS。
2 结果与分析
2.1 构建表达载体构建
根据目标血管能抑素N端的DNA序列,设计如下一对引物:
上游引物:5’ CCTTGAATTCGTCAGCATCGGCTACCTC 3’;
下游引物:5’gAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCA 3’。
应用上述的上下游引物,从含有人血管能抑素基因的pET-can载体中扩增编码人血管能抑素N端1～89氨基酸的基因片段(canstatin-N)。将PCR扩增产物插入pGAP9K的的EcoRⅠ和NotⅠ的位点,获得含血管能抑素N基因的表达载体pGAP9K-can-N (图1) 。将pGAP9K-can-N 转化大肠杆菌DH5α,提取质粒DNA,用EcoRⅠ和NotⅠ酶切 能够切除符合canstatin-N的分子量(图2),证明canstatin-N已经重组于pGAP9K的多克隆位点。
M.DNA marker;1.EcoR Ⅰand NotⅠ digested pGAP9K-can-N.
2.2 构建含血管能抑素N基因的毕赤酵母工程菌
用电转法将pGAP9K-can-N载体转化 GS115,选择高G418抗性的重组子。以重组子的染色体基因组为模板,用canstarin-N基因特异引物进行PCR扩增出符合canstatin-N基因分子量大小的扩增带(图3),证明canstatin-N基因已经重组于GS115的基因组。
M.DNA marker; 1.GS115(pGAP9K-can-N); 0.GS115(pGAP9K).
2.3 血管能抑素N基因在P.pastoris 中组成型分泌表达
SDS-PAGE电泳结果显示(图4)与含空载体的对照菌株GS115(pGAP9K)发酵液对比, GS115 (pGAP9K-can-N) 的发酵液在约14 kDa 附近出现1 条符合Canstatin-N分子量的新的蛋白带。组成型分泌表达的重组Canstatin-N 的量为56 mg/L。通过离子交换法获得纯的Canstastin-N蛋白(图4)。
M.Protein marker;1.Eluted 1;2.Eluted 2; 3.Eluted 3; 4.Fermentation broth of GS115(pGAP9K-can-N); 5.Fermentation broth of GS115(pGAP9K).
2.4 诱发血管内皮细胞凋亡分析
如图5结果所示Canstatin-N用药组平均有82%的血管内皮细胞与DeadEndTM Fluorometric TUNEL System作用呈现荧光,而PBS对照组仅有1.4%的血管内皮细胞发生荧光(P<0.01)。表明毕赤酵母组成型分泌表达的Canstatin-N蛋白具有诱发血管内皮细胞凋亡的生物学活性。
A.PBS;B.Canstatin-N.
3 讨论
前面的研究有报道用大肠杆菌[8]和毕赤酵母的诱导型表达系统胞内[9]表达Canstatin-N。用大肠杆菌表达的重组蛋白是以包涵体的形式存在于胞内,经过系列的纯化步骤(包括变性、复性和洗脱等)大量重组蛋白丢失。尤其是在变性和复性的过程中存在着二硫键的复位是否完全的问题,所以用大肠杆菌表达的重组重白的活性往往不稳定;毕赤酵母的诱导型表达系统(pAOX1)需要甲醇作为唯一碳源,而甲醇是毒性有害并且容易挥发的物质,存在着安全生产的隐患,不适合于在规模化生产中应用。由于毕赤酵母的细胞壁坚硬,需要酶的作用[9]才能将其细胞壁水解,但是酶的价格昂贵,所以胞内表达形式不适合应用于规模化生产。pGAP是三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子,是组成型启动子[4],它所调控的外源蛋白的表达伴随于细胞的增殖过程,有多种无害的有机适合于作为其唯一碳源,例如葡萄糖和甘油等[10,11]。本项目以葡萄糖为唯一碳源,成功地实现了用毕赤酵母的pGAP表达系统分泌表达Canstatin-N蛋白,并且其表达产物具有良好的生物学活性,本研究为Canstatin-N蛋白的规模化生产打下基础。
4 结论
实现用毕赤酵母的pGAP调控分泌表达Canstatin-N蛋白,表达产物具有诱发血管内皮细胞凋亡的生物学活性。
参考文献
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分泌表达 篇2
目的 原核表达并纯化结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6.方法 将ESAT-6基因自pET-24b-ESAT-6质粒亚克隆至pGEX-3C载体中,构建重组表达质粒pGEX-ESAT-6,经酶切及测序鉴定正确后,分别转化大肠杆菌JM107和BL21(DE3),以不同浓度IPTG诱导表达,表达产物经GSH-Sepharose 4B亲和层析纯化.结果 所构建的重组表达质粒pGEX-ESAT-6经酶切及测序鉴定正确;重组融合蛋白在大肠杆菌JM107中的表达量较高,可达菌体总蛋白的24.2%;最适IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L;纯化的目的.蛋白纯度可达83.9%.结论 已成功构建了重组表达质粒pGEX-ESAT-6,并在大肠杆菌JM107中高效表达,为结核分枝杆菌亚单位疫苗及核酸疫苗的研制提供了材料.
作 者：马姬 何巍 吴文鹃 孙迪 王佳凤 作者单位：马姬,吴文鹃(上海赛达生物药业有限公司,上海,03)
何巍,孙迪,王佳凤(长春生物制品研究所,长春,130062)
分泌表达 篇3
关键词 HER-2过表达 内分泌治疗 生物靶向治疗
一般认为，HER-2阳性患者不仅侵袭性强，且恶性程度高，对大多数化疗不敏感，只对蒽环类等少数药物敏感，对紫杉类等多种药物耐药。临床表现为对内分泌治疗耐药。
内分泌治疗的生物学机制
正常乳腺的上皮细胞含有多种激素受体，如雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、泌乳素受体、雄激素受体等。乳腺的发育有赖于多种激素的协调作用。乳腺癌细胞可以保留全部或部分的激素受体，其生长也受激素环境的影响，被称为激素依赖型乳腺癌。而激素受体保留很少或完全丧失时，其生长不受激素的控制与调节，则称其为非激素依赖型乳腺癌。促进激素依赖型乳腺癌生长的主要激素为雌激素。目前认为，雌激素可以和细胞核的雌激素受体结合，其复合物可和靶基因的雌激素反应元件结合并影响靶基因的转录，从而促进癌细胞的增殖。另外，雌激素还可以直接和其他转录因子相互作用，或者激活细胞膜的生长因子，并通过其他生物信号途径影响癌细胞的增殖和分化。内分泌治疗就是根据上述的生物学机制，通过降低雌激素的水平或阻止雌激素作用于靶细胞的各个环节等，从而达到抑制或阻止癌细胞增殖生长的目的。
HER-2基因与内分泌治疗
乳腺癌细胞对内分泌治疗的主要药物三苯氧胺(TAM)耐药是突出的临床问题，耐药机制不甚清楚。越来越多的证据显示，在乳腺癌治疗中，HER-2基因的过表达与雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)呈负相关，而ER和PR的状态是选择治疗方案的重要指标，ER阳性和PR阳性患者的内分泌治疗敏感性高于阴性者，有效率达60%以上。故HER-2高表达的乳腺癌患者对内分泌治疗反应性较差。
据文献报道：用三苯氧胺治疗ER阳性、HER-2阴性的有效率在50%左右。ER阳性，HER-2过表达的有效率在20%左右，ER阴性HER-2过表达者的有效率更低。生长因子激活HER-2信号通路的同时可激活特异性的蛋白激酶，引起ER非激素依赖性的受体活化。活化的ER移至细胞核内与DNA结合，促进特定的mRNA产生相应的功能蛋白，从而使肿瘤细胞增殖，内分泌治疗失败。Stal等进一步研究发现，以TAM作为乳腺癌术后辅助治疗，可使HER-2阳性患者的5年生存率(46%)较HER-2阴性者(67%)下降(P<0.0001)；而单纯手术组，两者的5年生存率无明显差别。这些研究结果表明，在早期乳腺癌术后辅助治疗中，HER-2过表达提示TAM辅助治疗耐药。绝经后HER-2过表达的早期乳腺癌患者，加用芳香化酶抑制剂比原有的TAM5年用药方案，能够有效地降低临床复发率。联合应用芳香化酶抑制剂和TAM2～3年或5年的治疗效果优于单独应用TAM。提示HER-2过表达的早期患者对TAM相对耐药，但是对于芳香化酶抑制剂仍敏感。
