特异基因（精选十篇）
特异基因 篇1
1 材料与方法
1.1 标本收集
胃癌组织和癌旁正常黏膜组织来源于川北医学院附属医院的胃癌患者,胃癌组织标本术后经川北医学院附属医院病理科鉴定为低分化腺癌。
1.2 主要化学试剂
RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA;PCR Select cDNA Subtraction试剂盒,50×PCR Enzyme Mix,Advantage PCR Cloning试剂盒为美国Clontech公司产品;NucleoSpin ExtractⅡ(Clontech)和PCR Purification(Qiagen)纯化相应产物;抑制性PCR产物以T/A方式接入pGEM-T(Promega)载体;文库扩增使用感受态大肠杆菌JM109;氨苄青霉素(50 mg/L)及显色剂X-Gal/IPTG(Gibco)筛选克隆。
1.3 方法
1.3.1 总RNA的制备
取上述胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜组织,1%PBS(含0.1%DEPC)缓冲液洗涤3次,用RNeasy Min Kit(Qiagen)试剂盒,按使用说明提取癌组织和癌旁组织总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳鉴定质量。
1.3.2 cDNA合成
使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech),参照使用说明,取胃癌组织和癌旁组织总RNA各2μl(2μg),以RT-PCR方法扩增合成双链cDNA,产物经NucleoSpin ExtractⅡ(Clontech)纯化,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物质量。
1.3.3 消减杂交及抑制性PCR
以PCR Select cDNA Subtraction试剂盒(Clontech)进行。以限制性内切酶RsaI消化等量胃癌组织和癌旁组织cDNA,纯化并回收其产物。以酶切后的癌组织cDNA为tester,癌旁组织为driver,一份tester cDNA与Adaptor 1连接,一份tester cDNA与Adaptor 2R连接,分别将带有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA片段与等量的driver cDNA混合进行第一次消减杂交,然后将两者杂交后产物和另一份driver cDNA混合进行第二次消减杂交。
以稀释后的第二次消减杂交产物为模板,以试剂盒中的引物1进行第一轮抑制性PCR扩增,反应参数为:75℃5 min后,94℃30sec,以94℃30sec、66℃30sec、72℃1.5 min,27个循环,最后72℃6 min。再将稀释后的第一轮PCR产物作为模板,以试剂盒中的巢式PCR引物1和引物2进行第二轮PCR扩增,反应参数为:94℃30sec、68℃30sec、72℃1.5 min,20个循环。以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定质量,并以PCR Purification(Qiagen)纯化PCR产物。
1.3.4 cDNA消减文库的构建、克隆与测序
将上述PCR产物与pGEM-Tasy(Promega)载体连接,转化经CaCl2处理的大肠杆菌JM109,铺于(含X-Gal,IPTG,Amp)LB平板,蓝白斑筛选和快速琼脂糖凝胶电泳方式筛选阳性克隆,随机挑选29个克隆送上海基康生物技术有限公司进行测序,以所测定的DNA序列为基准序列,通过GenBank检索和同源性分析。
2 结果
2.1 胃癌组织鉴定
本实验所用胃癌组织标本和癌旁正常黏膜组织标本均经川北医学院附属医院病理科鉴定证实。
2.2 总RNA和cDNA的合成
用Qiagen公司产总RNA快速制备试剂盒提取胃低分化腺癌组织和胃正常黏膜组织的总RNA(图1),用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit(Clontech)合成cDNA。结果显示,无论是在胃低分化腺癌组织中还是胃正常黏膜组织中都存在相应基因的大量表达,为构建消减文库奠定基础。
2.3 胃癌特异表达基因片段的制备
以RsaⅠ酶切的胃癌cDNA为tester,正常组织cDNA为driver进行SSH和抑制性PCR,产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示,在200~800bp范围内的存在一系列基因片段(图2)。
2.4 胃癌cDNA消减文库的构建、测序及序列分析
经过pGEM-T载体连接的序列片段由JM109菌克隆,存在大量的阳性重组子,选取有明显条带的克隆进行序列测定,获得5个特异性序列标签(NBPF1、FAM48A、RXFP2、QDPR和ACTB)。
3 讨论
本实验采用SSH对胃低分化腺癌组织和胃正常黏膜组织提取的RNA进行逆向PCR合成cDNA,产物经RsaⅠ酶切后连上接头,进行消减杂交,测序结果获得5个特异性序列标签(NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR)。NBPF1基因(neuroblastoma breakpoint family,member 1):NBPF基因是一种在基因复制过程中出现相互易位产生的融合基因家族,Sherif ZA等[1]报道其与乳腺癌有关,Sossey-Alaoui K等[2]报道其与肾上腺神经节神经母细胞瘤(Ganglioneuroblastoma)有关,Roberts T等[3]报道与恶性成神经细胞瘤有关;RXFP2基因(relaxin/insulin-like family peptide receptor 2)是松弛素家族肽受体的成员,富含亮氨酸的G蛋白偶联受体,在细胞的代谢过程中能引起cAMP的升高[4],Halls ML等[5]报道其隐睾病和不育症有关;QDPR基因(quinoid dihydropteridine reductase):醌型二氢喋呤还原酶基因,位于4p15.3,在BH4的循环中起关键作用,Farrugia R等[6]报道其突变会导致BH4的循环障碍,导致高苯丙氨酸血症和苯丙酮症的产生,Schochet TL等[7]报道其与青少年的吸烟有一定的关联,Lee PL[8]报道其与哺乳动物饮食中的三价铁离子的还原有一定的关系;FAM48A基因:亦称C13orf19,Kunze D等[9]和Schmidt U等[10]报道其与前列腺癌有关。以上这四种基因与胃癌的发生、发展未见相关的文献报道。ACTB基因(actin beta):细胞骨架蛋白基因,Humar B等[11]报道其与弥散型胃癌有一定的关系。我们将深入研究这些基因的功能及其与胃癌的作用机制。
特异基因 篇2
芜菁消减文库特异基因片段功能的初步分析
目的:对4个消减cDNA文库中筛选到的特异基因片段进行功能分析,为筛选津田芜菁和赤丸芜菁花青素合成的特异基因和代谢途径奠定基础.方法:以不同处理的津田芜菁和赤丸芜菁块根为材料,采用抑制削减杂交构建4个消减cDNA文库并富集特异基因群体,同时对消减文库的特异基因片段进行初步的.生物信息学分析.结果:通过功能聚类、代谢途径分析和基因注释等手段分析了消减cDNA文库的特异基因片段.结论:对消减文库特异基因片段的功能分析,为进一步分离和鉴定依光型和非依光型花青素合成相关基因奠定了基础.
