细胞灌注装置（精选八篇）
细胞灌注装置 篇1
关键词：细胞灌注装置,核磁共振,31P NMR,能量代谢
核磁共振技术(NMR)可无损伤、连续地观察细胞和组织内能量代谢变化,是目前研究细胞内部能量代谢的主要方法[1,2]。其中,31P NMR灵敏度较高,共振谱线简单,已广泛用于各种细胞实验室研究[3]。31P NMR研究细胞代谢遇到的一个困难是如何获得细胞稳定的31P谱,因获细胞31P谱需要高密度的细胞,而高密度的细胞在短时间很快发生代谢变化,一般细胞正常代谢不能维持3小时以上,这要求实验操作必须快速准确[4]。黄荣清等[5]曾对细胞31P NMR测试条件进行了探索,细胞处理过程中的温度、时间长短及31P NMR测试条件等参数对获得好的31P谱有很大的影响,其缺点是细胞收集后需在短时间内进行31P NMR测试且不能在线监测。如要长时间的在线监测细胞内部能量代谢变化,需研制一套可获细胞浓度高、存活时间长的灌注培养装置, 并将该装置与NMR技术联用监测细胞内的磷代谢物,通过细胞31P信号变化来追踪药物有效活性成分并探索肿瘤细胞在凋亡过程中发生的生理变化。
1细胞灌注装置的设计和制作
要维持细胞较高的浓度和较长的存活时间,灌注装置中的细胞必须处于无菌状态,适合的温度(一般为37 ℃)、酸碱度及有足够的营养物质[6]。本灌注装置通过温度控制仪、加热器及水循环器来控制水浴温度在(37±0.2) ℃;蠕动泵提供动力,使培养液在整个灌注装置中连续流动,为NMR内的细胞提供充足的氧气和营养物质,并带走代谢废物;本装置设计了压力显示系统,通过装有水银的U型管来显示整个装置的压力变化,可观察灌注实验是否正常进行,系统还可在装置压力突然增大时自动释放压力,以保证整个装置能正常灌注;考虑到试管中的气泡会破坏磁场的均匀性,影响实验结果,装置在蠕动泵前的部分设计为负压,蠕动泵后的部分设计为正压,这可除掉灌注时来自培养液中气泡。本灌注装置设计如图1所示。
按图1制作一套细胞灌注装置,并将装有细胞的NMR管直接伸入核磁共振仪中进行联机在线监测。性能测试表明,该装置机械性能稳定,温度可恒定在(37±0.2) ℃,流量、压力稳定可控,无细菌生长[7]。
A—培养瓶; B—三支管试管(管1); C—温度控制仪 D—恒温玻璃水箱; E—蠕动泵; F—三支管试管(管2) G—装有细胞的NMR管; H. U—型管
2细胞灌注-NMR实验
2.1仪器与试剂
NMR仪:日本(JEOL)ECX—500,500 MHz;Agarose胶:美国FMC公司;人乳腺癌(MCF—7)细胞株:中科学院上海细胞库;MEM培养基、胎牛血清:美国hyclone公司。
2.2实验方法和条件
收集对数生长期的MCF—7细胞,消化后用培养液洗涤2—3次, 10 ℃左右以1 500 r/min离心5 min,然后完全去除液体层,细胞数约(0.8—1)108细胞/mL。将上述约0.4 mL体积的细胞悬液与等体积的低熔点Agarose胶混合制成细条状后进入5 mmNMR测试管。测试管装内细胞应全部处于测试敏感区,启动蠕动泵,用含10%胎牛血清的MEM培养液进行灌注,灌注速度为0.4 mL/min,培养液维持在37 ℃,灌注培养一天后进行NMR测试。测试条件:弛豫时间:2.0 s,采样时间:1.617 4 s,脉冲角:60.0°,脉冲宽度:8.9 μs,累加次数:1 200次,D2O锁场,NMR管不旋转。
2.3细胞灌注-NMR法测MCF—7细胞的31P谱
实验表明,细胞密度低(1×107细胞/mL)及处理过程时间长时不能测得细胞中的31P NMR谱图。用高密度细胞(0.8—1)108细胞/mL)但没采用灌注培养,也很难测出细胞中其它磷代谢物的31P信号,因对高密度贴壁细胞处理及制成细条状胶所用的时间一般在70 min至80 min,在加上31P NMR谱测试时间,通常要耗费2个多小时,而细胞在处理和测试过程中会发生代谢变化,所以不用灌注是不利于贴壁细胞31P NMR谱测试。而用相同数量高密度细胞,灌注培养一段时间[一般(15—25)h]后细胞活度有所上升,能迅速测出细胞中31P NMR谱(图2)。
1—磷酸单脂(PME); 2—无机磷(Pi); 3—磷酸肌酸(Pcr); 4—γ-ATP; 5—α-ATP; 6-β-ATP
以磷酸肌酸(Pcr)峰化学位移位值为0, 对谱图2各峰可指认为:化学位移-2.48的峰为γ-ATP;化学位移-7.57的峰为α—ATP;化学位移-16.73的峰为β—ATP;化学位移4.70的峰为无机磷(Pi)峰;化学位移5.80的峰为磷酸单脂(PME)峰。实验结果与三磷酸腺苷钠标准样品的31P谱及文献资料[2,8]提供的31P NMR谱一致。
细胞灌注-NMR法测人乳腺癌细胞的31P谱实验表明,要获得细胞较好的稳定的31P—NMR谱,除需高浓度的细胞外,灌注培养一段时间也是一个重要因素。同时,细胞处理过程中要迅速且控制温度在10 ℃左右以减少细胞代谢及损伤,有利于细胞31P信号的测试。
2.4药物灌注细胞-NMR在线监测
采用上述实验方法和测试条件,将收集处理好的细胞(0.8～1×108细胞/mL)灌注培养一天,测得活细胞的正常31P谱后,换含有5×10-4 mol/L斑蝥素的培养液继续灌注培养,灌注速度为0.4 mL/min,监测药物灌注下MCF-7细胞在(2、4、6)h后的代谢情况,如图3所示。
1—无机磷(Pi); 2—磷酸肌酸(Pcr);3—γ-ATP; 4—α-ATP
在连续灌注下,斑蝥素作用乳腺癌细胞2 h后的 31P谱可知,化学位移为5.01及5.58的细胞内、外无机磷开始变化,逐渐变化为一个宽的无机磷峰,但γ-ATP及α-ATP的峰变化不明显,表明对药物对细胞已起作用。4 h后的 31P NMR谱可知,细胞内外的无机磷峰已合为一个无机磷峰,且γ-ATP和α-ATP的峰已减弱,可推知药物作用4 h后,细胞已发生能量代谢变化。在6 h后的 31P NMR谱可知,γ-ATP、α-ATP峰更弱,无机磷谱峰变窄,表明乳腺癌细胞代谢加剧,且随监测时间的增长细胞趋于死亡,细胞内的ATP会逐渐消失,只出现无机磷(Pi)峰。药物灌注实验表明,细胞灌注-NMR方法可监测药物不同时间的细胞能量代谢变化,可推知药物作用下细胞代谢的时间及最佳疗效范围。
3结果与讨论
本细胞灌注装置可获得相对浓度高、存活时间长的细胞,装置压力、流量稳定可控,装卸和使用方便,并采用循环灌注培养,克服灌注培养中培养液利用不充分的缺点。细胞灌注- NMR法不仅可获得细胞稳定的31P NMR谱,还可长时间的在线监测细胞的生长状态和药物作用下细胞的能量代谢变化过程,为筛选药物的有效活性成分提供一种检测手段,该方法克服了离体细胞需短时间内快速检测才能获得31P谱的不足。本实验中NMR仪只能使用5 mm的NMR测试管,该测试管有效空间内能容纳的胶固定后的细胞数量是有限的,这影响细胞31P信号采集, 导致细胞31P谱中有部分峰弱或不出现,如采用10 mmNMR测试管,容纳的细胞数量增多,可获得更好的31P NMR谱图,能更好地观测细胞的生长状态和代谢过程。因受仪器的限制,目前国内在这方面的研究较少,国外已用31P谱体内测定的方法检测抗肿瘤药物对肿瘤细胞杀伤作用的最适剂量和用药时间等[9]。细胞灌注-NMR方法对细胞等生物样品具有非破坏性、无损伤性,且能同时在线观察到细胞内PME、Pi、ATP等多种含磷化合物的信息,有很好的应用前景,值得进一步深入探讨和广泛研究。
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细胞灌注装置 篇2
[关键词] 再灌注损伤；雷帕霉素；凋亡；P53
[中图分类号] R446.62 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）02-29-03
Effect of RPM on P53 protein expression in renal ischemia-reperfusion injury of rats
ZHENG Chuandong1 GOU Xin2 ZHANG Li1 HU Xingping1
1.Department of Urology,the Fifth People's Hospital of Chengdu,Chengdu 611130,China;2.Department of Urology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016,China
[Abstract] Objective To study the RPM on renal ischemia-reperfusion injury in rat renal cell apoptosis and its mechanism. Methods Wistar rats 54,randomly divided into three groups:sham-operated group,ischemia-reperfusion group,RPM and ischemia-reperfusion group.HE staining analysis of pathological changes of kidney,TUNEL detection of cell apoptosis, P53 protein expression detected by SABC Immunohistochemistry. Results The ischemia-reperfusion group positive expression of the P53 protein and apoptosis of renal tissue cell rates are significantly higher (P＜0.05);RPM and ischemia-reperfusion group than ischemia-reperfusion group cells positive expression of the P53 protein and apoptosis rates are significantly lower(P＜0.05).HE staining analysis,RPM and ischemia-reperfusion group than ischemia-reperfusion group renal tissue damage significantly reduce. Conclusion RPM on renal ischemia-reperfusion injury-induced kidney damage has significant protective effect,which may be related to RPM reducing apoptosis through inhibition of P53 expression.
