表达状态

关键词： 球菌 机体 口腔 白色

表达状态（精选七篇）

表达状态 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

白色念珠 菌3683、SC5314、3630购自于ATCC;人口腔上皮细胞来源于50名健康志愿者。

1.2 试剂与仪器

沙堡液体培养基、RPMI 1640培养基及胎牛血清均购自美国Gibco公司;青霉素、链霉素及胰蛋白酶均购自美国Sigma公司;EDTA及细胞计数板购自上海碧云天生物技术有限公司;Trizol购自美国Invitrogenin公司 ; 荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连 )有限公司 ;引物购自上海生工 ;摇床购自德国Uni Equip公司 ;ABI 3900台式高通量DNA合成仪 、ABI 9700 PCR仪及ABI 7500全自动荧光定量均购自美国ABI公司。

1.3 白色念珠菌培养

将白色念珠菌3683、SC5314、3630接种于20 m L沙堡液体培养基中,于摇床培养18 h(37℃,200 r/min)。收集细菌,PBS洗2次,调整菌密度为1×107个/m L。

1.4 人口腔上皮细胞获取及培养

以细胞刮棒刮取来自浙江省温岭市第一人民医院的50名健康志愿者口腔上皮细胞,PBS洗两次,置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中, 调整细胞密度为1×107个/m L。

1.5 黏附能力检测

将口腔上 皮细胞与 白色念珠 菌3683、SC5314、3630以1∶100比例混合置于6孔板内,在摇床中孵育1 h(37℃,100 r/min)。 行革兰阳性染色 ,显微镜下随机选择50个口腔上皮细胞, 计数每个口腔上皮细胞上黏附的白色念珠菌数。 实验重复3次。 黏附能力计算为念球菌数/口腔上皮细胞数。

1.6 荧光定量 RT-PCR

1.6.1 白色念珠菌

白色念珠菌培养同“1.3”项下,PBS洗3次,调整菌密度为2×106个/m L。

1.6.2 口腔上皮细胞

细胞获取同“1.4”项下,调整细胞密度为2×105个/孔接种于6孔板。

1.6.3 共培养及观察

将口腔上 皮细胞与 白色念珠 菌3683、SC5314、3630分别以1∶10比例混合 ,RPMI 1640培养基培养 ,接种于6孔板,每孔1.5 m L,培养6 h,光学显微镜观察后,收集细胞,离心,置于-80℃冰箱保存。

1.6.4. 引物设计

ALS2:上游引物:5'-CCA AGT ATT AAC AAA GTT TCA ATC ACT TAT-3', 下游引物 :3'-TCT CAA TCT TAA ATT GAA CGG CTT-5',引物长度为366 bp。

ALS3:上游引物:5'-CCA CTT CAC AAT CCC CAT C-3', 下游引物 :3'-CAG CAG TAG TAG TAA CAG TAG TAG TTT CAT C-5',引物长度为342 bp。

GAPDH:上游引物:5'-TTG ACG GTC CAT CCC ACA A-3',下游引物:3'-GGA ATA ACC TTA CCA ACG GCT TT-5',引物长度为103 bp。

1.6.5 总 RNA 提取

用预冷的DEPC水1 m L清洗白色念珠菌, 置于1.5 m L EP管中 , 加入1 m L Trizol, 静置5 min; 加入0.2 m L氯仿,盖紧EP管,上下倾倒15 s,室温静置2~3 min,4℃ 12 000 r/min离心15 min,取上清;加入0.5 m L异丙醇,-20℃放置1 h,4℃ 12 000 r/min离心10 min,弃上清;75%乙醇洗2次,4℃ 12000 r/min离心5 min,弃上清, 吸取残存乙醇; 无菌台干燥5~10 min,加DEPC水溶解,-80℃保存备用。

1.6.6 RNA 纯度检测

应用紫外分光光度计检测RNA纯度, 分别测定260 nm和280 nm波长下RNA的吸光度 , 计算A260/A280,若比值在1.8~2.0之间则提示RNA质量较好。

1.6.7 逆转录反应

反应体系为5×逆转录buffer 2 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、d NTP 2 μL、RNase free d H2O 7.5 μL、Oligod T1 μL、Mgcl24 μL、AMV反转录酶1 μL、RNA模板2 μL,反转录体系共计20 μL;混匀后置于PCR仪中,反应条件为:42℃ 1 h,99℃ 5 min;得到c DNA模板,置于-20℃保存。

1.6.8 荧光定量 PCR

1.6.8.1标准品制备阳性标准品:预实验PCR扩增阳性产物经琼脂糖凝胶电泳, 紫外光下切割目的条带。采用回收试剂盒回收纯化。 利用A260测得值和片段长度计算其浓度,作为阳性标准品。 阴性标准品:采用灭菌双蒸水。

1.6.8.2 反应体系 5×SYBR Green Ⅰ PCR buffer 10 μL,上游引物 1 μL,下游引物 1 μL,d NTPs 1 μL,Taq 酶 1 μL,c DNA或阳性标准品1 μL,dd H2O 35 μL,反应体系共计50 μL。

1.6.8.3 反应条件 95℃ 3 min,95℃ 30 s,50℃ 45 s,共行 42 个循环。

1.6.8.4 数据测定 反应结束后 , 电脑分析结果 ,RNA表达=目的基因拷贝数/GAPDH 基因拷贝数。

1.7 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力

白色念珠菌3683、SC5314、3630与口腔上皮细胞共培养1 h后,革兰染色结果显示,3株白色念珠菌均可黏附于 口腔上皮 细胞 , 且菌株3683黏附数量(15.74±0.83)明显多于菌株SC5314(13.04±0.62)和菌株3630(13.11±0.57),差异有统计学意义(P < 0.05),而菌株SC5314和菌株3630黏附数量比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。

2.2 ALS2 及 ALS3 m RNA 表达情况

念珠菌口腔与上皮细胞混合培养6 h, 显微镜下观察显示口腔上皮细胞形态完整,周围黏附有白色念球菌,部分细胞已破裂为细胞碎片。 基因检测结果显示,混合培养6 h后,白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能检测到ALS2及ALS3 m RNA表达,其中,菌株3683 ALS2及ALS3 m RNA表达率均 高于菌株SC5314和菌株3630,统计学比较显示,差异有统计学意义(P < 0.05);菌株3630 ALS2及ALS3 m RNA表达水平均高于菌株SC5314,但两者比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 见表1。

注:与白色念珠菌 3683 比较,*P < 0.05

3 讨论

白色念球菌是人体重要的机会致病菌, 调查表明,近年白色念球菌的检出率逐年升高,其导致的医院感染排在第4位,且死亡率高达50%左右[6,7]。 研究已经证实,黏附性为白色念球菌的致病机制之一[8]。 过往白色念球菌对口腔上皮细胞的黏附性研究较多,但不同生物状态白色念珠菌黏附性的差异鲜有报道。 本研究观察白色念珠菌3683、SC5314、3630对口腔上皮细胞的黏附能力,对治疗选择的临床指导意义重大。

本研究黏附实验是将白色念珠菌与口腔上皮细胞混合培养,观察一定时间后每个口腔上皮细胞黏附白色念珠菌数, 该方法可直观证明菌株的黏附力,且操作简单[9]。 本研究黏附实验结果显示,3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮细胞, 且菌株3683黏附数量明显多于菌株SC5314和菌株3630, 统计学比较显示,差异有统计学意义(P < 0.05),而菌株SC5314和菌株3630黏附数量比较, 差异无统计学意义 (P >0.05)。 提示白色念珠菌株3683的黏附力最强 ,其对口腔的致病力最强。 导致不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞黏附能力差异的原因有待进一步分析。Zhao等[10]研究证实 , 野生型白色念球菌株 (CA112)、剔除ALS3基因的白色念球菌株(als3/als31843)及剔除了ALS1基因的白色念球菌株(als1/als11467)对颊上皮细胞和血管内皮包被的细胞培养板的黏附作用不同,其中,菌株als3/als31843对颊上皮细胞和血管内皮细胞的黏附数明显较低,而菌株als1/als11467仅对血管内皮细胞的黏附能力较低。 该结果提示了ALS家族基因功能的差异性及ALS3基因可能参与了白色念珠菌的黏附作用机制。

