模型灌注（精选八篇）
模型灌注 篇1
钻孔灌注桩后注浆技术是针对严重影响泥浆护壁灌注桩承载力的桩底沉渣及桩侧泥皮的缺陷进行补强,加固桩底桩侧一定范围的土体,进而提高单桩极限承载力的一种科学技术。资料表明[1]结合具体工程对其工艺参数和压浆装置不断优化完善,后注浆灌注桩承载力增幅可达40%～100%。
由于钻孔灌注桩后注浆技术在我国目前仍然处于成长阶段,一般通过试桩试验确定,使其应用受限。依据钻孔灌注桩后注浆机理,采用合理的假设,建立了钻孔灌注桩后注浆工艺参数估算模型。在施工中如果能够采用数学模型先预测注浆工艺参数,再有目标地进行试桩,不仅可以减少试桩试验次数,而且能够取得可观的经济效益。
1后注浆主要工艺参数估算模型
后注浆工艺参数中以注浆量和终止注浆压力最为重要。根据单桩极限承载力标准值的增加幅度要求及注浆机理,建立如下两个数学模型——注浆量模型和注浆压力控制模型,以估算注浆量和终止注浆压力。
1.1 注浆量模型
注浆量大小由桩端、桩侧土层性质、桩径、桩长、承载力增幅要求等因素来确定,注浆量模型见图1。为建立注浆量数学估算模型,假设:
1)单桩极限承载力增加量ΔQuk等于桩侧阻力增量ΔQs和桩端阻力增量ΔQp之和。
ΔQuk=ΔQs+ΔQp (1)
ΔQs=f1(Cs,Cp) (2)
ΔQp=f2(Cp) (3)
其中,Cs,Cp分别为桩侧注浆量和桩端注浆量;f为注浆量与承载力增加值之间的函数关系。
2)在饱和土中注浆时,桩侧后注浆使注浆点以上某一范围内土层桩侧阻力大幅度增强,桩端后注浆使浆液在某一球形半径范围内扩散,扩散半径为R。
3)桩侧后注浆使浆液向桩体周围扩散,各土层范围中桩身扩散半径为ti,可取0.01 m～0.03 m;桩侧土层为细粒土及正循环成孔取高值,为粗粒土及反循环成孔取低值。
4)若采取桩侧桩底联合注浆,后注浆侧阻增强贡献率ws显著大于注浆端阻增强贡献率wp,前者在65%以上,桩越长,前者越大。
第i层土桩侧承载力增加值ΔQsi,桩端承载力增加值ΔQp分别为:
ΔQsi=(ξsi-1)Qsi (4)
ΔQp=(ξp-1)Qp (5)
其中,ξsi为侧阻增强程度;ξp为端阻增强程度,不同土层中这两个系数的取值见表1。
非后注浆桩单桩极限承载力标准值计算按规范的经验公式:
Quk=πd∑qsik×hi+qpk×Ap[2] (6)
其中,d为桩径大小;qsik为极限侧阻力标准值;qpk为极限端阻力标准值;Ap为桩底面积。
对于后注浆桩,根据模型假设,针对不同注浆方式,单桩极限承载力标准值增值计算如下:
1)只在桩侧注浆。
ΔQuk=∑ΔQsi (7)
Cs=πd∑hiti (8)
2)只在桩端注浆。
单桩极限承载力标准值的增加量主要由桩端承载力增量贡献,若桩端承载力增量贡献值不足,则由桩侧阻力增加量来补充。即:
ΔQuk=kpΔQp+ks∑ΔQsi (9)
其中,
3)桩端、桩侧联合注浆。
桩侧阻力增量和桩端阻力增量按贡献率ws,wp进行分配。
ΔQuk=ΔQp+ΔQs (11)
ΔQs=ΔQuk·ws=∑ΔQsi (12)
ΔQp=ΔQuk·wp=kpΔQpi+ks∑ΔQsi (13)
其中,ws≥65%;wp≤35%;ws+wp=1。
1.2 注浆压力控制模型
注浆压力是指在不会使地表产生隆起和基桩上抬过大的前提下,实现正常注浆的最大压力。注浆压力与土层性质及注浆点深度等因素有关,注浆压力的范围可根据注浆压力控制模型确定,见图2。
1)注浆最大压力不能过小,注浆压力Pg必须大于抗注阻力Pr,浆液才能够顺利被注入土体中去。抗注阻力Pr与土体自重p0和注浆点的深度有关系,土体自重p0越大,深度越深,土体抗注阻力值就越大。2)注浆最大压力不能过大,以防止地表产生隆起和基桩上抬过大。注浆过程中注浆压力Pg必须小于桩体抗拔阻力Pc,Pc与桩侧抗拔阻力Qb和桩体自重G有关。
综合考虑以上两个方面,建立注浆压力控制模型:
Pr≤Pg≤Pc (14)
Pr=ζrp0 (15)
G=λρgV (17)
Pc=(Qb+G)/Ap=4ξ∑qsikhi/d+λρgl (18)