[Key words] Reperfusion injury;RPM;Apoptosis;P53
雷帕霉素（RPM）是放线菌培养液中分离的大环内酯类抗生素，是一种强有力的免疫抑制剂，已应用于肾移植中[1]。肾移植失败的重要因素之一是肾缺血再灌注导致了严重的肾小管损伤。目前有研究表明，缺血再灌注导致肾损害的重要环节是细胞发生了凋亡[2]。降低肾缺血再灌注中细胞凋亡的发生对肾损伤的防治有显著的临床意义。有研究表明，细胞凋亡能被雷帕霉素抑制[3]，促凋亡相关基因中P53是重要的因素之一[2]。本实验建立肾缺血再灌注大鼠模型，探讨雷帕霉素对大鼠缺血再灌注注损伤的疗效及对P53表达的影响。
1 资料与方法
1.1 主要试验药物和试剂
TUNEL试剂盒购自Roche公司；兔多抗P53，SA1022，DAB显色液均购自武汉博士德公司；RPM购自华北制药集团新药研究开发有限责任公司，RPM 批准文号2002HL0259，每毫升含RPM 1 mg。
1.2 试验动物和分组
54只8～9周的Wistar雄性大鼠，购自重庆医科大学实验动物中心（合格证号：检动字2002A040）。随机分成假手术（sham）组、手术（IR）组和药物（RPM+IR）组。再灌注后以0、24、48、72 h为4个观察时相（每个观察时相6只）。
l.3 动物模型的建立及用药
大鼠肾模型的建立[4]：给予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射，皮肤消毒。腹部正切口，切除右肾，分离左肾动脉，无损伤动脉夹夹闭，肾脏血流阻断以肾脏颜色发白即可确认，缺血45 min后，松开动脉夹，肾脏血流恢复，肾脏由苍白变为红润可确认。假手术组只分离左肾动脉，不夹闭。假手术组、手术组以等量生理盐水代替药物，以做阴性对照，药物组于术前灌胃给药RPM 4 mg/（kg·d）×3 d，术日术前2 h灌胃，术后给药至0、24、48、72 h各个观察时相。
l.4 HE染色组织学观察
肾标本予4%的多聚甲醛固定，石蜡处理，制成3 μm厚的石蜡切片，HE染色切片后，光镜观察各组的各时相肾脏切片。
l.5 细胞凋亡率检测
二甲苯进行各组各时相肾脏石蜡切片脱蜡至水，TUNEL试剂盒测定凋亡率，进行脱水、透明、封片。光镜下观察，棕黄色细胞核的细胞为凋亡细胞，切片各随机选择10个无重叠视野于分析仪（Noesis S.A.Frence）200倍光镜下，测定阳性染色平均光密度MOD及阳性染色面积率，计算细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）：AI（%）= MOD×阳性表达面积率×100%。
l.6 免疫组化检测P53
进行三组的各时相肾脏石蜡切片脱蜡至水，按兔SABC法免疫组化试剂盒操作，切片各随机选择10个无重叠视野（×400），予医学图像分析系统处理。阳性细胞率＝阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%，计数阳性细胞数及细胞总数，各计数100个细胞，检测P53表达的平均光密度值MOD，计算P53阳性表达指数=MOD×阳性细胞率×100%。
1.7 统计学处理
采用SPSS13.00软件，数据均以（）表示，多组间均数比较，采用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 建模成功后各组肾脏形态学变化
肉眼下：假手术组正常；药物组轻度淤血和水肿；手术组严重淤血、水肿，髓质明显变苍白。光镜下：假手术组各组无病理改变。手术组再灌注不同时间的肾脏病理改变各不相同。0 h组：肾脏正常。24 h组：肾小管腔被大量坏死细胞残留物质堵塞，肾小管的结构轮廓尚见，大量肾小管上皮细胞呈空泡样肿胀，部分坏死脱落，基底膜仅剩轮廓。48 h组：肾小管开始修复，肾小管中坏死的堵塞物质明显减少。72 h组：部分肾小管结构完全修复，管腔干净，通畅，坏死物质极少。光镜下，手术组各个时相的病变均较药物组严重，药物组肾小管上皮细胞仅呈空泡样肿胀、少许颗粒样变性，无坏死，间质无异常。见图1～2。
2.2 细胞凋亡率检测
TUNEL阳性细胞的细胞质无染色，细胞核黄褐色。肾小球阴性表达；肾小管阳性表达，髓质明显。见图3～4。图像分析阳性表达后。见表1。假手术组呈极弱阳性表达；手术组的细胞阳性率明显增加（P＜0.05）；药物组的细胞阳性率相对手术组显著减少（P＜0.05）。
2.3 P53蛋白的表达
P53阳性细胞细胞质无染色，细胞核黄褐色，肾小球阴性表达；肾小管阳性表达，髓质明显。见图5～6。图像分析阳性表达后。見表1。假手术组呈极弱阳性表达；手术组的细胞阳性率明显增加（P＜0.05）；药物组的细胞阳性率相对手术组显著减少（P＜0.05）。
3 讨论
3.1 细胞凋亡和肾脏缺血再灌注损伤关系
在动物实验中发现，肾小管上皮细胞凋亡在肾脏缺血再灌注损伤中会大量出现[5]，对移植后的尸体肾活检，发现了同样的情况[6]，而且供肾冷缺血时间与细胞凋亡和缺血再灌注损伤
织的表达（SABC×400) 织的表达（SABC×400）
呈正相关[7]。肾脏缺血再灌注损伤后细胞凋亡的机制极其复杂，氧自由基[8]、钙离子超载[9-10]、炎性因子和炎症介质[11]、与凋亡相关的基因，是多因素协同的病理生理过程。目前观点认为，根据激活的半胱天冬酶种类不同分为“外在”通路和“内在”通路[12]。亦即传统的死亡受体凋亡通路和线粒体凋亡通路。本实验与手术组比较，药物组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05），说明雷帕霉素能明显控制肾脏缺血再灌注中细胞凋亡的发生的作用。
3.2 P53在肾缺血再灌注中的作用
P53介导的线粒体凋亡通路：P53蛋白激活靶基因Bax，形成Bax-Bax二聚体，释放细胞色素C和胞质内的ATP，导致caspase-9裂解caspase-3，出现细胞凋亡。P53介导的死亡受体凋亡通路：P53诱导Fas激活caspase-8，导致caspase的裂解，细胞凋亡。实验表明：与手术组比较，药物组P53表达强度明显减弱（P＜0.05），提示雷帕霉素能降低P53表达，抑制线粒体凋亡和死亡受体凋亡通路两条途径，抑制细胞凋亡的发生。
3.3 雷帕霉素作用的可能机制
RPM在结构上与FK506极为相似，FK506为钙调神经素抑制剂类免疫抑制剂，而RPM为具有不同作用机制的增殖信号抑制剂（proliferation signal inhibitors，PSI）类免疫抑制剂[13]。研究发现，RPM通过非直接通路使激活的T细胞凋亡，阻止树突状细胞抗原呈递，抑制其成熟，减少细胞因子的分泌[14]。阻止树突状细胞在肾组织迁移聚集，改善大鼠缺血再灌注肾组织的病理损伤及肾功能[15]。RPM抑制内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等的增殖[16]。RPM可能是通过抑制细胞凋亡，抑制炎症，减少自由基的生成，抑制T细胞、T细胞依赖性B细胞、树突状细胞的活性，减少细胞因子的分泌；抑制平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞等的增殖改善肾脏微循环等多种途经减轻肾组织损伤。RPM已应用于临床器官移植中抗急、慢性排斥反应。此实验表明：给药RPM后，P53蛋白表达水平降低，细胞凋亡损害明显降低，降低缺血再灌注造成的肾组织损伤，在临床预防和减轻肾缺血再灌注损伤有很好的运用前景。
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小修自动灌注装置在现场的应用研究 篇3
1 灌注装置的结构
小修井自动灌注装置主要由便携式超声波流量计、超声波换能器、时间继电器和遥控装置、安装卡具等几部分组成, 其结构示意图见图1。
安装卡具有海水卡具、水卡具两种规格, 给据灌注液的不同, 超声波换能器选择不同的安装卡具。换能器V型吸装在注水管线上 (安装示意图见图2) 。
2 工作原理
在超声波多普勒流量测量方法中, 超声波发射器为一固定声源, 随流体一起运动的固体颗粒起了与声源有相对运动的“观察者”的作用, 当然它仅仅是把入射到固体颗粒上的超声波反射回接收据。发射声波与接收声波之间的频率差, 就是由于流体中固体颗粒运动而产生的声波多普勒频移。由于这个频率差正比于流体流速, 所以测量频差可以求得流速。进而可以得到流体的流量。
3 计算方法
当超声波束在液体中传播时 (图3) , 液体的流动将使传播时间产生微小的变化其传播时间的变化正比于液体的流速, 零流量时, 两个传感器发射和接收波所需的时间完全相同, 液体流动时, 逆流方向的声波传输时间大于顺流方向的声波传输时间。其关系符合下列表达式:
V——管道液流流速;
θ——声束与液体流动方向的夹角;
M——声束在液体的直线传播次数;
D——管道管径;
TU——声束在正方向上的传播时间;
TD——声束在逆方向上的传播时间。
4 主要技术参数
(1) 蓄电池充电电压:220V;
(2) 水卡具卡矩:54.50mm;
(3) 海水卡具卡距:55.74mm;
(4) 遥控距离:100m;
(5) 任意时间计时开启。 (默认间隔时间10min) ;