研究发现,ALS家族各基因的功能不同[11,12]。 一项对阴道念球菌感染的研究发现,虽然在感染过程中ALS家族各基因均检出,但ALS3基因的检出率最高[13]。 小鼠口腔念球菌感染模型初期检测显示,ALS1~4均可检出,提示其在念球菌感染初期已表达[14,15]。 本研究结果显示,念珠菌口腔与上皮细胞混合培养6 h,白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能检测到ALS2及ALS3m RNA表达, 其中, 菌株3683 ALS2及ALS3 m RNA表达率均高于菌株SC5314和菌株3630,差异有统计学意义 (P < 0.05); 菌株3630 ALS2及ALS3 m RNA表达率均高于菌株SC5314,但两者比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 结合本研究黏附实验结果可见,白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力与菌株中ALS2及ALS3基因的表达强弱有关,其中黏附能力强的菌株3683其ALS2及ALS3基因表达 水平高 。 提示ALS2及ALS3基因高表达可能为口腔白色念球菌感染致病机制之一。

综上所述,不同生物状态白色念珠菌的口腔上皮细胞黏附能力不同, 其中, 菌株3683的黏附能力最强,可能与其ALS2及ALS3基因的高表达相关。

摘要：目的 观察不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力及ALS m RNA表达,以期揭示口腔白色念球菌感染机制。方法 将白色念珠菌3683、SC5314、3630与来源于50名健康志愿者的口腔上皮细胞混合培养,采用革兰阳性染色观察白色念珠菌的黏附能力,采用荧光定量RT-PCR法检测白色念珠菌3683、SC5314、3630中ALS2及ALS3 m RNA表达情况。采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析。结果 黏附实验结果显示,3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮细胞,且菌株3683黏附数量明显多于菌株SC5314和菌株3630,统计学比较显示,差异有统计学意义(P<0.05),而菌株SC5314和菌株3630黏附数量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光定量RT-PCR结果显示,白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能检测到ALS2及ALS3 m RNA表达,其中,菌株3683ALS2及ALS3 m RNA表达水平均高于菌株SC5314和菌株3630,统计学比较显示,差异有统计学意义(P<0.05);菌株3630 ALS2及ALS3 m RNA表达水平均高于菌株SC5314,但两者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同生物状态白色念珠菌的口腔上皮细胞黏附能力不同,菌株黏附能力的强弱可能与其ALS2及ALS3基因情况表达相关。

浙江舟山方言状态词的程度表达 篇2

摘 要：浙江舟山方言状态词的程度表达不仅方式灵活多样，而且特点鲜明。就中级程度的表达而言，有前缀式、叠缀式和后缀式，具有浓烈的形象色彩；就高级程度的表达而言，有“名词性语素+得斯（骨斯）+形容词性语素”形式及其他形式，具有强烈的画面感。较之普通话，它形象生动；较之其他地区的吴方言，它具有独特的个性。

关键词：舟山方言 状态词 程度表达

舟山方言状态词的程度表达分为初级、中级、高级三类，略相当于英语中的原级、比较级和最高级。初级程度表达有两大特点：第一，相比宁波方言，相似度极高。两地地理位置及文化习惯相近，语言习惯也相似，如都使用“闹热”“壮”“领径”等词。第二，相比普通话，大部分一致，但是有不同点：与普通话同实异名，如“竭力”（舟山方言）——“疲倦”（普通话）；与普通话同名异实，如普通话的“壮”指“结实、强壮”，舟山方言的“壮”指“胖、肥”；与普通话有单音词复音词的区别，如“皮”（舟山方言）——“顽皮”（普通话）；舟山方言有而普通话没有，如“嘎门”（状态不感兴趣）。

舟山方言状态词的程度表达最有特色的莫过于中级和高级程度形式，故下文详细表述。本文通过舟山方言状态词不同程度的表达形式和特征，旨在表现舟山方言状态词的特点，并从中呈现舟山方言某方面的特征。

一、舟山方言状态词中级程度的表达

舟山方言状态词中级程度的表达形式复杂，但又有规律可寻：在初级程度状态词形式的基础上，通过变形法、前加法、后加法，呈现出三大类的形式特征。

（一）表达方式

1.前缀式

该形式使用前加法，在状态词前加上修饰语，令程度深化。舟山方言最常见的形式是以单音节状态词作词根，在该词根前加上一个形象化的比拟词前缀，构成AB式。例：“血红、笔尖、蜜甜”等。

2.叠缀式

叠缀式数量多，构词方式多样，语义涉及范围广泛。它通过变化状态词本身的形式来表示不同的程度，即以变形法为手段，但是它仍然离不开单音节状态词本身的基础性作用。该形式主要包括以下几种：

（1）ABB式

这是最常见的一种形式，由词根和一个叠音后缀组成三音节合成词。它的能产型强，运用广泛，结构灵活。其中，叠词的表达所受限制少，使其类型更加多样。例如：

酸——酸滋滋、酸咪咪、酸丢丢、酸唧唧；淡——淡索索、淡斯斯、淡咪咪、淡滋滋；冷——冷清清、冷幽幽、冷滋滋、冷骨骨、冷斯斯。

（2）AAB式

AAB式是ABB式的一种变形，不仅可以加深程度，而且会使所描写的事物更加形象生动，富有趣味。它的构成方式通常是“名词性语素+状态词语素”（“粉粉燥”）或是“量词性语素+形容词语素”（“只只甜”），使得重叠的语素义虚化，在普通话中是比较少见的。

（3）ABAB式

ABAB式由AB式重叠而成，不仅可以加深强度以起到强调的作用，还可以给人留下听觉上的美感。回环往复、节奏强烈，是舟山方言词汇富有韵律美的典型特征。如：焦黄焦黄、绯红绯红、蜜甜蜜甜、瓜酸瓜酸、透鲜透鲜、滚圆滚圆、滚壮滚壮、铁新铁新。

（4）ABAC式

ABAC式多用来形容一个人的举止，大多数具有贬义，具有形象生动的特点。它的程度比其他三种稍弱，但形象感更强。例如：

空头空脑——形容说话比较虚。头和脑都处于一种“放空”的状态，说明缺乏内容。如：渠说话空头空脑，莫听渠过。（他说话很虚，不要听他的。）

油头油脑——形容做人很油滑。用具体的“头脑”借代抽象的思考等行为，以此来形容一个人为人处事、思考问题的方式不务实。如：该人油头油脑。（这人很油滑。）

3.后缀式

（1）形容词语素+“相”

“相”作为舟山方言一个特殊的后缀语素，它所构成的状态词通常用来描述人的外貌，表示“很、蛮”。它的感情色彩丰富，褒义、贬义和中性色彩分明。例如：

嫩相——很年轻。因为只是陈述所看的事实，缺乏称赞的褒扬之意，因此是中性词。

活相——很机灵，富有朝气。它具有浓重的褒义色彩，通常用来夸奖一个人机智灵敏，能灵活处理事情。

死相——很呆滞，没有生气，是贬义词，通常用来形容人死气沉沉，缺少面部表情。

（2）形容词语素+“吧啦”

“吧啦”也是一个独特的后缀，没有实际意义，对前面的词根起到一个辅助的作用。如：“泥腥（脏）吧啦、伤心吧啦、罪过（可怜）吧啦、危险吧啦”。

（二）特点

1.前缀式

（1）第一音节是可独立的名词性语素

普通话中第一音节是可独立的名词性语素，其程度没有舟山方言的深刻强烈。而舟山方言中第一音节是可独立的名词性语素，都含有并且侧重于“很”的意思。如：“红——血红”。前一词根“血”修饰后一词根“红”，起到加强程度的作用。徐波（2005）认为：“血红”的“血”是一个半虚半实的语素，一方面，给予“红”这个抽象的形容颜色的语素以可感的形象；另一方面，实词“血”的意义虚化，表示“很”的意思。

（2）第一音节是形容词性的语素

普通话中第一音节是形容词性的语素多并列结构，如“绯红”中的“绯”即是“红”；而舟山方言多表示“很怎样”。如“冰冷”中的“冰”形容冰水刺骨般的冷意，表示很冷。又如“火热”，表示很热，这里的“火”作为形容词，用来形容如火般的炽热。

（3）第一音节是动词性的语素

普通话中位于第一音节的词没有虚化，或是本义或是其引申义，如“滚圆”，圆而可滚，很有形象感，给静止的事物赋予了动态。但是舟山方言中的“滚”的动词性意义已经虚化，当作副词用，表示“很、蛮”。

2.叠缀式

（1）结构对称匀整、声韵和谐

舟山方言状态词叠缀式结构对称匀整，以三字格和四字格为主要表现形式，并且这类四字格是由原先的非四字格通过重叠、加缀等方式进行衬音垫字而构成的，不是普通的偏正式、并列式、动宾式等结构。因此，在声韵上表现出了强烈的节奏感以及韵律的音乐美。