其中,ζr为注浆阻力经验系数;β为桩身抗拔和抗压承载力比值系数,一般取0.7[1];λ为混凝土灌注桩充盈系数,λ>1;ρ为混凝土的密度,普通混凝土密度为1 950 kg/m3～2 500 kg/m3;l为桩长。
2国家体育场基桩后注浆参数设计
本文根据模型结合国家体育场基桩工程,计算其主要后注浆工艺参数,注浆方案如表2所示,计算所需参数如表3所示。
根据国家体育场工程水文地质条件、有效设计桩长,对于承载力要求相对较低的基桩只在⑦大层设置一道桩侧后注浆,或只在⑨大层设置一道桩端后注浆,对于承载力要求相对较高的基桩在④大层和⑦大层设两道桩侧后注浆并在⑨大层设置桩端后注浆。
2.1 注浆量计算结果
根据注浆量模型,求得桩侧桩端充分注浆极限承载力增强值,如表4所示。
1)只在桩侧注浆:d=800 mm。
通过设置一道桩侧压浆将单桩极限承载力提高40%,提高至10 700 kN。根据注浆量模型求得桩侧注浆量为764 kg。国家体育场工程该类型桩实际注浆量为每层600 kg～800 kg,与计算结果接近。
2)只在桩端注浆:d=800 mm。
通过设置一道桩侧压浆将单桩极限承载力提高40%,提高至10 700 kN。计算结果是,桩底浆液扩散半径0.712 m,桩底注浆量1 150 kg。国家体育场工程该类型桩实际注浆量为1 400 kg/桩,预算结果与模型估算相差250 kg。
3)在桩端、桩侧联合注浆:d=1 000 mm。
根据模型计算的桩侧上层注浆量518 kg,桩侧下层注浆量460 kg,桩侧总注浆量978 kg,桩端注浆量750 kg。桩侧实际注浆量为800 kg,估算值超过178 kg;实际桩端注浆量为1 400 kg,估算值较低,根据压浆增强贡献率分配更为合理。
2.2 注浆压力的计算
首先,选取计算注浆压力的基本参数(见表5)。其中注浆阻力经验系数中粗砂、卵石取1.2～3.0(饱和状态取低值),土体自重压力取自地基勘察报告。
根据注浆压力控制模型计算注浆压力范围。在第④层注浆时抗注阻力0.18 MPa;在第⑦层注浆时抗注阻力0.45 MPa;在第⑨层注浆时抗注阻力0.88 MPa。
直径为800 mm的桩抗拔阻力为9.5 MPa;直径为1 000 mm的桩抗拔阻力为7.77 MPa。根据模型:
max(Pr)<Pg<min(Pc)。
即:
0.88 MPa<Pg<0.77 MPa。
实际工程的开启压力取7 MPa,桩端后注浆终止泵送压力不大于2.0 MPa,桩侧后注浆终止泵送压力不大于1.0 MPa。注浆过程中最大注浆压力不大于6 MPa。对比可知,实际采用的参数均在根据模型估算的正常注浆压力取值范围之内。
3国家体育场基础桩后注浆试验结果与分析
由图3后压浆与非压浆试验桩桩身轴力对比静载试验曲线可知,非压浆试验桩在极限荷载下桩身轴力约10 000 k N,压浆试验桩在极限荷载下桩身轴力约为14 200 k N,与非压浆桩相比提高了42%。
由图4后压浆与非压浆试验桩Q—s曲线对比静载试验曲线可知,在竖向荷载均为10 000 k N的时候,采取后注浆以后,平均沉降量约减小了5 mm。在竖向荷载均为14 200 k N的时候,平均沉降量约减小了18 mm。
4结语
作者根据注浆量模型和注浆压力控制模型,计算了注浆量和注浆压力,计算结果表明:
1)桩侧注浆量与实际十分接近,桩端注浆量偏小,偏小更为合理。
2)实际采用的注浆压力参数均在根据模型估算的正常注浆压力取值范围之内。
在施工中如果能够采用模型先预测注浆参数,有目标的进行试桩,不仅可以减少试桩试验次数,而且能够节约财力物力。
摘要：依据钻孔灌注桩后注浆机理,采用合理的假设,建立了钻孔灌注桩后注浆工艺参数估算模型,并采用模型结合国家体育场基桩工程,计算了其主要后注浆工艺参数,与该工程实际采用的参数进行了对比,结果表明注浆量模型和注浆压力模型在实际的后注浆工程项目中具有很好的指导意义。
关键词：钻孔灌注桩,后注浆,后注浆工艺参数,模型
参考文献
[1]刘金砺,祝经成,高文生,等.泥浆护壁灌注桩后压浆成套技术[R].建筑科学研究报告,1997.
