基因的表达

关键词： 哮喘 大鼠 对照组 模型

基因的表达（精选十篇）

基因的表达 篇1

关键词：基因芯片技术,早期大肠癌,筛选

大肠癌是一种常见的恶性消化系统肿瘤, 其发病率、死亡率极高, 一般认为其发生与高脂肪低纤维素饮食、大肠慢性炎症、大肠腺瘤、遗传因素和其他因素如:与血吸虫病、环境因素 (如土壤中缺钼) 等有关, 吸烟、长期处于辐射的环境也对其具有较大影响[1]。大肠腺瘤是公认的大肠癌癌前病变, 在其后的10~15年有极大可能演变为大肠癌[2]。本文通过基因芯片技术对早期肠癌及大肠腺瘤与正常肠黏膜组织基因差异性表达研究, 来探讨研究基因差异表达可能与大肠癌的发生及诱发有关, 来预测早期大肠癌的发生。基因芯片是目前最为先进的分子检测技术, 指对数以千计的DNA片段同时进行处理分析的技术, 诸如基因组的DNA突变谱和mRNA表达谱的检测等。该技术系指将大量的探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交, 通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而进行大量的基因表达及监测等方面的最新革命性技术。即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法, 在一块芯片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时, 通过确定荧光强度最强的探针位置, 获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。为了探讨并分析利用基因芯片技术筛选早期大肠癌的相关基因, 本文选取2015年7-12月我院肿瘤外科、胃肠外科、内镜室收治的大肠癌患者4例切除的肿瘤标本、大肠腺瘤患者4例以及正常人的大肠活检标本4例进行基因分析, 结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

资料来源于2015年7-12月我院肿瘤外科、胃肠外科、内镜室收治的大肠癌患者4例切除的肿瘤标本、大肠腺瘤患者4例以及正常人的大肠活检标本4例, 分别作为A、B、C组。所有患者均对本次试验知情同意, 并签署有关知情同意书。排除近期接受放疗、化疗等针对肿瘤的治疗措施的患者, 排除具有其他如糖尿病、高血压等疾病的患者, 排除合并其他严重大肠疾病的患者。所有患者的标本在从患者体内取出后, 立即于30min内将其低温保存在液态氮中。所有患者均经过病理学证实, A组4例为大肠癌组织, 避开肿瘤中心坏死组织及深部结缔组织和肌组织, B组为大肠腺瘤组织, C组为正常肠黏膜组织。

1.2 方法

(1) 首先, 采用Trizol试剂盒 (美国生产) , 提取三组组织的总RNA, 分离出其中的mRNA, 然后用分光光度计对其分别进行定量检测, 测定波长为260nm与280nm时的吸光度, 然后对两者比值进行计算。取三组等量的总RNA, 利用逆转录酶引物T7- (dT) Primer, 逆转录合成cD-NA一条链, 再以此为模版合成另一条链。将合成的cDNA进行纯化处理, 采用的是GeneChip Sample Cleanup Module试剂盒 (美国生产) 。之后利用合成的cDNA在RNA合成酶作用下, 体外转录生成cRNA片段, 并对其进行生物素标记。 (2) 将三组体外生成的RNA片段制成杂交液, 并将其加入到本次选用的HG-U133Plus2.0全基因组芯片 (上海生产, 包含47 000个转录本及其变异体基因, 其中已知38 500个) 中, 杂交过程为16h, 之后取出芯片放入工作站中进行洗脱与染色。 (3) 采用荧光扫描仪 (GeneChip Scanner) 对芯片进行扫描, 获取基因表达的相关荧光信号, 对其进行转换处理, 并进行分析。

1.3 观察项目和指标

首先对所提取的RNA进行完整性与纯度检测, 对所准备的全基因芯片进行质量判定, 然后观察杂交结果, 并进行PT-PCR检测。

1.4 统计学方法

采用LuxScan 3.0图像分析软件进行计算机自动分析与处理, 将利用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪扫描芯片获取的荧光信号强度转换为信号值, 并对各个基因探针检测出的辨别值与标准值进行比较, 得出上调或下调差异较大的基因组。

2 结果

2.1 芯片杂交的结果

经分光光度计检验及凝胶电泳鉴定, 样品RNA完整性良好, 纯度较高;从3组样品杂交后的扫描图可见, 杂交区域四周电线均匀, 边界清晰可见, 四角及中心标志物 (+字) 清晰, 芯片质量较好。图1显示芯片杂交的结果, 为正常组织基因 (横轴) 与腺瘤组织基因 (纵轴) 散点图, 图中斜线自上往下依次为上调30、10、4、2倍以及下调2、4、10、30的基准线, 2~4倍线之间较密集。

2.2 RT-PCR基因芯片检测结果

通过对400~500bp之间升高表达基因以及降低表达基因的RT-PCR检测发现其结果与基因芯片检测结果一致, 基因芯片检测结果可信度较高。图2显示癌组织与正常组织基因表达的RT-PCR检测结果, 选取的为升高表达基因479bp以及降低表达基因446bp。

注:1、2为正常组织mRNA表达, 3、4为癌组织mRNA表达

2.3 差异表达基因及其变异体数目

经过计算机筛选发现早期大肠癌相关基因A组及B组表达但C组不表达的有125个, 其中已知的有113个 (包括LOC401074、SOX4、BF等) ;A组及B组不表达而C组表达的有475个, 其中已知391个 (包括LOC284723、SSB1、C19orf21等) 。结果见表1。

3 讨论

大肠癌包括结肠癌和直肠癌, 最容易发生在直肠癌、乙状结肠癌, 是一种常见的恶性消化系统肿瘤, 是一种多基因、多步骤、多途径变化的疾病, 在我国的发病率非常高, 与饮食偏于油腻、食用蔬菜较少、肠道炎症、腺瘤及遗传因素有关, 吸烟、长期处于辐射的环境也对其具有较大影响[3]。肠癌在最初并没有明显的临床表现, 仅有比较轻微的不适感或大便潜血。后期逐渐表现出腹痛、大便习惯改变、便血、包块等, 还有可能伴有不同程度的全身症状, 最后可累及多个器官及组织。

大肠癌发病隐匿, 早期常无明显临床症状, 被确诊时20%~30%为较晚期, 即使进行手术、放化疗等综合治疗仍不能很好达到治愈的目的, 因此, 对于大肠癌的及早发现及早治疗对于患者来说具有非常重要的意义。可应用粪便OB检测、血CEA、肠镜等技术提高早期肠癌的检出率, 但是因粪便OB、CEA的特异性低, 且肠镜的有创性及费用高, 有些患者无法接受反复多次的肠镜检查等因素, 故在临床应用中有一定的局限性, 那么不久将来是否可以尝试推广利用基因芯片技术筛选早期肠癌, 积极处理大肠腺瘤, 成为一项值得关注的临床研究。大肠癌发生分为散发性、家族性、遗传性几种特征, 其中家族性遗传性基本遵循“腺瘤-腺癌”的演变过程, 故对此类疾病早期进行基因检测, 以此来预测肿瘤的发生至关重要, 目前针对大肠癌的基因学检测手段已经由早期的单基因检测发展到多基因联合检测[4]。肿瘤是局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控, 导致细胞的增殖失控和分化异常, 从分子水平探索癌变相关基因, 可望早期发现肿瘤。

本文通过基因芯片技术对早期肠癌及大肠腺瘤与正常肠黏膜组织基因差异性表达进行分析, 来探讨基因差异表达可能与大肠癌的发生及诱发有关, 预测早期大肠癌的发生。结果显示, 早期大肠癌相关基因A组及B组表达但C组不表达的有125个, A组及B组不表达而C组表达的有475个, 总共600个差异基因及变异基因。而在A组大肠癌与B组腺瘤共同特异性表达的125个基因及变异基因中, 有些已知的与癌症发生密切相关, 例如FABP6基因、LCN2、CHRM3[5~8]。大肠癌是一种消化科常见的恶性肿瘤, 而大肠腺瘤是一种公认的大肠癌癌前病变[9]。大肠癌与大肠腺瘤共同特异性表达的基因总数为125个, 而其中许多证明与大肠癌发生有较大关系, 大肠腺瘤经历10~15年时间变为大肠癌, 可能与这些基因的表达有着密切关系。而正常组织表达, 大肠癌与腺瘤不表达的有475个, 大肠癌的发生也或与这些基因的抑制有一定关系。因此在将来, 可以尝试推广利用基因芯片技术筛选早期肠癌, 积极治疗大肠腺瘤并提高早期肠癌的检出率, 提高肠癌治愈率, 减少患者痛苦及节省医疗资源, 当然还需要大样本继续探索和相关研究的完善, 并且更深入地研究大肠癌的发病机制, 从而更好地为肿瘤的基因治疗服务, 是后续研究目标。

参考文献

[1]刘峰, 郭久冰, 沈智勇, 等.基因芯片技术筛选结直肠癌腹膜转移相关基因〔J〕.南方医科大学学报, 2012, 32 (3) :400-403.

[2]程家乐, 姚敬, 彭佳远, 等.大肠癌肝转移相关的间质差异表达基因的筛选〔J〕.医学综述, 2014, 20 (5) :903-907, 封3.

[3]陈曦, 陈向征, 刘明, 等.基因芯片筛选结肠癌伊立替康耐药相关基因〔J〕.四川大学学报:医学版, 2011, 42 (1) :15-18, 36.

[4]Kim ER, Kim YH.Clinical application of genetics in management of colorectal cancer〔J〕.Intest Res, 2014, 12 (3) :184-193.

[5]Zhang H, Lee MY, Hogg MG, et al.High-throughput transfection of interfering RNA into a 3Dcell-culture chip〔J〕.Small, 2012, 8 (13) :2091-2098.