（2）形象色彩鲜明

舟山方言叠缀式状态词具有鲜明的形象色彩，它能带给人某种生动具体的感觉，即形象感。它常常能将抽象的理念化为具体可感的形象，带给人强烈的直观感受。

（3）叠缀式以ABB式为主，其他形式多是ABB式的变形

ABB式的变化形式可扩展为四音节状态词，除上文外，还可变成以下几种数量不多的形式：ABB——AYBB（红汗汗——红出汗汗）、ABB——ABYZ（热拔拔——热拔几燥）、ABB——AZBY（痒嗖嗖——痒抹嗖喽）。它也可变为其他形式的三音节状态词，如BBA式（香喷喷——喷喷香）。

（4）叠缀式的运用具有灵活性，往往多用其引申义

“焦黄焦黄”，它虽是颜色词，却经常被用来形容一种憔悴的病态，如：侬面色焦黄焦黄格。（你的面色看上去很憔悴。）

“石苦石苦”，它虽是形容味道的词，但经常用来泛指嘴巴很干，没什么味道。例如：我嘴巴石苦，一眼而味道啊呒呐。（我嘴巴很苦，没有一点味道。）

3.后缀式

（1）不同的后缀拥有较为确定的形容领域

“相”作为后缀语素，通常用来形容一个人的外貌；而“吧啦”则通常用来形容一个人的心理感受，很少用于其他描写。

（2）表现方式的独特性

后缀式的状态词本身具有独特性，普通话通常把表达程度意义的词放在形容词前面，如“很漂亮”；虽也有放在后面的情况，如“漂亮得很”，但是需要其他性质的词的辅助作用，而这类词通常是“的”，并且这种用法只限于“很”。而舟山方言有丰富的后缀式表达方式，并且运用广泛、灵活，体现了其特殊性。

二、舟山方言状态词高级程度的表达

舟山方言状态词高级程度的表达通常以四字格的形式展现，也有三字格、五字格，但数量上比较少。它总体呈现一种不规则的形式，但是在这种不规则中也可以发现某些具有特定规则的构词方式。

（一）表达方式

1.名词性语素+“得斯（骨斯）”+形容词性语素

在舟山方言状态词中，“名词性语素”是一个半实半虚的语素，它代表一定的实际意义，并且具有某种程度的渲染、加深功能；“得斯（骨斯）”是一个没有任何实际意义的虚语素，但它在程度的表达上具有决定性的作用；“形容词性语素”则是表述一种状态。例如：“血得斯红、蜜得斯甜、棉得斯软、笔得斯直、屁得斯轻、冰骨斯冷、铮骨斯亮”等。

2.其他形式

其他形式的状态词呈现出灵活多样的不规则状态。如：三字格的“撒骨咸”、四字格的“异样刮得”、五字格的“火热嗒嗒烫”“撒啦斯清爽”等。

（二）特点

1.使用的多样性

根据个人习惯的不同，舟山方言高级程度的表达具有多样性，体现了一种灵活的不规则性。如：“墨擦地黑”——“墨泥擦黑”，“铮骨斯亮”——“铮挂亮”，“冰骨斯冷”——“冰挂斯斯冷”，“雪得斯白——雪白里娘”，“妥得斯软——妥的斯斯软”。

2.生动的画面感

状态词高级程度的表达形式与普通话中的“最”相比，更具活力。它不仅仅是文字，更具有可视可感的画面效果。如：“火热嗒嗒烫”，该词形象地展示了一幅画面——不断冒着水泡的热水，伴随着嗒嗒的沸腾声。这带给人强烈的感官刺激，让人体会到“热”的一种最高状态。

三、结语

舟山方言状态词不同程度的表达形式是一种约定俗成的语言表达方式，是舟山人民通过长期的社会实践，归纳、总结、提炼出来的，具有多样的选择性。某些虚语素，在不同的表达中，其所传达的程度是不一样的。如“觉关”，在“有趣——眼有趣——交关有趣”中，表示的程度最深，而在“清爽——交关清爽——萨拉斯清爽”中，却表示中等。所以，舟山方言状态词的程度表达更灵活，满足了舟山人民个人表达的多样化及个性化需求。与此同时，它还具有某些规律性，呈现出一种“杂而有序、序中有杂”的鲜明特点，体现了舟山方言的独特性与浓厚的地域文化色彩。

参考文献：

[1]徐波.舟山方言中ABB式摹状形容词[A].上海市语文学会、香港中国语文学会、第三届国际吴方言学术讨论会论文集[C].上海：上海教育出版社，2005.

[2]徐波.舟山方言俗成语修辞考察[J].浙江海洋学院学报（人文科学版），2002，（4）.

[3]周志锋.宁波方言的词汇特点[J].宁波大学学报（人文科学版），2010，（1）.

[4]吴子惠.吴方言形容词表示程度的语法手段[J].浙江教育学院学报，2010，（6）.

表达状态 篇3

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集河北省河北医科大学第四医院胸外科2009年1月~2009年12月手术切除标本,经术后病理证实为食管鳞状细胞癌且未经放、化疗过的患者:其中男,44例,女,18例;年龄45~73岁,平均年龄60.74岁;部位上段3例,中段52例,下段7例。并取癌旁组织(距离癌组织约5 cm)30例作为对照。

1.2 主要试剂与仪器

组织基因组DNA提取试剂盒、Hot Taq DNA polymerase及PCR试剂均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;甲基化DNA修饰试剂盒为EZ DNA methylation-Gold Kit TM为北京天漠科技开发有限公司产品;PCR引物由上海生工合成;核酸分光光度仪为美国ND-1;PCR扩增仪为美国ABI7300;凝胶成像系统为美国PHAIMAGE。

1.3 试验方法

1.3.1 组织D N A的提取、亚硫酸氢盐修饰及其完整性判定

新鲜组织样品取30 mg切成小块,在液氮中碾碎。将粉末收集到1.5 m L离心管中,用200UL TE悬浮其余步骤按试剂盒说明书提示操作。提取DNA后检测DNA的含量和纯度,选取A260nm/A280 nm的比值在1.8~2.0的标本作为实验研究对象,采用甲基化DNA修饰试剂盒对DNA样品进行亚硫酸氢盐修饰。同一样品DNA在亚硫酸氢盐修饰前、后均用甲基化特异性引物和非甲基化特异引物扩增,如修饰前无任何目的条带扩增而修饰后有目的条带扩增,则甲基化完全。

1.3.2 甲基化特异性PC R扩增(M SP)

WIF-1的特异性甲基化引物(MSP)为5'-GGTTTTATTGGGCG TATCGT-3'(F),5'-ACTAACG CGAACGAAATACG A-3'(R),WIF-1的特异性非甲基化引物(USP)为5'-GGGTGTTTTATTGGGTGTATTGT-3'(F),5'-AAA AAAACTAACACAAACAAAATACAAAC-3'(R)。产物大小分别为145 bp,154 bp。对修饰后的DNA样品作PCR扩增。反应条件:95℃,10 min;95℃,40 s;52~57℃,40 s;72℃,40 s,35个循环;72℃,10 min。

1.3.3 对照的选择

抽取正常人外周血,EDTA抗凝,提取有核细胞的DNA,经Sss I甲基化酶处理作为甲基化的阳性对照,未经处理的正常人外周血DNA作为非甲基化的阴性对照,去离子水替代DNA模板作为空白对照,以消除假阳性的干扰。

1.3.4 R T-PC R

检测方法及逆转录合成c D N A,R T-PC R扩增Trizol法提取总的RNA,用紫外分光光度计测定RNA液OD260/OD280值≥1.8,RNA的电泳条带28S、18S、5S应清晰无降解。逆转录合成c DNA,-20℃保存备用。c DNA扩增:WIF-1基因的RT-PCR引物序列5'-CCGAAATGGAGGCTTTTGTA-3'(F),5'-TGGTTGAGCAGT-TTGA-3'(R),产物188 bp。内参GAPDH引物序列为5'-GCCTCGCTGT CCACCTTCCA-3'(F),5'-CACCTTCACCGTTCCAGT TT-3'(R),产物253 bp。PCR反应条件:95℃,5 min;95℃,40 s;52~57℃,40 s;72℃,40 s,35个循环;72℃,10 min。