浅谈钻孔灌注桩水下砼灌注 篇2
关键词：钻孔灌注桩；水下砼灌注；水下砼性能指标
中图分类号：TU7文献标识码：A文章编号：1009-2374（2009）05-0165-02
钻孔灌注桩因具有承载力高、可以穿越软硬岩层及施工方便等优点，在我国沿海地区地基基础工程中被广泛使用。其中水下砼灌注是钻孔灌注桩成桩质量控制中的关键工序，若施工措施不当就会造成桩缺陷，甚至产生报废桩，从而给施工单位造成重大损失，因此，在水下砼灌注中运用合理的施工控制措施以确保工程质量显得十分重要。
一、水下砼性能指标的控制
灌注桩砼有其本身的特殊性，要求砼在灌注中具有较好的流动性、和易性，因此需要控制好砼的性能指标。
1．砼原材料。细骨料宜选用中粗砂；粗骨料优先选用卵石，其含泥量应小于2%，以确保砼和易性、流动性，防止堵管现象。
2．混凝土的初凝时间。砼初凝时间应大于桩的砼灌注时间，一般砼初凝时间仅3～5小时，只能满足浅孔小桩径灌注要求，深桩灌注时间约为5～7小时。因此用于钻孔灌注桩的水下砼应掺加外加剂，使砼的初凝时间大于8小时，所掺加的外加剂不仅要具有缓凝作用，还应具有减水、改善和易性及节省水泥等材料作用。
3.坍落度控制。在实际施工中坍落度控制在200~220mm较好，这样的砼具有良好流动性。在钻孔灌注桩水下砼灌注中发生堵管等问题往往砼的坍落度、初凝时间等性能指标有关，所以必须严把砼质量关。除了控制好砼质量外，在水下砼的灌注过程中还要注意其他方面的控制。
二、水下砼的灌注
1．灌注前的准备。（1）孔内泥浆性能指标的控制：砼灌注前应调控好泥浆性能指标，根据施工经验泥浆比重控制为1.10～1.25、含砂率小于等于8%、粘度小于等于28s。因为泥浆比重过小，泥浆护壁就容易失去了阻挡土体坍塌的作用，如果泥浆的比重过大、过稠会降低泥浆流动性，增加浇注砼的阻力，使的置换砼产生困难，从而影响成桩的质量。（2）灌浆导管的选择：灌浆导管的选择应根据桩孔的深度、钢筋笼的设计直径及导管的活动范围等因素来综合考虑，选择合适导管直径。一般大直径导管可以缩短砼灌注时间。导管每节长度可视工艺要求、桩深来确定，一般为0.5m、1.0m、2.0m，底管长度不小于4m。导管之间的连接采用高强螺栓，在使用前应试拼装、试压，试水压力为0.6～1.0MPa，使用时将导管内壁杂物清除，并检验防水胶垫是否完好、有无老化现象，对导管进行量长度、编号，确保导管连接可靠、使用有序、易于装卸及良好的密封性。（3）设置隔水栓塞：隔水栓塞的选择直接影响砼的初期灌注。所选用的隔水栓直径应与导管内径相配，同时具有良好的隔水性能，保证顺利排出。隔水栓塞一般有预制砼圆柱塞、球胆及橡胶栓塞，球胆栓塞采用篮球或排球胆。在实际施工中，一般选用球胆栓塞，因为砼活塞极易因导管细微变形而卡死在导管内，易造成砼灌注的困难，而球胆栓塞却具有良好的弹性、隔水性、可多次重复使用及排出顺利等优点。
2．初期灌注。导管底端距孔底高度可根据桩径大小、隔水栓塞大小加以确定，一般控制在30～50cm，桩径小时取大值。漏斗内砼的初灌注量必须满足初灌时导管底部一次性埋入砼中1.0～1.5m。初灌量过小会造成脱管现象、底管口砼离析，造成断桩等事故，影响成桩质量。开始灌注时尽量准备足够的砼，砼下降产生的巨大冲击力可将孔底泥浆泛起，从而带动孔底沉渣返出，减少桩底沉渣厚度，提高桩的承载力。因为根据岩土有关理论说明：孔底的沉渣厚度少许的减少，则桩承载力将大幅度的增加。在灌首批砼之前先在料斗内放入0.1～0.3m3与砼标号的水泥砂浆，然后再放入砼，水泥砂浆起润滑导管作用。在首批砼顺利下滑至孔底后，立即检测导管内外的砼高度，检查导管是否埋入砼中，合格后应继续向漏斗加入砼，转入中期灌注，要确保砼灌注的连续作业，使砼和泥浆一直保持流动状态。
3．中期灌注。在中期灌注过程中，应匀速向漏斗内灌注砼，若突然灌注大量的砼，导管内空气将不能立即排出，会导致堵管。在灌注时需适当提升串动导管，串动导管时严禁碰撞钢筋笼，以防钢筋笼有上浮或下沉。串动导管作用：有利于后续砼的灌注。因为砼在导管内停留时间长，骨料滞留在导管中，使砼与管壁摩擦阻力增强，其流动性将变差，易造成上部砼下落困难，从而发生堵管；有利于提高砼密实度，保证成桩质量。串动导管可将砼挤入桩周围孔壁中，起到提高桩侧阻力的作用，另外也加大了砼与钢筋笼的握裹力。
在灌注中若发生堵管，在埋管深度不大时，可采用适当增加导管的上下串动高度及速度，使管内砼受力排出。如无效，可用大锤锤击导管或用钢管插入管内上下串动，仍无效应提出导管做事故处理，并做好记录备案。
在灌注过程中要及时拆卸导管。因为若导管埋深过大，将导致已灌注砼流动性降低，导管外砼对导管内砼的负压力增高，灌注超压力降低，使砼在导管内不易下落，若埋管过浅易造成断桩。据实际经验导管插入砼面深度以5.0～6.0m为宜，导管串动幅度以1.0m左右为宜。在灌注过程中，应经常用测锤探测砼面的上升高度，以正确判断砼的埋管深度，从而准确拆卸相应长度的导管，保持导管的合理埋深，以降低导管外砼对导管内砼的负压力，提高其超压力，使砼在导管内顺利排出。拆卸导管时应尽量缩短作业时间及砼在导管内的停留时间，以防堵管。拆卸下的导管应立即清洗干净。