作 者：许志茹 李春雷 孙燕 李玉花 XU Zhi-Ru LI Chun-Lei SUN Yan LI Yu-Hua 作者单位：东北林业大学,生命科学学院,黑龙江,哈尔滨,150040 刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 19(4) 分类号：Q75 S603 关键词：芜菁 消减文库 特异基因片段 功能分析特异的法国，特异的萨科齐 篇3
法国选民开启了新的经济和政治改革时代，他们在5月6日的第二轮总统选举投票中，选择保守派候选人萨科齐为新总统。
如今，法国面临的重大问题是在经济全球化的挑战下如何进行体制性改革，以改善近年来步调缓慢的经济发展，尤其是居高不下的失业率。因此可以预见，萨科齐在上任后的100天内，将改革僵化的劳工法，解除每周工作35小时的限制；他要向失业问题宣战，将失业率降到5%以下；他也要精简臃肿的公共服务体系，并大幅度削减公共债务。
但是，法国的根本问题是二战后长期福利社会体制形成的既得利益的巨大阻力。尽管萨科齐誓言推行"百日维新"，但从德国近年痛苦的改革经验看，中右政权未必会比一个"形左实右"的社会党政权更为有效。
在外交方面，上海欧洲协会副秘书长张祖谦认为，法国人选择萨科齐，就是选择了改革。根据法国"总统主外，总理主内"的政治传统，萨科齐当选总统后将对法国对外政策进行适当调整，尤其要修复法美关系，而对华态度将类似于德国默克尔政府。
萨科齐的崛起
萨科齐的政治崛起，体现了法国的特异性--它可说是旧欧洲唯一具有类似美国文化熔炉特点的大国。这是因为在血统上，萨尔科齐实在谈不上是真正"法国"种：他的父亲是匈牙利破落贵族，在二次大战后从匈牙利移民法国；他的外祖父则是上世纪初期来自奥斯曼帝国的犹太人。
有专家称，这一点反映了法国的一种强烈文化自信：不管血统如何，只要在文化上认同法国，便可以成为彻头彻尾的法国人。
萨科齐似乎从小对政治感兴趣。1968年发生法国5月风暴后，13岁的他和许多人上街，游行支持戴高乐总统。他在大二时放弃政治学专业的学习，但在政治道路上却走得一帆风顺。
萨科齐19岁起就替保守派政党助选。20岁时在尼斯参加一次保守派青年集会时，被时任法国总理的希拉克"慧眼识英"。1976年，萨科齐加入由希拉克创建并担任主席的戴高乐派保卫共和联盟，翌年当选巴黎西郊"富人区"诺伊(Neuilly)市的议员。1978年，他拿到律师证，与人合伙开了律师事务所。由此开始，年轻的萨科齐轻松地在政商两界打拼。
1983年，年仅28岁的萨科齐当选诺伊市市长。这是他"打破常规"的努力结果。当时的诺伊市长突然去世，按照惯例，继任者应是萨科齐所在的党派领导人､参议员查尔·帕斯卡(CharlesPasqua)。可当时帕斯卡正在医院接受一项小手术，萨科齐就毛遂自荐。等帕斯卡出院时，萨科齐已经赢得足够的支持。这让帕斯卡怒气冲天，向希拉克抱怨此事，希拉克笑道："在政坛，每个人都可能背叛别人。"这件事也使得希拉克更加器重萨科齐。
在1995年前的20年，希拉克始终是萨科齐的"政治导师"，后者的仕途也一帆风顺：1988年萨科齐出任国民议会上塞纳省议员；1993年进入内阁，担任"左右共治"时期右翼政府预算部长和政府发言人。两人的"分手"是在1995年总统大选中。萨科齐支持时任总理的巴拉迪尔当总统。希拉克当选总统后，将"叛徒"萨科齐踢出内阁。此后，萨科齐曾担任过一段时间的保卫共和联盟的总书记和代理主席的职务。
在2002年的法国总统竞选中，萨科齐回到希拉克身边，为后者竞选连任东奔西走。由保卫共和联盟以及其他右翼和中右翼党派组建的右翼统一大党---总统多数派联盟后更名为人民运动联盟，在立法选举中获胜。希拉克连任成功，萨科齐出任内政部长一职，他全力打击犯罪活动，牢牢抓住媒体注意力。法国媒体曾用"安心睡吧，他在守护着你"的溢美之词，来为萨科齐唱赞歌。
2003年，在法国电视二台的"100分钟辩论"节目中，主持人问萨科齐："财政部长洛朗·法比尤斯曾承认自己刮胡子时都想着总统竞选，你是否如此?"他答道："我不只是刮胡子的时候想。"他还影射年事已高的希拉克应该"给年轻人让路"。2004年3月的政府改组中，萨科齐被任命为政府国务部长兼经济､财长和工业部长，成为内阁中地位仅次于总理的第二号实力人物。
2005年5月，希拉克因全民公决《欧盟宪法条约》失败而更换内阁总理，萨科齐的地位未变､继续担任政府国务部长并兼任内政部长，他在当年年底发生的"巴黎郊区骚乱"中采取铁腕政策，很快平息了席卷全国的动乱，显示了其治理国家的魄力和才能。凭着十足的人气和果敢的作风，萨科齐在今年1月当选人民运动联盟唯一的总统候选人。
"默克尔式"外交
对于法国以外的世界来说，萨科齐时代的法兰西将采取哪些外交政策尤为引人注目。张祖谦认为，和前任希拉克相比，萨科齐在外交政策上的最大变化就是对美政策。
去年9月，萨科齐以法国内政部长的身份赴纽约参加"9·11"事件纪念大会，极力称赞了麦当娜､海明威､好莱坞电影､美国的科学研究，甚至对美国的移民政策也大加赞赏。
在此次总统竞选中，萨科齐表示自己当选后将与美国建立"深厚､真诚､坚定"的伙伴关系。作为战后60年来第一个"拥抱美国"的法国重量级政治人物，萨科齐希望修复跨大西洋两岸的关系。当然，萨科齐的"亲美"是"适可而止"的，正如他自己所说："法国是美国的朋友。但作为朋友，也有行动的自由。"
不过有专家指出，萨尔科齐所谓的"崇美"，其实是着眼于更广泛的盎格鲁-萨克逊发展模式，说到底还是几百年来的法英竞争情结。这里的背景是二战后法国推行高度国家干预的资本主义，出现所谓"30年光荣"，法国经济获得相对高速发展，终于在1964年在GDP总值上超越了英国而扬眉吐气。可是英国经过撒切尔夫人时代的改革，于1990年代中期在GDP总值上重新追上了法国。萨尔科齐的真正意愿，是要借鉴英美模式，再次树立法国在经济上的领先地位。
至于对华政策，张祖谦认为萨科齐的做法会类似德国女总理默克尔的方式---重视对华关系，但前提是不能影响和美国的关系。例如，在欧盟对华军售解禁问题上，尽管萨科齐承认中国人权状况已经发生很大变化，但他认为军售解禁作为一个具有特殊意义的问题，现在讨论尚为时过早，目前不支持解除对中国的武器禁运。事实上，欧盟大国之所以如此，主要还是看美国的脸色。
萨科齐是一个对中国抱有特殊感情的法国政客，他称中国"是一个重要的国家"，甚至是"极其重要的国家"。此次竞选法国总统，萨科齐首开先河地面向华裔选民开设了中文竞选视频网站。萨科齐承诺说，自己当选后将会推出打击犯罪､降低税收､改善经商环境等华人华侨最关心的政策。
事实上，萨科齐在巴黎有一个30多年的华人朋友何福基，在后者的推动下，萨科齐与法国华人华侨关系还不错，并于1991､1995和2004年三次访问中国。
第一次访华时的中法关系正处于危机余波中，可见萨科齐的政治魄力。第二次访华是萨科齐支持巴拉迪尔竞选总统失败后，处于最孤独时。事后他表示："我是中国人民的朋友，对中国怀有深厚的感情。感谢中国政府在我仕途处于最困难､思想最低落时，邀请我访问中国。"第三次赴华是以法国政府第二把手､执政党主席的身份前往北京，与胡锦涛主席进行了深入交谈。
特异基因 篇4
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试水稻材料包括抗性品种Fukei 138 (藤系138) ;感病等位基因亲本材料9311;Fukei 138 (藤系138) 与9311杂交获得的F1代材料;生产上常用骨干亲本材料培矮64S、广占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级巴斯玛蒂、盐稻4号、R1128。
1.2 引物设计
本研究在2对交叉引物PCR (PCR with confronting twopair primers, PCR-CTPP) 方法的基础上加以改进创新, 通过在内引物倒数第3位引入错配碱基, 开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的共显性标记, 如图1所示, 通过设计4条引物 (PF、PR、NF、NR) 并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增, 引物详细信息见表1, 根据扩增条带类型鉴定基因型。
1.3 PCR扩增
PCR反应体系为15μL, 含1.5μL 10×Buffer, 1.0μL d NTPs (10 mmol/L) , 4条引物PF、PR、NF与NR各为0.1μmol/L;Taq酶0.2μL (5 U/μL) , 1.0μL模板DNA (50 ng/μL) , 其余用dd H2O补齐;PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 共35个循环;72℃延伸5 min, 扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳, 用凝胶成像仪扫描记录结果。
2 结果与分析
2.1 序列比对及标记开发
对Pi35来源材料的Pi35编码区的等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序, 将获得序列首先与包含感病等位基因的材料日本晴及9311的对应序列进行比对, 对于具有差异序列的位点再利用包含其余3个等位基因的材料进行测序比对确认, 最终在Pi35基因3780T处获得1个Pi35特异性SNP位点, Pi35等位基因型为T碱基, 其余基因型均为G碱基。因此, 通过设计特异性引物对该SNP位点特异性扩增即可实现Pi35等位基因的鉴定。
引物设计原理如下 (图1) :在设计T型等位基因鉴定引物时, 根据PCR-CTPP方法原理, 首先在该SNP位点上游设计正向引物PF (表1) , 以该SNP位点的T碱基的互补碱基A作为3′端在该位点设计反向引物PR, PR的3′端的A碱基与T型等位基因材料正常结合扩增而与G型材料形成A/G错配无法扩增。同理, 按照上述思路开发出扩增G型等位基因材料的NF与NR, 试验结果表明, NF与NR在T型材料中也有较微弱的扩增, 因此为增强该引物特异性在NF的倒数第3位引入了一个错配碱基A增强其特异性, 结果表明该引物只有与G型等位基因材料扩增时有1条266 bp条带, 与T型材料没有条带扩增;4条引物名称、序列及扩增片段长度如表1所示。
2.2 供试材料Pi35基因型鉴定
利用Pi35-PF、Pi35-PR、Pi35-NF、Pi35-NR鉴定Fukei138 (藤系138) 、9311、Fukei 138 (藤系138) 与9311杂交获得的F1代材料、生产上常用骨干亲本材料培矮64S、广占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级巴斯玛蒂、盐稻4号及R1128。结果显示纯合Pi35基因型材料可以扩增出535 bp和317 bp 2条条带, 杂合Pi35基因型材料扩增出535 bp、317 bp和266 bp3条条带, 不含Pi35基因的材料只有535 bp和266 bp 2条条带 (图2) 。对扩增产物测序的结果表明, 该标记引物可以准确地鉴定水稻材料中的Pi35基因型。
注:M为DL2000 DNA marker;其中泳道1为Fukei 138 (藤系138) ;泳道2为Fukei 138 (藤系138) 与9311杂交获得的F1代材料;泳道3为9311;泳道4~16分别为培矮64S、广占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级巴斯玛蒂、盐稻4号、R1128。
3 结论与讨论
利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因, 培育广谱、持久抗性水稻品种是解决水稻稻瘟病抗性问题的最佳途径。紧密连锁的分子标记存在交换的可能, 不能完全准确地鉴定水稻材料中的抗性基因, 因此开发适合分子育种需要, 能够高通量、低成本检测抗病基因的基因内功能标记成为当务之急。马建等[3]开发的Pi35-d CAPS标记能够准确鉴定水稻材料中是否含有Pi35基因, 但是需要对水稻材料DNA扩增后进行酶切才能判定目标基因型。本研究开发的Pi35基因内特异性共显性SNP分子标记可以直接通过鉴定PCR产物判定目标材料的基因型, 无需酶切, 检测准确率100%, 不仅可以判断目标材料是否含有Pi35基因, 还可以检测出目标材料的基因型是杂合还是纯合[4,5,6]。该标记具有高通量、低成本的优点, 适合分子育种材料的大批量检测, 为水稻抗稻瘟病育种提供了便利。
摘要：Pi35是具有广谱持久抗性的水稻抗稻瘟病基因, 在水稻抗病育种中具有重要作用。通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到1个Pi35基因内特异SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物研究结果表明, 利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增, 可快速判断待测水稻Pi35的基因型。该方法简便快速、成本低廉, 可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。
关键词：水稻,Pi35基因,特异SNP,共显性分子标记
参考文献
[1]雷财林, 凌忠专, 王久林.水稻抗病育种研究进展[J].生物学通报, 2004 (39) :4-7.