1.3.5 结果的判定

(1)MSP结果分析:经Sss I甲基化酶处理后的DNA用甲基化特异性引物扩增,得到预期大小的甲基化目的片段,而空白对照未得到任何产物,说明所用引物与试剂正确。甲基化引物扩增阳性者为甲基化阳性,非甲基化引物扩增阳性者且甲基化引物扩增阴性者为甲基化阴性,甲基化引物与非甲基化引物扩增均阳性者,记做甲基化阳性。(2)m RNA检测结果半定量分析:产物通过Alphaease凝胶成像系统分析。测定目的基因扩增条带和与之对应的内参基因扩增条带的斑点平均光密度值AVG与条带面积AREA的乘积即IDV,结果以目的条带的IDV与之对应的内参基因扩增条带的IDV比值表示。即:相对表达量=目的基因IDV/内参基因IDV。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2和Fisher确切概率法,计量资料采用t检验及LSD、S-N-K方差分析,均为双侧检验,P<0.05视为有统计学意义。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 E S C C组织W IF-1基因启动子甲基化状态

ESCC组织及癌旁组织中甲基化情况见(图1)。ESCC组织中WIF-1甲基化率59.7%(37/62),癌旁组织中甲基化率为13.3%(4/30)。WIF-1基因在癌组织中甲基化率明显高于其相应的癌旁组织(P<0.05)。这说明WIF-1启动子甲基化可能在食管癌发生中有重要作用。

2.2 W IF-1基因甲基化与临床资料之间的关系

ESCC组织中甲基化情况与患者的年龄、癌组织分化程度及淋巴结有无转移相关(P<0.05),而与性别、部位、浸润深度及临床分期无关(P>0.05,附表)。

2.3 W IF-1基因m R N A在E S C C组和相应的癌旁正常组中的表达

WIF-1基因m RNA ESCC组表达量(0.565±0.112)显著低于癌旁正常组(0.666±0.107),差异有显著性(P<0.05)(图2)。

WIF-1mRNA在ESCC组织中表达情况与临床资料之间的关系详见(表1)结果显示:WIF-1mRNA在ESCC组织中表达与分化程度相关,随着分化程度的升高,m RNA的表达量降低,差异有显著性(P<0.05),而与性别,年龄,部位,淋巴结转移,浸润深度,临床分期无关(P>0.05)。

在WIF-1基因甲基化阳性的ESCC组织中,其m RNA相对表达量为(0.547±0.116),甲基化阴性的ESCC中m RNA相对表达量为(0.593±0.101),两者差异无显著性(P=0.111>0.05)。

M为甲基化,U为非甲基化,CA为癌组织,N为癌旁组织,MA为Marker

βN为癌旁组织内参,βCA为癌组织内参,CA为癌组织,N为癌旁组织,MA为Marker

3 讨论

Wnt信号通路是机体内的重要调控信号,在前列腺癌、肺癌、结肠癌等多种人类肿瘤的发生中广泛活化[3]。WIF-1序列高度保守,首先在人的视网膜中被证实,定位于染色体12q14.3,是Wnt/β-catenin信号途径的下游区基因,其编码产物为WIF-1蛋白,在人的前列腺、肺和脑中含量丰富[4]。

2007年傅斌等[5]通过研究57例膀胱癌患者WIF-1基因的甲基化情况,并选取13例正常膀胱组织和20例腺性膀胱炎标本做对照。结果显示膀胱癌、腺性膀胱炎和正常膀胱组织WIF-1启动子甲基化率分别为57.9%,15.0%和0,差异有显著性(P<0.01)。WIF-1启动子甲基化阳性率随肿瘤分级、分期的增加而显著升高(P<0.05)。

2008年丁振等[6]通过研究33例肝细胞癌及相应的癌旁组织W IF-1甲基化率分别为39.39%(13/33),15.15%(5/33)。WIF-1基因在肝癌组织中甲基化率均明显高于其相应的癌旁组织(P<0.05)。WIF-1基因m RNA在上述两种组织中平均相对表达量分别为(0.853±0.510)、(0.820±0.316,差异无显著性(P>0.05)。癌组织和癌旁组织中m RNA表达在甲基化组与非甲基化组之间均差异无显著性(P>0.05)。

该实验MSP结果显示:ESCC组织中WIF-1基因启动子区呈高度甲基化,癌组织与癌旁组织中甲基化率有明显差别(P<0.05)。

RT-PCR结果显示:WIF-1基因m RNA相对表达量在ESCC组均显著低于癌旁正常组,提示WIF-1基因m RNA表达异常可能与ESCC的发生有关。WIF-1基因m RNA相对表达量在甲基化阳性的ESCC组织与甲基化阴性的ESCC组织中差异无显著性,提示甲基化可能不是导致m RNA表达异常的主要原因。

综上所述,Wnt信号传导通路的异常激活与肿瘤的发生有着密切的关系,而WIF-1基因作为Wnt信号通路的抑制基因,其启动子的甲基化可致Wnt信号传导通路异常激活,从而参与食管鳞状细胞癌的发生。但目前有关WIF-1与食管癌关系的研究仍较少,对食管癌癌变过程中WIF-1表达的变化情况及其作用机制仍不清楚,随着研究的深入,WIF-1有望成为食管癌诊断与治疗的新靶点。

参考文献

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表达状态 篇4

1 材料和方法

1.1 材料

MPO测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所,50%葡萄糖购自湖北科伦药业有限公司,血糖仪购自中国强生医疗器材有限公司,美国Life Scan公司血糖试纸,Cox-2抗体购自Santa Cruz公司,GAPDH抗体购自杭州贤至生物有限公司,Trizol试剂盒购自Invitrogen公司,c DNA第一链合成试剂盒购自Fermenta公司。

1.2 动物选择与分组

SPF级成年雄性SD大鼠,体重250~300 g,购自武汉大学实验动物中心,随机分为正常血糖假手术(NG-Sham)组、正常血糖缺血再灌注(NG-I/R)组、高糖假手术(HG-Sham)组、高糖缺血再灌注(HG-I/R)组4组(n=8)。

1.3 动物模型

大鼠术前禁食,2%戊巴比妥钠腹腔注射45 mg·kg-1麻醉大鼠,腹腔注射25%葡萄糖3 g·kg-1或等量生理盐水后固定,取腹部正中切口,切开皮肤,显露腹白线,30 min后剪开腹白线,暴露腹腔,双线结扎右侧肾蒂并切除右侧肾脏;剪开腹白线15 min后用无损伤微血管夹夹闭左侧肾蒂45 min,缺血45 min后移除肾蒂上的微血管夹重新恢复血供,缝合关闭腹腔,再灌注24 h为肾缺血再灌注模型。腹腔注射25%葡萄糖3 g·kg-145 min后夹闭肾蒂为急性高糖模型,血糖大于11.1 mmol·L-1为急性高糖造模成功。

1.4 指标测定

1.4.1 比色法测定MPO活性

准确称取肾组织,按重量比1∶19加匀浆介质制备成5%组织匀浆液,取5%组织匀浆540μl加入试剂60μl,充分混匀后37℃水浴15 min,根据说明书依次加入试剂后混匀,60℃水浴10 min,取出后置于波长460 nm处测定吸光度值。

1.4.2 RT-PCR检测Cox-2-mRNA表达

参照TRIzolReagent说明书提取新鲜肾组织细胞中的总RNA并行纯度及完整性检测,按步骤进行反转录合成c DNA,引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计合成。按试剂盒操作说明进行PCR。

1.4.3 Western blotting检测Cox-2蛋白表达水平

RIPA裂解液匀浆组织,测定总蛋白浓度。各样品取50μg总蛋白上样电泳,湿转法转膜,用5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h。加入用封闭液稀释的一抗(1∶200),4℃孵育过夜。加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记二抗,室温摇床孵育2 h,显色曝光,凝胶成像仪成像。Band Scan软件分析胶片灰度值。

1.5 统计学处理

计量资料以±s表示,应用SPSS 19.0进行数据处理,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性高糖对缺血再灌注大鼠肾组织MPO活性的影响

与Sham组相比,I/R组MPO活性均显著增高(P<0.05),而HG-I/R组的MPO活性又明显高于NG-I/R组(P<0.05)。见图1。

与Sham组比较,a P<0.05;与NG-I/R组比较,b P<0.05

2.2 急性高糖对缺血再灌注大鼠肾组织Cox-2表达的影响

RT-PCR检测结果显示,Sham组大鼠肾组织内有均有微量的Cox-2-mRNA表达;再灌注24 h后I/R组较Sham组大鼠肾组织内Cox-2-mRNA表达明显增强(P<0.05),HG-I/R组较NG-I/R组肾组织内Cox-2-mRNA表达显著增多(P<0.05)。见图2。