(6) 打印机自动打印时间可设定。 (默认打印间隔5min) 。
5 安装及注意事项
5.1 电控箱的安装
(1) 将电控箱内的总开关关闭, 关闭箱外的急停按钮。将地线连接在电控箱。
(2) 设置时间继电器注水间隔时间, 按“+”“-”调间隔时间, 默认为10min, 数字栏状态为00:10:00。
(3) 将快速接头插头, 插入电控箱侧面的插座内接通电源。
5.2 流量计安装
(4) 选注水管线水平直管段, 距离弯管大于10m, 清除油污, 涂好耦合剂。
(5) 将红色线一端连接流量计, 另一端连接探头, 紧好接头螺丝, 同理, 连好蓝色线, 将红色线探头安装在注水管上游方向, 将蓝色线探头安装在注水管下游, 用水卡具卡在探头之间, 确定安装距离, 如果注入液体为海水卡具, 则换成海水卡具。 (注意事项:
(1) 保证两探头连线平行于油管轴线。
(2) 保证探头垂直于油管轴线。
(3) 保证探头下接触的油管干净, 耦合剂涂抹均匀, 无气泡, 无杂质)
(6) 将插头一端插在流量计数字面板处, 一端插在电控箱处。此插头是保证流量计与电控箱的同步开启与关闭。
5.3 操作说明
(1) 起管作业时, 开启电控箱总开关, 旋开急停按钮, 此时红色指示灯亮, 说明计时开始, 十分钟后开始注水, 如需立刻注水, 按下点动开关 (或直接按遥控器上开启键) , 开始注水。此时流量计, 开启开始计量注水量。
(2) 当注满井口时, 遥控关闭。泵停止注水, 流量计停止计量。
(3) 每当作业前都要将以前的流量累计数参数清零。
试验情况证明使用效果较好。
该井起冲沙管柱作业, 由于井漏采用连续灌注操作灌入量5440L。对流量计打印值进行核量, 验证其计量准确性。
按罐液面下降计算, 灌液面下降19.5cm, 灌入量=1.95×1500=2925L, 误差= (3116-2925) /2925×100%=6%, 改计量装置还是较为准确。
6.2 西53-3-3 (不漏)
该起管作业, 灌入量为-777L, 查找原因发现红蓝探头接反, 实际灌注量为777L。改正后使用正常, 灌入量为4012L, 使用正常。该井起补孔作业, 灌入量为827L, 平均每10根管灌注量在100L左右, 使用正常。
6.3 西50-3-1k (不漏压井液介质为海水)
该井起管作业, 灌入量为980L, 该井灌注介质为海水, 设定参数后, 用海水卡具装卡探头, 使用正常。
综上所述, 小修井自动灌注装置作为一种小修井作业的辅助工具, 具有结构简单、安装简易、测量准确, 不但能提高工作效率, 而且对井内是否溢流有监测功能, 有一定的预防井喷的作用, 在油田安全生产作业中有一定的推广应用价值。
摘要：井控作为井下作业行业的重中之重, 而起下管柱作业是发生井喷的几率最大, 由于管柱的起出, 或者井漏、抽汲现象等, 在施工过程中未及时补充液面, 导致套管中的液面会下降, 致使地层压力大于井筒液柱压力, 往往出现井控险情。为了确保施工安全有效, 都是人工控制灌注修井液并计量灌入量, 灌液频繁且每次灌入量不大, 需要专人控制和测量且计量的精度不高, 不仅需要专人专岗而且成本支出增加, 鉴于上述原因研制了小修井自动灌注装置, 这种装置设置时间间隔后自动灌注, 遥控开关, 而且对灌注量计量准确, 简单方便, 提高工作效率, 对溢流的监测准确。
关键词：井漏,灌注,超声波流量计,时间继电器
参考文献
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细胞灌注装置 篇4
缺血再灌注损伤是指各种原因引起组织、器官血液供应中断或者减少,血液供应恢复后出现组织、 器官代谢功能紊乱及结构破坏的现象。肝脏的缺血再灌注可引起肝窦状隙破坏,而肝窦状隙破坏后内皮细胞崩解,大量细胞因子释放可能会为肿瘤细胞提供适宜着床和生长的微环境。已有研究证实[1,2]缺血再灌注能明显促进肝肿瘤的复发和转移。对肝动脉阻断后肝癌耐药基因与蛋白表达的改变,目前的报道结果不一。在细胞水平,缺血再灌注引起肝癌细胞生物性状的改变更是鲜有报道,本研究通过分析Hep G2细胞及其阿霉素耐药株Hep G2/ADM细胞持续灌注组和缺血再灌注组多药耐药基因1(multidrug resistance gene-1,MDR1)、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance protein 2,MRP2)、P-gp和LRP的表达差异,探讨缺血再灌注与肝癌细胞多重耐药性的关系。
1材料与方法
1.1主要材料与试剂
DMEM、胎牛血清 (Hyclone公司),RIPA裂解液、β-actin抗体、一抗、二抗稀释液、MTT试剂盒 (碧云天生物技术研究所),PCR引物设计 (上海生工生物工程有限公司),兔抗人LRP多克隆抗体、小鼠抗人MDR1多克隆抗体(武汉博士德生物公司), DNA marker(天根生化科技有限公司),肝癌细胞株Hep G2由泸州医学院中心实验室保存,肝癌耐药细胞株Hep G2/ADM由四川大学华西医院肝胆外科惠赠。
1.2试剂的配制
缺血液与再灌注液根据钟理的方法配置[3]。缺血液主要 成份 :Na H2PO40.9 mmol/L,Na HCO36.0 mmol/L,Ca Cl21.8 mmol/L,Mg SO41.2 mmol/L,乳酸钠40 mmol/L,HEPES缓冲液20 mmol/L,Na Cl 98.5 mmol/L,KCl 10.0 mmol/L, 连二亚硫 酸钠10.0 mmol/L,p H 6.8,再灌注液主要成分:Na Cl 129.5 mmol/L,KCl 5.0 mmol/L,Na H2PO40.9 mmol/L,Na HCO320 mmol/L,Ca Cl21.8 mmol/L,Mg SO41.2 mmol/L, 葡萄糖55 mmol/L,HEPES 20 mmol/L。
1.3细胞培养方法
细胞复苏:自液氮罐取出冻存细胞,立即放入37℃温水浴中使冻存液融化,将细胞移至离心管中并加入无血清DMEM培养液,离心后去除上清液, 将细胞移入培养皿,加入适量含10%胎牛血清(fetal calf serum,FBS)的DMEM培养液,放入37℃,5%二氧化碳CO2培养箱中培养,次日更换培养液并观察细胞生长情况;细胞培养与传代:Hep G2细胞培养于含10%FBS的DMEM培养液中,Hep G2/ADM细胞培养于含10%FBS,ADM 0.4μg/ml的DMEM培养液中,培养条件同上,隔天更换培养液。当细胞生长至对数期融合度大于80%时可进行传代,过程为:弃掉原培养液,2 ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)液连续清洗两次,加入0.25%胰酶溶液1 ml消化细胞3 min,弃掉胰酶溶液后加入含血清培养液终止消化,用吸管将细胞反复吹打成细胞悬液,分装到另2、3个培养皿中,加入适量新鲜培养液后放入培养箱培养;细胞冻存:取对数生长期细胞,冻存前1天更换培养液。去除旧培养液,2 ml PBS液清洗2次,加入0.25%胰酶溶液1 ml消化细胞3 min,弃掉胰酶溶液加入适量培养液后用吸管吹打细胞使其成为细胞悬液,1 000 r/min离心5 min, 弃掉上清液,加入适量冻存液(50%FBS,40%培养基,10%DMSO),再将其移至冻存管中,4℃下存放30 min,转至 -20℃放置1 h,-80℃放置12 h后,即可转入液氮中长期保存。
1.4再灌注与缺血再灌注模型的建立
实验分为4组 :Hep G2灌注组 (HC组)、 Hep G2/ADM灌注组 (HAC组)、Hep G2缺血再灌注组 (HR组) 和Hep G2/ADM缺血再灌注组(HAR组)。细胞接种于培养皿后,培养于37℃,5%CO2培养箱中,待细胞密度达80%。灌注组在吸弃培养液后,加入与原培养基相同体积的再灌注液,在37℃、 5%CO2的培养箱中培养8 h。缺血再灌注组在吸弃培养液后,先加入与原培养基相同体积的缺血液,在37℃、5%CO2的培养箱中培养4 h后,吸弃缺血液换为等体积再灌注液在相同条件下培养4 h。
1.5观察细胞形态变化
倒置显微镜下观察肝癌细胞再灌注8 h和缺血再灌注8 h后的细胞形态变化,采集图像对比观察。
1.6 RT-PCR检测MDR1和MRP2 m RNA的表达水平
按照总RNA提取试剂盒说明提取总RNA。 RT-PCR引物:MDR1上游5'-GATACATGGTTTTCCGATCCATG-3';下游3'-CAGTGGTGTTTTTAGGGT CATCAA-5',扩增片段长度69 bp。MRP2上游5'-C GGCCATGACAAAGGACCT-3';下游3'-CTTGTTCA GTCCGTGTAGTGTGG-5',扩增片段长度198 bp。 GAPDH作为内参对照,上游5'-TGGGTGTGAACCA CGAGAA-3';下游3'-AGTACTGGTGTCAGGTACGG -5';扩增片段长度为143 bp。扩增程序如下:94℃变形5 min,然后94℃作用30 s,56℃作用25 s,72℃作用25 s,如此反复进行30个循环。将扩增产物凝胶电泳后,以定量分析软件Quantity One对PCR产物电泳条带进行灰度扫描,最后依据公式(目的基因条带光密度 /GAPDH基因条带光密度)计算获得目的基因RNA的相对含量。