综上所述，HER-2过表达乳腺癌的术后辅助内分泌治疗应选用芳香化酶抑制剂。
新辅助内分泌疗法
近年来，乳腺癌内分泌治疗受到了越来越多的重视，随着第3代芳香化酶抑制剂(AI)的研制和开发，其对乳腺癌的治疗作用愈发明显，并逐渐成为乳腺癌新辅助内分泌治疗的重要手段。很多研究表明，对肿瘤雌激素受体阳性的绝经后患者的辅助治疗，第3代AI(阿纳托唑、来曲唑、依西美坦)较三苯氧胺效果更好，对侧乳腺癌发病率更低；除了减少骨密度，增加骨折率以外，AI不良反应普遍较少，这提示在预防乳腺癌方面，AI具有巨大潜力。临床研究发现，新辅助化疗后达到病理缓解的患者，90%以上是雌激素受体阴性。对于雌激素受体阳性患者，其新辅助化疗疗效相对较差，适合新辅助内分泌治疗。因此，新辅助内分泌治疗将有可能是新辅助化疗的必要补充。新辅助内分泌治疗最佳的治疗持续时间目前尚没有定论，但是当前的证据显示可持续3～4个月以上，并且治疗可以继续直至肿瘤充分地收缩到可实施手术或可实行保乳手术的程度。
生物靶向治疗
生物靶向治疗因其高特异性和相对较低的不良反应，有可能成为较有希望的肿瘤辅助治疗手段。目前研究较多的有曲妥珠单抗，其临床益处在欧洲的一项大型试验中被更进一步地证实，试验将已完成化疗的乳腺癌患者随机分配，其中一组给予曲妥珠单抗治疗1～2年，另一组没有特殊治疗。结果显示接受曲妥珠单抗治疗的妇女无瘤生存率显著提高(2年无瘤生存率分别为85.8%和77.4%；HR=0.54，P<0.0001)，但同时患者左心室功能显著恶化。表明曲妥珠单抗可以考虑用于肿瘤HER-2过表达患者的辅助治疗，但在常规应用之前，需要更多的长期研究提供更可靠的数据。
结 语
分泌表达 篇4
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌种E.coli DH5α株为实验室保存;pcDNA3.1(+)真核表达载体为Invitrogen公司产品;pUC19-Endorphin质粒载体为作者先前工作结果;限制性内切酶HindⅢ、KpnⅠ、EcoRⅠ等为NEB公司产品;QIAGEN ○R Plasmid Mini Kit与Gel Extraction Kit均为QIAgen公司产品;T4 DNA Ligase购自TAKARA公司;NIH3T3细胞株由实验室保存;转染试剂LipoFectamine 2000购自Invitrogen公司;Primer-STAR高保真聚合酶购自TAKARA公司;β-内啡肽放射免疫分析试剂盒购自上海第二军医大学神经生物学教研室;其他相关试剂自行配置。
1.2 方法
1.2.1 获取人基因组DNA
取人外周血3ml,按《分子克隆》第三版“哺乳动物DNA的快速分离”中的方案6提取人基因组DNA,用1×TE溶解DNA后贮于-80℃低温冰箱备用。
1.2.2 构建融合基因片段
由上海申能博彩生物科技有限公司合成四条PCR引物:PR001: 5'-CCGAAGCTT TTCCAGGTGCATAGCGTAACCATGTCC-ATGTTGTTCTACAC-3',PR002: 5'-CG CTTGCTCTTGTGAGTC-CTGTTGA-3',PR003: 5'-TCAACAGGACTCACAAGAGCAAGCG-3',PR004: 5'-CGCGAATTCATTACTCGCCCTTCTTGTAGGC-3';其中PR001与PR002为获取人神经生长因子信号肽序列的引物,PR003与PR004为获取人β-内啡肽序列的引物,PR002与PR003两条引物为进行SOE-PCR (Sequence Overlapped Extension,SOE)而设计成反向互补,并且为了能够顺利进行DNA片段的亚克隆,分别在引物PR001和PR004的5'-端设计了适当的限制性核酸内切酶位点及酶切保护碱基。SOE-PCR反应进行过程如下:首先通过PCR反应获取人的神经生长因子信号肽的DNA序列,模板为所得的人基因组DNA,引物采用PR001及PR002,反应条件为:94℃×3min,94℃×10s,68℃×30s,68℃×3min,20℃保存,共运行28个循环;通过另一PCR反应获取人beta-内啡肽的表达序列,模板为质粒pUC19-Endorphin,引物为PR003及PR004,反应条件为:94℃×3min,94℃×10s,68℃×20s,68℃×3min,20℃保存,共进行28个循环;分别回收两个PCR反应的产物,以两个PCR反应的产物混合物为PCR反应底物(模板),引物采用PR001及PR004,反应条件为:94℃×3min,94℃×10s,68℃×40s,68℃×3min,20℃保存,进行28个循环,回收PCR产物得到两端带有设计的酶切位点的全人源的神经生长因子-β-内啡肽融合基因片段,-20℃冻存备用。
1.2.3 人神经生长因子信号肽融合基因真核表达载体的构建
分别用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ同时消化前面得到的融合基因片段及真核表达载体pCDNA3.1(+),37℃水浴反应4h后电泳并切胶回收目的片段和载体DNA;用目的片段和载体DNA建立连接反应体系,16℃水浴反应4h后转化DH5α感受态细胞,铺氨苄青霉素抗生素的琼脂糖凝胶平板,37℃孵箱过夜,生长后挑取单克隆并鉴定出含有全人源的神经生长因子-β-内啡肽融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-HNE,挑取一个单克隆送基因公司测序。
1.2.4 融合基因的转录表达检测及蛋白产物的定量分析
含真核表达载体pCDNA3.1-HNE的DH5α菌株于适量LB培养基内加抗性振摇过夜,QIAGEN ○R Plasmid Mini Kit抽提真核细胞转染级无内毒素的质粒。NIH3T3细胞常规在DMEM(含10%FBS)、5%CO2培养箱中培养,传代后铺十二孔板,1×105细胞/孔,次日取生长良好的三列培养孔按转染试剂盒的操作说明分别转染pCDNA3.1(+)、pCDNA3.1-HNE,继续5%CO2环境培养,转染48～72h内分别收集细胞和培养上清。收集的细胞抽提总RNA进行两步法RT-PCR,其中PCR引物为PR001和PR004,检测融合基因的转录。收取的细胞培养上清经5 000r/min×10min离心后取其上清按β-内啡肽放射免疫分析试剂盒操作手册检测表达产物浓度。
1.2.5 统计学处理
应用SPSS10.0统计软件包分析,各参数用均数±标准差undefined)表示,组间各资料用单因素方差分析进行统计处理,P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 真核表达载体的鉴定
将重组质粒pCDNA3.1-HNE菌株送联合基因上海联众基因研究院进行测序,测序结果经比对表明融合基因均正确地插入到载体内,且DNA序列完全正确,表达序列为456bp,其中包括信号肽363bp和β-内啡肽93bp。经限制性核酸内切酶酶切鉴定证实pCDNA3.1-HNE的结构也是正确的。
2.2 融合基因的转录及其表达产物的检测
扩增的转染级真核表达载体在标准条件下脂质体法转染常规培养的NIH3T3细胞,转染后48～72h内收集细胞抽提总RNA,进行两步法RT-PCR,检测结果如图2,其中阳性对照和cDNA均有阳性结果而阴性对照为阴性结果,说明cDNA内含有相应的核酸片段,融合基因发生了转录。
细胞培养上清RIA法检测融合基因表达产物结果如图3。经统计学分析结果提示pCDNA3.1-HNE组的表达水平与对照(pCDNA3.1)组的表达水平之间存在统计学显著差异(P<0.01),说明相对于对照组,实验组的真核表达载体能够表达出目的多肽,并分泌至细胞外。