[6]Li M, Wang N, Zang W, et al.Sensitive SNP Detection of KIF6Gene by Quantum Dot-DNA Conjugate Probe-Based Assay〔J〕.Analytical Letters, 2013, 46 (1/3) :508-517.

[7]Quan J, Saaem I, Tang N, et al.Parallel on-chip gene synthesis and application to optimization of protein expression〔J〕.Nature Biotechnology, 2011, 29 (5) :449-452.

[8]Liu Y, Bowen NJ, Matyunina L, et al.Gene transfection enhanced by ultrasound exposure combined with drug treatment guided by gene chip analysis〔J〕.International journal of hyperthermia:The official journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group, 2012, 28 (4) :349-361.

基因的表达 篇2

白藜芦醇合酶(RS)是Res生物合成的`关键酶之一,它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成Res.以花生中克隆的RS基因为基础,成功构建了RS基因的以Ubi为启动子的单子叶植物表达栽体pBIL-RS,为以后的基因工程遗传转化果蔗和其他单子叶植物改良其品质提供条件.同时构建了酵母表达载体pVT102U-RS,为下一步研究真核表达蛋白的生物活性提供条件,并为利用酵母生产Res提供了可能.

作 者：方珊茹 阙友雄 林剑伟 陈如凯 Fang Shanru Que Youxiong Lin Jianwei Chen Rukai 作者单位：方珊茹,Fang Shanru(福建省农业科学研究院水稻研究所,福州,350019)

阙友雄,林剑伟,陈如凯,Que Youxiong,Lin Jianwei,Chen Rukai(福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福州,350002)

Survivin基因的表达及意义 篇3

Survivin是凋亡抑制因子家族中的重要成员，在调节细胞分裂、细胞应激反应、细胞周期检查点、组织模式、细胞因子激活和不同的细胞信号通路的激活中起关键作用[1]，具有不同于家族其他成员的独特性质和结构，被认为是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。1997年耶鲁大学的Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体cDNA在人类基因组库的杂交筛选中克隆出Survivin，其基因定位于17Q25[2]，编码142个氨基酸，分子量为16.3 KD，含有4个外显子和3个内含子。Survivin通过多种途径促进肿瘤形成与进展：(1)Survivin可竞争CDK4，因Survivin对CDK4的竞争力强于pl6，导致CDK4被活化，进而使细胞从G1期向S转化，最终造成细胞的无限制生长；(2)Survivin可增加血管生成素I的表达，从而促进毛细血管网的形成和内皮细胞的增生；(3)Survivin还可以表达于G2/M期，以周期调节方式和对纺锤体微管作用，促使细胞异常有丝分裂，以克服凋亡；(4)Survivin抑制线粒体细胞色素C的释放以达到直接或间接抑制凋亡下游效应分子Caspase-3和Caspase-7，最终促进肿瘤进展[3]。

在人的生长发育过程中，Survivin在胚胎组织中高表达，这有利于胚胎和胎儿组织内环境稳定及分化，在成人分化成熟的组织中不表达(仅在胸腺和肠黏膜上皮中少量表达)，而特异性表达于恶性肿瘤组织[4]。在生理状态下，细胞正常凋亡清除了体内衰老和异常的细胞，有利于保持体内组织的动态平衡。在肿瘤发生的早期，各种因素导致凋亡抑制，不仅有利于细胞的增殖，还有利于异常基因细胞的进一步积聚，促使组织向恶性转化，从而有助于肿瘤进展[2]。Survivin与bcl-2相似，其基因的表达在肿瘤中直接或间接地抑制了细胞的凋亡。由于Survivin可致细胞异常增生和抗凋亡的功能，导致细胞無限制的生长及细胞分裂异常，从而引起癌细胞无限制的增殖，最终导致原发肿瘤对相连接组织的侵犯和癌灶的远处转移；同时Survivin的异常表达还能促进肿瘤新生血管、淋巴管的形成，这些因素直接导致Survivin阳性表达高的患者相对于表达低的患者生存率降低[3]。

Survivin在大多数常见肿瘤组织中均异常高表达，如在妇科肿瘤中，Survivin基因在卵巢癌和葡萄胎中尤其活跃[5]；而其在溃疡型胃癌中的阳性表达要明显高于无癌前病变的胃溃疡[1]。Survivin的表达与肿瘤的病理分级和病理类型有密切的关系，与肿瘤组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、分期和远处转移有关，疾病的分期越晚、恶性程度越高，Survivin的阳性表达率越高。这种在正常组织和增生组织不表达或少量表达，而在肿瘤组织中过度表达的特点说明，Survivin基因可能是在癌前病变或者肿瘤发生早期阶段被激活，并开始表达。Survivin在肿瘤组织中过表达，抑制细胞的正常凋亡，延长肿瘤细胞的生存期，增加恶性肿瘤的生长速度，提示Survivin基因的激活参与了肿瘤的发生与发展[2]。亦有研究显示，Survivin基因的异常表达可以使肿瘤细胞对化疗与放疗的抵抗性增强、敏感性降低。因此，在临床上可以根据这种基因的表达率帮助判断疾病的分期和类型，对肿瘤的基因诊断、基因治疗亦有重要意义。

癌症的最佳治疗方式就是建立一个有效的平衡，杀灭肿瘤细胞的同时能尽可能降低药物对机体的影响，并能有效抑制肿瘤细胞生长。这就需要一个抑制癌细胞生长依赖的分子靶点，而Survivin就具有这样良好的靶点。新近发现的一个新的强有力的Survivin抑制剂SPC3042比其他反义药物靶向抗癌药抑制Survivin mRNA更强效、更稳定，通过下调Survivin和原癌基因bc1-2从而使细胞周期停止，显著地促进细胞凋亡。体内和体外试验均证实SPC3042可以使紫杉醇治疗前列腺癌的敏感性增加[6]。由于基因组技术和蛋白组技术的进一步发展，RNA干扰技术发展迅速，它是将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，促使特定mRNA片段降解，导致相应蛋白质无法合成，从而达到基因沉默，关闭特定基因的目的，目前已有采用siRNA技术剔除Survivin的表达可增强肿瘤对化疗药物敏感性的报道[6]。又因为Survivin的生物学特性具有良好的免疫原性，因此，关于Survivn在免疫治疗应用的研究相继出现，它是指构成Survivin重组质粒并在原核系统中表达，获取高纯度的重组人Survivin蛋白分子，免疫豚鼠制备抗Survivin特异性抗体，抗Survivin的抗体可特异性地识别肿瘤组织中的Survivin蛋白[4]。此外，针对Survivin的靶点研究的主要方法还有采用反义寡核苷酸、酶活性RNA、显性负突变体及小分子抑制剂等[6]。Survivin的靶向治疗研究有效抑制Survivin基因的过表达，增加肿瘤组织的凋亡和抑制细胞的增殖，将有望成为今后瘤基因治疗新的领域[4]。

参考文献：

[1] 王华，王志红，赵敏. Survivin表达对良、恶性胃溃疡鉴别的临床意义[J]. 实用医学杂志. 2012，28(6)：923-925.

[2] 王昌亮，郑春辉，王在国. Survivin在乳腺癌中的表达及意义[J]. 中国肿瘤外科杂志. 2012，4(1)：56-57.

[3] 肖大旺，陈斌. Survivin与Caspase-3在乳腺癌中的研究进展[J].中外医学研究. 2012，10(2)：152-153.

[4] 杨洁，李晓江，赵留芳，等. 抗凋亡基因Survivin在分化型甲状腺癌中的表达及临床意义[J]. 昆明医学院学报. 2011，32(10)：27-31.

[5] 朱巧英．卵巢上皮性肿瘤中PTEN和Survivin的表达及意义[J]．实用医学杂志，2009，25(18)：3009-3010.

小麦MYB基因的表达分析 篇4

MYB转录因子在应答非生物胁迫中具有重要作用, 例如Ta Myb2-Ⅱ基因受干旱胁迫诱导表达[1,2]。Ta MYB32基因受高盐胁迫诱导[3]。在前期克隆小麦MYB基因的基础上[4], 分析在小麦不同组织中MYB基因的表达情况, 为进一步研究基因的功能奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

挑选大小均匀的小麦种子30粒, 用75%的酒精消毒1 min, 用无菌水冲洗后, 置于培养皿中, 加入去离子水。在光照培养箱中20℃培养, 生长20 d后, 取根、茎和叶片, 经液氮速冻后, 于-70℃保存备用[5]。

1.2 试验方法

用TRIZOL试剂盒 (TIANGENG) 提取根、茎、叶组织的总RNA。利用AMV反转录酶 (Ta Ka Ra) 发转录合成c DNA第1链。以分别转录的根、茎和叶组织总RNA为模板进行RT-PCR, RT-PCR反应体系和程序参见于月华等[4]。

采用半定量RT-PCR方法, 以小麦的根、茎和叶组织c DNA第一链为模板, 检测MYB基因在3种组织中的表达情况。扩增引物为:F:5′-AACGCCGTCAAGAATCACT-3′和R:5′-GAAGAAACCGCCACCACTA-3′。以小麦actin基因为内参基因[1]。扩增体系为20 u L, 扩增程序为:94℃预变性10 min, 94℃变性30 s→60℃复性45 s→72℃延伸1 min, 28个循环, 72℃延伸10 min[6]。

2 结果与分析

利用半定量RT-PCR, 分析在小麦根、茎和叶组织中MYB基因的表达特性。结果表明, 该基因在上述3种组织中均有表达 (图1) 。利用Quantity One软件对电泳结果进行定量分析, 表达量大小依次为根、茎和叶。

注:1为茎;2为叶;3为根。

3 结论与讨论

在不同的组织中, 小麦MYB基因的表达呈现组织特异性表达和组成型表达2种模式[7]。例如, 半定量RT-PCR分析发现Ta MYB32基因的转录本在根、茎、叶、雌蕊及花药中均有很强的表达, 在上述组织中呈现组成型表达模式[3]。在茎和根组织中, Ta MYB4表达量高, 但是在叶组织不表达, 表达具有一定的组织特异性。

基因的表达 篇5

目的 构建15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达PGDH蛋白.方法 以人正常大肠黏膜组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,转化E.coli DH5a,经温控诱导表达,并经Ni2+ -NTA亲和层析纯化,目的 蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 重组质粒pBV220-PGDH-Hia6经PCR及酶切鉴定,证明质粒构建正确.经温控诱导后,可表达出相对分子质量约为29 000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3 h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的`30%.Western blot验证了表达蛋白的特异性.纯化后目的 蛋白纯度大于95%.结论 已成功构建PGDH原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了PGDH蛋白.