1.7Western印迹检测P-gp和LRP蛋白表达
去掉培养液,用PBS冲洗培养皿2次去掉死细胞。离心收集细胞,按每5~10×106细胞加入0.5 ml含PMSF的裂解液,于4℃、12 000 r/min离心5 min。 取上清液于EP管中,细胞总蛋白测定按照BCA蛋白含量检测试剂盒操作说明进行,并根据测得吸光度计算出蛋白浓度。按每4μl蛋白加入1μl蛋白上样缓冲液,充分混匀。按积层胶60 V,30 min;分离胶110 V,120 min进行SDS-PAGE电泳,蛋白测定用5%积层胶,10%分离胶。然后取下凝胶电转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h,加入LRP、MDR1一抗4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入二抗37℃孵育1 h,TBST洗膜3次,ECL发光显色。用Quantity one软件定量分析显色条带的强弱, 计算灰度比值获得目的蛋白的相对表达量。
1.8MTT检测ADM和5-Fu对肿瘤细胞的生长抑制率
将细胞按照5 000个 / 孔的密度接种于96孔板中,待细胞贴壁后按预先设计的再灌注、缺血再灌注模型进行处理。设置不含任何细胞的孔为空白对照组,不加任何药物的孔为阴性对照组。以ADM和5-Fu血浆峰浓度值 (peak plasma concentration, PPC)的近似值Cmax设6种药物浓度,分别处理肿瘤细胞72 h。然后弃掉培养液加入含10%FBS的高糖DMEM培养液180μl和5 mg/ml MTT溶液20μl继续培养4 h,再次弃培养液后向各孔中加入150μl DMSO使形成的蓝色结晶(formanzan)完全溶解。在酶联免疫检测仪上选定570 nm波长测定吸光度值。
1.9统计学方法
以上实验均重复4次,计量资料均采用均数± 标准差(±s)表示,使用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,两样本均数的比较使用t检验,多个样本均数多重比较使用单因素方差分析(SNK法)。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1倒置显微镜观察细胞形态改变
无论是Hep G2细胞系还是Hep G2/ADM细胞系,缺血灌注4 h后可见细胞间隙增宽、细胞萎陷, 再灌注4 h后细胞间隙较前明显增宽,细胞肿胀可见细胞核,少量细胞出现空泡,并见细胞漂浮死亡, 细胞密度下降。而以灌注液持续灌注8 h的细胞同样可见细胞间隙增宽、细胞肿胀,但仅可见少量细胞漂浮死亡。见图1。
2.2MDR1、MRP2mRNA表达水平检测
结果显示(见图2和表1):MDR1、MRP2 m RNA在HR组较HC组表达明显增高(P <0.05),而HAR组与HAC组之间差异无统计学意义 (P >0.05),可见缺血再灌注显著增加了Hep G2细胞耐药基因m RNA的表达。
A:Hep G2 对照组灌注后(×200):可见细胞肿胀,间隙增宽,并有细胞坏死;B:Hep G2 缺血再灌注后(×200):可见细胞肿胀,细胞间间隙增,并见较多细胞坏死;C:人肝癌细胞 Hep G2/ADM 对照组(×200):可见细胞间隙明显增宽,漂浮的死亡细胞;D:人肝癌细胞 Hep G2/ADM 缺血(×200):可见细胞肿胀,间隙增宽,并有少量死亡细胞
2.3Westernblot检测P-gp和LRP的表达水平
经模拟再灌注与缺血再灌注后,提取总蛋白, Western blot检测各组细胞P-gp和LRP蛋白表达变化。结果显示:P-gp、LRP在HR组较HC组表达明显升高,差异具有统计学意义(P <0.01),而在HAR组与HAC组之间差异无统计学意义(P >0.05),提示,缺血再灌注能提高Hep G2细胞耐药蛋白的表达。见图3和表2。
2.4MTT检测抗肿瘤药物对细胞生长的抑制率
MTT结果显示:相同浓度的化疗药物对肿瘤细胞生长的抑制率,在HR组较HC组明显减弱(P < 0.05),而在HAR组与HAC组之间,比较无统计学意义 (P >0.05)。因此,缺血再灌注还可以降低Hep G2细胞对化疗药物的敏感性。见表3和4。表3和表4。
M:marker;1:HC 组;2:HR 组;3:HAC 组;4:HAR 组
(n =4,±s)
(n =4,±s)
(n =4,±s)
(%,n =4,±s)
3讨论
随着现代医学技术的发展,原发性肝癌在治疗效果上取得了巨大的进步,但由于其恶性程度高、转移早、易复发等特点,其最终治疗效果仍不尽人意。 新型抗肿瘤药物的运用提高了原发性肝癌的治疗效果,这使得化疗在原发性肝癌治疗中的作用越来越受到人们的关注,但肝癌细胞多重耐药的出现则严重影响了治疗效果及预后。缺血再灌注可以通过肝窦状隙的破坏、大量细胞因子释放等改变肿瘤细胞的微环境,从而对肿瘤细胞一系列生物学特性产生影响。研究显示缺血再灌注损伤能明显促进肝内肿瘤的复发和转移[4]。但对肝癌耐药性的影响,研究结果并不一致。有报道经肝动脉单纯灌注化疗后肝癌细胞表达P-gp的阳性率接近100%,然而,在活体大鼠I/R模型中肝癌细胞MDR1和P-gp表达下降程度与缺血程度和时间成正比[5,6,7]。因此,缺血再灌注对肝癌细胞耐药性的影响并不明确,本实验将在体外模拟肝癌细胞缺血再灌注过程,观察缺血再灌注引起微环境的改变与肝癌细胞多重耐药性的关系。
MDR1是P170糖蛋白的编码基因,属于ABC转运蛋白超家族成员,研究已证实该基因具有抗肿瘤细胞凋亡的作用,其机制与抗凋亡蛋白Bcl-xl有关。MRP2属于多药耐药家族中的一员,是一类跨膜转运蛋白,主要分布在管腔膜上表达,与MRP1具有高度同源性。其广泛分布于肝脏等正常组织,但表达水平较低,而在肿瘤组织中呈高表达。有研究表明,MRP2可以引起肝癌对化疗药物的耐药[8,9]。 BONIN等[9]与NIES等[10]曾报道MRP2基因在肝癌组织表达显著增高,与癌旁组织表达有显著不同。褚忠华等[11]则进一步证明采用si RNA技术下调Hep G2/ADM细胞的MRP2表达,能增加Hep G2/ADM细胞对化疗药物的敏感性,结果证明MRP2与肝癌细胞多重耐药相关,MRP2可成为逆转肝癌多重耐药性的治疗靶点。在本研究中发现,MDR1 m RNA与MRP2 m RNA的表达量在HR组较HC组明显增加,而在HAR组与HAC组之间差异无统计学意义。表明缺血再灌注可以诱导Hep G2细胞多药耐药基因MDR1与MRP2的高表达,而对Hep G2/ADM耐药株其效果不明显,证实了缺血再灌注引起的微环境变化能诱导肝癌细胞多药耐药基因MDR1与MRP2的高表达。
P-gp蛋白由MDR1编码,在正常人体的肾上腺、肾、肝、结肠、胰及脑毛细血管内皮细胞均有表达,其生理功能是将细胞内的毒性代谢产物排出体外,对组织细胞起保护作用。而在肿瘤细胞中,P-gp蛋白可利用ATP供能将细胞内多种抗肿瘤药物如: 长春新碱、秋水仙素、放线菌素D等排出细胞外,从而使肿瘤细胞因细胞内化疗药物不能达到有效浓度而免于杀伤,表现为细胞耐药性的产生,这也是肝癌化疗失败的重要原因之一。LRP蛋白是在肺耐药细胞系发现的一种与癌细胞多重耐药相关的蛋白,其几乎在所有类型的肿瘤细胞中均有过度表达。其耐药机制为参与核孔复合物的形成,阻止抗肿瘤药物进入细胞核,也有报道认为LRP介导的多重耐药性产生与溶酶体有关。有研究[12]表明在低糖环境中培养的Hep G2细胞较正常培养基培养组LRP、P-gp的表达明显增高,朱虹等[13]证实了在缺氧环境中培养的Hep G2细胞,其MDR1及编码LRP蛋白的m RNA表达水平升高。本实验模拟缺血再灌注过程, 实际上是让细胞经历低糖、缺氧环境后再恢复到正常生长环境的过程,P-gp、LRP蛋白在HR组较HC组明显升高,而在HAR组与HAC组间比较差异无统计学意义,这与PCR检测结果一致,从基因表达水平与蛋白产物两方面同时验证了缺血再灌注是肝癌细胞产生多重耐药的原因之一。
在本实验中采用两种不同化学结构和药理作用的化疗药物进行细胞生长抑制试验。ADM与5-Fu对HR组细胞的生长抑制率较HC组明显减弱。当ADM、5-Fu浓度为0.1、20和30 Cmax时,对HR组与HC组细胞生长抑制率无明显差异,当ADM和5-Fu浓度为1、5和10 Cmax时,其对HR组细胞的生长抑制率较HC组明显减弱。而抗肿瘤药物对HAR组细胞与HAC组细胞的生长抑制率差异无统计学意义,可能与Hep G2/ADM细胞本身就过表达P-gp蛋白有关。在HR组,随着ADM和5-Fu浓度的增加,对细胞生长的抑制率也逐渐增强。当浓度达到20 Cmax时,其生长抑制率分别为 (97.500± 0.006)%和(97.4±0.007)%,而当浓度达到30 Cmax, 其生长抑 制率分别 为 (98.700 ±0.003)% 和 (98.900±0.004)%,这表明当药物达到一定浓度后, 细胞生长抑制率不再随药物浓度的增加而增强。 HAC组与HAR组细胞对抗肿瘤药物均有较强的耐受性,对ADM可以达到20 Cmax,而5-Fu可以达到10 Cmax,随着药物浓度的继续增加,细胞生长抑制率并没有出现明显变化。出现以上情况可能与以下几种因素有关:1P-gp蛋白将细胞内的药物排出细胞外,通过降低细胞内药物浓度使肝癌细胞避免被杀死。但随着药物浓度的增加,P-gp蛋白不能将更多的药物排出,细胞内药物达到有效浓度,表现为细胞生长受抑制;2肝癌细胞内存在其他抗P-gp外排的机制,当细胞内药物达到一定浓度后,该机制激活,抑制P-gp蛋白外排功能;3各种肿瘤细胞并不仅仅依赖P-gp蛋白产生耐药性,LRP也是一种与肿瘤细胞多重耐药相关的蛋白质,其表达程度与肿瘤的预后相关。但有报道[14]指出单纯的将LRP c DNA转染入敏感细胞后,并未产生耐药细胞的表型, 说明耐药蛋白可能需要与其他分子共同作用才能引起肿瘤细胞耐药性的改变。通过实验还发现,低浓度ADM(0.1Cmax)对Hep G2/ADM细胞不仅没有抑制作用,相反还能促进其增值,这与王珊珊等[14]的研究结果一致,但其具体机制目前尚不明确。