1. DNA Marker; 2. Digestion by HincⅡ; 3. Digestion by BglⅡ+EcoRⅤ.
1. DNA Marker;2. cDNA;3. Positive control;4. Negative control.
3 讨论
信号肽在生物蛋白的分泌表达中起着非常重要的作用。选择合适的信号肽对于哺乳动物细胞培养系统中重组蛋白理想的合成和分泌非常重要[3],通过优化信号肽的序列可以改进重组蛋白的产量[4],信号肽在生物医药工程中的重要性不言而喻。
真核细胞内蛋白质的表达分为组成型表达和分泌型表达,分泌型表达的蛋白质或多肽在信号肽的引导作用下分泌出胞成为成熟的蛋白多肽。信号肽不仅参与到基因表达调控中[5],且会影响蛋白产物的分泌[6,7]。作为阿片肽家族重要成员的β-内啡肽在机体内具有重要的生物作用,不仅参与机体的痛觉调制,而且也是植物性神经系统、内分泌系统和免疫系统的重要调节因子。β-内啡肽的成熟是需要特定的细胞内水解酶[8]进行有效剪切,去除成熟多肽前的氨基酸序列才能成为有生物活性的蛋白。重组蛋白β-内啡肽的出胞需要有效的信号肽的介导才能顺利实现,选择合适的信号肽也是提高分泌表达的重要因素。作者选择人神经生长因子的信号肽序列作为融合基因的引导肽,利用PCR法得到人的神经生长因子信号肽部分表达序列。为了使最终所表达的蛋白多肽能够顺利地成为成熟的蛋白多肽,并且能够地分泌出细胞,作者在获取人神经生长因子信号肽部分序列时对其进行了点突变处理,使得与人β-内啡肽序列相连接的部位形成Furin水解酶的识别氨基酸序列[9]。所获得的DNA片段经分子生物学实验方法插入真核表达载体pCDNA3.1(+)内,经DNA测序和核酸内切酶酶切鉴定,证实该载体在插入序列和结构上是正确的。
文中所采用的人神经生长因子信号肽片段是一段含有121个氨基酸的多肽链,位于31个氨基酸长的β-内啡肽的N端,其长度足够使其发挥介导多肽与粗面内质网的蛋白质翻译复合体作用,从而促使多肽转运入高尔基体的管腔,并且在多肽转运的过程中该信号肽的氨基酸序列被Furin酶切割释放,完成翻译后修饰使β-内啡肽成熟,并分泌至细胞外。作者采用脂质体转染法将所构建的携带β-内啡肽全人源序列融合基因的真核表达载体导入NIH3T3细胞,在转染后的48～72h内收集细胞及其培养上清,抽提细胞总RNA后RT-PCR法证实了融合基因的转录。通过RIA(放射免疫分析)法测定了细胞培养上清内β-内啡肽的浓度,检测结果显示,融合基因载体组的多肽浓度达到280.33±24.16pg/ml,空白载体对照组是4.24±4.28pg/ml,统计学分析显示两组的结果之间具有显著差异(P<0.01),提示细胞培养上清中确实存在融合基因表达的β-内啡肽,说明真核表达载体中融合基因确实发生了转录表达,β-内啡肽在人神经生长因子信号肽的引导下顺利分泌到细胞外,所采用的信号肽发挥了其蛋白转运及分泌出胞的作用。
作者等[2]曾构建的用小鼠的信号肽起介导作用的β-内啡肽的融合基因,后者也能够顺利地表达并分泌至细胞外,但鼠的神经生长因子信号肽与人源信号肽的作用之间是否存在区别,所起作用的效率是否有差异尚需进一步研究。
摘要：目的:构建人神经生长因子信号肽与人β-内啡肽融合基因的真核表达载体,研究人神经生长因子信号肽介导β-内啡肽的分泌表达。方法:取得人基因组后,PCR法获取人的神经生长因子信号肽部分序列及人β-内啡肽序列;通过SOE-PCR法将两段DNA序列连接,然后插入到真核表达载体内,测序正确后扩增转染级的真核表达载体。表达载体脂质体法转染NIH3T3细胞,转染后4872h收集细胞及培养上清,RT-PCR法检测融合基因的转录,RIA法测定细胞外β-内啡肽的浓度。结果:成功构建全人源的分泌型表达β-内啡肽的真核表达载体,DNA序列经测序完全符合实验设计;融合基因能够顺利地得到转录并进行表达翻译,在细胞培养上清中可检测到其产物。结论:构建的真核表达载体能够分泌表达人β-内啡肽,提示人神经生长因子信号肽序列能够发挥其介导蛋白产物分泌表达的作用。
关键词：神经生长因子,分泌型表达,β-内啡肽
参考文献
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分泌表达 篇5
乳酸菌NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的.食品级诱导表达系统,而乳酸菌分泌表达异源蛋白比细胞质表达更优越.本研究将以pVE5524为模板PCR扩增的1.5kb SPUsp45-NucA-CWAM6-t1t2基因克隆到食品级细胞内诱导表达载体pRNA48上,构建成食品级细胞壁锚定表达载体pRNV48,与宿主菌L.lactis NZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定诱导表达系统.为检测该系统的功能,将铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H克隆进pRNV48中,并检测了OprF/H的表达量和免疫原性.