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[3]马建, 马小定, 赵志超, 等.水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子标记的开发及应用[J].作物学报, 2015, 41 (12) :1779-1790.
[4]易怒安, 李魏, 戴良英.水稻抗稻瘟病基因的克隆及其分子育种研究进展[J].分子植物育种, 2015, 13 (7) :1653-1659.
[5]邢鹏, 张幸, 李冬梅.稻瘟病抗性基因在主要育种亲本中的分步研究[J].分子植物育种, 2015, 13 (3) :505-512.
特异基因 篇5
水稻花药绒毡层特异表达基因RA39的克隆与表达特性分析
利用cDNA减法杂交、差异杂交筛选和RACE等技术,从水稻(Oryza sativa L. ssp. japonica)中克隆了一个新的绒毡层特异性cDNA,其编码基因被命名为RA39.该cDNA长1 013 bp, 编码由298个氨基酸残基组成的多肽.RA39是一个单拷贝基因,在绒毡层细胞中特异性表达,在小孢子母细胞减数分裂期的绒毡层细胞中有较高的`表达活性.用PSORT和PPSEARCH软件进行的结构分析揭示出RA39蛋白的N端是一个由17个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白包含一个跨膜区和一个胞质尾区两个主要结构域以及多个蛋白激酶的磷酸化位点.
作 者：丁兆军 吴孝槐 王台 DING Zhao-Jun WU Xiao-Huai WANG Tai 作者单位：中国科学院植物研究所,北京,100093刊 名：植物学报 ISTIC SCI英文刊名：ACTA BOTANICA SINICA年，卷(期)：200345(2)分类号：Q943.2关键词：水稻 花药 绒毡层特异表达基因 rice anther tapetum-specific gene
特异基因 篇6
1 材料与方法
1. 1 主要试剂
p UC57 载体( SD1176 ) ,南京金斯瑞生物公司生产; 限制性内切酶SalⅠ( 1080A) 、XhoⅠ( 1094A) 、r Taq DNA聚合酶( R10T1 ) 和p MD18 - Simple载体( D103A) 、Tran2Blue感受态细胞( CD411) ,宝生物工程( 大连) 有限公司生产; p BC - 1 载体,吉林大学提供; 质粒小提试剂盒( DP1001) ,Bioteke公司产品; Gel Extraction Kit胶回收试剂盒( D2500 - 01 ) 、无内毒素质粒小提试剂盒( D6950 - 01) ,Omega公司生产; 限制性内切酶NotⅠ( ER0595) ,Thermo科技公司生产。
1. 2 甜味蛋白Brazzein基因的人工合成
根据Gen Bank中甜味蛋白Brazzein基因的mRNA序列( A95587) ,由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成甜味蛋白基因- p UC57 质粒,将其命名为ST - p UC57。
1. 3 引物的设计
根据Gen Bank中甜味蛋白Brazzein基因的mRNA序列( 登录号为A95587) 设计特异引物,用Premier Primer 5. 0 生物软件对引物进行分析,确定引物的特异性,并且分别在上、下游引物的5'端引入SalⅠ酶切位点( 下画线部分) ,引物序列为TP - 1 5' -GTCGACATGGCTAAGTTTGCTTCT - 3',TP - 2 5' -GTCGACTTAGTATTCGCAGTAATC - 3'。
1. 4 甜味蛋白Brazzein基因的扩增
以ST - p UC57 质粒作为模板,TP - 1 与TP - 2为引物,利用r Taq DNA聚合酶进行梯度PCR扩增,分别选择51. 7 ℃、52. 6 ℃、53. 6 ℃、54. 0 ℃、54. 5 ℃和55. 6 ℃为梯度PCR的退火温度。对目的条带进行胶回收,并连接到p MD18 - Simple载体上,命名为STP - p MD18 - Simple。将STP - p MD18 - Simple转染至Tran2Blue感受态细胞中,挑出白斑进行阳性克隆鉴定。利用质粒小提试剂盒提取质粒后用SalⅠ酶进行单酶双酶切和PCR扩增鉴定,并将阳性质粒送交上海英骏生物科技有限公司测序,再利用Premier Primer 5. 0 和DNAMan软件对DNA序列进行分析。
1. 5 甜味蛋白Brazzein基因真核表达载体的构建
利用SalⅠ酶对STP - p MD18 - Simple进行单酶切、双酶切,并用Gel Extraction Kit胶回收试剂盒进行胶回收,以获得甜味蛋白Brazzein基因片段。根据限制性内切酶SalⅠ与XhoⅠ为同尾酶的特性,用XhoⅠ酶单酶切乳腺特性载体p BC - 1 以获得线性化乳腺特性载体p BC - 1。将甜味蛋白Brazzein基因和线性化的p BC - 1 载体进行连接转化后获得乳腺特异的甜味蛋白Brazzein基因真核表达载体,命名为STP - p BC - 1。
1. 6 STP - p BC - 1 质粒的鉴定
利用Premier Primer 5. 0 软件设计2 对引物,序列为: 第1 对引物ST - 1 5' - CCTGGAAGCATGGAGTCT - 3',ST - 2 5' - GAGTTAGTATTCGCAGTAATCG - 3';第2 对引物ST - 3 5' - TTTCCTCATCTTCCCATTCA - 3'和ST - 4 5' - CAGAAGTTAAACAGCACAGT - 3'。当甜味蛋白Brazzein基因与p BC - 1 载体正向连接时,则可用引物ST - 1 与ST - 2 通过PCR扩增得到404 bp的片段; 当p BC - 1 载体发生自连接,则用ST - 3 与ST - 4 引物扩增得到104 bp的片段; 若有外源基因插入,则可扩增得到370 bp的片段。利用XhoⅠ和NotⅠ对STP - p BC - 1 进行单酶切鉴定,对PCR以及酶切鉴定结果正确的重组质粒STP - p BC - 1 进行测序。
2 结果
2. 1 甜味蛋白Brazzein基因的扩增结果
以甜味蛋白的ST - p UC57 质粒为模板,TP - 1与TP - 2 为引物进行梯度PCR扩增,结果表明,当退火温度在51. 7 ~ 55. 6 ℃时,其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,在约260 bp处均可观察到目的条带,见图1。
M.DL-2 000 Marker;1~6.51.7,52.6,53.6,54.0,54.5,55.6℃。
2. 2 STP - p MD18 - Simple的酶切与PCR鉴定结果
将上述PCR扩增产物连接到p MD18 - Simple载体上,获得STP - p MD18 - Simple重组质粒; 用限制性内切酶SalⅠ对STP - p MD18 - Simple进行单酶双酶切,获得与预期结果相一致的约为260 bp与4 500 bp的特异条带,见图2。
M.DL-2 000 Marker;1.重组质粒酶切鉴定结果。
以重组质粒STP - p MD18 - Simple为模板的PCR鉴定结果表明,约在260 bp处观察到与目的条带相一致的条带,见图3。
2. 3 甜味蛋白Brazzein基因的序列分析
对重组质粒STP - p MD18 - Simple进行测序后,采用DNAMan软件进行序列分析,结果表明,克隆获得的甜味蛋白Brazzein基因与Gen Bank中序列同源性为100% ,见图4。
2. 4 STP - p BC - 1 的酶切与PCR鉴定结果
将STP - p BC - 1 用NotⅠ 和XhoⅠ 进行双酶切后,获得与NotⅠ酶切相一致的约为22 000 bp的条带,见图5。引入SalⅠ位点的STP - p BC - 1 用XhoⅠ酶进行酶切后,得到与STP - p BC - 1 相一致的约22 000 bp的条带,见图6。对重组质粒STP - p BC -1 进行PCR鉴定,当以ST - 1 与ST - 2 为引物,扩增得到显示甜味蛋白基因与p BC1 载体正向连接的约为404 bp的片段; 当以ST - 3 与ST - 4 为引物,扩增得到显示外源基因插入的约370 bp的片段,见图7。将STP - p BC1 经测序显示与预测值相符。
M.DL-2 000 Marker;1.重组质粒PCR鉴定结果。
3 讨论