总之,本课题研究结果表明,缺血再灌注引起的肝癌生长微环境的变化,可以诱导肝癌细胞多药耐药基因MDR1、MRP2及多药耐药蛋白P-gp、LRP的过表达,从而对抗肿瘤药物的生长抑制作用产生抵抗。缺血再灌注是肝癌细胞产生多重耐药表型的原因之一,但其具体胞内信号传导通路及机制还需要进一步研究。
摘要：目的 通过检测人肝癌细胞株Hep G2细胞与人肝癌耐药细胞株Hep G2/ADM细胞缺血再灌注后多药耐药基因1(MDR1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)、P-gp和LRP表达及细胞增殖变化,探讨缺血再灌注与肝癌细胞多重耐药表型间的关系。方法 用灌注液与缺血液分别灌注Hep G2、Hep G2/ADM细胞,RT-PCR检测每组细胞MDR1和MRP2表达水平,Western blot检测P-gp和LRP表达水平,MTT检测细胞阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)对肝癌细胞的生长抑制率。结果 缺血再灌注组Hep G2细胞相对于灌注液持续灌注组Hep G2细胞MDR1、MRP2、P-gp和LRP的表达均明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05),抗肿瘤药物对细胞增殖抑制率减弱。而缺血再灌注组Hep G2/ADM细胞相对于灌注液持续灌注组Hep G/ADM细胞MDR1、MRP2、P-gp和LRP表达及肿瘤药物对细胞增殖抑制率均无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 缺血再灌注可以使Hep G2细胞多重耐药基因及蛋白表达增加,从而对抗肿瘤药物产生抵抗,参与多重耐药的形成。
细胞灌注装置 篇5
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂
32只健康清洁级雄性Wistar大鼠 (体重250 g±30 g, 山西医科大学动物中心提供) ;腺苷 (美国Sigma公司) ;红四氮唑 (TTC) 及Evans 蓝 (上海申能-德赛诊断技术有限公司) ;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、Bcl-2及Bax免疫组化检测试剂盒 (北京中山生物工程公司) 。
1.2 动物模型制备及分组
以20%乌拉坦 (5 mL/kg) 腹腔麻醉, 连续监测Ⅱ导联心电图。开胸暴露心脏, 在左冠状动脉前降支 (LAD) 距左心耳下缘2 mm处穿过丝线, 提起后以套管夹闭造成冠状动脉阻塞。用随机数字表法将32只大鼠随机分组, 每组8只。假手术组 (Ⅰ组) :开胸只穿线不结扎血管, 麻醉维持150 min;缺血再灌注损伤组 (I/R) :缺血30 min, 再灌注120 min;腺苷预处理组 (Ⅱ组) :缺血前5 min, 股静脉缓慢输注腺苷305 μg/ (kg· min) , 持续5 min, 然后处理同I/R组;腺苷后处理组 (Ⅲ组) :缺血30 min后, 股静脉缓慢输注腺苷305 μg/ (kg· min) , 持续5 min, 而后再灌120 min。假手术组和缺血再灌注组均于前述注射腺苷相同时间点于股静脉缓慢输注等量生理盐水, 5 min内滴注完作为对照。
1.3 观测指标
1.3.1 心肌梗死范围的测量
于实验终点将LAD重新阻塞, 左心室内推2%Evans 蓝2 mL, 2 min后迅速剪下心脏, 分离缺血区 (无蓝色) 和非缺血区 (蓝色) 、坏死区 (灰白色) 和非坏死区 (深红色) , 滤纸吸干将非坏死心肌称重, 梗死范围以坏死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。
1.3.2 心肌细胞凋亡的检测
取缺血区心肌组织, 放在10%中性甲醛液中, 固定24 h以上, 逐级乙醇脱水, 石蜡包埋切片。凋亡细胞的细胞核为深浅不一的棕黄色或棕褐色, 非凋亡细胞核呈蓝色。在高倍镜下, 每张切片随机选取10个视野, 每个视野计数100个细胞中凋亡阳性的细胞数, 然后加在一起, 即可得到凋亡阳性细胞千分率。
1.3.3 Bcl-2、Bax蛋白表达水平
应用与TUNEL法相同的组织石蜡切片行Bcl-2、Bax蛋白免疫组织化学检测。一抗1∶50PBS稀释的Bcl-2、Bax抗体。具体步骤严格按SP试剂盒说明操作, DAB显色, 中性树脂封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。蛋白阳性表达细胞的胞质呈棕黄色或棕褐色, 细胞核蓝染为不表达。在每张切片上, 分别随机选择10个视野, 每个视野计数100个细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达阳性的细胞数, 然后加在一起, 即可得到蛋白表达阳性细胞千分率。
1.4 统计学处理
采用SPSS 11.0统计软件。实验结果以均数±标准差
2 结果
2.1 心肌梗死范围
Ⅱ组和Ⅲ组梗死范围均明显低于I/R组 (P<0.05) 。详见表1。
2.2 心肌细胞凋亡的检测
I/R组凋亡心肌细胞明显增加, 呈弥漫分布, Ⅱ组和Ⅲ组凋亡细胞较少, Ⅰ组偶见凋亡的心肌细胞。I/R组有较高的心肌细胞凋亡率, 较Ⅰ组明显增高 (P<0.05) 。与I/R组比较, Ⅱ组和Ⅲ组心肌细胞凋亡率明显降低 (P<0.05) 。详见表2。
2.3 Bcl-2及Bax蛋白表达水平
Bcl-2及Bax蛋白阳性反应积聚于胞浆中, 呈棕黄色。I/R组Bax表达阳性细胞率明显高于Ⅰ组 (P<0.05) , 而Bcl-2表达阳性细胞率明显低于Ⅰ组 (P<0.05) 。与I/R组比较, Ⅱ组和Ⅲ组Bcl-2表达阳性细胞率明显升高 (P<0.05) , Bax表达阳性细胞率明显降低 (P<0.05) , 而两组间无统计学意义 (P>0.05) 。详见表2。
3 讨论
腺苷是由心肌细胞和血管内皮细胞释放的一种内源性物质, 能够开放钾通道, 抑制钙超载, 在预适应和I/R损伤中起保护作用。目前, 腺苷作为缺血再灌注损伤中重要的保护性物质已被公认, 其对缺血预适应的作用已经明了。但对于腺苷后处理, 以及它对细胞凋亡和凋亡相关基因蛋白Bcl-2、Bax的作用, 对缺血再灌注损伤心肌的保护作用机制, 国内外研究甚少。
以往一直认为心肌缺血/再灌注损伤后的细胞死亡是坏死。但近年来许多学者研究证实, 心肌缺血/再灌注细胞凋亡还存在另一种死亡形式——凋亡[6,7,8]。
细胞凋亡是由许多基因参与的细胞结束其生命的过程。有着非常复杂的调控机制, 其中Bcl-2基因家族是目前较为公认与凋亡密切相关的基因, Bcl-2基因产物主要定位于线粒体膜, 核膜及内质网上。有研究表明细胞凋亡减弱时, Bcl-2表达增强;反之, 细胞凋亡增强时, Bcl-2表达减弱。Bcl-2抗凋亡的作用可能与抗氧自由基, 钙超载及细胞内蛋白酶变化有关。也有学者认为与Bcl-2能保持线粒体膜的稳定性, 抑制细胞色素C和凋亡诱导因子释放有关[9]。Bcl-2家族中Bax功能与Bcl-2相反, 具有促进细胞凋亡的作用。最近研究表明, Bax通过与线粒体上Bcl-2蛋白形成二聚体发挥作用, 当Bax高表达时, 形成同源二聚体Bax/Bax促进凋亡, Bcl-2高表达时, 形成异源二聚体Bcl-2/Bax以抑制凋亡的发生。
本研究结果显示, 腺苷预处理和腺苷后处理都可明显减少梗死范围及心肌细胞凋亡, 已证明均对心肌缺血再灌注损伤有保护作用, 且两者无统计学意义 (P>0.05) 。本实验还发现, 正常心肌细胞有一定量的Bcl-2和Bax基因表达, 当心肌遭遇缺血和缺血再灌注时, Bcl-2基因表达显著下调, Bax基因表达显著上调, 并同时伴有心肌细胞凋亡显著增多;而腺苷预处理和后处理可以显著提高Bcl-2蛋白表达, 降低Bax蛋白的表达, 显著减少心肌细胞凋亡。但对Bcl-2和Bax的详细机制, 还有待于进一步研究。