作 者：徐波 曹郁生 陈燕 郭兴华 XU Bo CAO Yu-sheng CHEN Yan GUO Xing-hua 作者单位：徐波,XU Bo(食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,江西,南昌,330047;江西农业大学,生物工程系,江西,南昌,330045)
曹郁生,陈燕,CAO Yu-sheng,CHEN Yan(食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,江西,南昌,330047)
郭兴华,GUO Xing-hua(中国科学院,微生物研究所,北京,100080)
分泌表达 篇6
关键词：RANTES,子宫内膜异位症,调节活化正常T细胞,趋化因子
子宫内膜异位症多发于生育年龄妇女群体中, 据相关统计资料显示, 其发病率高达15%左右, 临床多表现为痛经、盆腔包块、性交痛等症状, 且超过50%的患者可能出现不孕等表现[1], 对患者的身心健康可能造成严重威胁。目前临床上对子宫内膜异位症的发病原因尚不明确。大量研究观点表明, 子宫内膜异位症是多项因素相互作用所致, 且与人体调节活化正常T细胞表达及分泌趋化因子的作用存在一定的相关性[2]。基于此, 为进一步分析RANTES与子宫内膜异位症的相关性, 我院对近年来收治的40例患者进行了研究, 报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料:
选取2012年2月至2014年2月于我院接受治疗的40例子宫内膜异位症患者为观察组。所有患者均行腹腔镜手术治疗, 均为女性, 年龄在25~44岁, 平均年龄为 (35.4±2.1) 岁;按照美国生育协会修订的腹腔镜诊断内异症 (r AFS) 的分期标准将其分为Ⅰ期14例, Ⅱ期19例, Ⅲ期7例。选取同期于我院接受IUD治疗的20例正常子宫内膜者为对照组, 年龄24~43岁, 平均年龄为 (34.9±1.8) 岁。入选研究的两组对象在性别、年龄等基础资料的对比方面并不存在显著差异 (P>0.05) , 具有较强的可比性。
1.2 方法:
(1) 标本处理:观察组患者于手术治疗过程中取患者异位囊肿壁病理组织, 面积控制在2 cm×2 cm左右。对照组对象则于无菌操作下, 刮取子宫内膜。并于两组标本中分别置入链霉素与青霉素行细胞培养。 (2) 实验方法:观察组标本采用洗涤液冲洗2次后, 将其体积剪碎至1 mm×1 mm×1 mm。并注入1.25 g/LⅠ型胶酶, 于37℃温度条件下, 消化1 h, 后过滤, 离心5 min, 待细胞沉淀后重复培养洗涤。采用玻片法, 对加波形蛋白行免疫组化染色处理, 随后鉴定标本间质细胞的纯度。将细胞接种于孔板中, 待融合度高达90%时, 加入低血清培养2 d, 并于培养液中加入浓度为10μg/L的白细胞介素-1β (IL-1β) , 持续培养, 分别于1 d、2 d及3 d后收集标本上清及细胞液, 行常规检测处理。采取组织和细胞总RNA提取法 (TRIzol) 将细胞总RNA提取出, 并实施扩增处理, 采用内参条带光密度与特异扩增条带为参数实施半定量分析处理。同时采用酶联免疫吸附检测法测定标本上清中RANTES表达水平。采用小室实验法检测标本间质细胞上清液对其单核细胞的趋化活性水平。
1.3 统计学方法:
采用SPSS19.0统计学软件对实验数据进行处理与分析, 计量资料选用 (±s) 表示, 组间对比进行t检验, 以P<0.05时为有显著性差异和统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者病理标本中RANTES蛋白表达水平对比:
经IL-1β刺激1d后, 观察组与对照组细胞内RANTES蛋白表达水平并无显著差异 (P>0.05) ;2 d、3 d后观察组患者病理标本细胞中RANTES蛋白表达水平明显高于对照组, 组间对比差异显著 (P<0.05) , 见表1。
2.2 两组标本单核细胞趋化活性检测结果对比:
在经受IL-1β刺激3 d后, 观察组患者病理标本细胞上清液对单核细胞的趋化指数呈明显上升趋势, 与对照组相比差异显著 (P<0.05) , 见表2。
3 讨论
近年来有大量研究文献证实, 子宫内膜异位症患者其异位子宫内膜的黏附、侵袭伴随着人体激素的变化而产生相关的炎性反应, 同时也是患者子宫内膜异位病灶形成的重要原因[3]。但临床上对逆流经血在人体子宫内膜碎片中发挥的作用尚且存在一定的争议。有部分观点认为, 子宫内膜异位症患者其在位内膜可能发生形态及基因表达方面的变化, 但在子宫内膜逆流于人体腹腔后, 可能导致大量细胞因子的表达异常, 导致子宫内膜避开人体的免疫监视反应, 进而促使其种植、繁衍, 引起子宫内膜异位症的产生[4]。
调节活化T细胞与分泌趋化因子是趋化因子CC亚家族中的代表因子之一, 主要由人体巨噬细胞、活性T细胞及子宫内膜细胞分泌而出, 表达于血管内皮细胞、单核细胞、T细胞及嗜酸粒细胞中。并通过与相关受体结合, 参与到免疫细胞的活化反应, 并在机体的炎性反应中起到关键的作用。有部分研究表示, 子宫内膜异位症患者腹腔液中嗜酸粒及巨噬细胞的数量、RANTES蛋白表达水平显著高于正常对照组, 与本组实验研究结果基本一致[5]。RANTES蛋白因子是人体巨噬细胞中特异性较高的激活因子之一, 并经由输卵管逆流至人体腹腔, 与活化细胞发生反应, 分泌出炎性介质, 促使人体内异位子宫内膜的生成, 导致病灶的形成。本组研究中通过对子宫内膜异位症与正常子宫内膜患者进行对照分析, 结果提示, 经受IL-1β刺激2 d、3 d后观察组患者病理标本细胞中RANTES蛋白表达水平明显高于对照组, 同时观察组患者病理标本细胞上清液对单核细胞的趋化指数呈明显上升趋势, 与对照组相比差异显著 (P<0.05) , 同时也进一步证实子宫内膜异位症患者RANTES蛋白表达水平的差异是导致子宫内膜异位病灶形成的重要原因, 需在临床上引起广泛重视。
参考文献
[1]范小斌, 曹引丽, 蔺小贤, 等.RANTES在子宫内膜异位症在位内膜及异位内膜的表达及其意义[J].实用妇产科杂志, 2012, 28 (12) :1035-1038.
[2]吴亚玲, 郝敏.趋化因子在子宫内膜异位症发病机制中的作用[J].国际妇产科学杂志, 2009, 36 (5) :352-355.
[3]黄红艺, 张凤兰, 张团英, 等.CXCL10在子宫内膜异位症患者血清及腹腔液的表达及意义[J].实用医学杂志, 2011, 27 (8) :1394-1395.
[4]林敏, 王溢, 董克, 等.子宫内膜异位症患者腹腔液中NF-κB和趋化因子MCP-1、RANTES的表达[J].实用医学杂志, 2014, 11 (4) :577-579.