由于甜味蛋白以其具有的特性备受关注。为了人工获取大量的甜味蛋白,最近几年,广大学者探讨了采用转基因技术获取该蛋白的方法。自M. Witty[4]首次获得转甜味蛋白ThaumatinⅡ基因的马铃薯植株以来,已先后获得转甜味蛋白Thaumatin基因的马铃薯植株、转甜味蛋白Thaumatin基因的烟草植株等,并在一定程度上改变了相应植株的风味,但是从这些植株中未能提取到相应的甜味蛋白。
M.1 kb Ladder Marker;1.NotⅠ酶切鉴定结果;2.STP-p BC-1质粒。
M.1 kb Ladder Marker;1.XhoⅠ酶切鉴定结果;2.STP-p BC-1质粒。
由于Brazzein具有甜度高且与糖类的甜味相似,因此,甜味蛋白可广泛应用于不易摄取糖类的患者,或可应用于新型的绿色食品添加剂。为了建立获取大量Brazzein的方法,张咏春等[5]采用转基因技术,探索了利用大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌表达Brazzein的方法,但未能获得理想的效果。另据张菲菲[6]报道,将Brazzein基因导入人参后,可改善人参果果实的味道; 此外,赵红玲等[7]将Brazzein基因转入毕赤酵母中,并获得了具有甜味的产物。上述结果表明,采用合理有效的转基因技术,可人工获得甜味蛋白。
M.DL-2 000 Marker;1.ST-1和ST-2为引物的PCR产物;2.以ST-3与ST-4为引物的PCR产物。
自K. Gordon等[8]通过转基因小鼠乳腺获得 β -酪蛋白以来,有关乳腺生物反应器的相关技术得到快速发展。Carver等通过乳腺表达系统,在羊乳腺中获得了抗胰蛋白酶( α1- antitrypsin) ; Ludger等利用转基因动物乳汁成功提取到双特异性抗体。上述结果表明,乳腺生物反应器是比较成熟的生产高价值蛋白的一项新技术。迄今为止,尚未见到有关Brazzein在动物乳腺中表达的相关报道。为了建立通过山羊乳汁获取大量Brazzein的方法,本研究在人工合成Brazzein基因的基础上,利用乳腺特异表达的p BC - 1载体,构建Brazzein基因的真核表达载体,并进行PCR和酶切鉴定,结果表明,所合成的Brazzein基因与Gen Bank中的序列的同源性为100% 。经酶切和PCR鉴定,构建的克隆载体STP - p MD18 - Simple正确。将Brazzein基因和p BC1 载体连接后,经PCR和酶切鉴定,结果表明,成功构建了甜味蛋白Brazzein基因的乳腺特异性表达载体STP - p BC1。
自I. Wilmut等[9]成功克隆出世界上首例体细胞核移植后代“多莉”以来,体细胞克隆技术得到快速发展,体细胞克隆牛、猪、山羊、犬和猫等相继获得成功。自A. E. Schnieke等[10]首次以转染外源DNA的绵羊成纤维细胞为核供体,通过细胞核移植方法成功地获得了转基因绵羊以来,利用该方法已相继获得转基因牛[11]、猪[12]和山羊[13]。能否将上述构建的STP - p BC1 转染山羊体细胞后,并通过体细胞核移植的方法获得特异乳腺表达Brazzein的转基因山羊有待于进一步探讨。
摘要：为了建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法,研究在人工合成甜味蛋白Brazzein基因的基础上,利用乳腺特异表达的pBC-1载体,构建Brazzein基因的真核表达载体。结果表明:所合成的Brazzein基因与GenBank中Brazzein序列的同源性为100%,构建的克隆载体STP-pMD18-Simple正确;将甜味蛋白Brazzein基因与pBC-1载体连接后,成功构建甜味蛋白Brazzein基因的乳腺特异性表达载体STP-pBC-1。
特异基因 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
限制性内切酶、DNA连接试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自Takara公司;MDA-MB-453细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库;RPMI-1640培养基、DEPC、Trizol总RNA提取剂为Invitrogen公司产品;体外转录试剂盒为promage公司产品。
1.2 方法
1.2.1 核酶的设计
用计算机人工设计HER-2特异性核酶。选择HER-2m RNA基因序列 (NM-004448) 第2502位点的GTT为核酶切割位点, 在核酶基因序列两端分别加上Bam HⅠ和Eco RⅠ限制性内切酶位点及保护碱基。以核酶基因的非模板链为HA链, 模板链为HB链, 经设计后的核酶基因序列共58bp。
1.2.2 核酶基因的合成
设计核酶基因HA链和HB链, 并由上海生物工程技术服务有限公司合成, 取50μL A、B链混合经95℃加热变性5min, 逐渐冷却到室温, 退火形成互补双链, 命名为RZ基因。
1.2.3 核酶基因重组子的构建及鉴定
RZ基因与pc DNA3.1 (+) 载体Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切消化, 并经凝胶回收。将RZ基因和pc DNA3.1 (+) 载体按摩尔比10∶1混合进行连接反应后, 转化入大肠杆菌JM109, 挑取单个菌落提取质粒, 应用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切初步鉴定, DNA测序鉴定重组子。
1.2.4 核酶靶基因HER-2重组子的构建及鉴定
MDA-MB-453细胞悬浮生长于10%小牛血清的RPMI-1640培养基中 (含100U/m L青霉素, 100U/m L链霉素) , 37℃, 在体积分数为5%的CO2中培养。Trizol试剂提取细胞总RNA。利用Primer Premier 5软件设计引物。上游引物:5'-GAATTCCGGCACAGTCTACAAGGGCATC-3';下游引物:5'-GGGGTACCCCAGGCGTCCGCGGTTT-3'。RT-PCR扩增靶基因HER-2 c DNA片段, 也将其插入载体pc DNA3.1 (+) , 重组子经PCR反应后电泳及测序鉴定。
2 结果
核酶基因真核表达载体的鉴定:
2.1 酶切鉴定
应用Bam HⅠ, Eco RⅠ双酶切载体, 室温, 2.0%琼脂糖凝胶, 80V, 电泳30min。电泳未见到<100bp的小片段。结果见图1。
2.2 核酶基因真核表达载体DNA测序鉴定
将构建出的载体进行DNA测序分析, 由上海生物工程公司测定。所合成的核酶基因序列正确, 并已被准确地克隆入pc DNA3.1 (+) 的Bam HⅠ和Eco RⅠ两个酶切位点之间, 该序列于T7启动子的下游。结果见图2。
3 讨论
核酶是一类具有催化活性的RNA分子, 本实验采用锤头状核酶。锤头状核酶能与特异性的HER-2靶基因结合, 并且能切割HER-2靶基因, 因此具有较强的抑制效率。锤头状核酶分子较小, 结构简单, 其催化活性中心只含有13个保守序列, 加上两端与靶基因结合的结合臂, 即组成了与靶基因GUC序列结合的具有催化活性的核酶, 广泛应用于基因治疗领域[5,6,7,8]。由于核酶的本质是RNA, 在细胞内不稳定, 易被细胞内的RNA酶降解, 本实验构建稳定而高表达的核酶载体成为发挥核酶较强抑制效率的首要步骤。所构建核酶的靶基因载体, 在体外检测RZ活性及最佳反应条件, 能增大其在体内发挥作用的可能性, 保证为催化切割靶基因提供基本条件。
本实验RZ切割位点是根据毕锋等[9]设计的HER-2特异性核酶切割位点设计的, 在基本核酶序列两端加入Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切位点, 定向插入pc DNA3.1 (+) 载体的T7启动子下游, 这样核酶基因既能在真核细胞中表达又能在原核细胞中表达, 便于核酶基因的扩增及细胞转染的研究。本实验构建的RZ表达载体, 结果有效表达, 可用于后续的体外转录及体外切割活性实验, 以便提供核酶的体外切割活性及最适反应条件, 为下一步研究核酶在细胞内发挥较强抑制作用提供了可能性。
摘要：目的 构建人表皮生长因子受体-2 (HER-2) 特异性核酶 (ribozyme, RZ) 体外表达载体的建立。方法 设计合成RZ基因, 将该RZ克隆到真核表达载体pcDNA3.1 (+) 中, 测序鉴定。结果 经DNA测序分别证实合成的RZ基因序列克隆入pcDNA3.1 (+) 中。结论 构建HER-2特异性RZ真核表达载体有助于进一步研究RZ对靶基因切割作用及雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER-2信号转导.