腺苷预处理及后处理均能减少心肌细胞凋亡, 且两者无明显差异。其机制可能通过上调Bcl-2表达和下调Bax表达而实现的。但是, 从心肌缺血不可预知的角度来讲, 腺苷后处理是在缺血心肌发生之后进行, 弥补了腺苷预处理临床应用的缺陷, 更具有临床潜力。
摘要：目的研究腺苷后处理对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白的影响。方法32只Wistar大鼠随机分为4组 (每组8只) :假手术组 (Ⅰ组) :开胸只穿线不结扎血管, 麻醉维持150min;缺血再灌注组 (I/R组) :结扎30min, 再灌注120min;腺苷预处理组 (Ⅱ组) :缺血前5min, 股静脉缓慢输注腺苷305μg/ (kg.min) , 持续5min, 而后再按I/R组操作;腺苷后处理组 (Ⅲ组) :缺血30min后, 股静脉缓慢滴注腺苷305μg/ (kg.min) , 持续5min, 而后再灌注120min。采用TUNEL法观察各组心肌细胞凋亡, 应用免疫组化SP法观察Bcl2和Bax蛋白的表达。结果与I/R组比较, Ⅱ组及Ⅲ组心肌梗死范围均明显减小, 心肌细胞凋亡率降低 (P<0.05) , Bax表达水平明显降低, Bcl2表达水平明显升高 (P<0.05) , 而Ⅱ组和Ⅲ组间差异无统计学意义。结论腺苷后处理可以减轻再灌注心肌细胞的凋亡, 这一过程可能是通过上调Bcl2表达和下调Bax表达而实现的。
关键词：腺苷,细胞凋亡,Bcl2,Bax,大鼠
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细胞灌注装置 篇6
1材料与方法
1.1材料与分组
1.1.1 药品和试剂
螺内酯 (江苏宜兴前进制药厂) , Fas和Bcl-2免疫组化试剂盒。
1.1.2 研究方法
实验动物及分组采用平行对照的研究方法, 选用清洁级SD大鼠30只 (由三峡大学医学院动物中心提供) , 质量150～250g, 雌雄不限, 适应性饲养7天后用于实验。随机分为三组, 假手术组 (n=10) 、单纯缺血再灌注组 (n=10) 和药物干预缺血再灌注组 (n=10) 。SPI组于术前7天开始螺内酯 (5mg/kg/d, bid) 研磨灌胃, 实验鼠以戊巴比妥钠全麻。模型参照simpsond的方法, 开胸后于冠脉左前降支中段穿线环绕结扎, 肉眼观察心肌颜色判断结扎是否成功, 45min后放松结扎线形成心肌再灌注。其中假手术组不结扎, 所有实验动物冠状动脉再通形成后再灌注3h后处死动物, 取出心脏, 制作标本, 固定后准备行光镜和免疫组化检测。
1.2检测方法
1.2.1 凋亡相关基因蛋白的检测
再灌注3h结束后分离左心室心肌组织, 取缺血区组织, 以免疫组化检测心肌细胞凋亡相关基因蛋白Fas、Bcl-2的表达情况。采用HPIAS21000图像分析系统计算A 值, 作为测量Fas、Bcl-2蛋白表达的半定量参数。
1.2.2 电镜检测
取样品组织戊二醛固定, 逐级丙酮酸脱水, 环氧树脂包埋, 超薄切片后醋酸油、柠檬酸铅双染, H-600透射电镜观察。
1.3统计学处理
采用SPSS13.0统计软件处理, 计量资料以undefined表示, 多组间两两比较采用LSD-t检验, 多组间计量比较采用单因素方差分析。
2结果
2.1实验动物存活评价
共计建立大鼠模型30只, 术中及术后死亡3只, 假手术组10只全部存活, 缺血再灌注组存活8只, 死亡2只, 药物组存活9只, 死亡1只。假手术组大鼠心脏肉眼观形态饱满, 呈暗红色;MI/RI组大鼠心脏肉眼观梗死区心室变薄, 形态僵硬, 塌陷, 呈乳白色;药物组整体观形态与MI/RI组无显著差异, 颜色略深呈灰白色。
2.2Fas和Bcl-2蛋白含量变化 (A值)
MI/RI组Fas含量 (0.26±0.13) 明显高于假手术组 (0.12±0.04) (P>0.01) , 药物组Fas含量 (0.15±0.03 ) 明显低于MI/RI组 (0.25±0.12 ) (P>0.05) ;MI/RI组Bcl-2含量 (0.11±0.05) 明显低于假手术组 (0.21±0.04) (P>0.01) , 药物组Bcl-2含量 (0.19±0.03) 明显高于MI/RI组 (0.11±0.05) (P>0.01) 。见表1、图1。
注:与假手术组比较, ﹡P>0.01;与I/R组比较, ﹡﹡P>0.01, △△P>0.05。
3讨论
近年来随着心肌缺血再灌注治疗方法的增多, 心肌缺血再灌注损伤日益受到人们的重视。但其发生的确切机制目前尚不明确。研究发现, I/R可能与钙超载和氧自由基大量产生有关。钙超载启动了细胞凋亡。Na+-H+交换阻断剂可抑制因钙超载导致的细胞凋亡, 从而减轻I/R损伤、缩小心肌梗死面积[3]。
醛固酮能诱导蛋白质合成, 促进细胞增殖。研究表明, 醛固酮进入细胞后, 仅与细胞质受体结合, 形成激素-受体复合物, 获得进入核内的能力, 再与受体结合, 诱导蛋白质合成, 促进细胞增殖;醛固酮也可以直接增加核Ca2+及蛋白激酶C的含量, 核Ca2+的增加能激活蛋白激酶C, 蛋白激酶C可以导致核P53磷酸化与醛固酮受体结合, 影响心肌细胞凋亡[4,5]。螺内酯在受体水平上阻断醛固酮与P53的结合, 阻断了P53对Bax及Bcl-2的调节作用, 使Bcl-2下降。它能够作用于线粒体使线粒体膜通透性升高, 释放细胞色素C, 细胞色素C与凋亡蛋白激活因子及半胱氨酸蛋白酶形成复合物, 激活半胱氨酸蛋白酶-3, 氧自由基大量产生, 启动细胞凋亡[6]。
本实验中我们采用结扎冠状动脉左前降支后再通的方法复制心肌缺血再灌注的动物模型, 观察到在再灌注前给予螺内酯治疗可以使心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达增强, Fas蛋白表达减弱, 表明螺内酯能抑制再灌注过程中细胞凋亡的发生。螺内酯保护I/R心肌损伤的机制可能是通过调节Bcl-2和Fas表达来抑制心肌细胞凋亡。螺内酯作为一种醛固酮拮抗剂, 具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用[7], 螺内酯下调细胞凋亡相关蛋白的表达, 部分逆转左心室肥厚[6]。本研究通过缺血再灌注前螺内酯干预后, 阻止了异丙肾上腺素引起的心肌内解耦联蛋白2 (UCP-2) mRNA及蛋白表达的增加, 从而改善心脏的能量代谢[8]。
我们研究发现, 心肌缺血再灌注后, 从免疫组化结果分析, 螺内酯可以使心肌细胞中Fas表达比缺血再灌注组明显减少, 而Bcl-2表达明显增多, 螺内酯可以降低I/R时心肌细胞凋亡程度。提示螺内酯对缺血再灌注心肌的影响在利尿作用改善心功能之外, 有可能通抑制心肌细胞凋亡, 从而改善心肌损伤导致的心功能的下降。这一结果支持Harada等[9]的有关螺内酯对缺血再灌注损伤心肌有明显的保护作用和具有抗心肌细胞凋亡作用的报道。
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细胞灌注装置 篇7
关键词：股骨头缺血性坏死,自体骨髓干细胞,髓芯减压,动脉灌注
股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)是一种骨科常见病、多发病,致残率较高,而且病因不明,一般认为其发病机制与脂肪栓塞、血管内凝血、骨内高压和骨细胞脂肪性坏死有关。由于人工关节置换存在使用寿命问题,青壮年患者不宜积极或过早行关节置换。我们将自2002年以来我院先后治疗的病情相近的30 例股骨头缺血坏死病例分为三组,分别采用单纯动脉灌注、动脉灌注加股骨头髓芯减压、动脉灌注加股骨头髓芯减压后干细胞移植三种方法治疗,取得满意的临床疗效,现报告如下。
1 临床资料
1.1 一般资料
30 例均采用MRI确诊为股骨头缺血坏死,挑选患者均为ARCO分期ⅠA~ⅢA期患者[1]。其中男19 例,女11 例,年龄18~49 岁。单侧病变11 例,双侧病变19 例。Ⅰ期7 例,Ⅱ期21 例,Ⅲ期2 例。病程3~24个月。6 例有使用激素药物史,10 例有酗酒史,13 例不同程度外伤史,1 例无明显诱因。全部病例均有X线片及MRI。其中行1次治疗者3 例,2次治疗者19 例,3次治疗者8 例,每次治疗相隔1个月。临床表现以患侧髋关节疼痛为主,伴有不同程度跛行和患肢功能障碍。30 例分为3组:第1组10 例,采用单纯的选择性动脉灌注;第2组10 例,采用选择性动脉灌注加股骨头髓芯减压;第3组10 例,采用选择性动脉灌注加股骨头髓芯减压后由动脉及髓芯内注射自体骨髓干细胞。
1.2 治疗方法