4．后期灌注。在灌注砼的后期，由于导管内砼柱高度减少，超压力降低，而导管外泥浆的稠度、比重却增大，容易出现砼上升困难，因为砼必须以大大超过泥浆的反作用压力才能将孔内的泥浆挤压出孔口，在实际施工时，可采取在孔内加水稀释泥浆或人工扒拨部分沉淀物等方法，使砼灌注顺利。要控制好最后一次砼灌注量，避免浪费砼材料。砼超灌高度应符合设计要求，确保凿除浮浆后桩顶砼达到设计强度，实际施工可制作简易打捞工具捞取砼样以控制好砼超过高度，为防止桩顶空心，在灌注结束后，导管拔出砼之前应串动导管，幅度不超过50cm，并且导管提升速度要慢。
在钻孔灌注桩水下砼灌注时，要合理控制好灌注速度，确保砼灌注时间不超过砼的初凝时间，这对于保证桩的灌注质量十分重要。只要工程技术人员在实际施工中做好准备，不断总结经验，加强对砼灌注的各环节的科学管理及控制，就可确保钻孔灌注桩水下砼的质量。
参考文献
[1]中国建筑科学研究院．建筑桩基技术规范（JGJ94-94）[M]．北京：中国建筑工业出版社，1995．
模型灌注 篇3
1 简介
目前研究LIRI的动物模型包括:肺缺血-再灌注损伤模型、肺移植模型、肺动脉栓塞模型等, 实施方法:阻断单侧肺门, 实验肺无血液循环及气体交换[2,3];介入堵塞肺动脉产生急、慢性动脉栓塞[4,5];离体肺通过灌注、保存方法后移植, 肺完全缺血而有气体交换[6]。可分别阻断肺动、静脉, 阻断单侧肺门血管后恢复双肺通气, 用来产生外科手术中阻断肺血管导致LIRI的效果[2]。目前有多种实验动物被选作用来建立肺缺血再灌注模型, 如大鼠、犬、兔以及猪等[7]。
2 发生机制
LIRI可导致肺移植后发生原发性移植肺功能障碍, 表现为肺动脉压升高、肺出血、肺水肿和急性呼吸功能衰竭, 发生机制与活性氧产生增多、细胞内钙超载、中性粒细胞活化和高能磷酸化合物生成障碍等因素有关[8,9]。目前以活性氧产生增多、中性粒细胞活化和钙超载的研究最为多见。
2.1 活性氧增多
肺再灌注后, 肺血液循环和气体交换恢复, 肺内氧含量增加, 氧自由基大量释放损伤肺泡上皮细胞及血管内皮细胞, 损害了血管通透性, 组织内水分聚积, 导致细胞代谢障碍, 引起肺的损伤[10]。LIRI时活性氧增加, 氧自由基爆发是肺损伤的根本原因[11]。机体清除氧自由基主要靠超氧化物歧化酶, 其活性决定清除氧自由基的能力, 其能催化超氧自由基歧化为过氧化氢, 继而降解为氧气和水[11,12]。氧自由基 (OFR) 导致肺损伤的原理是: (1) 直接损伤DNA; (2) 脂质过氧化:导致细胞及细胞器膜损伤; (3) 氧化氨基:酶失活及多肽链断裂; (4) 影响基因的转录, 诱导炎症相关基因的表达, 产生多种致炎因子, 导致炎细胞的激活[13]。Shimoyama等[14]将离体鼠肺灌洗液中加入抑肽酶, 丙二醛减少, 氧浓度增加。IRI使丙二醛增多、氧化物歧化酶的活性减小[15]。李颍川等[16]发现再灌注后肺内氧自由基产生增加使超氧化物歧化酶含量明显下降, 破坏肺内皮细胞功能和结构, 导致肺损伤。丙二醛反映机体内脂质过氧化的程度, 可作为再灌注肺损伤间接评估指标[17]。
2.2 中性粒细胞活化
中性粒细胞 (PMN) 在肺IRI中有重要的作用, 由其分泌的促炎因子导致[13]。IRI导致肺损伤时, 促炎与抗炎因子的比例失调, 炎症因子增加, 抗炎因子减少, 导致炎症。炎症因子进一步激活多种炎症细胞因子, 导致“瀑布样”级联效应, 出现肺损伤[13]。促炎因子在PMN内部及其他细胞间进行调节, 从而导致炎症反应[18]。
2.3 细胞内钙超载
钙超载导致细胞膜、细胞器功能障碍, 细胞膜通透性增加, 线粒体功能障碍, 产生ATP减少;钙离子依赖性蛋白酶活性增加, 生成自由基增多, 造成肺损伤[19]。主要原因:缺血后, 细胞内钠-钾-ATP酶功能障碍, 因此细胞水肿;恢复血供, 钠离子被转移到细胞外, 引起钙离子被交换入细胞内[19]。钙超载是指:缺血再灌注致细胞内钙离子增加引起细胞的结构和功能损害[20]。
3 模型建立
3.1 小鼠肺缺血再灌注损伤模型
准备:禁食12 h, 禁水4 h。阿托品0.01 mg/kg肌注, 2%戊巴比妥钠注射液60 mg/kg腹腔麻醉, 必要时6 mg/kg追加麻药[21]。取仰卧位, 固定于显微手术台上, 颈胸部手术区备皮。采用20 G静脉留置针作气管插管。连接呼吸机, 见到胸廓起伏, 则插管成功, 固定。呼吸机频设率为130~150次/min, 潮气量150~200 m L/min, 吸呼比1:1.5。实验组: (IR组) :腹腔注射肝素500 U/kg。10 min后, 备皮区常规消毒, 显微镜下取横切口约8 mm, 钝性分离胸大小肌, 从第3肋间进胸, 暴露肺门, 微血管夹断左侧肺门, 左肺无通气。阻断60 min后恢复左肺通气及循环, 逐层关胸。术后置于32℃温箱中, 待小鼠清醒后, 拔气管插管。对照组 (sham组) :仅暴露左肺门, 观察60 min后关胸, 其余操作同IR组。
3.2 大鼠肺缺血再灌注损伤模型