关键词：人表皮生长因子受体-2 (HER-2) ,核酶
参考文献
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特异基因 篇8
近年来, 对肉品进行物种鉴别的方法有了长足的发展:从依据经验的肉眼鉴别, 到依据蛋白质的一系列方法 (如ELISA[1]、电泳[2]、色谱法[3]等) , 再到现今主要依据DNA进行鉴别的一系列方法 (如PCR[4,5]、测序[6]等) 。与蛋白质相比, DNA具有种内保守性高、种间特异性强等优点, 还具有较高的热稳定性, 其核苷酸序列不因环境和加工条件的影响而改变。在利用DNA进行鉴别的方法中, PCR方法特异性强, 操作简便, 反应迅速, 是快速检测的首选方法。
1 材料和方法
1.1 试验样品
海狸鼠肉, 取自河北省定州市海狸鼠养殖基地;绵羊肉, 河北衡水顺尧有限公司;山羊肉, 河北农业大学动物医学实验室提供;猪肉、鸭肉和鸡肉, 购自河北保定市农贸市场;蓝狐肉和水貂肉, 河北石家庄藁城市化泽牧业有限公司提供。
1.2 主要试剂
Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒, 购自生工生物工程 (上海) 有限公司;普通PCR反应用2×Es Taq Master Mix, 购自北京康为生物技术有限公司;DL-1 000 Marker, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
无水乙醇, 购自天津天利化学试剂厂;琼脂糖, 购自BIOWEST公司;TBE电泳缓冲液等, 自制。
1.3 DNA分析软件
采用NCBI的Primer-BLAST程序、Primer Premier 5.0、DNAMAN等。
1.4 引物的合成
参照从Gen Bank下载的海狸鼠Cyt B基因序列 (序列号为GI:23394303) 设计引物, 上游引物从621位点开始, 下游引物至925位点结束, 目标产物长305 bp。引物序列为:F 5'-CCCATCAGGACTCAACT-CA-3', R 5'-TATGGAGTAAGGGGAGTAGTAT-3'。引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。
1.5 DNA的提取
除对各物种常规肉样进行DNA提取外, 对海狸鼠样品另进行如下处理:1) 在待测肉组织样品中按1∶1、1∶10、1∶100的比例掺入玉米粉 (市购) ;2) 待测肉组织样品在100℃沸水中煮熟10 min;3) 待测肉组织样品在高压灭菌锅中经120℃加热20 min。
取各种肉样各1份, 用组织基因组DNA提取试剂盒分别提取DNA, 稀释后经紫外分光光度仪测得OD260/280值均在1.8~2.0之间, -20℃保存。
1.6 PCR检测
1.6.1 特异性检测
分别用特异性引物对各物种进行扩增。PCR反应体系 (20μL) :2×Es Taq MasterMix 10μL, 10μmol/L的引物F、R各0.5μL, 模板DNA 0.5μL, 去离子水8.5μL。PCR反应条件为:94℃5 min;94℃30 s, 58℃30 s, 72℃30 s, 共30个循环;72℃5 min。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果, 一律取3μL上样。
1.6.2 引物浓度的优化
PCR反应体系 (20μL) :2×Es Taq Master Mix 10μL, 10μmol/L的上、下游引物分别为0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2.0, 3.0μL (即上、下游引物的终浓度分别为0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.35, 0.50, 1.00, 1.50μmol/L) , 模板DNA0.5μL, 用去离子水分别补足至20μL。反应条件同1.6.1。
1.6.3 退火温度的优化
反应体系同1.6.1。反应条件:94℃5 min;94℃30 s, 55.0~61.0℃ (55.0, 55.4, 56.1, 57.2, 58.6, 59.8, 60.5, 61.0℃共8个梯度) 30 s, 72℃30 s, 共30个循环;72℃5 min。
1.6.4 Mg2+浓度的优化
PCR反应体系 (20μL) :2×Es Taq Master Mix (Mg2+浓度为3 mmol/L) 10μL, 25 mmol/L的Mg Cl2溶液体积设为0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2μL的梯度 (对应的反应体系中的Mg2+终浓度为1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 2.75, 3.00 mmol/L) , 10μmol/L的上、下游引物各1μL, 模板DNA 0.5μL, 用去离子水分别补足至20μL。反应条件同1.6.1。
1.6.5 灵敏性检测
取1.5中经过不同方法处理的样品提取的DNA进行灵敏性检测。PCR反应体系 (20μL) :2×Es Taq Master Mix 10μL, 浓度为10μmol/L的上、下游引物各1μL, 模板DNA 1μL, 去离子水7μL。反应条件同1.6.1。
2 结果与分析
2.1 最佳反应条件
2.1.1 不同引物浓度下的PCR检测结果
分别用终浓度为0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.35, 0.50, 1.00, 1.50μmol/L的引物对模板进行扩增, 结果见图1。
M.DL-1 000 Marker;1~8.引物浓度为0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.35, 0.50, 1.00, 1.50μmol/L;9.空白对照。
总体来说, 引物浓度越高, 扩增条带越亮, 但引物终浓度为0.25μmol/L扩增得到的条带亮度与更大浓度没有明显差别, 说明引物浓度对反应无明显影响, 推荐最优浓度为0.25μmol/L, 即在反应体系中分别加入浓度为10μmol/L的上、下游引物0.5μL。
2.1.2 不同退火温度下的PCR检测结果
分别用8个不同退火温度进行反应, 温度范围在55~61℃ (分别为55.0, 55.4, 56.1, 57.2, 58.6, 59.8, 60.5, 61.0℃) , 结果见图2。
M.DL-1 000 Marker;1~8.退火温度分别为55.0, 55.4, 56.1, 57.2, 58.6, 59.8, 60.5, 61.0℃。
由图2可见, 当温度达到60.5℃和61.0℃时, 扩增条带不如其他温度下的条带亮, 说明退火温度应在60℃以下。
2.1.3 不同Mg2+浓度下的PCR检测结果
在反应体系中加入不同浓度的Mg2+ (1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 2.75, 3.00 mmol/L) 进行扩增, 结果见图3。
由图3可见, Mg2+浓度对反应结果影响不大, 因此反应体系中不必额外加入Mg2+。
M.DL-1 000 Marker;1~7.Mg2+浓度分别为1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 2.75, 3.00 mmol/L;8.空白对照。
2.2 特异性和灵敏性检测
2.2.1 引物特异性试验结果
用海狸鼠特异性引物分别扩增绵羊、山羊、鸭、鸡、猪、海狸鼠、蓝狐和水貂的DNA, 空白对照用0.5μL H2O代替DNA模板, 结果见图4。
M.DL-1 000 Marker;1~8.分别为绵羊、山羊、鸭、蓝狐、水貂、猪、鸡、海狸鼠样品;9.空白对照。
由图4可见, 海狸鼠肉样品得到305 bp的目的条带, 其他7种肉样和空白对照无扩增产物, 说明此引物在8种动物中具有特异性。
2.2.2 不同模板稀释倍数
将用试剂盒提取的海狸鼠肉组织的基因组DNA分别稀释10、1×102、1×103、1×104倍, 得到的稀释模板用于PCR反应, 产物的电泳检测结果见图5。
由图5可见, 模板稀释1×102倍后仍有明显的扩增条带。
2.2.3 掺杂样品的检测
将海狸鼠肉组织样品与玉米粉混合, 混合比例为1∶1、1∶10、1∶100, 再用试剂盒提取基因组DNA用于PCR反应, 空白对照用1μL玉米粉提取的DNA代替模板, 产物的电泳检测结果见图6。
由图6可见, 肉组织中掺有大量玉米粉时仍能被检测出。
2.2.4 高温高压处理检测
将海狸鼠肉组织样品在100℃沸水中煮10 min, 再用试剂盒提取基因组DNA, 将得到的模板用于PCR反应, 空白对照用1μLH2O代替DNA模板, 产物的电泳检测结果见图7。
1~4.基因组DNA分别稀释1×104、1×103、1×102、10倍;5.未稀释的基因组DNA;M.DL-1 000 Marker。
M.DL-1 000 Marker;1~3.海狸鼠肉组织样品与玉米粉混合比例分别为1∶1、1∶10、1∶100;4.空白对照。
M.DL-1 000 Marker;1~3.分别为海狸鼠肉组织原样品、煮沸处理样品、高压处理样品;4.空白对照。
由图7可见, 扩增产物的亮度没有减弱, 说明高温对线粒体DNA不能造成大的损伤, 该方法依然灵敏。
将海狸鼠肉组织样品在高压灭菌锅中经120℃加热20 min, 其余步骤同高温处理, 产物的电泳检测结果见图7。
由图7可见, 扩增产物的亮度有所减弱, 但仍然有明显的条带, 可见经高压处理后的肉样仍能检测出DNA。
3 讨论