a)灌注治疗:采用Seldinger技术经股动脉插管将4Fcobra或Yashrio导管超选至患侧旋股内、外动脉及闭孔脉内,注入造影剂6~10 mL,造影并行摄片,观察股骨头供血情况。分别在上述血管内持续手推灌注罂粟碱30 mg,尿激酶10万U,丹参20 mL,低分子右旋糖酐50 mL。再次造影并摄片。保留导管于股深动脉或旋股内/外动脉开口处,包扎穿刺部位及外鞘管,肝素帽封闭导管,返回病房后动脉泵持续、交叉灌注尿激酶60万U,丹参200 mL,低分子右旋糖酐150 mL(灌注时间不少于8~10 h)。拔管后穿刺点压迫不少于20 min,纱布、绷带加压包扎后,外压沙袋8 h,穿刺侧肢体平伸12 h以上,测足背动脉;b)股骨头髓芯减压方法:于股骨大粗隆下方切开长约1 cm皮肤切口,采用内径约5 mm自制环锯在C臂透视下从大粗隆经股骨颈钻入股骨头坏死病灶。c)干细胞移植方法:在局麻下穿刺髂骨,取出自体红骨髓200~400 mL,经高速离心后获得骨髓干细胞悬液约10~20 mL,冷藏保存后备用(由血液中心提供),于获得骨髓干细胞后1~2 h内先行股骨头髓芯减压,然后再行动脉灌注,灌注完成后选择旋股内侧动脉注射入部分骨髓干细胞后拔除导管及鞘管,随后用特制刮勺伸入环锯内搔刮坏死区后,再将剩余骨髓干细胞注射入环锯内,由环锯内填入大粗隆处正常松质骨及少量明胶海绵以防止干细胞漏出,拔除环锯,皮肤缝合1针后加压包扎。术后常规抗生素预防感染3~5 d,1周后扶杖下地持续6~12个月。避免患肢负重。术后饮食中加钙,避免辛辣、刺激食物,忌烟酒,服用鱼肝油及钙片不少于4个月,阿司匹林100 mg/d,服3个月,15~30 d后复查,情况允许,行2次或3次治疗。
2 结 果
30 例均有随访记录,随访时均常规行骨盆X线片及髋关节MRI检查,随访时间为6~18个月,平均12个月。术后采用髋关节Harris评分[2,3]及影像学情况评定疗效(见表1)。治疗后疼痛明显缓解,关节功能恢复。三组结果经统计学分析,动脉灌注加股骨头髓芯减压后注射干细胞较另外两组在MRI表现上有明显差异(P<0.05)。
3 讨 论
股骨头缺血性坏死发病率逐年上升,以男性多见。多数患者有过量激素应用、酗酒史,表现为髋部疼痛、膝关节疼痛、下蹲、外展受限、跛行、下肢短缩而致残疾,严重影响正常工作与生活。股骨头缺血的病因尚不明确,但多数学者研究后认为引起股骨头缺血的因素可分为创伤性、非创伤性两大类。创伤性ANFH是股骨头营养血管阻断所致,非创伤性ANFH却相当复杂,其归结起来主要是脂肪栓塞[4]、血管内凝血骨内小动脉受损[5]、骨内小静脉淤积、骨内高压[6]等。
股骨头缺血性坏死的治疗概括起来主要可分为保守治疗、微创介入治疗、姑息性手术治疗、股骨头表面置换或人工关节置换[7]。由于股骨头缺血性坏死患者大多数为青壮年,置换人工股骨头,若干年后还需再次置换。因此现在对股骨头缺血性坏死早期治疗多主张以微创介入治疗和姑息性手术治疗为主,目的是阻止病情进展,尽可能保留病变股骨头,维持其接近正常的髋关节功能,避免或延缓人工关节置换术的时间[8]。
股骨头缺血微创介入治疗的关键是设法改善股骨头的血液循环,缓解疼痛症状,使骨小梁重建,恢复髋关节的功能。血管介入治疗,通过血管造影,将导管置入股骨头营养血管,并将药物全部注入这些血管,可以迅速解除血管痉挛,溶解血栓,再通血管,改善循环。国内有许多学者通过实验将骨髓干细胞经动脉灌注均取得良好效果,骨髓干细胞动脉灌注动物实验表明[9],骨髓干细胞治疗股骨头缺血性坏死作用机制可能为:a)疏通发生病变的股骨头内血管,改善静脉回流,降低骨内压,恢复或改善股骨头的血供;b)改善或增加股骨头坏死区域周围及髋部各组织的血液循环,为股骨头坏死区域提供良好血供的局部环境;c)保护局部血管内皮,促进血管内皮细胞修复、再生及血管新生。
通过对股骨头髓芯减压的研究表明,髓芯减压可以缓解股骨头髓内压,改善股骨头血流量[10],缓解疼痛,去除坏死骨,促进新骨成骨。现代医学证实,股骨头缺血性坏死是一种骨细胞和/或干细胞的疾病[11]。临床上开始使用骨髓干细胞治疗股骨头缺血性坏死。国内有学者在动物模型上采用干细胞移植治疗股骨头坏死,取得良好效果[12]。骨髓多功能干细胞是骨髓的一种间充质干细胞,具有多向分化潜能,在特定的理化条件和细胞因子的诱导下,可定向分化为各种组织细胞。近年来,随着对骨髓成骨潜能研究的深入,已证实骨髓基质细胞能在体外培养转化为成骨细胞,在培养液中成骨[13]。
我科选择股骨头缺血性坏死早期患者(ARCO分期ⅠA~ⅢA期)行血管灌注,股骨头髓芯减压及骨髓干细胞移植治疗,效果明确,国内已有大量的文献报道。但行血管灌注和股骨头髓芯减压联合骨髓干细胞移植治疗的报道较少。我科通过对三组相似患者治疗的对照表明,将三者联合运用后在MRI的表现上有明显的差异。我们认为将三种方法联合使用的治疗效果最佳。首先行股骨头髓芯减压,可以缓解股骨头髓内压,改善股骨头的血流量,降低股骨头内毛细血管前动脉压及后静脉压,从而有利于下一步股骨头血管灌注时更好地改善股骨头的微循环,给移植的干细胞提供充足的营养,促进血管内皮细胞修复、再生及血管新生,带走代谢产物,促进坏死区骨质的重建。同时通过股骨头髓内压的减低及股骨头周围微循环的改善,移植的干细胞能够更好地弥散于股骨头坏死区内,为坏死区骨组织的重建提供良好的组织环境。
细胞灌注装置 篇8
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康成年雄性SD大鼠48只,体质量250～300 g,由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.2 试剂和仪器
阿托伐他汀购自辉瑞制药公司。L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、Hoechst染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所。总超氧化物歧化酶(TSOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠Fas多克隆抗体购自武汉博士德公司。AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。德国Carl Zeiss公司Zeiss荧光显微镜。美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪。
1.3 实验方法
1.3.1 分组方法
应用计算机软件编制的随机分配表将48只大鼠分为4组:假手术组(0.9%氯化钠溶液2 ml/d)、I/R组(0.9%氯化钠溶液2 ml/d)、阿托伐他汀组(阿托伐他汀20 mg·kg-1·d-1)、阿托伐他汀+L-NAME组(阿托伐他汀20 mg·kg-1·d-1、L-NAME 15 mg/kg)。灌喂3 d后制作大鼠在体心肌I/R模型。L-NAME溶于2 ml双蒸水中,于结扎缺血前15 min尾静脉注射,不灌喂。
1.3.2 大鼠在体心肌I/R模型的建立[2]
20%乌拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉,接心电监护仪监测心电变化,并做Ⅱ导联心电图记录。气管插管,接人工呼吸机(频率55次/min,潮气量1.5 ml/100 g)。开胸,于冠状动脉左前降支起始0.2 cm处穿线,待呼吸、血压平稳15 min后,用一细小带凹槽乳胶管垫于血管和结扎线之间,结扎。30 min后剪开结扎线,再灌注120 min(假手术组仅穿线不结扎)。结扎成功标志:结扎线远端心肌颜色紫绀,心电图表现为R波高耸或ST段抬高[3]。模型制备成功标志:松开结扎线以恢复冠状动脉血量,缺血部位心肌颜色恢复,抬高的ST段下降。
1.3.3 血清NO的测定
各组大鼠再灌注120 min后,取大鼠颈动脉血1 ml,离心后取血清,按试剂盒说明测定NO水平。
1.3.4 心肌组织TSOD、MDA的测定
再灌注120 min后,立即取下大鼠心脏,取左室前壁的组织块约0.3 g,用滤纸吸干,置-70 ℃冰箱保存。实验结束后按试剂盒说明用黄嘌呤氧化酶法测TSOD活力,硫代巴比妥酸法测MDA水平。
1.3.5 Fas蛋白表达的测定
再灌注末取下心脏,切取左室心尖部约0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm,10%甲醛室温固定,常规石蜡包埋切片,脱蜡至水,高压修复抗原,3%过氧化氢(H2O2)孵育,滴加5% BSA封闭液,一抗Fas(1∶100)4 ℃过夜(以PBS取代一抗作阴性对照),滴加生物素化山羊抗兔IgG孵育,滴加SABC孵育。每步后用PBS缓冲液(pH 7.2～7.6)冲洗。DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片。Fas蛋白阳性表达细胞主要为心肌梗死区周围的心肌细胞,光镜下细胞质(细胞膜)呈棕黄色颗粒为Fas蛋白表达阳性。光镜下400倍放大,经细胞图像分析系统随机选取5个无重叠视野,计算每个视野中Fas蛋白表达阳性细胞数目与总细胞数目的比例,取其均值为Fas蛋白阳性表达率。
1.3.6 Hoechst染色法观察细胞形态学变化
将制好的石蜡切片按试剂说明书操作:脱蜡、洗涤、染色、再洗涤、封片、观察。
1.3.7 凋亡细胞的检测