鼠禁食12 h, 禁水4 h, 3%戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔注射, 气管切开, 插管, 机械通气, 呼吸频率70次/min, 吸呼比1:1.5, 取左侧胸部第5肋间前外侧切口, 解剖肺门, 静脉注射肝素钠 (100 U/kg) [10]。阻断肺门30 min, 再灌注120 min[22]。阻断后肺萎缩, 变为暗紫色, 开放后肺迅速膨胀, 颜色恢复淡红色[23]。
3.3 兔肺缺血再灌注损伤模型
肌注阿托品0.5 mg, 静脉2%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉, 麻醉维持:2%戊巴比妥钠, 每次5 mg/kg, 维持麻醉深度[24]。气管插管接呼吸机。呼吸机参数设定:频率30次/min, 吸呼比1∶1, 氧浓度100%, 潮气量10 m L/kg, 游离左肺门。游离右侧股动脉, 置入生理仪监测导管, 检测动脉压 (MAP) 、心率 (HR) 。取右侧卧位, 取左侧3、4肋间切口, 进胸, 解剖左肺门。分别游离左侧肺动脉、左肺上、下静脉, 静脉注入肝素 (1.0 mg/kg) 10 min后, 可分别阻断肺动脉及上、下肺静脉1 h后再顺序开放肺上、下静脉和肺动脉或单纯阻断肺动脉1 h, 手术中左肺持续通气[25]。
3.4 犬肺原位常温缺血再灌注动物模型
禁食水12 h, 肌注阿托品, 眠乃宁0.05 m L/kg诱导麻醉, 用力蒙欣维持麻醉, 气管插管, 机械通气:潮气量15~20 m L/kg, 频率20次/min, 氧浓度60%, 持续心电监测。左侧股动脉穿刺监测血压, 游离穿刺右侧颈外静脉, 监测中心静脉压 (CVP) , 监测血氧饱和度。取双侧第4或第5肋间横切口, 切开心包并悬吊, 解剖肺动脉主干及左右各支、左右肺静脉上中下各支。主肺动脉近端置入测压管, 左肺动脉远端置入灌注管。肝素化 (1 mg/kg) , 阻断左肺动脉、阻断左主支气管、阻断左肺静脉各支, 左肺动脉灌注常温LPD液, 左肺常温阻断120 min, 开放左肺循环及支气管。再灌注120 min后, 留取病理标本, 再灌注240 min后, 留取病理标本。
4 结语
自从Mc Cord[26]提出了缺血再灌注损伤 (ischemiareperfusion-injury, IRI) 的概念以来, 至今对各器官组织的缺血再灌注损伤的研究一直成为医学领域的重点和难点。对于肺缺血再灌注而言, 因为肺保护技术的发展, 近二十年间肺IRI的发生明显减轻, 但缺血再灌注导致的肺损伤仍是致患者早期死亡及发生晚期并发症的主要原因, 且严重的肺IRI还与移植后发生免疫排斥反应、阻塞性细支气管炎等有关[27,28,29]。因此, 肺缺血再灌注损伤动物模型的建立对于肺移植理论及实践研究意义非凡, 为临床上肺缺血再灌注损伤提供新的治疗思路[30]。
摘要：缺血再灌注损伤 (IRI) 是器官移植研究的重点。肺缺血再灌注损伤 (LIRI) 的发生与白细胞活化分泌促炎因子、活性氧增多、细胞内钙离子浓度升高等有关, 因此研究LIRI主要侧重这几个方面。现在各种动物模型 (如鼠、兔、犬等) 的建立能够很好地模拟这些发生, 解决了临床直接研究的难题。文章就这些方面的研究进展作一综述。
模型灌注 篇4
一材料与方法
1. 实验动物及其分组与模型制作
取26~35g雄性C57BL/6小鼠40只, 随机分为假手术组以及Ⅰ~Ⅲ组。4%水合氯醛对实验动物进行麻醉, 给药容积为10ml/kg。实施麻醉后, 将动物仰卧位固定, 颈正中切口, 剪去枕骨腹侧面部分颅骨, 用5-0缝线 (上海浦东区金环医疗用品股份有限公司生产) 结扎延髓腹侧面上的基底动脉。分离双侧颈总动脉, 穿线备用。依次缝合肌肉及皮肤, 将动物放置于38℃恒温加热板保持2小时, 以维持正常体温。24小时后, 拆线打开原手术伤口, 同时结扎双侧颈总动脉。Ⅰ~Ⅲ组分别于结扎后10、12、14分钟后, 小心取下结扎于双侧颈总动脉的缝线, 恢复灌注。假手术组动物进行以上除结扎基底动脉以及双侧颈总动脉之外的步骤。
2. 脑组织标本的取材、染色和观察
手术7天后, 将各动物以4%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉, 暴露心脏, 先用生理盐水灌注30分钟, 待肝脏变白后, 换成4%多聚甲醛灌流, 直至动物肝脏变硬, 尾巴僵硬后, 剪下头部并开颅取脑, 再浸入4%多聚甲醛中1天。取出固定好的脑组织, 经冲洗、脱水、透明、包埋等步骤后, 制成4μm厚连续切片, 每隔10张切片取连续2张进行尼氏染色, 于高倍镜下观察拍照并对尼氏染色阳性神经元进行计数。
3. 数据分析与处理
如无特殊说明, 实验结果均用均数±标准差表示。采用SPSS17.0统计软件, 各组尼氏染色阳性神经元数用Wilcoxon Mann-Whitney秩和检验进行组间统计, 并用Bonferroni法进行两两比较。
二实验结果
1. 死亡率