作 者：李美宁 冯燕 常冰梅 解军 张悦红 殷云勤 程牛亮 作者单位：李美宁,冯燕,常冰梅,解军,张悦红,程牛亮(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室,太原,030001)

殷云勤(山西医科大学第一医院消化检验中心,太原,030001)

“基因的表达”中重难点的突破 篇6

【关键词】基因的表达

【中图分类号】G633.91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2012）02-0095-01

“基因的表达”是人教版必修2中的内容，是从分子水平上阐述细胞中的遗传物质是如何起作用的，即遗传信息转录和翻译的过程。由于此部分内容不仅抽象复杂，而且涉及的物质种类比较多，因此学生常常会陷入“学习时都懂，学完了都不懂”的困惑之中。为了能使学生加深对这部分内容的理解，不容易遗忘，本人尝试多手段教学，获得了良好的效果。

1.模拟活动

1.1活动准备：

（1）学生甲、学生乙、其余全部学生；

（2）准备一条绳子模拟DNA，上面标注a、b、c、d、e五个基因，每个基因后面隐藏一个纸条（上面有相应的碱基序列）；

（3）准备八十一张卡片，其中二十张空白卡片，备用；其余的六十一张卡片，上面标注不同的反密码子，随机分发给其余的学生；

（4）准备两张并排的椅子，模拟核糖体上的两个位点；

（5）讲台用多张凳子围起来，凳子之间留有一人通过的间隙，模拟细胞核上的核孔；

（6）多只气球，每只气球下有两根绳子，气球上标注各种氨基酸。

1.2活动步骤:

1.2.1 模拟转录过程。

学生甲站在讲台内，手拿一条绳子，学生乙携带空白卡片进入，甲随机抽取某基因后面的纸条，在黑板上写出相应的碱基序列，学生乙按照基因上的模板链在黑板上写出相应的RNA上的碱基序列，然后从起始密码子开始抄写在空白卡片纸上（每张卡片纸的正面写3个碱基，反面编号），然后携带卡片离开讲台。

1.2.2 模拟翻译过程

（1）学生乙穿过凳子之间的间隙，站在两张椅子的后面，右手持第一张卡片置于第一张椅子上方，左手持第二张卡片置于第二张椅子上方，并显示上面的碱基。

（2）下面的学生开始读学生乙所展示卡片上的碱基序列，并有相应的学生一手持卡片，一手持相应气球来到前面，学生乙核对后让其坐在第一把椅子上，然后由第二个学生也一手持卡片，一手持相应的气球来到前面，同样经学生乙核对后坐在第二把椅子上，两个学生合作将两只气球上的一根绳子连接起来，然后第一个学生离开第一把椅子回到座位，学生乙隐藏第一张卡片，右手持第二张卡片，左手持第三张卡片，显示碱基，同时第二个学生移坐在第一把椅子上，下面的学生继续读码重复上面的过程。

（3）当下面的学生读到终止密码子时，没有学生上去，坐在椅子上的学生离开，绑在一起的气球也离开椅子。

1.3讨论：

1.学生乙表示什么？模拟的转录过程中哪些内容没有体现出来？

2.模拟的翻译过程中有哪些细节没有体现出来？

3.模拟过程中会出现抢位置的现象吗？不同的人所拿的气球会相同吗？

4.一种氨基酸可能有多个密码子，这一现象称做密码的简并。你认为密码的简并对生物体的生存发展有什么意义？

5.如果不考虑不编码的序列，DNA中的碱基、mRNA中的碱基、蛋白质中的氨基酸数量会存在什么样的比例关系？

学生先通过模拟活动亲身体验了基因表达的过程，再通过小组交流讨论加深了对转录和翻译过程的理解，对于容易混淆的概念，如遗传信息、密码子、反密码子，学生就能很轻松地加以区分。由于整个模拟过程学生亲自参与，因此遗忘的概率也比较低。但是此模拟活动要想获得成功，必需在这之前进行理论知识的学习，学生可结合书上的图形进行充分的预习，也可以先上一节课，了解整个过程后再实施模拟活动。

2.联想记忆教学

学生先根据基因的表达画出一条主线：DNA RNA蛋白质，然后回忆这些过程中所涉及的各种物质和结构，学生会想到“DNA ，信使RNA， 转运RNA， 核糖体RNA， 脱氧核苷酸， 核糖核苷酸， 氨基酸，核糖体， RNA聚合酶”等，并将这些按转录和翻译两个过程进行归类，再以“结合—配对—延伸—释放”这八个字对具体的过程进行展开。例如转录是RNA聚合酶首先识别DNA上的启动子并与之结合，启动转录，然后是核糖核苷酸随机地与模板链上的碱基碰撞，当碱基互补时配对形成氢键，新结合的核糖核苷酸在RNA聚合酶的作用下连接到正在合成的mRNA上，合成的mRNA从模板链上释放出来，DNA双链恢复。通过主线和一些关键词，学生尝试将上面的物质串联起来，有利于学生对过程的记忆。

3.识图填图画图

教材中关于转录和翻译的过程采用图文并茂的方式进行呈现，因此教师不仅要利用插图达到形象和直观的教学效果，还应配合教材中的文字描述作深入浅出的讲解，使文字信息与图形信息结合起来，让学生感知到基因的表达是一个多层次的、动态的、相互协调和配合的过程。除此之外，为了加深学生的印象，教师还可以设计一些不完整的图形，让学生进行补充，或者让学生直接绘出转录和翻译的过程图。在绘图中，应注意教师的示范性环节，培养学生化繁为简、突出重点、相对准确的绘图习惯。例如：先画核膜，以示真核生物的转录和翻译在不同场所进行，再画DNA的双螺旋结构，其中部分双链打开，再画出一条单链表示mRNA，在mRNA和DNA模板链上写上配对的碱基，在以氢键连接的部位画一个大圆圈，以示RNA聚合酶，这样就能表示出转录的过程了。学生在画图的时候，眼、耳、手、脑并用，多种感觉器官的刺激，更能加深学生的记忆。

4.多媒体结合比喻教学

多媒体应用在生物教学中，能够提高课堂的效率和教学的质量，激发学生学习兴趣的同时，也充分发挥了学生的主体参与性。在本节内容教学中，先通过多媒体展示基本概念并进行比较，学生直接从屏幕上获取了理论性的知识，为后面过程的学习奠定了基础。然后再通过多媒体的动画模拟，展示了转录和翻译的具体过程，学生边观察边思考讨论，这样既调动学生的学习兴趣，建立一个愉悦的学习氛围，又能对教学重点和难点进行有效的突破。在多媒体展示动态过程的同时，教师加上适当的比喻，如翻译的过程可比喻成大人送小孩去电影院看电影，每个大人一手拉着小孩，一手拿着电影票，将小孩安排到对应的座位上离开，最后电影院里就是一群对号入座的小孩。学生结合多媒体动画模拟和比喻，更能加深对基因表达过程的记忆和理解。

基因的表达 篇7

实时定量PCR (RT-qPCR) 较普通PCR定量准确、重现性好、灵敏度高, 已经成为分析基因转录水平的首选方法[5,6,7]。然而, 多种变量因素影响其数据处理和结果分析, 如提取RNA的质量、酶的效率 (反转录效率, 扩增效率) 等等。为了去除这些变量可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异, 实验者通常选择表达稳定的单一内参基因GAPDH或ACTB进行校正和标准化。然而越来越多的研究表明, 某些条件下稳定表达的内参基因变得不再稳定[8,9]。为了确保RT-qPCR结果的可靠性, Bustin等[10]针对实验中的种种问题提出一套标准指南 (MIQE指南) 。本研究依据该标准指南共选取10个候选看家基因:ACTB、GAPDH、RPL37A、PPIB、PGK1、PPIA、SDHA、TBP、HPRT1、RPL13A, 通过SYBR-Green RT-qPCR技术对LPS刺激THP-1细胞的基因转录水平进行检测, 评估不同条件下适合此细胞基因表达水平研究的内参基因, 以确保后期RT-qPCR实验结果的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 THP-1细胞培养与样本采集

THP-1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 (TCHu-57) , 用含10%FBS (Gibco 10099-141, 购自北京茂建) 的RPMI-1640 (Hyclone, SH30809.01B) 培养基, 37℃, 5%CO2的细胞培养箱培养。稳定培养传2代~3代后给予Lipopolysaccharide (LPS, Sigma, L2880, 10μg/mL) 刺激。实验设计LPS刺激THP-1细胞不同时间点:LPS刺激0h、2h、6h、12h、24h。

1.2 总RNA提取纯化与反转录

依照说明书使用TransZol Up (ET111-01, 北京全式金生物技术有限公司) 抽提上述5个时间点THP-1细胞的总RNA, DNaseI (D2215, TaKaRa大连宝生物工程有限公司) 去除基因组DNA的污染, 紫外分光光度计测定每个样本RNA的浓度与纯度。参照反转录PrimeScriptTM-reagent kit (DRR037S, TaKaRa大连宝生物工程有限公司) 说明书, 以400ng总RNA为模板合成cDNA, 同时设阴性对照。