试验在设计引物时选用线粒体基因, 是因为其存在广泛, 拷贝数多, 结构简单、稳定。其中Cyt B基因是线粒体DNA中被研究最多的基因, 其核苷酸序列长1 140 bp, 编码379个氨基酸, 在不同物种间长度无明显差异。Cyt B基因起源古老, 进化速度适中, 在种属间存在多样性, 故适合作为物种鉴定的目标基因。有研究表明, 肉样在经过处理后 (如加热) , 基因会降解, 故应把扩增片段长度控制在600 bp以下[7]。本试验目标片段为305 bp, 可有效避免因模板降解严重造成的假阴性结果, 可用于对加工的肉制品的检测。结果表明, 将经高温和高压处理后的肉样提取DNA进行PCR扩增, 其灵敏度没有受到明显影响。在市场中进行肉样采集时, 难免会造成肉样污染, 本试验结果表明, 即使有大量的杂质也不会影响检测的灵敏性。
在反应条件优化试验中, 虽然退火温度在56℃左右扩增条带最亮, 但是为了减少非特异性扩增的可能, 推荐将反应的退火温度设置为58℃。这是由于在合理的退火温度范围内, 退火温度越高产生非特异性扩增的概率越小。
在肉样的物种鉴别工作中, 若鉴别物种侧重于目标肉样 (如牛肉[8]、羊肉) 的检测, 其缺点是当混合肉样中混有一定比例的目标肉样, 普通PCR方法便无法准确进行鉴别;利用混合原料肉样进行检测, 可有效避免假阴性结果的产生。之前已有研究人员对市场中常见的原料肉样进行检测, 如鸭肉、猪肉[9,10]等。海狸鼠作为混合肉的新原料, 开始逐渐出现在市场中;因此, 有必要对其进行特异性鉴定。本试验所设计的引物, 不仅可以将海狸鼠与目标肉样区分开来, 更能将其与常见的原料肉样进行鉴别。下一步的工作是建立其余几种新的原料肉样的鉴别方法, 如水貂、狐狸等。
本试验利用海狸鼠线粒体基因Cyt B设计引物, 建立了特异性检测海狸鼠肉的PCR方法。此方法成功地从海狸鼠基因中扩增出305 bp的目的片段, 通过条件优化, 得到了反应的最优方案:反应体系20μL, 其中模板DNA 1μL, 上、下游引物各0.5μL, 2×Es Taq Master Mix 10μL, 水8μL。反应条件为94℃5 min;94℃30 s, 58℃30 s, 72℃30 s, 共30个循环;72℃5 min。本方法反应迅速, 灵敏度高, 操作简便, 适合用于海狸鼠肉的快速检测鉴定。
摘要：为了建立可以快速对海狸鼠肉进行鉴别的特异性PCR方法, 试验采用线粒体Cyt B基因序列设计引物, 对海狸鼠肉进行特异性扩增, 并对此PCR方法进行条件优化。结果表明:海狸鼠可扩增出305 bp的条带, 且对其他常见物种无反应;引物浓度、退火温度和Mg2+浓度对反应结果影响不大;当模板稀释100倍时仍有清晰条带;对肉品进行高温高压处理以及掺杂处理均不影响扩增结果。说明此方法可以应用于海狸鼠的物种鉴别。
关键词：CytB基因,PCR方法,海狸鼠肉,物种鉴别,线粒体
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特异基因 篇9
Tet-on基因表达系统由1995年Gossen和Bujard等建立,该系统在诱导物如多西环素(doxycycline)的作用下,rt TA调控元件和四环素相应元件TRE特异结合,启动下游目的基因的表达,在无诱导物时则不能启动下游基因的转录[1]。具有严密性、特异性、高效性等优点[2,3,4,5,6,7,8,9]。
原核显微注射法是目前制备转基因小鼠最常用的方法之一。将目的基因注入小鼠受精卵原核,然后移植于假孕的母鼠输卵管或子宫中,培育得到转基因小鼠。1980年底Gordon等人培育出第一个转基因小鼠[10]。
乳腺癌是近年来女性中发病率最高的恶性肿瘤,每年约有40万患者死于乳腺癌,且发病率每年都呈上升趋势[11]。目前针对乳腺癌的研究已取得很多进展,但其发病机制仍未明确。小鼠乳腺肿瘤病毒MMTV(Mouse Mammary gland Tumor Virus)是在小鼠乳腺中特异表达的启动子。1988年Leder[12]实验室创建了第一个在MMTV驱动下表达激活的大鼠neu(NEU-NT)的ERBB2转基因小鼠乳腺癌模型MMTV-NEU-NT,该模型提出乳腺表达激活了的大鼠neu可能是其转变为乳腺癌的关键因素。此后,MMTV被用来建立了许多乳腺癌模型,如MMTV-Ras,MMTV-myc,MMTV-Wnt等[13]。
CUEDC2(CUE domain containing protein 2)是含有CUE结构域的蛋白质。CUE结构域是一个大约含有40个氨基酸的保守序列,能识别细胞内的单泛素和多泛素。在本实验室的前期工作研究中,发现CUEDC2能够促进孕激素受体PR的泛素化降解,参与乳腺癌细胞生长和增值的信号调控[14],这为乳腺癌的治疗提供了新的思路。本实验室在最近的研究中,通过对449例乳腺癌临床标本分析发现,CUEDC2在乳腺癌中高表达,并可作为分子标志物进行乳腺癌内分泌治疗的预后判断[15]。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒p3xflag-CMV和pF43为本实验室保存。
MCF7-rtTA+细胞为本实验室保存,用含有10%小牛血清的DMEM培养基培养。
诱导剂多西环素片(Doxycycline)为江苏正大丰瑞有限公司生产。限制性内切酶购自NEB公司。质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、逆转录试剂盒均购自Promege公司。PCR引物由上海英骏生物技术有限公司(北京合成部)合成。细胞转染采用LipofectAMINE 2000转染试剂,按说明书操作。
抗体除实验室自制,均来自Santa Cruz公司。
转基因小鼠在SPF级动物房由专人饲养,使用IVC动物笼具-小鼠独立通风式正压/负压饲养系统。温度(25±1)℃,相对湿度(70±4)%。笼具、垫料、饮水瓶均经高压处理。转基因小鼠均来源于美国Thomas Jefferson大学Kimmel Cancer Center和The Jackson Laboratory。
1.2 质粒p F43-3xFlag-CUEDC2的构建
人的CUEDC2基因通过PCR的方法从人乳腺文库中扩增出,含酶切位点的特异性引物为Cue F5、Cue Tg3(Cue F5:CCCAAGCTTGAGCTGGAGAG-GATCGTC,CueTg3-GCTCTAGATCAATGGAAGCGG-TACTTTC)。用HindⅢ、XbalⅠ双酶切PCR产物和载体3xFlag-CMV(如图1-A所示),然后用DNA连接酶连接以得到3xFlag-CUEDC2重组质粒并送至英骏生物技术有限公司测序。
用PCR方法从3xFlag-CUEDC2重组质粒上扩增出带酶切位点的3xFlag-CUEDC2片段。引物为CueTg5、CueTg3(CueTg5:TCCCCGCGGATGGACTA-CAAAGACCATGAC,CueTg3:GCTCTAGATCAATG-GAAGCGGTACTTTC)。用SacⅡ、XbalⅠ双酶切PCR产物和载体pF43(如图1-B所示),连接得到pF43-3xFlag-CUEDC2重组质粒(如图1-C所示),酶切鉴定质粒是否构建成功(内切酶为NotⅠ、XbalⅠ、PvuⅠ)。
1.3 质粒p F43-3xFlag-CUEDC2表达检测
将MCF7-rt TA+接种于六孔板的两个孔中,培养12 h(细胞密度达到80%左右)后向两个孔中分别转染p F43-Vector和p F43-3xFlag-CUEDC2。转染后6 h更换新鲜培养基并加入已无菌过滤的doxycycline(终浓度为2 mg/m L)。24 h后收集并裂解细胞(蛋白酶抑制剂混合液,20 mmolTris-Hcl pH8.0,150 mmolNacl,1 mmolEDTA,1 mmolDTT,0.1%NP-40,10%甘油)。Western Blot检测分析一抗Flag,二抗为羊抗鼠二抗。
1.4 显微注射用线性DNA的制备
质粒pF43-3xFlag-CUEDC2用限制性内切酶NotⅠ、XbalⅠ酶切,1%的琼脂糖凝胶电泳,在长波紫外灯下含切取目的DNA片段的胶块,用凝胶回收试剂进行回收。-20℃保存。
1.5 CUEDC2转基因小鼠的制备与检测
此部分工作由美国Thomas Jefferson大学Kimmel Cancer Center动物实验中心完成。PCR检测其基因型,(引物为CueTg5、CueTg3。反应参数:94℃预变性3 min后进入循环,94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30个循环,最后延伸7 min)得到3个Founder:耳号分别为998,999,1 000。得到的Founder小鼠和FVB野生型小鼠交配三代以上,以检测CUEDC2是否稳定整合到基因组中并能稳定传代。经实验分析,Founder YU998、YU999可以稳定遗传给后代,而Founder YU1000在两代后CUEDC2基因信息丢失。
1.6 获得CUEDC2/MMTV-rtTA转基因小鼠
将CUEDC2转基因小鼠与MMTV-rtTA转基因小鼠交配得到CUEDC2/MMTV-rtTA双阳性转基因小鼠,PCR检测其基因型,鉴定出CUEDC2,rt TA均为阳性的小鼠。
1.7 Western blot检测
组织中蛋白的提取:CUEDC2/MMTV-rtTA转基因小鼠、同窝单阳性(CUEDC2、rt TA)转基因小鼠做对照组,在其怀孕14 d时,以2 mg/m L的Doxycycline通过饮水给药,诱导7 d。同时设不诱导的CUEDC2/MMTV-rtTA转基因小鼠对照组。在临产前取回,CO2处死取乳腺。向一个完整的乳腺中加入1 m L的组织裂解液(蛋白酶抑制剂混合液,50 mmol Tris-Hcl pH 7.5,150 mmol NaCl,1 mmol PMSF,1 mmol Na4VO3,1 mmol DTT,1%NP-40,0.5%sodium deoxycholate,0.1%SDS,10%甘油)。匀浆并超声后置于4℃旋转混合仪中旋转20 min,于4℃,12 000 r/min离心20 min后取上清。取100μL上清做input,余下加入anti-Flag beeds,置于4℃旋转混合仪中旋转3 h后用wash buffer洗3次。离心弃上清后加入1×loading buffer,在沸水中煮样10 min。离心取上清做Western Blot。一抗为Flag,二抗为羊抗鼠二抗。