与Sham组比较,a P<0.05;与NG-I/R组比较,b P<0.05

Western blotting检测结果显示,I/R组较Sham组大鼠肾组织内Cox-2蛋白表达增强(P<0.05),且HG-I/R组的Cox-2蛋白表达显著高于NG-I/R组(P<0.05)。见图3。

3 讨论

缺血再灌注损伤所导致的炎症反应是肾移植手术后移植肾功能恢复延迟的一个重要因素[6]。这种无菌性炎症反应导致血管内白细胞聚集并穿透血管壁,浸润组织,同时伴随微循环障碍[7]。

与Sham组比较,a P<0.05;与NG-I/R组比较,b P<0.05

MPO存在于髓系细胞的嗜苯胺蓝颗粒中,是髓细胞的特异性标志,在机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用,可催化反应生成过量的氧化剂,造成炎症部位氧化应激和组织细胞损伤[8]。本研究证实SD大鼠缺血前的急性高糖可以导致缺血肾脏中MPO活性明显增加。

Cox-2已被证实可在多种炎症细胞因子、感染等刺激因素下所诱导,在组织损伤部位表达增强。本研究发现缺血再灌注损伤明显增强了肾脏Cox-2的表达,而在高糖环境下这一作用被进一步放大。有报道称使用Cox-2抑制剂可明显降低肾缺血再灌注损伤后的肾小管上皮细胞的凋亡率,改善肾功能,提示其可能参与了肾缺血再灌注损伤后的炎症反应[5]。另有研究证实在肾脏缺血再灌注后,在Cox-2表达达到高峰后数小时肾损伤也达到了高峰[9]。

Esposito等[10]报道在使用生长抑素排除胰岛素分泌的影响后,急性高糖能造成健康成人的包括白细胞介素在内的多种炎症细胞因子在短期内明显增加。本研究通过腹腔注射25%葡萄糖造成急性高糖环境,发现亦可导致非糖尿病大鼠缺血再灌注后MPO和Cox-2的进一步升高。

综上所述,正常环境下肾缺血再灌注后,MPO和Cox-2表达升高,是机体对I/R所产生的一种应激反应。然而缺血前急性高糖可以加重肾缺血再灌注所引发的炎症损伤,导致损伤进一步加重。

摘要：目的:探讨急性高糖对缺血再灌注后大鼠肾组织髓过氧化物酶(MPO)和环氧合酶2(Cox-2)表达的影响。方法:成年雄性SD大鼠随机分为正常血糖假手术(NG-Sham)组、正常血糖缺血再灌注(NG-I/R)组、高糖假手术(HG-Sham)组、高糖缺血再灌注(HG-I/R)组4组(n=8)。大鼠切除右侧肾脏,夹闭对侧肾蒂45 min再灌注24 h制备肾缺血再灌注模型。大鼠急性高糖模型为术前45 min通过腹腔注射25%葡萄糖3 g·kg-1制备。比色法检测大鼠肾脏MPO,RT-PCR法检测肾脏Cox-2-mRNA,Western blotting检测肾脏Cox-2蛋白表达。结果:与Sham组相比,I/R组MPO活性,Cox-2-mRNA、Cox-2蛋白表达均显著增高(P<0.05),而HG-I/R组的MPO活性,Cox-2-mRNA、Cox-2蛋白表达又明显高于NG-I/R组(P<0.05)。结论:急性高糖可以增加缺血再灌注后大鼠肾组织MPO活性,增加Cox-2的表达水平,加重肾缺血及再灌注所引发的炎症损伤。

关键词：高糖,肾脏,缺血再灌注,Cox-2,大鼠

参考文献

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表达状态 篇5

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康成年雄性Wistar大鼠54只 (山西医科大学实验动物中心提供) , 体重190 g～230 g;氯化锂、匹鲁卡品、丙酮酸乙酯均购自美国Sigma公司;XIAP兔抗鼠多克隆抗体购自北京博奥森生物科技有限公司;Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、TUNEL试剂盒、即用型SABC试剂盒、DAB试剂均购自武汉博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

雄性Wistar大鼠54只, 随机分为对照组 (N组) 6只、模型组 (M组) 和丙酮酸乙酯组 (EP组) 各24只, 后两组按时间点分为4个亚组 (6 h, 12 h, 24 h, 48 h) 。

1.2.2 动物模型建立

各组均采用灌胃法处理, EP组造模前15 min腹腔注射丙酮酸乙酯50 mg/kg, N组和M组给予等容积生理盐水。15 min后M组、EP组腹腔注射氯化锂按体重127 mg/kg , 20 h后经腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30 mg/kg。N组腹腔注射等量生理盐水。观察大鼠出现癫痫发作的时间, SE达1 h时, 给予地西泮10 mg/kg腹腔注射终止癫痫发作。参照Racine评价标准。0级:无任何发作迹象;Ⅰ级:凝视, 头面部轻微颤动;Ⅱ级:点头或湿狗样抖动;Ⅲ级:前肢局限性惊厥;Ⅳ级:具有后肢站立的全身强直性惊厥;Ⅴ级:具有站立伴摔倒的全身强直-阵挛性发作。

1.2.3 标本处理

M组和EP组大鼠分别于SE后相应时间点处死, N组同SE后6 h组处死。用25%乌拉坦4 ml/kg深麻醉后, 立即断头取脑, 置入4%的多聚甲醛中固定, 常规脱水、透明、浸蜡、包埋后, 在视交叉海马区连续切片, 片厚5 μm。

1.2.4 TUNEL染色

按试剂盒 (POD) 提供的方法进行严格操作, 细胞核染成棕黄色颗粒者即为阳性细胞, 即凋亡细胞。

1.2.5 XIAP、Caspase-3蛋白免疫组化检测

常规SABC法行免疫组化检测, DAB显色。每张切片取5个 (×400倍) 视野, 测定每个视野的阳性细胞数, 取其平均值。胞浆或核膜染色呈棕黄色为蛋白阳性表达。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计分析软件, 两组间的比较采用t检验, 多组间的比较采用方差分析, 检测结果以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。

2 结 果

2.1 行为学观察

N组无癫痫发作。M组大鼠注射匹鲁卡品15 min～30 min后均出现节律性点头、咀嚼、流涎等动作, 随后出现单侧或双侧前肢阵挛, 此后出现前肢阵挛伴站立, 进一步发展到全身强直阵挛发作伴站立、摔倒, 反复发作, 均达到Ⅳ级～Ⅴ级发作, 呈癫痫持续状态。EP组大鼠也均达到SE, 但痫性发作程度较M组轻, 多在Ⅲ级～Ⅳ级, 且潜伏期较长。

2.2 HE染色结果

N组神经元整齐排列紧密, 细胞核呈圆形或椭圆形, 胞浆透明, 染色质均匀分布, 核仁清晰。M组出现嗜酸性神经元, 细胞排列紊乱, 胞体收缩, 胞浆红染、胞核固缩胞。EP组也出现嗜酸性神经元, 但排列尚可整齐, 形态尚属正常。

2.3 细胞凋亡检测

N组仅见少量TUNEL阳性细胞表达。M组SE后6 h可见TUNEL阳性细胞表达, 且随时间点延长而增加, 24 h时达高峰, 48 h时减少。EP组与M组凋亡阳性细胞数的变化相似, 但相应时间点TUNEL阳性细胞数均显著少于M组 (除6 h外, P<0.05) 。详见表1。

与N组相比, 1) P<0.05;与M组相比, 2) P<0.05

2.4 XIAP及Caspase-3免疫组化结果

XIAP、Caspase-3在N组有微量基础表达。SE后6 h时M组XIAP、Caspase-3开始增强, 12 h时XIAP达高峰, Caspase-3显著增强;24 h时XIAP开始减弱, Caspase-3达高峰;48 h时两者均减弱。EP组与M组比较, 各个时间点XIAP和Caspase-3表达差异均有统计学意义 (除6 h外, P<0.05) 。详见表2、表3。

3 讨 论

在大脑癫痫持续状态损伤过程中伴有大量神经元凋亡, 从而加重了神经元的损伤, 这主要与细胞内钙超载及氧自由基产生有关。Caspase蛋白酶家族是执行中枢神经系统神经元凋亡过程的主要酶类, 在神经元凋亡中发挥关键作用。Caspase-3是Caspase家族最重要的蛋白酶, 也是凋亡发生的标志性酶。在正常细胞内Caspase以无活性的蛋白酶原形式存在, 凋亡信号刺激靶细胞时通过Fas/FasL系统和粒酶B/穿孔素系统等途径以级联反应的形式被激活, 活化的效应性Caspase-3是各种凋亡通路的共同中介, 能直接或间接酶解一系列细胞存活所必需的蛋白, 促进细胞凋亡的发生。因此, 一旦Caspase-3启动便宣告细胞必定死亡。