分泌表达 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 胰腺
选用体重为10～15 kg的长白仔猪, 在相对无菌的条件下取胰腺的体尾部, 保存在Euro-collins液中 (4 ℃) , 尽快送到实验室。
1.1.2 试剂
胶原酶Ⅴ, Sigma公司;1640培养基, Gibco公司;Hank’s液、小牛血清, Sigma公司;RNA提取Trizo, Sigma公司;T载体, Promega公司。
1.2 胰岛分离
将采取的胰腺迅速去除周边脂肪、血管和被膜, 用冷的Euro-collins液冲洗, 称重。用眼科剪将其剪成0.5 mm3大小的组织块。再用预热至38 ℃的Hank’s液配制的浓度为0.5 g/L的胶原酶Ⅴ进行胰岛组织自动持续震动消化。将试管放入恒温磁力搅拌器中, 每次消化时间控制在20 min以内, 驱除上清液及液固界面上松散发白的针尖大小的组织, 经150目的铜网过滤, 滤液用大量的Hank’s液终止消化。回收未过滤的组织与消化物, 加入消化酶继续消化4～5次, 至组织块基本消化后滤过。
1.3 胰岛细胞的培养与纯化
将收集的大细胞迅速漂洗2次后静置片刻, 除去细胞悬液镜检, 调整浓度为5×106个细胞接种, 进行单层培养, 16 h后转入24孔板中。3 d内静置不动以利贴壁。3 d后用碘乙酸处理成纤维细胞, 同时采用消化时差法进行胰岛细胞的纯化。
1.4 培养细胞的观察
应用倒置显微镜记录细胞生长状况。采用双硫腙染色法查看胰岛数量。
1.5 加铜处理
在培养7 d后的胰岛细胞中, 采用完全随机化设计进行加铜试验。以分析纯硫酸铜为铜源, 参照参考文献[1]将铜的添加水平分别设为0, 7.8, 15.6, 31.2 μmol/L, 加入铜后培养12 h。
1.6 SS的测定
采用放免技术测定胰岛细胞培养上清液中SS的浓度。
1.7 SS基因的克隆
1.7.1 引物的设计
根据GeneBank猪SS基因组DNA序列中编码区设计:上游引物, 5′-CCTCGGACCCCAGACTCCGTCAGTT-3′;下游引物, 5′-CGTTCCCGGGGTGCCATGGCTGGGTT-3′;扩增长度为226 bp。
β-肌动蛋白 (β-Actin) 引物:上游引物, 5′-TGGACTTCGAGCAGGAGATGGCCACGGC-3′;下游引物, 5′-TGATCTTCATGGTGCTGGGCGCCAGGGC-3′;扩增长度为321 bp。
1.7.2 总RNA的提取
按照总RNA提取试剂盒说明操作。
1.7.3 RT反应
取等量的总RNA 1 μg进行RT反应, 生成cDNA。
1.7.4 SS基因及β-Actin
基因的PCR反应 将RT产物进行PCR反应, 反应条件:1.0 mol/L MgCl2;94 ℃45 s, 55 ℃45 s, 72 ℃ 45 s, 30个循环;72 ℃延伸10 min。
1.7.5 SS基因的克隆及测序
将PCR产物克隆到T载体上, 将鉴定正确的重组质粒送TaKaRa公司进行序列测定。
1.7.6 铜对SS基因mRNA变化的测定
将1.5中加铜处理后的细胞培养皿中的上清液吸出, 加入1 mL的Trizo试剂提取总RNA, 经核酸测定仪测定后取等量的总RNA进行RT反应。分别取cDNA产物1 mL进行SS基因和β-Actin基因的PCR扩增, 凝胶电泳, 照像。重复5次。
1.8 数据处理
应用凝胶分析系统对凝胶电泳图像进行分析, 得出SS基因与β-Actin基因条带亮度的对比值, 应用SPSS10.0进行统计分析。
2 结果
2.1 胰岛细胞形态学观察结果
在组织分离初期, 细胞从圆形逐渐呈上皮样平铺于培养板底部, 其间掺杂有成纤维细胞。组织块细胞的伸展、平铺较散在细胞慢, 3～4 d可见组织块周围开始蔓延出一些细胞。同时组织块内存在着一些生长良好的细胞, 光镜下散在的单个细胞为圆形, 光亮透明;这些细胞会逐渐蔓延分离, 逐渐占据较大范围的生长空间。生长5～7 d, 出现几个细胞聚集在一起的细胞团, 细胞由少许结缔组织包围;稍大一点的组织块生长良好, 在细胞团周围延伸出单个细胞呈平铺状态, 排列紧密, 胞浆颗粒丰富, 亦可见细胞核及核仁。经碘乙酸处理后的胰岛细胞纯度较高。光镜下双硫腙染色的胰岛细胞团呈圆形、椭圆形或不规则形, 颜色为猩红色或红色, 而胰腺外分泌腺组织不着色。
2.2 铜对体外培养的胰岛细胞SS分泌的影响
采用放免技术测定了胰岛细胞培养上清液中SS的浓度, 结果见表1。由表1可见, 添加不同浓度的硫酸铜对体外培养胰岛细胞SS的分泌影响差异不显著 (P>0.05) 。
2.3 SS基因PCR扩增结果
SS基因经PCR扩增, 获得了226 bp的片段, 见图1。
1.SS基因;2.DL 2 000 Marker。
2.4 SS基因β-Actin扩增结果
SS基因经β-Actin扩增, 获得了321 bp大小的片段, 见图2。
1.DL-2 000 Marker;2.SS基因。
2.5 铜对SS基因mRNA表达的影响 (见图3、表2)
1.样品1;2.样品2;3.样品3;4.样品4;5.DL-2 000 Marker。
由表2和图3可见, 添加4种浓度的硫酸铜对体外培养的胰岛细胞SS基因mRNA表达没有显著影响 (P>0.05) 。
3 讨论
一般认为, 铜的促生长作用可通过两种途径完成, 一种是通过消化系统途径:包括增加采食量、增加饲料利用率等;另一种途径是通过神经系统的调节, 即下丘脑-垂体-肝脏-IGF-Ⅰ促生长激素轴的作用。对于第一种途径中, 铜是通过何种机制增加了动物的采食数量、如何增加了饲料利用率还不是非常清楚。胰腺作为机体代谢的主要器官, 对机体所吸收的各类营养物质的消化和吸收具有重要的作用, 尤其对糖类这一主要能源物质的吸收和代谢起着至关重要的作用。
同时, 铜的促生长作用同样受激素GH的强力调控, 而SS是一种能够抑制GH释放的低分子碱性肽, 对体内GH的分泌和释放起到关键的调控作用, 从而影响生长激素轴在体内发挥作用。除下丘脑外, 胰腺也是可分泌少量SS的另一器官, SS不但抑制GH的基础分泌, 而且抑制GH对生理功能的调节。同时, SS可以抑制多种消化酶的释放, 如抑制胃泌素、促胰液素、胃动素、肠高血糖素、胰多肽、胰岛素和胰高血糖素的释放。它的分泌直接受食物和消化系统的调控, 从而反馈式地调节神经内分泌的生理功能。
分泌表达 篇8
PA-PLA 1首先由华盛顿大学G lom set的实验室从牛的睾丸和脑组织中分离纯化并克隆[1,2,3]。我们从人的肾脏组织克隆了人的PA-PLA 1基因 (G en Bank accession no.D Q 315474) , 该基因定位于14q22, m R N A长2923 nt, 编码一个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽, 分子量为83141D。通过序列比对分析, 发现该基因与K IA A 0725p和p125蛋白具有一定的同源性。K IA A 0725p和p125蛋白均能水解膜PA生成LPA, 进而影响高尔基体分泌小泡的形成, 并在细胞转运小泡介导的物质运输中发挥调节作用[4,5]。PA-PLA 1是否涉及细胞转运小泡介导的物质运输尚不清楚, 但PA-PLA 1在人不同的组织中呈差异性表达[3]。我们用荧光定量PCR方法检测17种人组织发现PA-PLA 1基因在胰岛组织中具有极高的表达水平 (另文发表) , 提示PA-PLA 1可能参与了胰岛β细胞功能的调节。本研究用葡萄糖刺激胰岛素分泌 (glucose-stim ulated insulin secretion, G SIS) 实验研究小鼠分泌胰岛素细胞株M IN 6的PA-PLA 1基因表达与胰岛素分泌的关系, 为PA-PLA 1生理功能的阐明提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