1.3 实时定量PCR

实验中涉及的所有内参基因的基因序列均来自于GenBank。采用Allele ID6对序列进行分析, 并设计适合于SYBR Green的特异性上、下游引物 (见表1) , 委托上海英骏公司 (Invitrogen) 合成。RT-qPCR反应总体系为20μL, 包括2×SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) 10μL、ROX 0.2μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、cDNA模板1μL、ddH2O补齐余体积。Stratagene实时荧光定量仪Mx3000p运行, 反应条件为95℃预变性5s、95℃变性5s、55℃退火30s、72℃延伸30s并收集荧光, 40个循环, 57℃~95℃生成熔解曲线。每个样品3次重复。经过Mx3000p软件分析, 可以得到各内参基因的循环阈值 (Ct) 。

1.4 实时定量PCR扩增效率的验证

以cDNA第一链为模板, 做梯度稀释。依次做5个梯度稀释后cDNA初始浓度分别为1/10、1/102、1/103、1/104、1/105。每个反应重复2次, 通过RT-qPCR分析相关系数, 扩增效率等通过Stratagene实时荧光定量PCR仪Mx3000P自带软件得到。

1.5 数据分析

根据qRT-PCR定量分析结果, 利用GeNorm和NormFinder软件对各候选内参基因在LPS刺激不同时间后的表达稳定性进行统计学分析, 从而筛选出最优的内参基因。

2 结果

2.1 内参基因引物特异性

普通PCR扩增、1%琼脂糖凝胶电泳检测每个内参基因引物的特异性, 结果如图1所示, 各引物条带清晰, 扩增产物片段大小正确。各内参基因的溶解曲线均为单一峰, 证明内参基因引物特异性良好。

注:1为RPL37A;2为ACTB;3为GAPDH;4为PPIB;5为PGK1;6为PPIA;7为SDHA;8为TBP;9为HPRT1;10为RPL13A。

2.2 荧光定量PCR的效率 (见表2)

10个候选内参基因的标准曲线R2值变化范围为0.990~0.999, 表明cDNA初始模板量与其相应的Ct值线性关系较好。

2.3 NormFinder软件分析

5个样本经10个候选基因的特异性引物扩增后, Ct值分布如图2所示, 由图可知GAPDH、PGK1Ct值比较稳定。

经GenEx软件中Normfinder分析, 10个候选内参基因的组内标准差如图3所示, 经过分析, Normfinder选择GAPDH (SD=0.0951) 为最佳基因, 说明在分析LPS刺激后THP-1细胞mRNA的表达量时GAPDH的变化最小, 而RPL13A (SD=1.539 4) 最不稳定。

2.4 GeNorm软件分析结果

Genorm软件通过分析内参基因在不同样品中的表达稳定性 (M) 来确定最稳定的内参基因, 但该程序基于标准差, 默认M=0.5为取舍值。若某内参基因的M值小于0.5, 可考虑将其作为内参基因。M值越大表示其稳定性越差;反之, 稳定性越好。由图3可知, 候选内参基因的稳定性为GAPHD=PGK1>PPIB>RPL37A>HPRT1>ACTB>PPIA>SDHA>TBP>RPL13A。GAPDH、PGK1稳定性好, 适合作为LPS刺激下THP-1细胞基因表达分析的内参基因。

3 讨论

RT-PCR是分析基因转录水平的首选方法, 为了确保其结果的准确性和可靠性, 选择合适的内参基因是非常重要的一个环节。内参基因通常是各种看家基因, 在细胞内组成性表达, 有助于保持细胞的功能。由于内外环境的变化, 在细胞内真正恒定表达的基因并不存在。RT-PCR实验中选择的理想内参基因应该满足以下条件:①不存在假基因, 避免基因组DNA的扩增;②表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;③稳定表达于不同类型的细胞和组织 (如正常细胞和癌细胞) , 且其表达量是近似的, 无显著性差别;④高度或中度表达, 排除太高或低表达;⑤其稳定的表达水平与目标基因相似;⑥不受任何内源性或外源性因素的影响, 如不受任何实验处理措施的影响。实际上能满足这些条件的基因几乎是不存在的, 目前所研究的基因 (包括看家基因) 在不同类型的细胞、组织及实验条件下表达均有差异[11], 研究者有必要针对不同的实验条件、分析寻找适合各自实验系统的特异性稳定表达的内参基因。

本研究依据MIQE指南共选取10个候选看家基因, 采用NormFinder和GeNorm软件评估不同条件下适合THP-1细胞基因表达水平研究的内参基因。NormFinder软件经标准曲线或ΔCt法将原始数据转换成线性表达量, 然后通过方差分析得出基因的表达稳定值M, 可以直接评价基因的稳定性[12]。GeNorm软件是通过分析内参基因的表达稳定值来筛选内参基因[13]。原始数据先经2–ΔCt (EMinCt-SampleCt) 法转换成相对表达量输入Excel表格, GeNorm软件将每个候选内参基因与其他候选基因的配对表达水平比值进行对数变换, 计算出标准差作为基因表达稳定值M, 然后对所有候选内参基因的表达稳定性排序。根据NormFinder和GeNorm软件分析得出本实验中GAPDH和PGK1是表达最稳定的内参基因。RT-PCR进行基因转录分析中选择一个以上的内参基因作内参可以得到更可靠的结果[14], 为确保后期RT-qPCR实验结果的准确性和可靠性, 同时选用GAPDH和PGK1校正目的基因表达。

总之, RT-PCR实验中研究者应该根据细胞和组织的类型及不同实验条件, 选择最合适的内参基因, 选择2个或2个以上的内参基因将有助于得到更可靠的结果。参考文献:

基因的表达 篇8

1.1 实验材料

健康成年雄性SPF级SD大鼠(体重150～200g)24只,购自南华大学实验动物中心。

1.2 动物分组及大鼠哮喘模型的建立

大鼠按随机表随机分为正常对照组与哮喘模型组。哮喘模型组(B组,分别为两周B1组、四周B2组、8周B3组,每组各6只)在第1天和第8天腹腔注射OVA(1 mg)+Al(OH)3(100 mg)生理盐水混合液1 m L致敏,第15 d开始以1%OVA雾化激发,每次30 min,隔天1次,以大鼠出现呼吸急促、腹肌抽搐、口唇紫绀代表哮喘模型复制成功。正常健康大鼠为正常对照组(A组6只)以生理盐水致敏,蒸馏水雾化吸入作为对照。分别在哮喘激发2周、4周和8周雾化吸入后的24 h后处死,收集肺泡灌洗液行炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数、取肺组织行HE染色、病理图像分析、提取肺组织RNA行基因芯片筛选及实时定量PCR。

1.3 实验方法

1.3.1 肺泡灌洗液炎性细胞检测

肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数,分离气管,作“V”形切口,行气管插管,每次注入Hankp s液2 m L作肺泡灌洗,重复3次,要求回收率大于75%且无血液混入。将所收集的BALF离心(2 000r/min离心20 min),取细胞沉淀,用1 m L Hankps液重新混悬,并涂片行瑞氏染色,油镜下记数500个细胞,进行炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数。

1.3.2 气道形态学参数测量

肺组织HE染色后,以图像分析软件测定支气管基底周径(Pbm)、总管壁面积(WAt)、内壁面积(WAi)、平滑肌面积(WAm),并用Pbm将测量值标准化,分别以WAt/Pbm,WAi/Pbm,WAm/Pbm表示,代表相应管壁各层厚度。

1.3.3 肺组织总RNA的提取

用Trizol按一步法分别提取总RNA,每50～100 mg组织加Trizol 1m L,匀浆,室温下5 min;加0.12 m L氯仿摇匀,4℃离心15 min(12 000 g);取上清液移至新EP管,加0.15 m L异丙醇,4℃冰箱保存30 min;4℃离心15min(12 000 g);弃上清,加75%乙醇1 m L清洗,再4℃离心5 min(10 000 g)。无RNase水溶解RNA,测得所提的总RNA A260/A280的比值在1.18～2.10之间,1.5%琼脂糖凝胶电泳观察18 s与28 s条带清晰且密度比值约等于2,无基因组污染时可用。

1.3.4 基因芯片实验

由杭州联川生物信息技术有限公司采用Phalanx Rat OneArray基因芯片进行基因表达谱实验,每样品进行二次技术重复实验,用激光共聚焦扫描仪对杂交后的芯片进行扫描,并对杂交信号值进行背景扣除,归一化。筛选差异表达基因的标准为:以基因表达倍数值≥2.0和基因表达倍数值≤-2.0为阈值来确定差异表达基因。

1.3.5 生物信息学分析

用GO及Pathway功能分类标准对差异基因进行功能分类分析。

1.3.6 荧光定量RT-PCR验证

选取2个在2种组织中差异表达的基因,根据GenBank序列号获取全长c DNA序列,由杭州联川生物技术有限公司设计并合成上下游引物基因名称和上下游引物序列以及退火温度和产物长度见表1。SYBRGreen荧光实时定量RT-PCR反应在ABI PRISMR 7900HT型荧光定量PCR仪上进行各样品的目的基因和管家基因分别进行Real-time PCR反应根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成,每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品受检基因校正后的相对含量。

1.4 统计学分析

所有实验数据用(x±s)表示,使用SPSS 13.0软件进行统计学分析,组间比较应用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,采用Pearson直线相关性分析进行相关性分析,P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 白细胞(WBC)及嗜酸性粒细胞(EOS)计数