凋亡抑制蛋白 (IAPs) 是迄今作用最强的内源性Caspase的抑制剂, IAP家族中XIAP是结构最典型、功能最全面、作用最强的, 也是近年来与凋亡相关的研究热点[3]。XIAP具有特征性结构即杆状病毒重复序列结构 (Baculoviral IAP repeat, BIR) 及羧基端具有泛素连接酶E3活性的环指结构域 (Ring finger domain, RING) 。XIAP可通过其BIR2抑制有活性的Caspase-3和Caspase-7, 通过BIR3抑制有活性的Caspase-9, 同时其具有的RING锌指结构可介导具有E3活性的XIAP本身和其靶分子的泛素化降解等多种途径来发挥抗凋亡作用 [4]。研究证实, 氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠SE后观察到XIAPmRNA、Smac等表达现象, 表明XIAP确实参与了SE后神经元损伤的调控过程[5]。本实验研究结果显示, N组仅有XIAP、Caspase-3基础量的表达;M组XIAP于SE后6 h升高, 12 h达高峰, 48 h减少, 而Caspase-3于SE后6 h升高, 24 h达高峰, 与TUNEL阳性细胞的表达基本一致, 进一步证实了XIAP可抑制神经元凋亡;EP组各个时间点Caspase-3、TUNEL阳性细胞数较M组减少 (除6 h, P<0.05) , 而XIAP阳性细胞数增加 (除6 h外均P<0.05) , 表明丙酮酸乙酯能够通过上调XIAP、下调Caspase-3, 从而发挥抗凋亡作用。

EP作为一种新型的脑保护剂越来越受到人们的关注。EP能抑制大鼠体内的氧自由基的氧化作用, 是一种过氧化氢清除剂, 具有防止自由基损伤的作用;EP可调节多种炎症介质的释放如HMGBl、TNF-α及IL-6等发挥抗炎症介质作用[6];对心脏、肝脏、小肠等多种器官缺血再灌注损伤 (I/R) 、内毒素损伤、休克等病理状况下EP均具有保护作用[7,8]。本研究显示在大鼠癫痫持续状态模型中, 采用丙酮酸乙酯预处理可减轻癫痫发作的级别和减少神经元的凋亡, 其可能机制是通过上调SE时大鼠脑组织内的XIAP的表达及抑制Caspase-3的生成, 阻断凋亡信号传导通路及凋亡执行途径发挥抗凋亡作用。丙酮酸乙酯对SE后大脑的保护机制是多途径、多位点。

摘要：目的 探讨丙酮酸乙酯干预对大鼠癫痫持续状态 (SE) 后导致神经元损伤的影响及其可能机制。方法 雄性Wistar大鼠54只随机分为对照组 (N组) 、模型组 (M组) 和丙酮酸乙酯组 (EP组) , 后两组再分为6h、12h、24h、48h亚组, 每亚组6只。应用氯化锂-匹罗卡品制备SE动物模型, TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡, 免疫组化法检测XIAP和Caspase-3蛋白的表达。结果 M组在SE后6h脑内可见TUNEL、XIAP和Caspase-3阳性细胞, TUNEL和Caspase-3表达高峰在24h;XIAP表达高峰在12h。EP组各时间点TUNEL和Caspase-3阳性细胞数较M组明显减少 (除6h外, 均P<0.05) , 而XIAP阳性细胞数则明显增加 (除6h外, 均P<0.05) 。结论 丙酮酸乙酯能够提高XIAP蛋白的表达, 抑制Caspase-3蛋白的表达, 对大鼠癫痫持续状态后神经元损伤具有保护作用。

关键词：丙酮酸乙酯,癫痫持续状态,XIAP,Caspase-3

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表达状态 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康Wistar大鼠 (2、6、12、18、24月龄) , 雄性, 40只, 由黑龙江省佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2 药品与试剂

阿扑吗啡 (上海研晶生物制剂有限公司) ;胆固醇检测试剂盒、甘油三酯检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 (长春汇力生物技术有限公司) ;NF-κB免疫组化试剂盒 (上海新闵生物科技有限公司) ;NOS测定试剂盒 (上海瑞奇生物科技有限公司) ;考马斯亮兰 (上海博古生物科技有限公司) 。

1.3 仪器

752N型紫外可见分光光度计, HH-8型数显恒温水浴锅, LDZ5-2型低速自动平衡离心机, QD628型电子动物秤, JJ2型组织匀浆机, 解剖台, 微量进样器等。

1.4 动物分组与血脂的检测

按照月龄将大鼠分为2、6、12、18、24month组, 每组8只。1w后, 称重, 尾尖取血, 测定血清总胆固醇 (TC) , 甘油三酯 (TG) , 低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 以及高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 含量, 按照试剂盒说明操作。

1.5 阴茎勃起功能检测

适应性饲养15d后, 置于观察箱内, 适应环境10min, 调暗灯光, 保持室内安静。在大鼠颈项皮肤松弛处注射阿朴吗啡80μg/kg, 即刻观察30min, 并记录阴茎勃起次数, 龟头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起1次。

1.6 NF-κB的检测

处死大鼠, 于下腹正中低位切口仔细分离、解剖阴茎组织。采用免疫组织化学法检测大鼠阴茎海绵体内NF-κB蛋白表达情况, 按照试剂盒说明进行操作。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统, 每张切片随机选取5个视野, 计数500~1000个海绵体细胞, 测定NF-κB免疫组化染色阳性细胞比率。

1.7 NOS的含量检测

准确称取阴茎海绵体净重, 加9倍量的生理盐水充分匀浆, 3500rpm, 离心10min, 取上清, 用生理盐水按1:9稀释成1%的组织匀浆, 备用待测。测定方法按照试剂盒使用说明进行操作。

1.8 统计学方法

采用SPSS20.0软件以均数±标准差表示, 多组计数资料之间比较用χ2检验进行方差分析;并对大鼠阴茎海绵体内NF-κB表达和NOS含量做等级相关分析;以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血脂的检测

血脂检测结果表明:不同月龄组大鼠血清中TG、TC、HDL和LDL浓度均无显著性差异 (P>0.05) , 见表1。说明各组大鼠均处在非高脂血症状态。

2.2 各组大鼠阴茎勃起功能检测

阿扑吗啡实验结果表明各组大鼠勃起功能无显著性差异 (P>0.05) , 见表2。说明各组大鼠的阴茎勃起功能相同, 勃起率均为100%, 实验中不同月龄组大鼠均处在勃起功能正常的状态, 未发生勃起功能障碍。

2.3 不同月龄组大鼠阴茎海绵体内NF-κB检测

对各组大鼠阴茎海绵体内NF-κB表达情况, 见表3。进行χ2检验结果表明:χ2=22.02, P<0.05, 说明不同月龄组大鼠阴茎海绵体内NF-κB表达程度存在显著性差异, 且随着年龄的增长而增加。

2.4 各组大鼠阴茎海绵内NOS含量检测

对各组大鼠阴茎海绵体内NOS含量, 见表4。检测结果做方差分析:F=40.69, P<0.05, 表明五组大鼠阴茎海绵体内NOS含量具有显著性差异;经SNK法两两检验, 12month组和18month组比较, 无显著性差异;2month组、6month组、24month组分别比较均具有显著性差异, 且2month组、6month组和24month组均与12month组、18month组比较均具有显著性差异, 根据表4各组数据可知, 大鼠阴茎海绵体内NOS含量2mont组>6mont组>12month组>18month组>24month组。

2.5 各组大鼠阴茎海绵体内NF-κB表达和NOS含量的相关分析

对各组大鼠阴茎海绵体内NF-κB表达和NOS含量做等级相关分析, 见表5。结果表明不同月龄组大鼠阴茎海绵体内NF-κB表达和NOS含量均存在相关性, 且二者呈现负相关性。