小鼠胰岛瘤细胞株M IN 6由解放军总医院邢军老师馈赠;高糖D M EM (H yclone美国公司) ;胎牛血清 (北京元亨金马生物公司) ;小鼠超灵敏胰岛素ELISA检测试剂盒 (M ercodia A B, Sweden) ;R N A提取试剂盒Trizol (美国invitrogen公司) ;Protein A ssay D ye R eagent Concentrate (美国Bio-R ad公司) ;逆转录试剂盒 (美国Ferm entas公司) ;荧光定量PCR试剂盒 (日本Takara公司) ;小鼠PA-PLA 1和β-actin引物均由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 M IN 6细胞的培养
在37℃、5%CO2条件下, 用含15%胎牛血清、青霉素100 U/m L、链霉素100μg/m L、50μm ol/Lβ-巯基乙醇的高糖D M EM培养, 细胞生长融合度达80%后, 按每孔5×105个细胞植入24孔板中, 培养48 h后备用。
1.2.2 葡萄糖刺激胰岛素分泌 (G SIS) 实验
以含不同浓度葡萄糖 (0、5、10、15、20、25和50 m m ol/L) 的K rebs-R inger Bicarbonate (K R BB) 缓冲液按文献所述方法刺激M IN 6细胞分泌胰岛素[6], 每种浓度设3个复孔, 刺激时间为2 h。或以含25 m m ol/L葡萄糖的K R BB刺激M IN 6细胞分泌胰岛素, 刺激时间分别为2、6、12、18和24 h, 每个刺激时间设3复孔。收集细胞上清液, 酶联免疫吸附法测定胰岛素分泌量变化。
1.2.3 细胞总R N A提取、逆转录及总蛋白质的提取和定量
以PBS冲洗胰岛素分泌实验后的细胞2次后, 每孔加入500μL Trizol, 按Trizol试剂说明书分别提取细胞总R N A及总蛋白质。1%琼脂糖凝胶电泳检测总R N A完整性, 紫外分光光度法检测其纯度和含量。以提取的总R N A 3μg为模板, oligo (d T) 18为引物逆转录合成c D N A, 存于-20℃备用。提取的总蛋白以酶标板微孔法考马斯亮蓝检测其浓度, 用每孔细胞总蛋白质的浓度校正胰岛素分泌量。1.2.4荧光定量检测PA-PLA 1基因表达水平 (1) 引物的设计:根据G en Bank小鼠PA-PLA 1基因m R N A序列 (登录号:D Q 272481) 设计引物P1:5′-TCTTG A TG G A G A CA CA G TTG A TTCC-3′, P2:5′-TTA CA CA CCCCA A G G A A TG G-3′扩增小鼠PA-PLA 1基因, 产物长度为250 bp。以小鼠β-actin基因作为内参, 引物分别为P3:5′-G TCCCTCA CC-CTCCCA A A A G-3′, P4:5′-G CTG CCTCA A CA C-CTCA A CCC-3′, 扩增产物长度为266 bp。 (2) 内参照基因与目的基因扩增效率检测:将M IN 6细胞空白组c D N A进行倍比稀释, 获得原倍、2-1倍、2-2倍、2-3倍、2-4倍、2-5倍、2-6倍浓度的c D N A, 并将其作为模板, 用上述引物分别扩增β-actin与PA-PLA 1。每个样本设3个平行管, 20μL反应体系为:2×SY BR Prem ix Ex Taq 10μL, 上下游引物各1μL, c D N A 3μL, R O X R eference D ye II 0.4μL, ddH2O 4.6μL。反应条件为:95℃60 s;95℃10 s, 55℃20 s, 72℃20 s, 72℃时收集荧光信号, 共进行46个循环。PCR扩增结束后, 从55℃~95℃全程读取荧光信号获得融解曲线, 以确定扩增产物的特异性。以稀释倍数的2的对数值为X轴, β-actin和PA-PLA 1的CT值为Y轴, 做线性回归图, 观察两条线的斜率, 以确定内参β-actin基因与目的基因PA-PLA 1的扩增效率是否一致。 (3) G SIS实验对内参表达量的影响检测:以不同浓度葡萄糖刺激下所得的细胞c D N A为模板, 分别扩增β-actin基因, 获得Ct值后, 计算基因表达改变倍数2-ΔCT, 其中ΔCT= (CT处理组-CT空白组) , 以A N O V A计算基因表达改变倍数的P值, 以检测葡萄糖对内参照基因表达的影响。 (4) PA-PLA 1 m R N A的表达水平与细胞胰岛素分泌量相关性检测:空白组、G SIS组的c D N A分别以β-actin和PA-PLA 1引物进行荧光定量PCR, 获得CT均值后, 计算ΔCT (CTβ-actin-CT PA-PLA1) 和ΔΔCT (G SIS组ΔCT-空白组ΔCT) 。并计算胰岛素分泌实验组PA-PLA 1 m R N A表达改变的倍数 (2-ΔΔCT) 。
1.3 统计学处理
应用SPSS 13.0软件分析数据。计量资料的统计描述用表示, 采用线性相关分析PA-PLA 1m R N A的表达水平与细胞胰岛素分泌量的相关性, P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 葡萄糖刺激胰岛素分泌 (G S IS) 实验
2.1.1 不同葡萄糖浓度G SIS实验结果
K R BB刺激2 h后, 检测到培养基上清有胰岛素分泌, 经相应孔内细胞总蛋白校正, 得出不同葡萄糖浓度的K R BB溶液刺激M IN 6细胞分泌胰岛素实验结果, 如图1A所示。随着葡萄糖浓度的增加, 胰岛素分泌量亦增加, 当葡萄糖浓度为25 m m ol/L时胰岛素分泌量达到最大值 (23.10±0.80) pm ol/ (m L·m g蛋白质) , 是空白对照组的1.47倍。当葡萄糖浓度为50m m ol/L时, 胰岛素分泌量有所下降, 为 (22.83±0.78) pm ol/ (m L·m g蛋白质) 。
2.1.2 不同时间G SIS实验结果
随着葡萄糖K R BB溶液刺激时间的延长, 胰岛素分泌量增加。刺激时间为6 h时, 胰岛素分泌量为 (34.76±4.20) pm ol/ (m L·m g蛋白质) , 是空白对照组的1.67倍;当刺激时间为24 h时, 胰岛素分泌量最大为 (99.57±6.90) pm ol/ (m L·m g蛋白质) , 是空白对照组的4.77倍 (图1B) 。
2.2 荧光定量检测P A-P LA 1基因表达水平
2.2.1 内参照基因与目的基因扩增效率
以M IN 6细胞倍比稀释的c D N A为模板分别扩增β-actin及PA-PLA 1基因, 得到平滑的扩增动力学曲线, 融解曲线呈单峰, 琼脂糖凝胶电泳结果证实其PCR产物符合目的片段大小, 提示β-actin基因及PA-PLA 1基因均扩增良好, 无非特异性扩增。以稀释倍数的2的对数值为X轴, β-actin、PA-PLA 1基因的扩增CT值为Y轴, 做线性回归图 (图2A) , R 2均大于0.98。
2.2.2 G SIS实验对内参表达量的影响
荧光定量PCR检测空白组、G SIS组M IN 6细胞的c D N A中β-actin的m R N A的表达水平, 以A N O V A计算ΔCT间的P值, 结果显示 (图2B) M IN 6细胞中β-actin的m R N A的表达水平并不受葡萄糖浓度的影响 (P>0.05) 。