正常对照组及哮喘模型各组大鼠肺泡灌洗液中白细胞(WBC)及嗜酸性粒细胞(EOS)计数见表2。

2.2 病理组织学改变

正常对照组气道周围无炎性细胞浸润,平滑肌层均匀,无杯状细胞增生及黏液分泌,周围散在少许胶原。见图1。哮喘二周组支气管黏膜下及管壁周围嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润,黏液腺增生,部分气道上皮脱落,黏膜下细胞外基质沉积,新生血管形成,气道平滑肌增厚,杯状细胞增生,伴黏液高分泌,胶原过度沉积,基底膜增厚。见图2。随着哮喘病程的进展,气道平滑肌增厚逐渐增加,气道壁进一步增厚,气道管腔狭窄程度更加明显明显。见图3、4。

注:1)示哮喘二周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);2)表示哮喘四周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);3)表示哮喘八周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);4)哮喘四周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);5)表示哮喘八周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);6)表示哮喘八周组与哮喘四周组比较,差异有显著性(P<0.05)

2.3 图像分析

哮喘大鼠模型在激发两周出现支气管管壁及平滑肌增厚,大鼠激发八周WAt/Pbm、WAi/Pbm及WAm/Pbm均较对照组、激发两周及四周显著增加,表现出气道平滑肌随着激发时间的延长而逐渐增厚。见表3。

注:1)表示哮喘二周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);2)表示哮喘四周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);3)表示哮喘八周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);4)哮喘四周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);5)表示哮喘八周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);6)表示哮喘八周组与哮喘四周组比较,差异有显著性(P<0.05)

2.4 总RNA定性分析

哮喘组和对照组提取总RNA的A260/A280比值分别在1.81～2.10之间,说明没有蛋白质和DNA残留,纯度较高。经1%甲醛变性、琼脂糖凝胶电泳后,可以清晰地看到18S和28S两条条带,说明RNA完整性好,没有降解。见图5。

1:对照组;2:正常对照组;3:哮喘模型二周组;4:哮喘模型四周组;5:哮喘模型八周组

2.5 芯片杂交结果

扫描结果显示芯片信号强度均一,基因点清晰,背景值均匀,符合要求,且每个标本进行一次技术重复,所有检出信号点的强度经归一化以后的相关性大于95%,说明实验数据可靠;小图为每个基因扫描图右下角放大图。每一个点代表一个基因的表达,亮度越高就代表表达量越高。见图6。

A:正常对照组;B:哮喘模型二周组;C:哮喘模型四周组;D:哮喘模型八周组

2.6 基因表达谱芯片筛选结果分析

按P<0.05差异显著性标准,从24 358条基因中,筛选出哮喘患者与正常对照差异表达2倍以上的基因,其中与哮喘疾病过程中持续表达相关的基因有13条,其中上调基因9条,下调基因4条见表4。用GO及Pathway功能分类分析发现上述差异表达基因主要涉及到炎症反应、免疫反应、防御反应、免疫过程、创伤反应、外部刺激反应固有免疫反应等功能。

2.7 荧光定量RT-PCR结果

在哮喘大鼠肺组织差异表达的基因中选取2个基因Mal、TPD52L1做荧光定量RT-PCR检测,发现在哮喘大鼠肺组织中,上述2个基因在两种组织中变化倍数的变化方向与基因芯片检测结果一致,证明基因芯片结果准确可靠。见表5。

3 讨论

哮喘作为一种多基因遗传疾病,它受到环境因素和遗传因素的双重影响,其发病的复杂分子生物学机制及调控机制目前仍未明朗。以往对于哮喘的研究多局限于气道炎症或气道重塑的某一阶段,而哮喘的发病是一个动态过程,其早期以气道炎症为主,而后期以气道重塑为主。基因芯片技术克服了以往在哮喘研究中的缺陷,能够更全面地从整体分子学水平研究哮喘发病的病因及病理生理机制。本研究以差异基因表达倍数值2.0和基因表达倍数值-2.0为阈值来筛选差异表达的基因,笔者观察到哮喘两周组VS正常对照组中有472条基因表达上调,187条基因表达下调,哮喘四周组VS正常对照组中有447条基因表达上调,365条基因表达下调,哮喘八周组VS正常对照组中有642条基因表达上调,392条基因表达下调,从中可以看出随着哮喘病程的进展参与差异表达的基因越多,通过GO及Pathway对差异基因进行功能分类分析,发现有13条基因在哮喘病程中持续表达,这13条基因涉及到哮喘的防御反应、免疫反应、细胞凋亡等功能有关。

本研究中基因芯片筛选出的基因NOX1、C5、XCL1等目前已经在许多实验中证实参与哮喘的疾病进程,影响哮喘气道炎症及重塑[3,4,5],由此也说明,本组哮喘大鼠模型建立是成功的,但还有许多哮喘发病中的典型基因在本实验中未出现,可能与实验样本容量等有关。此外,本实验中笔者还发现许多新基因在哮喘发病过程中表达,其中Ma L(T细胞成熟相关蛋白)、TPD52L1是其中表达较典型基因,而本组的实时定量PCR结果也显示这两个基因参与哮喘疾病的发展。

Ma L基因于1987年分离得到,定位于2q13,含4个外显子,其c DNA全长为1 051 bp。Ma L基因家族成员在肺、肾等多种组织中广泛表达,而且不同种属之间有同源蛋白质,提示它们在细胞中具有重要的功能。Ma L作为顶端膜蛋白在细胞表面的存在,具有调节上皮细胞吸收和分泌的重要作用[6],并且Ma L基因在顶端膜蛋白转运和蛋白分泌机制中也起作用[7]。近年研究发现Ma L与肿瘤的发生发展有密切的关系。文献报道,在口腔鳞状细胞癌细胞与正常口腔上皮细胞相比,Mal基因的表达显著减少[8]。另外,研究发现Ma L基因在乳腺癌、宫颈癌、头颈鳞状细胞癌、胃癌细胞中均表达下调,认为Ma L下调的机制与启动子的甲基化有关[9,10]。Ma L可通过Fas途径抑制肿瘤细胞的运动浸润和肿瘤的发生,促进细胞凋亡[11]。FERNANDO等[12]发现Ma L除了具有基底-顶端转运的基本功能外,还具有维护上皮样组织细胞的正常极性,其表达下降和分布状态改变,能破坏正常细胞极性,导致肿瘤发生。

气道上皮在哮喘发病中发挥着重要的作用,气道上皮结构完整性的缺陷或功能紊乱是哮喘等疾病的启动环节[13],但其相关机制尚不明确。本实验通过利用全基因表达谱芯片技术,对哮喘大鼠模型的不同阶段进行基因表达差异谱分析,发现Ma L随着大鼠哮喘病程的进展其表达逐渐出现下调。以往文献表明,MaL主要在上皮细胞中表达,与维持上皮细胞形态和功能密切相关,笔者推测Ma L在肺组织中下调,主要是在气道上皮细胞中表达减弱,可能与哮喘发病有关。且本实验研究发现在哮喘疾病中气道内炎性细胞的浸润以嗜酸性粒细胞为主,并在早期即有气道上皮的破坏,且随着疾病的进展气道内炎症的浸润及上皮的破坏和气道重塑情况越严重(见表2、3,图1～4)。为此,笔者推测Ma L在哮喘疾病中的作用机制可能是内外界因素不断刺激气道上皮细胞,引起Ma L表达下降。使气道上皮细胞正常形态和功能发生改变,促使气道上皮细胞分泌促炎性因子或致纤维化因子,从而启动气道炎症,维持其慢性发展,进而促使气道重塑的形成,导致哮喘病理、病程的进展。如果能提高Ma L表达,能否延缓或抑制哮喘的炎症启动、持续和气道高反应性及气道重塑,是一个新的治疗途径。

TPD52L1是癌蛋白52(D52)家族成员之一。D52家族基因扩增与肿瘤增生和病毒转导细胞增生相关[14]。逆转录病毒转导的D52能够促使鸡的神经胶质上皮细胞增生[15],又证实了D52家族基因表达与细胞增生相关。通过本实验发现,TPD52L1随着哮喘病程的进展其表达逐渐上调。结合本实验结果及相关文献,笔者推测TPD52L1参与哮喘疾病的进展,可能与气道上皮细胞的增殖等有关,从而促进哮喘气道重塑的形成。

结合本实验结果及相关文献报道,笔者将在今后的实验中,通过对气道上皮细胞的研究,检测Mal、TPD52L1基因在气道上皮细胞中的具体作用,从而为哮喘的发病机制提供新的实验依据。

另外,从结果中发现有许多基因参与哮喘的疾病进程,但在哮喘整个疾病过程中只有13个基因持续表达,这一现象是否因本实验样本量有关,此外某些基因在大鼠哮喘早期表达上调或下调,而在晚期表达下调或上调,这在以往的文献中未见报道,笔者也将在后续试验中对此进行研究及分析。

支气管哮喘的发病是多因素、多基因共同影响的结果。现已发现了许多与哮喘发病相关的基因,但我们还需要在全基因组的水平上进行检测,以全面研究哮喘相关基因的表达。基因芯片(gene chip或DNA microarray)作为一种高通量高效能的筛选工具是研究基因表达的有效方法[1,2],它在疾病研究中以一种系统、整体的方法进行研究,打破了一种疾病,一种基因的陈旧模式,整体宏观地研究生物体基因的表达及功能。为此,我们采用全基因表达谱芯片技术,筛选哮喘大鼠差异基因表达的动态变化,并分析这些基因的功能,以进一步探讨哮喘发病的分子机制。