3 讨论

年龄是ED的独立危险因素之一, 众多的流行病学研究显示, 尽管在男性的各个年龄阶段都会发生勃起功能障碍, 但以中老年人发病率明显较高, 研究还发现其发病的严重程度同年龄密切相关[4]。另外, 高脂血症也是引起男性ED的重要因素, 研究发现高密度脂蛋白 (HDL) 水平的下降和总胆固醇/高密度脂蛋白比值 (TC/HDL) 的上升与ED有明显相关性[5]。本研究为排除高脂血症对ED的影响, 首先对不同月龄组大鼠血脂的各项指标进行检测, 结果表明各组均无显著性差异, 说明各组均处在非高脂血症状态下。目前, 关于阴茎勃起的机制主要认为是阴茎血管及海绵体平滑肌舒张, 使得海绵体窦腔扩大, 血液灌注、滞流, 窦内压增高, 压迫白膜下静脉, 阻断血液回流, 使阴茎勃起。在该过程中, 阴茎血管及海绵体平滑肌舒张是勃起的关键, 而这种舒张是通过左旋精氨酸 (L-arg) -一氧化氮 (NO) -环磷酸鸟苷 (cGMP) 通路完成, 即阴茎勃起最终通路。NOS是该通路中的关键酶, 能催化L-arg生产NO, NO通过弥散方式激活鸟苷酸环化酶 (GC) , 生成cGMP, cGMP通过刺激血管平滑肌上的cGMP依赖性蛋白激酶, 调节Ca2+通道, 使得细胞内Ca2+浓度增高, 影响Na+-Ca2+交换, 使得血管舒张, 血流灌入阴茎海绵体, 最终引起阴茎勃起[6]。NOS活性降低, 可以直接导致NO水平的下降, 进一步影响阴茎血管的舒张, 导致ED的发生。大量研究表明衰老能够引起NOS活性的降低[7], 这一点与本研究所得结果具有一致性, 即随着大鼠年龄的增长NOS的含量而降低。

NF-κB通路在衰老的发生和调节中扮演重要的角色[8]。NF-κB信号通路不但在衰老中被激活, 参与衰老相关疾病的发生发展, 还参与其它衰老相关的信号通路如mT-OF、IGF-1、SIRT和DNA损伤修复等, 彼此关联, 形成一个影响衰老的网络体系。研究表明, NF-κB转录活性在自然衰老的不同组织中逐步上调, 如心脏、脾脏、肾脏、淋巴、睾丸等, 但关于大鼠阴茎海绵体组织中NF-κB表达的研究尚未见报道。本研究表明大鼠阴茎海绵体内NF-κB的表达, 随着大鼠年龄的增长而增加, 与对其它自然衰老组织中NF-κB表达的研究结果具有一定相似性。虽然目前学者们在衰老与NOS、NF-κB的关系方面有一定研究, 但关于非高血脂症状态下的阴茎海绵体内NOS活性、NF-κB表达, 以及二者相关性的研究未见报道。本实验结果表明, 在非高脂血症状态下: (1) 大鼠阴茎海绵体内NF-κB的表达, 随着大鼠年龄的增长而增加。 (2) 大鼠阴茎海绵体内NOS的含量, 随着大鼠年龄的增长NOS的含量而降低。 (3) 大鼠阴茎海绵体内NF-κB的表达与NOS含量呈负相关性。通过对不同月龄大鼠的阴茎海绵组织中NOS活性、NF-κBp65蛋白表达及二者相关性的研究, 可为ED的预防及临床治疗奠定理论基础。

摘要：目的:通过对不同月龄Wistar雄性大鼠血清中总胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 浓度的检测, 勃起功能进行测定, 以及对阴茎海绵体内转录因子 (NF-κB) 的表达情况和一氧化氮合成酶 (NOS) 表达含量的检测。方法:进行统计学分析, 明确非高血脂症状态下不同月龄勃起功能正常的大鼠阴茎海绵体内NOS和NF-κB表达之间的相关性。结果:各组大鼠阴茎勃起功能均正常, TC、TG、HDL、LDL在不同月龄组均无显著性差异 (P>0.05) , 说明不同月龄大鼠均处于非高血脂症状态;大鼠阴茎海绵体内NOS含量随月龄的增长而降低, 而NF-κB的表达情况则随月龄的增长而增加。结论:NF-κB的表达情况和NOS含量呈负相关。

关键词：非高脂血症状态,大鼠阴茎海绵体,NOS与NF-κB表达

参考文献

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表达状态 篇7

1材料与方法

1.1材料

转染T-SV40和H-ras癌基因的人肾小球系膜细胞株(HMCL)由英国Royal Free Hospital肾脏病中心RUAN Xiongzhong教授惠赠。RPMI-1640培养液及胎牛血清(FBS)(Gibco,U.S.A)。IL-1β(R&D,England), Ox-LDL(中国医学科学院基础所),ABCA1抗体(Novus, U.S.A) 溶于0.5 m L磷酸盐缓冲液 (PBS), 分装 -70℃ 保存。PCR反应体系、逆转录酶(MMLV)缓冲液(Promege, U.S.A),d NTP、Oligo (d T)、 引物均由上海生工生物工程公司合成,ABCA1引物序列:上游5'-ATTCGCTCTGAGATGAGCACCA-3';下游5'-TTTCAAGCGGGCAT AGAACCA-3'。 GAPDH引物序列 : 上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3' 下游5' -ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'。 15d-PGJ2:15-deoxy-Δ12,14Prostaglandin J2(Calbiochem,U.S.A),化学分子式C20H28O3, 溶于二甲基亚砜 (DMSO), 贮液浓度为10 mmol/L分装,-20℃冻存备用。 工作液DMSO终浓度为0.1% (V/V)。

1.2 HMC细胞的培养和鉴定

用10%FCS的RPMI1640细胞培养 液在37℃, 5%CO2培养箱中孵育培养HMCL细胞,以0.01 mol/L PBS冲洗细胞 ,0.25%胰蛋白酶/0.025%乙二胺四乙酸 (EDTA)消化,10%FCS的RPMI1640培养液悬浮细胞传代培养。 间接免疫荧光法检测: 胞浆Actin、Collagen Ⅳ 、Fibronnectin及Vimentin染色阳性 ,Cytokeratin、Ⅷ因子染色阴性。

1.3 15d-PGJ2的细胞毒性试验细胞形态学观察

1细胞形态学观察。 静止细胞后分别换用含终浓度为0、2.5、5、10、15、20 μmol/L 15d -PGJ2的0.2% FCS RPMI1640培养基培养24 h,40倍相差显微镜下观察HMC细胞形态的改变。2锥虫蓝排斥试验。分组方法同上,培养24 h收集各组细胞,PBS轻洗,胰酶消化后离心,细胞沉淀用NS制成悬液,锥虫蓝染色, 随机计数5个视野所有细胞。 死亡细胞百分数以核蓝染的细胞数占总细胞数的百分比表示。 3LDH释放试验。 分组同上,培养24 h收集各组细胞。 不含药物的6孔细胞设为低水平对照组,高水平对照组于实验前加入200 μL 1%Triton破坏细胞。各孔取100 μL上清加入100 μL反应混合物,室温避光30 min,不含细胞的培养液校零,酶标仪490 nm波长检测。细胞毒性指数=(实验组OD值-低水平对照组OD值)/(高水平对照组OD值-低水平对照组OD值)×100%, 即为细胞死亡百分数。

1.4实时PCR检测ABCA1 m RNA表达

15d-PGJ2对IL-1β 诱导的ABCA1 m RNA表达的影响: 培养细胞静止后,40 μg/m L Ox-LDL预先孵育24 h,随机分为5组,每组3皿,空白组:普通培养的细胞、对照组:5 ng/m L IL-1β 及3个实验组:5 ng/m L IL-1β+2.5 μmol/L 15d-PGJ2,5 ng/m L IL-1β+5 μmol/L 15d-PGJ2,5 ng/m L IL-1β+10 μmol/L 15d-PGJ2。 37℃ 培养24 h收获细胞,提取总RNA,合成c DNA,25 μL反应体系PCR扩增:DEPC水15 μL,引物(P1+P2)1 μL, RT产物2 μL,SYBER Green Ⅰ染料12.5 μL,95℃ 10 s, 95℃ 15 s,60℃ 30 s,共扩增40~50个循环。

1.5 Western印迹检测ABCA1蛋白表达

15d-PGJ2对IL-1β 诱导的ABCA1蛋白表达的影响: 培养细胞静止后,40 μg/m L Ox-LDL预先孵育24 h,随机分为4组 ,每组3皿 ,空白组 :普通培养的细胞,对照组:5 ng/m L IL-1β,实验组:5 ng/m L IL-1β+ 5 μmol/L 15d-PGJ2,5 ng/m L IL-1β+10 μmol/L 15dPGJ2,37℃培养24 h收获细胞 ,提取总蛋白 。 上样蛋白质250 μg,电泳、转膜5 h,封闭缓冲液过夜,1∶600一抗与膜孵育,室温缓慢振荡2 h,1∶6000二抗室温缓慢振荡1 h,洗膜,ECL显影。