2.2.3 不同葡萄糖浓度G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平
随着葡萄糖浓度的增加, PA-PLA 1 m R N A的表达水平亦增加。当葡萄糖浓度为25 m m ol/L时PA-PLA 1 m R N A的表达水平达到最大值, 是空白对照组3.95倍;而当葡萄糖浓度为50 m m ol/L时, PA-PLA 1 m R N A的表达水平稍有下降, 为空白对照组的2.63倍 (图3A) 。
2.2.4 不同刺激时间G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平
随着葡萄糖K R BB溶液刺激时间的延长, PA-PLA 1 m R N A的表达水平亦增加。6 h PA-PLA 1 m R N A的表达水平为空白对照组的1.21倍;当刺激时间为12 h时, PA-PLA 1m R N A的表达水平为空白对照组的3.06倍;24 h时, PA-PLA 1 m R N A的表达水平为空白对照组的6.48倍 (图3B) 。
2.3 P A-P LA 1 m R N A表达水平与胰岛素分泌相关性分析
线性相关分析的数据显示, 不同葡萄糖浓度G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平与胰岛素分泌具相关性, 其相关系数r为0.89, P<0.01;不同刺激时间G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平与胰岛素分泌同样具相关性, 其相关系数r为0.98, P<0.01。
3 讨论
PA-PLA 1自被华盛顿大学G lom set的实验室首次报道以来, 人们对其酶学功能与基因结构已有了较深入的了解, 但对其生理功能却知之甚少。PA-PLA 1在细胞内水解PA生成LPA, 其酶活性影响细胞内PA和LPA两种脂类信号分子的水平, 因而它的生理功能可能涉及细胞内的信号转导, 并通过细胞信号转导途径对多种细胞生理过程发挥调节作用。PA-PLA 1有特定的组织分布, 在成年牛的睾丸和脑组织中具有较高的酶活性, 其中成年牛睾丸组织比新生牛的高10倍。而在肝脏、心脏、脾脏和血液中则检测不到该酶活性。因此有研究推测PA-PLA 1参与的信号转导过程与精子的发生和神经元的相互作用有关[3]。我们的研究首次表明, 小鼠分泌胰岛素细胞株M IN 6中PA-PLA 1基因表达与胰岛素分泌有关。不论是不同葡萄糖浓度G SIS实验, 还是不同刺激时间G SIS实验, M IN 6细胞的PA-PLA 1基因表达均与细胞的胰岛素分泌呈显著的正相关, 提示PA-PLA 1对M IN 6细胞的胰岛素分泌可能具有促进作用。PA-PLA 1对胰岛素分泌的影响及其机制尚待研究。鉴于PA-PLA 1在细胞内水解PA生成LPA, 其活性影响PA和LPA两种分子在细胞内的水平, 因而PA-PLA 1对胰岛素分泌的影响或调节有可能是通过PA和LPA两种分子发挥作用。
有研究表明, PA参与细胞内转运小泡介导的物质运输过程。SCH M ID T等人[7]报道, 分子呈倒锥形的LPA脂酰化生成分子呈锥形的PA的分子结构改变可使质膜高度卷曲, 从而促使转运小泡的生成。W EIG ER T等人[8]报道这种分子结构改变也诱导高尔基体管道形成。抑制PA的合成可导致高尔基体结构的改变和内分泌细胞分泌功能的抑制[9]。此外, PA还通过与N-乙基马来酰亚胺敏感因子 (N-ethylm aleim ide-sensitive factor) 、A D P-核糖基化因子 (A D P-ribosylation factor) 和激蛋白 (kinesin) 等与转运小泡介导的物质运输过程相关的蛋白结合而对细胞的物质运输过程发挥调节作用[10]。但PA这种对细胞膜泡运输过程的影响显然不能解释PA-PLA 1对胰岛素分泌的正调节作用。
近年的研究文献显示, LPA作为信号分子通过其特异的G蛋白偶联受体发挥作用, 其信号反应包括活化蛋白激酶以及磷脂酶C和D、动员Ca2+、抑制腺苷环化酶、促使花生四烯酸释放和刺激D N A合成等, 在血小板聚合、平滑肌收缩、细胞增殖以及肌动蛋白细胞骨架的重排等细胞过程中发挥关键调节作用[11,12]。有报道[13]指出, 一种与LPA同类的脂类信号分子溶血磷脂酰胆碱 (lysophosphatidylcholine, LPC) 能通过一种新发现的G蛋白偶联受体促进胰岛素的分泌。新近的研究[14]发现, PA-PLA 1在大脑细胞内生成一种新的大麻受体-G蛋白偶联受体55 (G protein-coupled receptor 55, G PR 55) 的激动剂2-花生酰-溶血磷脂酰肌醇 (2-arachidonoyl-2-arachidonoyl-lysophosphatidylinositol) , 并可能通过PA-PLA 1-溶血磷脂酰肌醇-G PR 55轴参与大脑功能的发挥。基于这些研究报道, 可以假设PA-PLA 1可能通过在胰岛β细胞内水解PA生成LPA, 进而激活某种G蛋白偶联受体而参与胰岛素分泌的调节。
分泌表达 篇9
关键词：乳腺癌,乳腺肿瘤,SIRT1,SPARC
据世界卫生组织(WHO)统计资料显示,2000年全球新发女性乳腺癌病例超过100万,标化发病率为35.66/10万 ,标化病死率为12.5/10万 ,乳腺癌已成为全球妇女首发恶性肿瘤。在乳腺癌的病理类型中,浸润性导管癌恶性程度较高,预后较差。沉默信息调节因子(SIRT1)基因位于10q22.1,长约33 kb,蛋白分子量约为60 k U,具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的脱乙酰基酶活性, 其广泛存在于人体各个细胞内。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC),是一种非胶原糖蛋白,它在肿瘤中的作用是促进肿瘤细胞黏附,诱导肿瘤细胞迁移,并改变肿瘤细胞基质成分。两者均与乳腺癌的发生、发展、浸润和转移有关。本研究采用免疫组化检测SIRT1和SPARC在乳腺癌组织中的表达情况, 并进一步分析SIRT1、SPARC与临床病理因素之间的关系。
1 材料与方法
1.1实验材料
标本均为来源于潍坊市人民医院2014年1~6月经病理明确诊断的乳腺浸润性导管癌石蜡60例和乳腺纤维瘤15例,均为女性,年龄≥18岁,中位年龄43岁。所有乳腺癌患者均接受乳腺癌改良根治术或保乳术,术前均未行任何放疗及化疗治疗,无严重、未控制的内科疾病及感染,无病生存时间≥6个月。本研究已经医院伦理委员会研究通过,本研究均在患者及家属知情同意并签署知情同意书的条件下进行。依据TNM分期标准,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者分别为22、16、22例,且伴有淋巴结转移者25例,无淋巴结转移者35例,每例标本均有免疫组化法检测的雌激素受体(estrogen receptor,ER) 和孕激素受体 (progesterone receptor,PR)表达情况。
1.2 实验方法
SIRT1鼠抗人单克隆抗体(一抗,工作浓度1∶400)及SPARC兔抗人单克隆抗体(一抗,工作浓度1∶200)均购自北京博奥森生物技术有限公司,免疫组化试剂盒、抗体稀释液、PBS冲洗液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化采用Envision法,组织标本依次经过常规切片,脱蜡入水,高压修复,严格按照试剂盒说明书进行。以已知阳性切片作为阳性对照,用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定