基底动脉结扎后的死亡率为85%。死亡原因考虑为: (1) 麻醉后的自主呼吸丧失; (2) 不可避免的技术性失败, 导致基底动脉破裂或致死性出血。
双侧颈总动脉结扎后的动物死亡无技术性死亡, 均为缺血引起。第Ⅰ组无动物死亡, 然而随着缺血时间的延长, 死亡率升高, 如第Ⅱ组的死亡率上升到了27%, 第Ⅲ组的死亡率达36%。死亡的时间多集中在全脑缺血后的3~5天 (65%) 。
2. 脑组织切片观察
假手术组细胞3~4层, 排列整齐紧密, 细胞核大而圆、核仁清晰;尼氏小体染色浓密规则 (图A) 。Ⅰ~Ⅲ组细胞排列散乱、部分丢失、胞核固缩, 尼氏小体染色呈现不同程度的变淡或消散, 且胞浆出现嗜酸性变化 (图B~D) 。
全脑缺血后海马CA1区神经元尼氏染色情况 (放大倍数200×) 。 (A) 假手术组动物无CA1区海马神经元损伤。3-VO法全脑缺血10min (B) 、12min (C) 以及14min (D) 后, 可观察到明显的CA1区神经元损伤。
每张尼氏染色切片高倍镜下 (200×) 随机选取大叔脑组织海马双侧CA1区各5个不重叠的视野进行尼氏染色阳性神经元计数:假手术组128±6, Ⅰ组53±3, Ⅱ组45±6, Ⅲ组32±5, Ⅰ~Ⅲ组与假手术组相比, P<0.05, 提示实验组动物神经元变性具有统计学意义, 即3-VO法具有全脑缺血引发神经元变性的能力。
三讨论
我们采取3-VO法制作小鼠全脑缺血模型, 主要是通过基底动脉和颈总动脉结扎, 阻断脊髓血流与脑血流之间的通路, 从而引起短暂性的全脑缺血, 引起海马神经元的迟发性死亡。从实验结果来看, 病理性损伤的程度取决于颈总动脉的结扎时长, 且结扎10分钟是较为理想的缺血时间, 因为能引起CA1区细胞50%左右的缺失, 同时死亡率低。
但此种方法同样存在个体差异大的问题, 同时, 术后存活率较低, 被烧灼阻断的椎动脉不可再通, 改变了正常的解剖结构, 影响再灌注的脑血流量, 造成再灌注不完全。我们所采取的3-VO法操作简便, 因为在C57BL/6小鼠体内, 基底动脉位于枕骨大孔和第一颈椎之间, 位置明显, 因而可提高实验成功率, 为相关脑血管病动物模型的制作提供更易于操作的方法和思路。
模型灌注 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
SPF级Wistar雄性大鼠60只, 体重200~250 g, 购自兰州大学实验动物中心。
1.1.2 主要试剂
3.6%水合氯醛, 10%多聚甲醛, 头端包被多聚赖氨酸、已消毒的MCAO线栓[型号2432-A4, 线头直径为 (0.32±0.2) 、线身直径为0.24 mm]购自北京沙东生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 改良大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型的建立
参考Longa等的报道, 随机选取30只雄性Wistar大鼠, 术前12 h禁食, 但不禁水。采用3.6%水合氯醛, 对大鼠按1 m L/100 g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后。剃须刀颈部皮肤备皮, 取仰卧位, 固定于手术台上, 颈部用碘酒、酒精消毒后, 取颈部正中切口, 长约2 cm, 切开皮肤及皮下组织, 锐性分离颈前正中肌群, 将肩胛舌骨肌向外侧牵拉, 颈前正中肌群向内侧牵拉, 暴露右侧颈总动脉, 小心剪开包裹颈总动脉 (common carotid artery, CCA) 及迷走神经的鞘膜, 将颈总动脉与迷走神经分离开, 并沿CCA向远端分离出颈内动脉 (internal carotid artery, ICA) 及颈外动脉 (external carotid artery, ECA) 近心端, 结扎CCA近心端, 动脉夹夹闭CCA远心端, 以5-0丝线在CCA中段放置一打好结的丝线, 勿收紧线结, 用显微剪将CCA近心结扎端远侧剪一小口, 插入线栓, 将丝线打紧, 以保证线栓能自由活动, 但又不经动脉破口渗血;松开CCA远端动脉夹, 缓慢将线栓经CCA、ICA置入大脑中动脉 (middle cerebral artery, MCA) , 当出现阻力时即可停止前进, 以湿的生理盐水纱布覆盖颈部伤口, 线栓缺血1 h后, 取下覆盖创口的纱布, 在麻醉状态下, 缓慢拔出线栓至CCA, 结扎CCA远心端后, 完全退出线栓, 去除牵拉肩胛舌骨肌及颈部舌前肌群的缝线, 缝合颈部皮肤。另设对照组30只, 颈部正中切口, 牵开颈部舌前肌群及肩胛舌骨肌, 分离CCA、ECA及ICA, 结扎CCA近端及远端, 不插入线栓, 操作完毕后, 缝合肌肉及皮肤。两组大鼠术中均放置于恒温毯上, 直至术后清醒。两组大鼠术后均连续3 d肌注青霉素4000 U/d。
1.2.2 大鼠神经功能缺陷体征的观察
所有大鼠均在模型成功后观察大鼠行为。参考Zealong评分标准进行神经功能评分[4]。0分:无神经功能缺陷征;1分:一侧前肢部分屈曲;2分:一侧前肢完全屈曲;3分:向偏瘫侧转圈;4分:向偏瘫侧倾倒;5分:不能自发行走, 意识丧失。