1.6统计学方法

采用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 15d-PGJ2的细胞毒性试验

本实验选用15d-PGJ2工作浓度为0~10 μmol/L, 在此范围内细胞死亡率<5%, 对细胞无明显毒性作用。 见表1。

2.1.1细胞形态学观察相差显微镜观察结果显示 , 2.5~10 μmol/L浓度组各组与对照组比较 , 细胞形态无明显改变。15 μmol/L组细胞形态不规则,少量细胞漂浮、死亡,20 μmol/L组可见大量细胞死亡。

2.1.2锥虫蓝排斥试验细胞的死亡率随着药物作用浓度的增加而升高,2.5~10 μmol/L浓度各组细胞死亡率分别为1.26%、2.85%、3.86%,15~20 μmol/L浓度组细胞死亡率分别为16.78%、31.25%。 见图1。

2.1.3 LDH释放试验药物的细胞毒性呈剂量依赖性, 2.5~10 μmol/L浓度各组细胞死亡率分别为1.75% 、 3.26% 、4.17% ,15 ~20 μmol/L 15d -PGJ2导致的细 胞死亡率分别达19.83%、41.08%。 见图1。

2.2 15d-PGJ2对IL-1β 诱导的ABCA1表达的影响

2.2.1 15d-PGJ2对IL-1β 诱导的ABCA1 m RNA表达的影响5 ng/m L IL-1β 作用于细胞24 h与普通培养的空白组比较, 能够降低ABCA1 m RNA表达为0.195倍 (P < 0.01),15d-PGJ2呈剂量依赖性的增加IL-1β 抑制的ABCA1 m RNA表达 。 与单纯5 ng/m L IL-1β 对照组比较,2.5 μmol/L 15d-PGJ2浓度研究组细胞ABCA1 m RNA表达升高1.34倍(P < 0.05),5、10 μmol/L浓度研究组细胞ABCA1 m RNA分别升高2.15、2.88倍(P < 0.01)。 见图2。

2.2.2 15d-PGJ2对IL-1β 诱导的ABCA1蛋白表达的影响5 ng/m L IL-1β 作用于细胞24 h与普通培养的空白组比较,能够降低ABCA1蛋白表达为0.583倍 (P < 0.01),15d-PGJ2呈剂量依赖性地增加IL-1β 抑制的ABCA1蛋白的表达。 与单纯5 ng/m L IL-1β 对照组比较,5 μmol/L 15d-PGJ2浓度研究组细胞ABCA1蛋白表达升高为1.16倍 (P < 0.05),10 μmol/L 15d-PGJ2浓度研究组细胞ABCA1蛋白表达升高为1.54倍(P < 0.01)。 见图3。

3讨论

高脂血症与肾脏疾病进展密切相关,它不仅是许多肾脏疾病常见的临床表现,脂代谢异常本身也参与了肾脏病的进展。 越来越多的证据表明肾小球硬化与动脉粥样硬化有相似的病理改变和病理生理机制,血管动脉粥样硬化实质是一个慢性炎症的过程,而炎性反应又是造成肾脏组织损伤的主要机制,因此炎症因子与脂质参与动脉粥样硬化和肾小球硬化的形成,炎症加重脂质失调导致的肾损害是肾小球硬化和肾病进展的重要因素,研究炎症如何在细胞水平影响胆固醇稳态是明确脂质介导的动脉粥样硬化和肾脏损害的关键。

细胞内脂质稳态涉及脂质的摄取、合成、外流代谢多方面的平衡,很多因素影响动脉粥样硬化部位细胞对脂质的摄取和降解,受体表达变化是可能的调控机制。 ABCA1在胆固醇逆转运和高密度脂蛋白胆固醇生成的起始步骤中起重要作用。 研究发现,人类动脉粥样硬化区的ABCA1基因表达明显上调, 且病例组巨噬细胞来源的泡沫细胞中ABCA1表达是对照组的2倍, 表明ABCA1可使巨噬细胞清除过多的胆固醇,增加循环HDL-C水平,发挥抗动脉粥样硬化的作用[2]。 肾小球硬化的特征是巨噬细胞和系膜细胞转化来的泡沫细胞的存在,炎症因子可以降低人肾小球系膜细胞ABCA1表达,抑制ABCA1途径介导的脂质排出[3],从而大大超过其清除能力而使之最终变成泡沫细胞。 本研究发现IL-1β 降低系膜细胞ABCA1蛋白和ABCA1 m RNA表达, 因此炎症因子可以通过抑制ABCA1的表达降低脂质的排出 , 从而导致细胞内胆固醇的失衡使其变成泡沫细胞,加重肾小球硬化和肾病的进展。

由于ABCA1在胆固醇逆向转运中发挥重要作用,因此调控其基因的表达对于胆固醇的动态平衡尤为关键。 ABCA1基因的转录调节受多种因素影响,其中以核激素受体超家族的转录调节最为重要。PPAR-γ 是一类由配体激活的核转录因子,属于Ⅱ型核受体超家族成员,是糖代谢和脂肪生成的主要调节者,在改善血脂、减轻炎性反应、提高胰岛素敏感性等多种病理过程中发挥重要作用,PPAR-γ 活性失调与多种疾病如肥胖、 糖脂代谢、 炎性反应、 血管疾病有关[4]。 PPAR-γ 激动剂对肥胖人群具有抗动脉粥样硬化作用[5],在2型糖尿病和肥胖小鼠模型中 ,PPAR-γ 部分激动剂替米沙坦,改善糖尿病血管病变[6]。 研究表明 , PPAR-γ 超表达可以增强巨噬细胞胆固醇流出 ,从而减弱Apo E缺陷的大鼠的动脉粥样硬化[7]。

大量研究表明,PPAR-γ 可通过调控ABCA1的表达,发挥抗动脉粥样硬化的保护作用。 在动脉粥样硬化的发生发展中,PPAR-γ 通过核受体超家族成员肝X受体d(LXRα)上调ABCA1的表达,介导胆固醇外流和脂质转运的基因的表达,促进胆固醇流出及血浆转运,降低细胞内胆固醇含量,对细胞内胆固醇的调节发挥着至关重要的作用, 因此PPAR-γ-LXRαABC通路在巨噬细胞胆固醇流出机制中具有重要作用[8]。 Ozasa等[9]通过给予2型糖尿病患者服用PPAR-γ 激动剂吡格列酮,并在离体条件下血清培养人巨噬细胞加入PPAR-γ 激动剂吡格列酮,在体内研究和离体实验发现ABCA1的表达增多, 最后巨噬细胞通过ABCA1蛋白将胞内多余的胆固醇转移至胞外。而抑制PPAR-γ 表达可以促进动脉粥样硬化 。 Hamblin等[10]研究发现,在PPAR-γ 基因表达缺失的小鼠,血管内皮细胞VCAM-1的表达升高, 动脉粥样硬化等相关血管病变发生率增加,提示PPAR-γ 的缺失可能与动脉粥样硬化发生有着重要联系。

PPAR-γ-肝脏X受体(LXRα)-ABC通路不但在巨噬细胞胆固醇流出机制中具有重要作用,能够抑制动脉粥样硬化斑块的形成, 还参与肾脏的脂质代谢。 对低密度脂蛋白受体基因敲除糖尿病小鼠动脉的研究表明[11],过氧化物酶体增殖物激活受体 α/γ 双激动剂可以减轻小鼠脂质沉积和炎性反应,增加斑块内胶原和 α-SMA含量,有利于粥样硬化斑块稳定性。研究表明肝脏X受体(LXR-α)激动剂能提高兔系膜细胞ABCA1表达,并促进其介导的胆固醇流出,说明LXRα 通过ABCA1途径参与调节肾脏脂质的平衡[12]。 对慢性肾功能不全患者的研究发现,患者巨噬细胞内胆固醇含量增加与ABCA1表达下调有关[13]。

PPAR-γ 主要通过抑制炎性反应来实现对动脉粥样硬化的抑制作用,动脉粥样硬化发生发展过程中产生大量的炎症因子,人及动物粥样斑块炎性部位有PPAR-γ 高度表达,活化的PPAR-γ 通过限制巨噬细胞谱系促炎性反应,在炎性反应中发挥关键调节器的作用,而PPAR-γ 在内皮细胞的缺失可促进动脉粥样硬化的发生发展。 PPAR-γ 受体激动剂罗格列酮能减少巨噬细胞在血管壁的聚集,并抑制炎性反应和动脉粥样硬化斑块的形成。 以上研究表明,激活的PPARγ 在调节内皮功能 、维持内皮结构完整 、抑制动脉粥样硬化发生发展的过程中发挥重要作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。