经两位有经验的病理科专家对结果进行判定,SIRT1在细胞中阳性表达为黄色或棕黄色 ,SPARC在细胞中阳性表达为棕黄色[1]。根据染色程度及阳性细胞表达数进行评分:不着色记为0分,着色淡者记为1分,着色中等记为2分,着色深者记为3分,阳性细胞表达数:≤5%记为0分,>5%~25%记为1分,>25%~50%记为2分,>50%记为3分 ; 两者得分乘积为最后得分。0~1分记为阴性(-),2~3分记为弱阳性(+),4~6分记为阳性 (++),>6分记为强阳性(+++)。在统计分析中将表达(-)~(+)划分为低表达,(++)~(+++划分为高表达。
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析,SIRT1和SPARC的表达及其与临床病理因素的分析采用χ2 检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SIRT1 在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织中的表达
免疫组化染色结果显示(图1,封三),SIRT1主要表达于乳腺癌肿瘤细胞的细胞核和细胞质中。在乳腺纤维腺瘤及乳腺癌中,SIRT1的阳性表达率分别为33.3%(5/15)及61.7% (37/60),差异有统计学意义 (P< 0.05)。
2.2 SPARC 在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织中的表达
免疫组化染色结果显示(图2,封三),SPARC表达于肿瘤细胞、间质细胞的细胞质及细胞核中,以细胞质表达为主。SPARC在乳腺癌间质细胞的高表达率(73.3%,44/60)明显高于乳腺癌肿瘤细胞(10.0%6/60)和乳腺纤维腺瘤间质细胞(40.0%,6/15),差异均有统计学意义(P < 0.05)。提示SPARC在乳腺癌间质细胞中呈高表达,而在肿瘤细胞中呈现低表达。
2.3 乳 腺癌 组织 中 SIRT1 的 表达与临床病理指标的关系
乳腺癌中SIRT1的表达与患者年龄、肿物大小ER、PR等因素均无关 (P > 0.05),但与TNM分期、腋窝淋巴结转移有关(P < 0.05)。见表1。
注: SIRT1:沉默信息调节因子;ER:雌激素受体;PR:孕激素受体
2.4 乳腺癌组织 中 SPARC 的表达与临床病理 参数的关系
乳腺癌中SPARC的表达与患者年龄、肿物大小、ER、PR、TNM分期均无关 (P > 0.05), 但与腋窝淋巴结转移有关(P < 0.05)。见表2。
注:SPARC:富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白;ER:雌激素受体;PR:孕激素受体
3 讨论
SIRTl是组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)第Ⅲ类蛋白质家族的成员之一, 并且是NAD+依赖性组蛋白和蛋白脱乙酰基酶。SIRT1不仅可以通过组蛋白脱乙酰诱导染色质沉默,并且可以通过调节转录活性调节细胞存活,在细胞的生理及病理过程中起重要作用,如基因沉默、DNA损伤修复、肿瘤发生等[13]。SIRT1表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移有关。樊林等[14]研究认为,胃癌组织中SIRT1的表达较正常组织表达增高,且浸润深度越深、有淋巴结转移及临床分期越高时,表达随之升高。另有学者研究证明,SIRT1的高表达率在子宫内膜癌、肝癌、结直肠癌中明显上升,且在子宫内膜中的表达水平与临床分期呈正相关[15],在结直肠癌中的表达与分期及淋巴结转移呈正相关[16], 这可能与Wang等 [17] 发现的SIRT1是通过P13K/PTEN/AKT途径促进恶性肿瘤的发生有关。后期进一步研究发现,STRT1还通过脱乙酰基作用调控着诸多与肿瘤关系密切的信号因子,进而影响着肿瘤的各种特性[18,19,20]。例如:Powell等[21]的研究表明SIRTl的缺失可诱导前列腺上皮内瘤变的发生, 表明了SIRT1的抗肿瘤作用。但关于SIRT1在乳腺癌组织中的表达研究较为少见。本研究显示,在乳腺纤维腺瘤中SIRT1的阳性表达率为33.3%, 明显低于乳腺癌中SIRT1的阳性表达率(61.7%),差异有统计学意义 (P < 0.05),在有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ期的乳腺癌中SIRT1的高表达率高于无淋巴结转移、Ⅰ、Ⅱ期(P < 0.05),这与宋新峰[22]研究结果一致。SIRT1的表达与患者年龄、性别、肿物大小、ER、RP表达情况无关 (P > 0.05)。提示SIRT1可作为乳腺癌的诊断、病程判断 、预示乳腺癌的恶性程度的重要参考指标。
SPARC是一种含有大量半胱氨酸 (Cys) 的酸性分泌蛋白,又称骨连接蛋白(osteonec-fin)或基底膜40蛋白(BM40),编码SPARC蛋白的基因位于人类染色体5q31.3~q32,包含10个外显子,全长25.9 kb,为单拷贝基因[2]。SPARC蛋白的主要功能是阻止细胞黏附、促使细胞变形、改变细胞周期、调整细胞分化及抑制某些生长因子对细胞的刺激,还可以调节细胞外基质和基质金属蛋白酶的产生,并能影响新生血管的生成[3]。SPARC具有明显的组织特异性,已有研究表明,SPARC在转移性黑色素瘤中呈现高表达 , 在绝大多数异常痣中呈现中等表达[4,5];在前列腺癌的部分原发灶中呈现低表达或中等表达,在大部分前列腺癌转移灶中高表达[6], 此外 ,SPARC在恶性肿瘤中的表达与淋巴结转移有关。杨锡贵等[7]研究认为在有淋巴结转移的食管鳞癌患者中,SPARC蛋白阳性表达率较无淋巴结转移组升高;另有学者研究表明,在肺癌组织[8及子宫内膜癌组织[9]中,SPARC的表达与淋巴结转移呈负相关。学者将正常表达SPARC的小鼠和SPARC敲除小鼠进行比较,发现前者肿瘤的发生、发展、转移明显慢于后者。这可能与SPARC表达减少后影响ECM聚集 ,导致胶原沉着和纤维形成减少 ,抑制肿瘤细胞的黏附和迁移有关[10]。本研究结果表明,SPARC在乳腺癌组织和乳腺纤维腺瘤组织中表达存在差异性,在乳腺癌间质细胞的高表达率(73.3%)高于乳腺纤维腺瘤中高表达率(40.0%),两者差异有统计学意义; 在乳腺癌的间质细胞中SPARC的高表达率明显高于肿瘤细胞(10.0%)(P < 0.05),这与张雪梅[11]研究结果相一致。乳腺癌中有淋巴结转移的SPARC高表达率(96.0%)高于无淋巴结转移(74.3%)(P < 0.05),这与孙孝媛等[4]研究结果一致。说明在有淋巴结转移组中SPARC的表达强度可能与乳腺癌的浸润转移有关,这可能与Rotllant等[12]研究认为的SPARC通过溶解细胞黏着斑、促使细胞变圆、促进细胞骨架重排来完成其抗黏附作用, 增加肿瘤的侵袭和转移能力有关。SPARC在TNM分期为Ⅲ期的高表达率(94.4%)高于Ⅰ、Ⅱ期 (76.3%), 但差异无统计学意义 (P >0.05),考虑本研究纳入乳腺癌患者例数较少 ,Ⅰ、Ⅱ期患者占63.3%。SPARC在乳腺癌组织中的表达是否与TNM分期有关, 虽然本研究尚未得出具有统计学意义的结果,但可能随着样本量的增加,会出现有意义的结果。本研究结果表明,SPARC在乳腺癌中的表达与患者年龄、ER、PR、肿物大小、病理分期等因素无关,与淋巴结转移有关。这些提示SPARC与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移有关。