摘要：目的 利用基因芯片技术寻找哮喘大鼠与正常大鼠之间差异基因的动态变化,寻找参与哮喘发病的新基因。方法 分别于激发哮喘2、4、8周处死大鼠收集肺泡灌洗液行炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数,取肺组织行HE染色、病理图像分析,提取肺组织RNA行基因芯片筛选及实时定量PCR验证。以基因表达倍数值2.0和基因表达倍数值-2.0为阈值来确定差异表达基因,然后用GO及Pathway分析对差异表达基因进行功能分类分析,结果以P<0.05为差异显著性标准。结果 从24 358条表达基因谱中,筛选出哮喘大鼠与正常大鼠持续性差异表达2倍以上的基因有13条,其中发现Mal和TPD52L1等新基因参与哮喘疾病过程。结论 Mal、TPD52L1基因在肺组织中异常表达,影响哮喘的病程进展。

基因的表达 篇9

食线虫真菌是植物寄生性线虫潜在的生物防治因子之一,对该类真菌侵染线虫的机制进行研究是构建高效生物防治菌和提高生防效率的基础。Dactylellina cionopaga(=Monacrosporium cionopaga,Dactylella cionopaga,Golovinia cionopaga)是一种产生黏性分枝的捕食线虫真菌。该菌对根结线虫Meloidogyne javanica具有很好的防治效果[1],也能够防治胞囊线虫Heterodera schachtii[2]。由于生长较快,与其他食线虫真菌相比更容易被开发成制剂[3]。目前关于产生黏性分枝的食线虫真菌的侵染机制研究鲜有报道。基因外源表达是鉴定基因功能的重要方法之一。D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ经荧光定量PCR证明在该菌侵染线虫过程中表达量更高。本文通过对融合表达载体pGT21M进行改造,构建了含有组氨酸标签的黑曲霉表达载体,外源表达了D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

Dactylellina cionopaga AS 3.6776(SQ27-3)分离自云南三七根部土壤,为中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室保存。黑曲霉(Aspergillus niger)201和黑曲霉表达载体pGT21M由中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室唐国敏老师惠赠。

1.1.2 试剂

酶液:5~8mg/ml Lysing enzyme(Sigma公司),1mg/ml cellulase R-10(日本Yakult公司),0.8mol/L MgSO4缓冲液配制。Tris-HCl缓冲液:50mmol/L,pH 7.5。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。化学试剂为分析纯,购自上海生物工程技术服务有限公司。硝酸纤维素滤膜和超滤管购自Millipore公司。His·Bind Column购自Novagen公司。改良的BCA蛋白检测试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司。

1.1.3 仪器

凝胶电泳系统(BIO-RAD,美国);紫外凝胶成像系统(BIO-RAD,美国);离心机(Sigma,德国);微量移液器(Gilson,美国);梯度PCR仪(Biometra,德国)。

1.1.4 培养基

选择培养基:含有200μg/ml潮霉素的查氏培养基。

发酵培养基:6%可溶性淀粉,2%酵母提取物,0.5% KH2PO4,0.5%玉米粉。

1.2 方法

D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ通过信号肽捕获技术克隆后测序(GenBank accession No.JF699729)[4]。组氨酸标签以质粒pPICZαA为模板进行扩增,使用His-L(5′-tgtgggcccaacgatgagatttccttc-3′)和His-R(5′-cgagggccctcaatgatgatgatgatg-3′)为引物。将扩增产物连接至质粒pGT21M的ApaⅠ位点。应用NotⅠ酶切连接产物,通过连接酶使纯化的酶切产物的大片段发生自连,获得多克隆位点3′末端具有组氨酸标签的质粒pGT21M-HIS。以Pn-L(5′-cgaatcgatggcagaggaaggcgaaaagct-3′)和Pn-R(5′-ggaatcgatagtggagcaagtcctgaggga-3′)为引物,扩增丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ无信号肽编码序列的DNA片段,用ClaⅠ酶切后与同样酶切并去磷酸化的载体pGT21M-HIS连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,构建丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ黑曲霉表达载体pGT21M-HIS-PrI。以Checkinsert(5’-tgcggccacatctgccattg-3’)为测序引物对该表达载体进行测序鉴定。

黑曲霉的原生质体制备基本参照K.Wernars等人的方法[5]。黑曲霉原生质体的转化使用PEG-CaCl2介导的共转化方法。将转化子在选择培养基上分离纯化。采用CTAB法提取黑曲霉转化子基因组DNA,以Pn-L、Trp-R2(5’-ggccggatccaagaaggattacctctaa-3’)为引物,通过PCR反应鉴定整合了目的基因的转化子。D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ在黑曲霉细胞中的转录用RT-PCR进行检测,以进行了DNA消化的总RNA为模板,引物为Pn-L和Pn-R。

将鉴定的转化子与原宿主菌同样活化后接种于发酵培养基中,通过SDS-PAGE和蛋白平板活性检测筛选转化子。初筛样品1次重复,于发酵4d、6d后取发酵上清进行检测。复筛样品3次重复,分别于培养3d、4d、5d、6d、7d和8d后取发酵液进行SDS-PAGE和蛋白平板活性检测。

蛋白酶酶活平板测定方法如下:配制0.1mol/L柠檬酸-磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。将100ml缓冲液分为两份,在其中50ml缓冲液中加入1g琼脂糖煮沸,放至55℃水浴保温。同时,将另外50ml缓冲液加热至55℃,然后将0.5g酪蛋白(casein)缓慢溶于其中。将两份溶液混合后倒培养皿。测定酶活时,在casein平板上用打孔器(Ф=4 mm)打小孔,加入30~50μl酶液,30℃恒温静置,观察有无透明圈形成。当制备pH 5.0蛋白平板时,用2%脱脂奶粉代替酪蛋白。

大量发酵黑曲霉转化子,进行重组蛋白的分离纯化。过滤发酵液除去菌丝体,依次用饱和度为25%和80%的硫酸铵溶液分级沉淀上清中的蛋白质,10 000g离心。将沉淀重悬于Tris-HCl缓冲液中,然后对50mmol/L Tris-HCl缓冲液进行透析除盐,使用BaCl2检测透析效果。应用0.4μm硝酸纤维素滤膜过滤透析液,获得丝氨酸蛋白酶粗酶液。重组蛋白通过亲和层析进行纯化。粗酶液的上样与洗脱遵循His·Bind Column说明书进行。每500μl洗脱液收集一管,用超滤管脱盐并浓缩样品。对纯化的酶液进行SDS-PAGE和蛋白平板活性分析。

2 结果与分析

黑曲霉能够分泌大量内源蛋白。为了方便目的蛋白外源表达后的分离纯化,在黑曲霉表达载体pGT21M的多克隆位点下游插入了组氨酸标签。经测序鉴定证明构建了具有HindⅢ、BstBⅠ、ClaⅠ、HpaⅠ、NotⅠ、XbaⅠ克隆位点的载体pGT21M-HIS。将丝氨酸蛋白酶PrDⅠ前肽编码序列插入pGT21M-HIS的ClaⅠ位点,酶切和测序结果均显示构建了该基因的融合表达载体pGT21M-HIS-PrI,载体图谱如图1所示。

通过原生质体共转化,将pGT21M-HIS-PrI导入部分内源蛋白酶基因敲除的黑曲霉菌株201,获得共转化子164个。随机选取潮霉素抗性菌落,用PCR方法鉴定了含有目的基因的转化子39个(图2A)。收集发酵2d的黑曲霉菌丝体,提取总RNA,进行RT-PCR检测,鉴定目的基因是否转录的结果表明,转化子Pn7b、Pn11、Pn140转录了目的基因(图2B)。培养经过PCR鉴定的转化子,转化子初筛的SDS-PAGE分析结果表明,与对照相比转化子发酵液泳道具有微弱的蛋白差异条带。蛋白平板活性检测结果显示,在pH 5.0蛋白平板上转化子发酵液具有蛋白水解活性。复筛结果证明了,发酵4d的转化子目的蛋白表达量较高。另外,用液氮研磨破胞,应用SDS-PAGE及pH 5.0和pH 7.0蛋白平板检测转化子胞内蛋白酶的表达量及其活性。结果表明,在SDS-PAGE凝胶上不能确定有目的条带出现,转化子和对照之间无明显的蛋白表达和蛋白酶活性差异。

A.PCR.1:A.niger 201;2~6:推测的转化子;B.RT-PCR.1:A.niger 201;2~6:推测的转化子。 A.PCR.1:A.niger 201;2-6:Putative transformants;B.RT-PCR.1:A.niger 201;2-6:Putative transformants.