再灌注后取左室前壁梗死区边缘心肌组织5 mm3,用机械法制备单细胞悬液,经200目尼龙网过滤。用细胞计数板在显微镜下将待测细胞的浓度调整为1×106个/ml。取1 ml细胞悬液,1 000 r/min 4 ℃离心10 min,弃上清。加入1 ml冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮,1 000 r/min 4 ℃离心10 min,弃上清液。重复上述步骤1次。将细胞重悬浮于200 μl Binding Buffer。加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,轻轻混匀,室温避光反应15 min。加入300 μl Binding Buffer,在1 h内上机检测。用FITC/PI双色分析程序测得心肌细胞凋亡指数(AI)。采用流式细胞术对大鼠I/R后心肌细胞凋亡情况进行检测。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。计量资料以
2 结果
2.1 阿托伐他汀对大鼠I/R后血清NO水平、心肌组织TSOD活力及MDA水平的影响
4组大鼠的血清NO水平、心肌组织TSOD活力及MDA水平间差异均有统计学意义(F值分别为437.42、357.72、978.43,P<0.01)。I/R组的NO水平、TSOD活力、MDA水平与假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。阿托伐他汀组的NO水平、TSOD活力、MDA水平与I/R组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。阿托伐他汀+L-NAME组的NO水平、TSOD活力、MDA水平与阿托伐他汀组比较,差异有统计学意义(P<0.01);阿托伐他汀+L-NAME组的NO水平、MDA水平与I/R组比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。
2.2 Hoechst染色法观察细胞形态学变化
镜下(激发波长在350 nm左右,发射波长在460 nm左右)凋亡细胞的细胞核致密浓染,呈明亮的蓝白色。假手术组凋亡细胞很少;I/R组凋亡细胞大量存在;阿托伐他汀组凋亡细胞明显减少;阿托伐他汀+L-NAME组凋亡细胞数介于I/R组和阿托伐他汀组之间(见图1)。
注:与假手术组比较,*P<0.01;与I/R组比较,★P<0.01;与阿托伐他汀组比较,▲P<0.01
2.3 阿托伐他汀对Fas蛋白表达及AI的影响
4组大鼠的Fas蛋白阳性表达率、AI间差异有统计学意义(F值分别为118.03、677.83,P<0.01)。I/R组的Fas蛋白阳性表达率、AI与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。阿托伐他汀组的Fas蛋白阳性表达率、AI与I/R组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。阿托伐他汀+L-NAME组的Fas蛋白阳性表达率、AI与阿托伐他汀组比较,差异有统计学意义(P<0.01,见表2)。
AV标记早期凋亡细胞及坏死细胞,PI标记正常死亡细胞而不能标记凋亡细胞,故右下象限为凋亡细胞,右上象限为坏死细胞,左下象限为活细胞。假手术组凋亡细胞很少,活细胞很多;I/R组凋亡细胞大量存在;阿托伐他汀组凋亡细胞明显减少;阿托伐他汀+L-NAME组凋亡细胞数介于I/R组和阿托伐他汀组之间(见图2)。
3 讨论
Fas蛋白属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员,是Ⅰ型膜蛋白,Fas配体(FasL)以三聚体形式结合Fas并诱导Fas的三聚化,激活的Fas通过与具有死亡域的Fas相关受体连接蛋白(FADD)结合,FADD通过其DD区与Fas的胞内DD区结合,形成死亡诱导信号复合体(DISC),FADD N端(胞内)死亡效应区(DED)与caspase-8 N端的DED区相互作用,并与DISC连接同时激活caspase-8,引起Capase-8蛋白的自身激活,继而激活其他Capase成员,引发Capase级联反应,最终导致细胞凋亡[4]。有研究显示,心肌细胞Fas蛋白的阳性表达与心肌细胞凋亡密切相关[5]。本研究结果显示,I/R大鼠镜下可见大量细胞体积变小、细胞核致密浓染、呈明亮蓝色的凋亡细胞,较假手术大鼠心肌细胞AI增加,说明MI/RI中存在心肌细胞凋亡。应用阿托伐他汀后,心肌细胞AI较I/R大鼠的心肌细胞AI明显下降,说明阿托伐他汀可抑制I/R心肌细胞凋亡的发生;应用阿托伐他汀后可使Fas蛋白表达下降,提示阿托伐他汀可能通过下调Fas蛋白的表达而抑制心肌细胞的凋亡。
注:A:假手术组;B:I/R组;C:阿托伐他汀组;D:阿托伐他汀+L-NAME组
注:与假手术组比较,*P<0.01;与I/R组比较,★P<0.01;与阿托伐他汀组比较,▲P<0.01
注:A:假手术组;B:I/R组;C:阿托伐他汀组;D:阿托伐他汀+L-NAME组
超氧化物歧化酶(SOD)是体内存在的一种抗氧自由基酶,其活力的高低间接反应了机体清除氧自由基(OFR)的能力[6],MDA为OFR发生脂质过氧化反应过程中形成的脂质过氧化物,其水平间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。两者的变化可反映心肌的抗氧化能力。本研究结果显示,应用阿托伐他汀的大鼠较I/R大鼠心肌组织的TSOD活力显著升高,MDA水平显著降低,表明阿托伐他汀能减轻I/R心肌的脂质过氧化反应,提高机体清除OFR的能力。机体氧化损伤的后果之一就是导致细胞凋亡[7]。研究表明,抗氧化剂可抑制Fas系统介导的细胞凋亡[8]。Tanaka等[9]通过对心肌过度表达超氧化物歧化酶-1(SOD-1)的转基因大鼠心肌I/R模型,与未转基因大鼠比较,发现心肌细胞凋亡明显下降,同时发现Fas/FasL表达下降,并且caspase-3活性也明显下降,表明SOD-1可能通过其抗氧化作用使Fas/FasL系统抑制,从而减少I/R时的心肌细胞凋亡。本研究显示,应用阿托伐他汀后,大鼠的TSOD活性升高,MDA水平下降,Fas蛋白表达下降,心肌细胞AI降低,提示阿托伐他汀可能通过清除氧自由基来干预Fas蛋白的表达,从而减少凋亡的发生,保护细胞。但具体作用于凋亡信号转导途径的哪一步,还有待于进一步研究。
NO是以左旋精氨酸和分子氧为底物在一氧化氮合酶(NOS)催化作用下合成的,L-NAME是NOS的抑制剂,加入L-NAME后,可抑制NO的生成[10]。目前研究发现,阿托伐他汀可以通过激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路,提高内皮型NOS活性,增加NO的合成[11]。NO可通过抑制炎性细胞膜上的NADPH氧化酶,减少细胞超氧阴离子的产生;也可直接淬灭自由基,阻止自由基的形成及终止脂膜上的自由基链式反应,减轻脂质过氧化[12,13]。本研究显示,在加入L-NAME后,MDA水平升高,与I/R大鼠无显著差异,而TSOD活力降低,但仍高于I/R大鼠,说明阿托伐他汀清除MDA的作用完全依赖于NO,SOD对心肌的保护作用部分依赖于NO。本研究结果显示,加入L-NAME后较应用阿托伐他汀的大鼠的心肌细胞AI增高,但仍低于I/R大鼠,表明阿托伐他汀抑制细胞凋亡的作用部分被L-NAME拮抗,阿托伐他汀抑制MI/RI诱导细胞凋亡的作用是通过增加NO合成来抗OFR损伤实现的,也意味着阿托伐他汀抑制细胞凋亡的作用不仅仅只由NO合成增加引起,很可能同时还存在其他物质或激活途径,提示NOS-NO途径可能是阿托伐他汀抑制细胞凋亡的诸多途径之一。
本研究表明,短期应用阿托伐他汀可清除氧自由基,干预Fas蛋白表达,从而减少心肌细胞凋亡;NOS-NO途径可能是其抑制细胞凋亡的诸多途径之一。阿托伐他汀能够减轻I/R造成的心肌细胞损伤,使细胞趋于恢复正常,保证心肌结构和功能的稳定,为临床治疗MI/RI开辟了新途径。
摘要：目的 观察短期应用阿托伐他汀对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法 将48只SD大鼠随机等分为假手术组(0.9%氯化钠溶液2ml/d)、缺血再灌注组(0.9%氯化钠溶液2ml/d)、阿托伐他汀组(阿托伐他汀20mg.kg-1.d-1)、阿托伐他汀+L-硝基精氨酸甲酯组(阿托伐他汀20mg.kg-1.d-1、L-硝基精氨酸甲酯15mg/kg)。灌喂3d后制作大鼠在体心肌缺血再灌注模型。L-硝基精氨酸甲酯于缺血前15min尾静脉注射。再灌注后测定血清一氧化氮(NO)水平、心肌组织总超氧化物歧化酶(TSOD)活力及丙二醛(MDA)水平;Hoechst荧光染色观察凋亡细胞形态学变化;检测凋亡蛋白Fas表达及心肌细胞凋亡指数(AI)。结果 阿托伐他汀组与缺血再灌注组比较,NO水平、TSOD活性、MDA水平、Fas蛋白阳性表达率及AI间差异均有统计学意义(P<0.01)。阿托伐他汀+L-硝基精氨酸甲酯组与阿托伐他汀组比较,NO水平、TSOD活性、MDA水平、Fas蛋白阳性表达率及AI间差异均有统计学意义(P<0.01),与缺血再灌注组比较,NO、MDA水平间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 阿托伐他汀能够减轻缺血再灌注造成的心肌细胞损伤,短期应用阿托伐他汀可清除氧自由基,干预Fas蛋白表达,从而减少心肌细胞凋亡;一氧化氮合酶(NOS)-NO途径可能是阿托伐他汀抑制细胞凋亡的途径之一。