1.2.3 TTC染色和HE染色
所有大鼠分别于造模后6 h断头后取脑, 观察脑底有无血凝块, 动脉环有无血栓形成以排除蛛网膜下腔出血和继发性血栓形成, 将脑组织以生理盐水冲干净, -20℃放置15 min, 行冠状位切片, 厚度为2 mm, 置2%2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑 (TTC) 中, 避光37℃染色约20 min后, 4%多聚甲醛固定, 放置于透明玻璃板上拍照。
1.2.4 脑梗死体积的测定
以图像分析软件 (Image Pro-Plus, IPP) 对脑梗死体积进行分析, 采用梗死率表示梗死体积 (梗死体积比率:各切面梗死面积相加之各/各切面面积相加之和×100%) 。
2 结果
2.1 模型成功率
两组模型大鼠共60只, 其中3只死于麻醉意外, 实验组1只, 对照组2只, 被排除。实验组成功制作模型24只, 失败3只, 2只死亡, 成功率为82.75%, 模型平均操作时间约 (20.4±5.3) min。对照组无死亡, 平均操作时间为 (12.5±4.8) min。
2.2 神经功能缺失评分
实验组模型中, 24只模型大鼠右侧眼裂变小, 左侧肢体偏瘫, 左侧肢体疼痛觉减退, 行走时多向右侧转圈。所有模型大鼠神经功能评分均在3~4分, 其中17只大鼠神经功能评分达3级, 7只达4级。而对照组无任何临床症状, 无神经功能缺失表现, 所有大鼠神经功能评分均为0分。
2.3 TTC染色
所有大鼠取脑观察, 脑底均无血凝块, Willis动脉环均未见血栓形成。实验组大鼠梗死侧大脑半球外侧面大部分颜色苍白, 其余部分染成均匀红色, 经IPP软件分析, 各实验大鼠脑梗死体积基本一致, 梗死体积约 (34.62±5.32) %。对照组经TTC染色, 全脑均染成均匀红色, 未见梗死灶。
3 讨论
缺血性脑血管病是严重威胁现代人类健康的重大疾病, 其中脑缺血再灌注损伤又占缺血性脑血管病的绝大多数。建立一种具有良好重复性、简便、易行的, 并能最大程度模拟人类缺血性卒中发生的局灶性脑缺血动物模型, 是缺血性脑卒中研究的关键问题之一[5,6]。其中, 以大鼠大脑中动脉闭塞模型运用最为广泛, 闭塞大脑中动脉的方法有开颅机械闭塞法、开颅电凝大脑中动脉法、线栓法、微栓子栓塞法、化学刺激导致血栓闭塞法、光化学诱导血栓形成法和内皮素灌注诱导血管收缩法等[3,7,8,9]。
理想的试验性脑缺血动物模型应该具备以下条件:能重复闭塞单根脑血管;能引起相应供血区的血流量改变或梗死发生;能实现缺血梗死区再灌注。在众多脑缺血模型中, 以线栓法具显著优势, 该方法可以有效地阻断大鼠MCA供血区的脑血流, 而且可以模拟血管再通后的再灌注情况。线栓法制备的大鼠MCAO/R模型能满足上述要求, 并无需开颅, 避免了其他开颅建模法引起的颅内环境 (特别是颅内压) 改变和颅内感染;线栓法制备的MCAO/R梗死位置和体积比较恒定;能进行永久性和短暂性脑缺血或梗死的研究, 特别是实现了脑缺血——再灌注;降低了大鼠死亡率和术后并发症的发生。
传统的线栓制备过程为:颈部切口后, 仔细分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉, 颈外动脉切一小口, 或切断颈外动脉, 经颈外动脉裂口插入线栓, 通过颈内动脉到达大脑中动脉, 以造成大脑中动脉供血区的缺血、梗死, 缺血2 h后拔出线栓, 形成再灌注损伤, 从而成功制作模型[4]。但由于大鼠的解剖特点, 手术视野小, 术中需分离出颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉, 分离过程中易损伤迷走神经、颈外动脉分支等, 分离难度相对较大, 易出血, 术后发生呼吸抑制, 呼吸道分泌物增多, 颈部出血等并发症[10]。为此, 笔者对该模型制备过程进行改良, 采用颈部正中切口, 将颈前正中肌群向内侧牵拉, 将肩胛舌骨肌向外侧牵拉, 经颈前正中肌群—肩胛舌骨肌间隙暴露颈部血管, 仅分离颈总动脉, 颈内、颈外动脉的近心端, 结扎颈总动脉远心端, 用动脉夹夹闭颈总动脉远心端, 然后在颈总动脉切一小口, 将线栓经颈总动脉, 通过颈内动脉插入至大脑中动脉, 造成大脑中动脉供血区缺血, 缺血1 h后, 在麻醉状态下完全拔除线栓, 结扎颈总动脉远心端, 使得右侧大脑半球大脑中动脉供血区由大脑前动脉、后交通动脉、大脑后动脉及相关穿支动脉供血, 实验缺血区的再灌注, 成功制备了MACO/R模型。
3.1 手术切口的选择
制作MACO/R模型, 目前主要有两种切口, 一种为正中切口, 另一种为颈部旁正中切口[11]。在本实验中, 笔者的体会是, 采用正中切口较直观, 切开颈部皮肤后, 小心切开皮下腺体被膜, 暴露颈前肌群, 沿肌间际进行分离, 锐性分离颈前正中肌群, 将肩胛舌骨肌向外侧牵拉, 颈前正中肌群向内侧牵拉, 经肩胛舌骨肌—颈前正中肌群间隙显露深部的颈总动脉及迷走神经。颈总动脉及迷走神经包在颈动脉鞘内, 锐性剪开颈动脉鞘, 小心分离颈总动脉与迷走神经, 切忌对神经及血管进行牵拉、夹持, 以免损伤血管内膜, 导致血栓形成;或损伤迷走神经, 出现心率下降、呼吸抑制等[12,13]。在本组实验中, 手术过程中, 大鼠心率及呼吸均平稳。