进行转化子的大量发酵,采用硫酸铵沉淀、亲和层析和超滤纯化浓缩发酵上清200倍,应用SDS-PAGE和蛋白平板检测纯化产物。结果表明,纯化产物在SDS-PAGE凝胶分子量约为45kDa处具有目的条带(图3),获得的酶液在pH 5.0蛋白平板上30℃条件下温育过夜,显示出了蛋白水解活性(图4),而在pH 7.0蛋白平板上无水解圈出现。改良的BCA蛋白浓度检测结果表明,纯化后酶液的蛋白浓度为30μg/ml。

3 讨论

丝氨酸蛋白酶是食线虫真菌重要的侵染相关蛋白之一。目前已经从食线虫真菌中至少分离纯化了16种丝氨酸蛋白酶。酶学、免疫学和基因表达研究证明,它们分别在捕食真菌(Arthrobotrys oligospora PΠ和Aoz1、D.cionopaga Dcp等)、内寄生真菌(Hirsutella rhossiliensis Hasp和Hnsp、Verticillium suchlasporium P32和V.chlamydosporium VCP1)和卵寄生真菌(Lecanicillium psalliotae Ver112、Paecilomyces lilacinus pSP-3和PIP、Clonostachys rosea Lmz1和PrC)对植物寄生性线虫的侵染过程中发挥作用[4,6,7]。利用丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂处理A.oligospora明显影响了该菌对线虫的侵染[8]。在A.oligospora中表达多拷贝丝氨酸蛋白酶PⅡ基因,可以增加侵染结构的数量,提高该菌对线虫的致病力[9]。V.suchlasporium丝氨酸蛋白酶P32在侵染过程中定位于被侵染线虫的卵上[10]。电子显微镜观察结果显示,分离纯化的H.rhossiliensis丝氨酸蛋白酶能够改变线虫体表形态[7]。对食线虫真菌的丝氨酸蛋白酶及其基因进行结构和功能分析是构建生物防治因子工程菌株的重要理论基础。D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ具有信号肽,编码胞外蛋白,在该菌侵染线虫过程中高表达,推测的氨基酸序列与其他食线虫真菌蛋白酶高度同源,与从D.cionopaga中纯化的丝氨酸蛋白酶Dcp的N-端序列不同[4]。该基因及其编码的丝氨酸蛋白酶的结构和功能有待于研究。

由于在食线虫真菌中往往存在多种丝氨酸蛋白酶同功酶,从细胞发酵液中纯化蛋白然后进行结构和功能分析受到了蛋白量和特异酶鉴定可重复性的限制。进行基因外源表达是解决该问题的途径之一。目前建立的基因外源表达系统包括昆虫杆状病毒表达系统、大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、极端嗜盐古菌表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统。在各种外源表达系统中,大肠杆菌表达系统和酵母表达系统常被用于丝状真菌基因的外源表达。大肠杆菌表达系统具有表达量高的特点,但是表达的外源蛋白往往以包涵体的形式存在,而且不能够对表达的蛋白进行翻译后修饰。应用酵母表达系统可以进行外源基因的胞外和胞内表达,该表达系统也能够对表达的蛋白进行糖基化修饰。Clonostachys rosea丝氨酸蛋白酶Lmz1[11]和H.rhossiliensis丝氨酸蛋白酶Hasp在毕赤酵母(Pichia pastoris)中均已获得了外源表达,并且重组蛋白表现出了蛋白水解活性[7]。然而,我们对D.cionopaga蛋白酶基因PrDⅠ进行毕赤酵母外源表达时,SDS-PAGE检测结果显示,该基因不能在以BMMY为诱导培养基培养的毕赤酵母GS115中获得胞外表达。黑曲霉遗传背景清晰,具有较强的分泌胞外蛋白的能力,能够分泌大量淀粉酶,长期用于食品和药物的工业化生产,被认定为安全的生产菌株[12,13,14]。黑曲霉表达系统是主要的丝状真菌表达系统之一,黑曲霉表达系统的建立为丝状真菌基因外源表达获得成功提供了更大的可能。报道的外源基因表达量能够达到微克级到克级[15,16,17,18]。然而,目前可用的黑曲霉表达系统还很有限[19,20,21]。就我们检索的文献,至今还没有应用含有组氨酸标签的分泌表达载体在黑曲霉中进行成功外源表达的研究报道。在本研究中,使用由pGT21M改造的载体,将D.cionopaga可能与侵染机制相关的丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ转入糖化酶高产菌株黑曲霉201中进行了外源表达。

D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ序列分析表明,该基因推测的前肽理论分子量为39.84kDa,成熟肽理论分子量为28.90kDa。然而,D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ在黑曲霉201中外源表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析证明分子量约为45kDa,说明目的重组蛋白在表达后进行了翻译后修饰。该现象与丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ序列的翻译后修饰位点分析结果和A.oligospora PΠ黑曲霉表达结果的报道相一致[4,22]。A.oligospora天然PΠ蛋白的分子量为40kDa,而在黑曲霉AB1.13pclA和AB1.18中外源表达的重组蛋白的分子量为48kDa[22]。重组表达的PΠ在抑制剂类型、底物谱和最适pH反应上与天然蛋白无明显差异。D.cionopaga天然的PrDⅠ的动力学特性还有待于研究,以与重组蛋白的性质相比较。在本研究中,黑曲霉表达的外源蛋白在酸性条件下具有活性,与大多数碱性蛋白酶的主要活性范围不同,该反应特征可能也与蛋白质经翻译后修饰的结果有关。

M.Ward等报道使用黑曲霉糖化酶N-末端编码序列进行外源基因的融合表达可以增加目的蛋白的表达量[23]。本研究应用的载体的母质粒黑曲霉表达载体pGT21M在多克隆位点上游具有黑曲霉糖化酶基因启动子和N-端编码序列,在下游具有色氨酸终止子,能够引导外源基因进行胞外融合表达。刘丽等用pGT21M母质粒pGT10大量表达了细菌血红蛋白[24]。张金祥等应用融合表达载体pGT21M和非融合载体pGT进行基因外源表达的结果显示,以pGT21M构建的转化子表达外源蛋白的量较低,但是比活力较高[25]。本研究使用改造的pGT21M进行了丝氨酸蛋白酶基因的融合表达,与木聚糖酶B相比,外源基因表达量较低[15]。以非融合载体pGT构建D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ表达载体将可能能够提高该基因在黑曲霉中的外源表达量。

作为蛋白分泌表达的重要宿主,黑曲霉中与错误折叠蛋白分泌压力相关的基因转录与翻译反应已被分析[26]。N.S.Dunn-Coleman等报道,应用筛选模型对含有目的基因表达载体的黑曲霉突变子进行筛选,可能能够获得外源蛋白分泌量达到克级的转化子[27]。然而,本文筛选的转化子胞内蛋白检测结果初步显示了,对获得的转化子进行突变难以进一步增加外源蛋白的分泌表达量。本研究使用的黑曲霉菌株为胞外蛋白酶部分敲除菌,进一步构建蛋白酶缺陷宿主或根据蛋白分泌压力相关基因优化宿主将可能改善黑曲霉表达体系的外源表达量[28]。

G.M.Eibes等证明,通过优化发酵条件能够提高A.nidulans转化子的外源表达量[29]。虽然该策略在过氧化物酶的黑曲霉表达中没有发挥作用,但是在其他基因的黑曲霉表达中,改变发酵条件可能将提高特异外源蛋白的表达量。D.cionopaga PrDⅠ黑曲霉转化子的发酵条件有待于进一步优化。

4 结论

本研究构建了含有组氨酸标签的黑曲霉表达载体。利用该载体获得了D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ黑曲霉转化子,应用亲和层析进行外源表达蛋白的大量制备,将能够对该酶结构和功能进行进一步的研究。

基因的表达 篇10

通过这样一次性的多基因转化,多个基因一般可整合在受体染色体的一个遗传位点上。转化后可根据与其连锁的选择标记基因进行简单方便的筛选。但目前所构建的多基因抗虫载体多以潮霉素抗性基因(hpt)作为筛选标记基因,其安全性受到一部分人的质疑。而抗除草剂基因不仅可以使作物获得除草剂抗性而方便除草,也方便在田间对其它目的基因的跟踪和选择,在水稻杂种优势中还具有特殊用途[9],如进行机械化制种、快速鉴定杂种纯度和克服两系法不育系育性不稳定的缺点,并且本身的安全性得到了广泛认同,已经应用于商业化生产,如转Epsps基因大豆[10]、转Bar基因水稻[11]等。本研究以抗除草剂基因Epsps为筛选标记,构建了含有3个抗虫基因(PinⅡ、Bt、GNA)的表达载体,同时在载体构建中对大分子的连接方法进行了全面的比较及优化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

质粒pRSSGNA(含GNA基因)、pKC-3(含PinⅡ、Bt、GNA基因)由中山大学李宝建教授提供。pTSM(含除草剂基因Epsps)由中山大学徐培林教授提供。质粒pCAMBIA1300由澳大利亚国际分子生物学农业应用中心(CAMBIA)提供。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由本实验室保存。

1.1.2 试剂:

限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ、HindⅢ,T4 DNA连接酶、碱性磷酸酶(CIAP)、DNA凝胶回收试剂盒购自Takara公司;PCR反应所需要的Taq DNA聚合酶和dNTP等各种试剂,RNaseA酶等购自TIANGEN公司;抗生素卡那霉素(Kanamycin,Kan)、氨苄青霉素(Ampcillin, Amp)等其他试剂购自Sigma公司。

1.1.3 实验仪器:

恒温水浴槽,高压灭菌锅,WH-1微型旋涡混合仪,磁力搅拌器,PCR仪,低温高速离心机,小型台式离心机,控温摇床,小型低温恒温器,DYY-6B型电泳仪, DYCP-31D型琼脂糖水平电泳槽,紫外分析仪,超净工作台,电子天平,艾科浦纯化水机,低温冰箱,超低温冰箱等。

1.1.4 培养基:

LB液体培养基配制(1L):在800mL去离子水中加入胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g。完全溶解后用1mol/L NaOH调pH7.0, 再加入去离子水定容至总体积1L,20min高压灭菌即可。LB固体培养基则在高压灭菌前加入15g琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA的提取,限制性内切酶的酶切,琼脂糖凝胶电泳,DNA片段的回收、连接、转化、筛选和鉴定方法参考文献[12,13]。

1.2.2 连接反应中的各组试验对比方案设计:试验共设置一次连接(No.1)和二次连接(No.2)2组方案;每组方案根据载体片段的浓度大小设置2个处理:处理1(0.1μg)和处理2(0.5μg);每个处理下设置4个水平:①目的片段和载体片段摩尔比为3∶1;②目的片段和载体片段摩尔比为4∶1;③目的片段和载体片段摩尔比为8∶1;④目的片段和载体片段摩尔比为10∶1。每个水平重复2次。分析数据来源于DNA片段连接转化后在相应LB固体平板上鉴定成功的正确转化子数目的转化率。