1.8 免疫组化检测
小鼠的诱导和乳腺的取得同本文1.7。乳腺组织用石蜡包埋后修快、切片,于42℃水中伸展切片后贴在预处理的玻片上烘烤。依次用二甲苯、梯度酒精、3%双氧水处理片子。封闭,加一抗CUEDC2(实验室自制#25-28)。4℃过夜,用增强剂处理后加二抗(鼠二抗)。最后加显色液,于显微镜下观察。
2 结果
2.1 质粒p F43-3xFlag-CUEDC2的构建
以3xFlag-CMV为原始质粒,按本文1.2方法进行。终质粒的酶切鉴定结果见图2。结果表明3xFlag-CUEDC2已正确克隆到pF43中。
2.2 质粒p F43-3xFlag-CUEDC2的表达检测
将待测质粒p F43-3xFlag-CUEDC2与对照组质粒p F43-vector转染MCF7-rtTA+细胞。用Western Blot检测。结果如图3所示,在2μg/m L的Doxycycline的诱导下,p F43-3xFlag-CUEDC2成功表达3xFlag-CUEDC2。
2.3 CUEDC2转基因小鼠的检测
CUEDC2转基因小鼠共得到3个Founder。PCR检测其基因型。所用引物为CueTg5:TC-CCCGCGGATGGACTACAAAGACCATGAC,CueTg3:GCTCTAGATCAATGGAAGCGGTACTTTC。结果如图4所示。得到阳性小鼠3只:998,999,1 000。
2.4 CUEDC2/MMTV-rtTA转基因小鼠的检测
Founder 999,Founder 998的CUEDC2转基因小鼠与MMTV-rtTA转基因小鼠交配得到CUEDC2/MMTV-rtTA转基因小鼠。PCR检测基因型。Founder 1 000不能将转基因CUEDC2稳定遗传给后代。PCR引物为CueTg5 CueTg3、rt TA-5,rt TA-3。
(CueTg5:TCCCCGCGGATGGACTACAAAGAC-CATGAC,CueTg3:GCTCTAGATCAATGGAAGCGG-TACTTTC,rt TA-5:ACTAAGTCATCGCGATGGAGCA,rt TA-3:CTCGATGGTAGA CCCGTA ATTG)。结果如图5所示。Founder 998的子代130、137、139、094及Founder 999的子代112、140、141、144、146、147、149、150、153为CUEDC2,rt TA双阳性转基因小鼠。
A—Founder 998,B—Founder 999,M—Marker 200
2.5 Western blot检测转基因小鼠乳腺CUEDC2
的表达
131、112是来源于Founder 998的F2代CUEDC2/MMTV-rtTA转基因小鼠,132、130是同窝的CUEDC2、rt TA单转基因小鼠。将130、131、132通过饮水给予2 mg/m L的Doxycycline。140、141是来源于Founder 9998的F4代CUEDC2/MMTV-rtTA转基因小鼠,142,143是同窝的CUEDC2、rt TA单转基因小鼠。将140、142、143通过饮水给予2 mg/m L的Doxycycline。诱导7 d后处死取乳腺。提取组织蛋白做Western blot。结果如图5所示。
A—Founder 998,B—Founder 999
只有112、140这两只给药的CUEDC2/MMTV-rt TA双阳性转基因小鼠乳腺表达3xFlag-CUEDC2。说明Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC的转基因小鼠构建成功。
2.6 免疫组化检测转基因小鼠乳腺CUEDC2的表达
对Western blot所检测的小鼠取乳腺组织做免疫组化。结果如图6所示。只有112、140这两只给药的CUEDC2/MMTV-rtTA双阳性转基因小鼠的乳腺免疫组化结果为阳性。验证了Western blot的结果。
A—小鼠来源于Founder 998,B—小鼠来源于Founder 999
3 结论
本课题通过显微注射的方法,构建了Tet-on系统诱导的乳腺特异表达的CUEDC2转基因小鼠模型。通过PCR、Western blot、免疫组化实验证明所构建的模型是成功的。
在最近的临床大样本研究中发现CUEDC2的表达与雌激素受体ER负相关,与Her2正相关,并与乳腺癌愈后生存相关。因此在今后的研究中可以基于本研究已经建立的CUEDC2过表达小鼠模型,结合Her2转基因成瘤模型,观察在小鼠乳腺中CUEDC2对Her2成瘤性的影响以及CUEDC2自身成瘤的可能性,从而阐明CUEDC2与Her2的关系及功能,探索CUEDC2对Her2诱发乳腺癌模型的影响,为进一步揭示CUEDC2的生物学功能奠定基础,也为完善针对Her2诱发乳腺癌治疗提供新的思路。
摘要：建立Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠模型,构建转基因表达载体,经细胞诱导表达验证后,酶切得到含有CUEDC2的线性DNA片段,并采用显微注射的方法及后续筛选鉴定,得到CUEDC2转基因小鼠。进而通过与乳腺特异表达的MMTV-rtTA转基因小鼠交配,得到CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠。利用2 mg/mL的多西环素(Doxycycline)诱导小鼠体内CUEDC2表达。通过Western Blot、免疫组化检测表达。结果表明经诱导CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠的2个Founder的F1、F2代在转录水平和蛋白水平均成功表达CUEDC2,并具有乳腺特异性。表明Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠制备成功。为后续CUEDC2的功能研究奠定了技术基础。
特异基因 篇10
目前虽有利用植物生物反应器表达h IL-12的报道,但是表达量非常低[9,10]。有研究表明,对植物表达系统中驱动外源基因表达的启动子进行替换和改进,能有效提高外源基因的表达量[11]。在前期研究中,作者课题组克隆了马铃薯叶特异性启动子Prbcs并构建了其驱动的h IL-12表达载体,将其导入马铃薯基因组后获得了阳性转基因植株[12,13]。因此,本研究接下来对阳性转基因马铃薯中h IL-12在RNA和蛋白水平的表达情况进行检测,为利用马铃薯高效表达生产h IL-12蛋白提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
转基因马铃薯材料由作者实验室前期研究获得[13]。
1.1.2 试剂
植物RNA提取试剂盒(Tiangen公司);c DNA制备试剂盒(北京博迈德公司);h IL-12抗体(Abcam公司);HRP标记二抗(碧云天公司);化学发光试剂盒(Bio-Rad公司);SDS-PAGE凝胶试剂盒(碧云天公司);h IL-12 ELISA试剂盒(上海生工公司)等。其它试剂为国产或进口分析纯。
1.1.3 仪器
PCR仪(Flex Cycler,德国JENA);凝胶成像系统(GELDOC XR,美国Bio-Rad);酶标仪(IMARK,美国Bio-Rad);蛋白质电泳设备及转印系统(美国Bio-Rad);化学发光成像仪(Chemidoc Touch,美国BIO-RAD);台式高速冷冻离心机(PRIMO R,美国Thermo Fisher);超净工作台(BCM-1300A,苏净安泰空气技术有限公司);人工气候箱(XL-250BS/H-Ⅲ,馨郎科技有限责任公司)。
1.1.4 培养基
马铃薯无性繁殖及试管薯诱导培养基参考文献[13]。
1.2 方法
1.2.1 h IL-12在转基因马铃薯中RNA水平的表达检测
利用植物RNA提取试剂盒,按照操作说明提取马铃薯块茎总RNA,反转录获得c DNA。反转录体系和过程如下:总RNA 2μg,oligo(d T)(100 ng/μL)1μL,5×buffer 4μL,d NTP(10 mmol/L)2μL,RNase inhibitor 20 U,反转录酶M-MLV 1μL,加DEPC处理水至20μL,42℃反应1 h后,-20℃保存备用。以c DNA为模板,以启动子引物[12]Prbcs-f:5’-CAGGAAAAAGGGATTAATGAG-3’和Prbcsr:5’-GTTGACAATAATTGCTCTCTAG-3’检测确定有无基因组DNA污染,以h IL-12-F:5’-GCT-GATGGATCCTAAGAGGC-3’和h IL-12-R:5’-TTAGGAAGCATTCAGATAGC-3’为引物进行扩增检测h IL-12基因的表达。以组成型基因GAPDH作为内参[14],扩增引物为GAPDH-F:5’-AT-GAAGGACTGGAGAGGTGG-3’和GAPDH-R:5’-GAAAATGCTTGACCTGCTGT-3’。扩增反应程序为:预变性94℃2 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s;26~30循环,72℃延伸10 min。
1.2.2 Western Blot检测h IL-12蛋白在转基因马铃薯中的表达