1.2.3 大分子连接方法的优化:二次连接法按文献[4,14]方法进行。一次连接法优化为:50μl反应体系中只进行一次连接反应,加入载体DNA片段(经过CIAP完全处理)0.1μg(0.5μg),加入的外源DNA量与载体DNA片段的摩尔比在3:1到4:1之间,16℃连接过夜,取20μl连接产物直接用于大肠杆菌转化。

1.2.4 PCR扩增和鉴定基因的引物序列为:

TSP基因:Primer 1: 5'-CGCGGATCCATGGCACAGATTAG-CATG-3',

Primer 2: 5'-CATGCCATGGTCTGTGCAGTGACCACTGAT-3'。扩增片段长度为220bp。

aroAM12基因:Primer 1: 5'-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3',

Primer 2: 5'-CGCGGATCCTTAGCAGGCTACTCATTC-3'。扩增片段长度为1.3kb。

Bt基因: Primer 1: 5'-GAAGGATTGAGCAATCTCTA-3',

Primer 2: 5'-CAATCAGCCTAGTAAGGTCG-3'。扩增片段长度为300bp。

PCR反应体系为:DNA模板50ng;上下游引物各1μmol;10×PCR反应缓冲液2μl;dNTP(10mmol/L) 0.4μl;Taq酶(3U/μl) 0.2μl;双蒸水补齐至20μl。

2 结果与分析

2.1 中间载体pCTSM1300的构建

用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切pTSM,回收大小为2 320bp的CaMV35s-TSP-Epsps目的片断,与pCAMBIA1300用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后的载体大片段相连接得载体pCTSM1300。转化大肠杆菌培养后提取该质粒,用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切验证表明载体构建正确(图1第2和第3泳道)。

2.2 中间载体pCT-PinⅡ-1的构建

用KpnⅠ/HindⅢ双酶切pKC-3,回收大小为3 000bp完整的PinII片段(含PinⅡ启动子,Act1内含子和PinII终止子);与pCTSM1300用KpnⅠ/ HindⅢ双酶切后的载体大片段连接得中间载体pCT-PinⅡ-1。用KpnⅠ/HindⅢ酶切验证该质粒表明pCT-PinⅡ-1载体构建正确(图1第5泳道)。

2.3 中间载体pCT-Bt-2的构建

用HindⅢ酶切pKC-3,回收大小为4500bp完整的Bt CryI(A)结构基因片段(包含Act1启动子和NOS终止子);与pCT-PinⅡ-1用HindⅢ酶切后回收的载体大片断(CIAP处理完全)相连接得中间载体pCT-Bt-2。用HindⅢ酶切鉴定是否连接上(图1第7泳道);用KpnⅠ+XhoⅠ酶切鉴定方向,若切出大小为7 500bp、7 000bp及2 300bp的三条片断(图2第3泳道),则为正向连接;若切出大小为11 000bp、3 500bp及2 300bp的三条片断则为反向连接(图3第2泳道)。

2.4 载体pCTSK的构建

用KpnⅠ酶切pRSs1GNA,回收大小为8 200bp的完整片段(包含PRSs1启动子,IVS-1内含子和NOS终止子),与中间载体pCT-Bt-2用KpnⅠ酶切后的载体大片段(CIAP处理完全)相连接,得到新载体pCTSK。用KpnⅠ酶切鉴定是否连接上(图1 第10泳道); 用XhoⅠ+NruⅠ酶切鉴定方向,方法同2.3。用PCR法鉴定TSP、aroAM12和Bt基因的结果见图4和图5。载体构建流程见图7。

Lane 1:15kb DNA marker;Lane 2:pTSM EcoRⅠ+XhoⅠ;Lane 3:pCTSM1300 EcoRⅠ+XhoⅠ;Lane 4:pKC-3 KpnⅠ+HindⅢ;Lane 5:pCT-pinⅡ-1 KpnⅠ+HindⅢ;Lane 6:pCT-pinⅡ-1 HindⅢ;Lane7:pCT-Bt-2 HindⅢ;Lane 8:pCT-Bt-2 KpnⅠ;Lane 9:pRSs1GNAKpnⅠ;Lane 10:pCTSK KpnⅠ.

Lane 1:15kb DNAmarker;Lane 2:pCT-Bt-2 HindⅢ;Lane 3:pCT-Bt-2 KpnⅠ+XhoⅠ

Lane 1:pCT-Bt-2 HindⅢ;Lane 2:pCT-Bt-2 KpnⅠ+XhoⅠ;Lane 3:pCT-Bt-2 PstⅠ;Lane 4:15kb DNAmarker.

Lane 1:15kb DNAmarker;Lane 2 and Lane 3:Amplification fragment of TSPsequence(200bp);Lane 4 and Lane 5:Amplification fragment;of aroAM12gene(1.3kb).

Lane 1:DNAmarker;Lane 2:Amplification fragment in pKC-3(300bp);Lane 3:Amplification fragment in pCT-Bt-2(300bp);Lane 4:Amplification fragment in pCTSK(300bp).

2.5 大分子连接反应中的各组实验方案对比结果分析

在大分子DNA连接中,连接效率的高低受目的片段和载体片段的浓度和摩尔比的影响很大,过高和过低均不利于连接。本试验根据载体的量及其目的片段与载体片段的摩尔比设置两组试验处理,获得如下数据(表1)。

利用DPS数据处理系统,对表1数据进行单因素实验统计分析,结果显示每个处理下的不同水平(3∶1、4∶1、8∶1和10∶1)间存在显著性差异;进行二因素有重复试验统计分析,对每个连接方案(No.1或No.2)间2个处理(0.1μg或0.5μg)进行方差分析,以及对各个处理(0.1μg或0.5μg)间的2个连接方案(No.1或No.2)进行方差分析,两因素组成的各个组合的SSR检验结果显示:单个的处理(0.1μg或0.5μg)下的不同连接方案间或单独的连接方案(No.1或No.2)下的不同处理间均无显著性差异(表2)。

将上述两组方案数据获得的平均转化率绘制成柱形图(图6),从图中也直观的说明,无论用哪种连接方法,目的片段和载体片段的摩尔比在3∶1和4∶1时,得到目的转化子的转化效率均很高(平均转化率45%以上),且远高于摩尔比为8∶1和10∶1时,此时的载体浓度在2～10ng/μl之间,且均对实验结果无显著影响。以上数据表明,二次连接法的连接效率确实很高,这一点与谭德勇等[14]、范钦等[4]的实验结果也一致,但与文中优化的一次连接方案的连接效率相差无几。从试验试剂消耗、试验时间效率的出发点上来看,优化的一次连接方案显得更为高效、快捷。

注: No.1*、No.2*分别指一次连接方案和二次连接方案,C*表示重复。

3 讨论

草甘膦是一种高效、低毒的广谱除草剂,它通过竞争性抑制植物莽草酸代谢过程中磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶活性,阻断芳香族氨基酸的生物合成导致植株死亡[15]。aroAM12基因为来自鼠伤寒沙门氏杆菌中编码EPSP合成酶的突变基因,突变的EPSP合成酶对底物PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)的亲和力提高,对草甘膦亲和力下降,从而提高了对草甘膦的抗性[16]。2004年以来,全球种植的抗草甘膦转基因作物面积占全球转基因作物总种植面积的72%[17],主要以北美洲为主。虽然中国也已经开展了一系列有关研究,但目前为止还没有自主知识产权的商品化转基因抗草甘膦作物问世。研究证明,用aroAM12基因转化棉花、油菜和烟草,获得的转化植株的草甘膦抗性均有明显的提高[18,19,20];而且用来作为选择标记基因,可以减少使用潮霉素抗性基因所带来的安全性顾虑。这些均显示了该突变基因良好的应用前景。

目前将Epsps基因与多个抗虫基因连锁转入水稻的研究报道还未见报道。中山大学李宝健提出了应用多基因转化策略综合改良农作物的新思路,并将多基因载体通过基因枪或农杆菌转化法转入生产上具有实用意义的水稻受体中[21]。本文中构建的表达载体已经转入水稻光温敏核不育系中,以期在抗除草剂、抗虫水稻培育和杂交稻机械化制种中发挥重要作用,结果将另文报道。

在大分子DNA连接中,DNA连接的效率较低,连接效率的高低受目的片段和载体片段摩尔比的影响很大,过高和过低均不利于连接。为了克服这些矛盾,谭德勇等[14]采用二次连接法将两个质粒的大片段进行重组,使连接效率大大提高;范钦等[4]通过改良的二次连接法将多个载体大片段进行连接,成功的构建了多基因抗虫表达载体pKC-3。但是二次连接法存在程序烦琐、时间长、浓度不易控制等缺陷。为了避免二次连接法的繁琐,本试验通过优化连接片段间的摩尔比,将载体片段浓度控制在2～10ng/μl之间,摩尔比控制在3∶1～4∶1之间,通过一次连接同样提高了大分子连接的效率。

摘要：目的:为了获得水稻的广谱抗虫性,同时也避免由潮霉素抗性基因引起的安全性问题。构建以抗除草剂基因(Epsps基因)为筛选标记的多基因抗虫植物表达载体pCTSK。方法:以双元载体pCAMBIA1300为基础,将潮霉素抗性基因hpt替换成携带烟草叶绿体转运肽序列TSP的草甘膦抗性突变基因aroAM12(编码细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶Epsps)作为筛选标记基因,获得中间表达载体pCTSM1300。然后再连接上3个抗虫基因(马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryI(A)及雪花莲外源凝集素基因GNA)的完整表达片段(包含各自的启动子和终止子)。结果:通过PCR方法和酶切方法鉴定已成功地构建了该表达载体;通过不同实验方案的数据分析,得出在载体构建的大分子连接中优化的一次连接法连接效率高于二次连接法的结论。