取马铃薯绿色叶片或块茎约0.1 g,加入1.5m L总蛋白提取液(0.1 mol/L Tris-HCl,p H 7.5,50mmol/L EDTA,0.5%SDS,1%蛋白酶抑制剂),冰上研磨至匀浆,12 000 r/min离心10 min,收集上清液利用BCA法测定蛋白质浓度后保存。Western Blot方法参考文献[15]并进行适当改进。配制浓度为12%的SDS-PAGE凝胶,将处理后的蛋白样品点入上样孔进行电泳。电泳完毕后按照“滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸”从负极到正极的顺序进行组装置于电转仪中,恒流200 m A转移1~2 h。将膜用TBS清洗1次(5 min),浸入5%脱脂奶粉(TBS溶解)中37℃封闭1 h后,将膜取出,TBS清洗1次(5 min);在5%脱脂奶粉(TBS溶解)中按照1∶2000的稀释比例加入一抗,膜浸入其中,37℃孵育1h;将杂交膜1×TTBS清洗5次,每次5 min;在5%脱脂奶粉中按照1∶5 000的稀释比例加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G),将膜浸入其中,37℃孵育1 h;1×TTBS清洗5次,每次5 min,1×TBS洗15 min;利用化学发光试剂盒进行发光后利用化学发光成像仪进行曝光照相。
1.2.3 ELISA定量检测h IL-12蛋白在转基因马铃薯中的表达
将待测样品稀释30倍后用人IL-12 ELISA检测试剂盒测定样品中h IL-12的含量,按照试剂盒说明书进行操作。主要步骤包括将蛋白质样品(包括标准品与待测样)、生物素标记抗体及酶试剂加入h IL-12包被的酶标板,混匀后37℃保温1 h,洗板后加入显色液,5 min后加入终止液于450 nm测量OD值。所有数据用SPSS 22.0软件进行统计分析,实验数据重复3次,结果用均值±标准差(x-±s)表示。利用独立样本T检验法计算两个样品间的差异显著性,P<0.05表示有统计学意义(*)。
1.2.4 转基因植株无性繁殖与试管薯诱导
在超净工作台中,将无菌幼苗植株切成3 cm左右带叶的小段,接着将切下来的茎段插入MS培养基。将其置于人工气候箱,22℃条件下以光照16 h黑暗8 h的周期进行培养,进行无性繁殖。无性繁殖的植株生长至10 cm左右长度后,转入装有MS培养基(含0.5 g/L活性炭)的培养管中,置于22℃光照8 h黑暗16 h的人工气候箱进行试管薯诱导。
2 结果与分析
2.1 h IL-12在转基因马铃薯叶片中的表达检测
在前期研究中,获得了大量Prbcs驱动的h IL-12转基因马铃薯植株,并通过PCR和GUS染色分析初步获得了11株阳性植株[13]。本研究接下来首先提取植株叶片总RNA并反转录为c DNA。首先利用启动子DNA引物Prbcs-f和Prbcs-r检测确定无基因组DNA污染后,利用RT-PCR检测h IL-12基因的表达情况。结果显示,11个样品中的有7个检测了h IL-12基因RNA水平的表达(图1A)。为进一步检测外源基因在转录后的蛋白质表达情况,提取这7株马铃薯植株叶片总蛋白,利用h IL-12抗体进行Western Blot检测h IL-12在蛋白水平的表达情况。结果显示:其中的2、4、9、10、15号5个植株块茎能明显检测到h IL-12蛋白表达,另外的6、11号植株叶片中未检测到明显信号(图1B)。本研究进一步利用ELISA技术对h IL-12蛋白的表达进行定量检测,结果与Western Blot实验一致,除6、11号植株外,其余5个转基因植株的叶片中均检测到h IL-12蛋白,表达量在0.5~3.0μg/g总蛋白之间(图1C)。其中,10号植株的马铃薯叶片中h IL-12表达量最高,达到2.84±0.19μg/g总蛋白(图1C)。
2.2 h IL-12蛋白在转基因马铃薯中表达的组织特异性检测
由于本研究中驱动h IL-12基因表达的启动子Prbcs为叶片和绿色组织特异性启动子[13],为检测h IL-12蛋白的表达是否也具有组织特异性,本研究接下来对在叶片中能检测出h IL-12蛋白表达的5个植株的块茎进行了检测。通过试管薯的诱导,本研究成功获得了这5个植株的马铃薯块茎(图2A)。将块茎的绿色外皮去掉后提取总蛋白进行ELISA检测并对检测数据进行统计学分析。结果显示,虽然都能检测到微量的h IL-12蛋白信号,但2、10、15号植株块茎中h IL-12蛋白的表达与野生型对照植株无统计学差异(P>0.05)。而4号和9号植株块茎中检测到h IL-12蛋白的表达虽然与野生型对比有统计学差异,但表达量极低,每克总蛋白中h IL-12的表达量均小于0.4μg(图2B),远低于其在叶片中的表达量,初步表明h IL-12蛋白的表达具有叶片组织特异性。
注:编号0表示野生型植株叶片(阴性对照),其余编号表示不同阳性单株。Note:number 0 indicates the negative control;other numberss indicate different transgenic lines.
注:A:转基因试管薯(箭头);B:ELISA检测试管薯中h IL-12蛋白的表达,编号与图1对应,*表示与阴性对照相比有统计学差异(P<0.05)。Note:A:transgenic potatomicrotuber(arrow);B:expression of h IL-12 in transgenic potato microtubers;numbers are correspondence with that in figure 1;asterisks mean statistical differences with control(P<0.05).
2.3 马铃薯转基因植株无性繁殖及h IL-12蛋白表达的遗传稳定性检测
将表达h IL-12的2号和10号转基因马铃薯幼苗,切成3~5 cm长的茎段进行无性繁殖。待植株长至7~8 cm的高度后(30 d左右,图3A),选取其后代幼苗各5株提取叶片的总蛋白。利用ELISA技术检测无性繁殖后h IL-12蛋白表达情况,验证其遗传稳定性。结果显示(图3B),所有的叶片均能检测到h IL-12蛋白的表达,且表达量和亲代植株接近。表明在经过一次无性繁殖后,h IL-12在转基因植株中的表达稳定。接着,本研究选取2-2号和10-1号植株的各5株后代幼苗叶片,提取蛋白利用ELISA技术检测h IL-12的表达量,分析经过2次无性繁殖后h IL-12蛋白的表达情况。结果显示,所检测的全部样品中均有h IL-12蛋白表达(图3C)。以上研究结果初步表明获得的h IL-12转基因植株的遗传稳定性良好。
注:A:马铃薯转基因幼苗无性繁殖。B:ELISA检测h IL-12在第二代马铃薯幼苗叶片中的表达;0:阴性对照;其余编号表示2号和10号植株的不同后代单株。C:ELISA检测h IL-12在第三代马铃薯幼苗叶片中的表达;0:阴性对照;其余编号表示2-2号和10-1号植株的不同后代单株。Note:A:propagation of transgenic potato plants.B:expression of h IL-12 protein in the second generation of potato leaves by ELISA;number 0 shows negative control and others mean generations of transgenic Line 2 and Line 10.C:expression of h IL-12 protein in the third generation of potato leaves by ELISA;number 0 shows negative control and others mean generations of transgenic Line 2-2 and Line 10-1.
3 讨论
利用外源重组表达系统生产的生物技术药物已在癌症、心脑血管疾病、糖尿病等重大疾病的治疗方面起着举足轻重的作用[16]。目前,临床上和实验室所使用的重组白细胞介素大多数是用大肠杆菌或者动物细胞进行表达和生产[17,18,19],价格较为昂贵。Nancy S Magnuson等于1998年利用烟草悬浮细胞表达系统,获得了具有生物学活性的人IL-4[20]。自此以来,先后已有多种白细胞介素在成功植物中获得重组表达。相比于微生物和动物细胞反应器,植物具有细胞培养简单、转基因体系成熟、与动物细胞相似的真核基因表达机制等优点,开发植物生物反应器来表达具有应用价值和潜力的药用蛋白受到了许多科研工作者的重视[1,2,3,4]。
但是,相比于已经成熟的微生物重组表达体系,植物细胞中外源蛋白的表达量很低[3,20],限制了其发展和应用。Gutiérrez-Ortega等早在2004年便在烟草中成功表达了具有生物学活性的h IL-12蛋白,但表达量仅为30 ng/g(鲜重)[21]。在本实验室的前期研究中,利用组成型的Ca MV35S启动子驱动h IL-12基因在马铃薯中的重组表达,虽获得了具有生物学活性的重组蛋白[22],但表达量仍低于0.1μg/g(总蛋白)[9]。因此,如何提高h IL-12蛋白在植物生物反应器中的表达量至关重要。启动子是决定其下游基因表达量的关键因素之一,利用组织特异性启动子来驱动外源基因,可以在植物的某一特定组织内获得高表达的重组药用蛋白,从而有效提高植物生物反应器的表达效率。如:Yoonkyung Park等利用Ppatatin启动子驱动白细胞介素-2(IL-2)蛋白特异性的在块茎中表达,表达量提高了2倍以上,最高可达到约110μg/g(总蛋白)[10]。在前期研究中选择的Prbcs启动子是植物叶片组织中一个高效特异性的启动子[23],目前尚无该启动子在植物生物反应器表达重组白细胞介素领域应用的报道。本研究将Prbcs启动子应用于h IL-12在马铃薯生物反应器中的表达,获得了能在叶片组织中大量表达h IL-12蛋白的转基因马铃薯植株。h IL-12在每克总蛋白中的表达量约2.8μg,外源蛋白的表达量比前期研究[9]大大提高。
此外,植物基因组遗传的复杂性往往易会造成外源基因表达的不稳定性,外源基因在经过几代繁殖后表达量可能会大大减少[24]。因此,药用蛋白基因在转基因植物基因组中的遗传稳定性是决定植物生物反应器生产效率的重要因素之一[11]。在本研究中,外源基因在所检测的所有试验材料中的表达均具有非常好的遗传稳定性,进一步为该表达系统的应用提供了理论基础。