3.2 线栓插入方法的选择
传统的手术方法为颈外动脉剪一小口, 或切断颈外动脉, 将线栓经颈外动脉裂口插入, 经颈总动脉分叉, 顺着颈内动脉, 入颅阻塞大脑中动脉, 缝合伤口, 将线栓尾端留于颈部伤口外, 留置线栓2 h后, 拔除部分线栓至颈总动脉或颈外动脉, 剪去多余的线栓[4]。笔者的体会是, 由于传统模型制作过程中, 分离相对复杂, 且部分大鼠迷走神经分支较多, 与颈部血管形成襻, 包裹血管, 分离时不得不牺牲一些分支, 从而损伤较大, 术后易出现呼吸道并发症。同时, 成功制备局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型, 必然会对迷走神经造成一定的损伤, 而左侧迷走神经直接分布于心脏, 对心脏功能产生较大影响, 因此可能对心脏功能产生直接的影响, 甚至往往会造成血压的波动[10,14]。在实验中观察到, 分离颈动脉鞘的迷走神经襻和分离颈内动脉时, 大鼠有时会出现挣扎、痰鸣和呼吸不规则, 大鼠口唇青紫等, 采用右侧颈动脉线栓模型可减少对心脏的影响, 故该模型成功与否的另一个重要因素是脑外因素尽量要小[15,16]。在本实验中, 笔者对分离过程进行改良, 选取右侧颈动脉进行线栓模型的制备, 术中仅分离颈内动脉及颈外动脉近端, 在仔细辨认颈内、颈外动脉后, 从颈总动脉插入线栓, 小心经颈总动脉、通过颈内动脉, 达到阻塞大脑中动脉的目的, 在操作中, 需注意勿将线栓插入颈外动脉, 以确保线栓进入颈内动脉, 术中注意保护迷走神经, 切忌勿夹持迷走神经, 尽量不切断迷走神经分支。
3.3 排除线栓的处理方法
传统的模型制备方法为插入线栓后, 缝合皮肤, 将线栓末端留置于皮肤外, 大脑缺血2 h后拔除线栓至颈外动脉, 或全部拔除线栓。这样做的缺点是:若全部拔除线栓, 多会导致颈外动脉裂口出血, 形成颈部血肿, 压迫气管、颈总动脉等, 发生严重并发症, 拔管后死亡率高。若仅将线栓拔至颈外动脉, 然后剪去多余的线栓, 这样势必留置线栓于颈外动脉内, 若需长时间观察动物模型, 存在诱发血栓形成、感染等风险。故此两种方法均不利于MACO/R大鼠的长期观察。此外, 研究发现, 在大鼠清醒状态下将留于体外的线栓拔出以再通血流, 大鼠清醒时, 受拔线的刺激会使劲挣扎, 引起蛛网膜下腔出血, 大鼠死亡率高, 于是在给大鼠拔线再灌注时追加麻醉药, 降低了颅内出血率[4]。在本实验中, 笔者经颈动脉插入线栓后, 将大鼠持续置于保温毯上, 并用湿盐水纱布覆盖创面, 以减少经伤口丢失体液, 缺血时间结束后, 在麻醉状态下, 直视下完全拔除线栓, 并结扎颈总动脉, 使得右侧大脑半球经大脑后动脉、后交通动脉等重新获得血供, 实现了缺血再灌注, 这样, 能在大鼠安全状态下拔除线栓, 拔除线栓过程中无大鼠挣扎所致颅内出血等风险, 在模型大鼠体内不留置异物, 没有引起血栓形成及感染等风险, 利于实验动物的长期存活。通过本方法改良, 术后取脑组织行TTC染色, 发现脑梗死区范围一致, 神经功能缺失评分均在3~4分, 表明模型成功率高, 稳定性强。
综上所述, 经改良, 笔者成功建立了Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型, 该模型具简便、易行、稳定、可靠特点, 为脑缺血再灌注损伤模型的进一步研究提供了动物模型。
摘要：目的:通过改良线栓法建立稳定的Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型。方法:60只雄性Wistar大鼠, 参考Longa法并适当改进建立大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型30只, 对照组30只。实验组结扎右侧颈总动脉近心端, 夹闭颈总动脉远心端, 颈总动脉剪一小口, 从颈总动脉经颈内动脉插入线栓, 缺血1 h后, 在麻醉状态下完全拔出线栓, 并结扎颈内动脉远心端。对照组结扎右侧颈内动脉近心端及远心端, 但不插入线栓。术后取脑组织行TTC染色, 并进行神经功能评定。结果:经改良线栓法制作脑缺血再灌注损伤模型, 成功率达82.75%, 平均操作时间约 (20.4±5.3) min, 模型大鼠右侧眼裂变小, 行走时向右侧转圈, 模型大鼠神经功能评分均在34分, 经TTC染色梗死侧大脑半球颜色苍白, 脑梗死区范围一致, 梗死体积约 (34.62±5.32) %;对照组无任何临床症状, 无神经功能缺失表现, 经TTC染色无梗死灶。结论:通过改良, 成功建立了Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型。
模型灌注 篇6
1 资料与方法
1.1 实验动物及分组
成年健康雄性Wister大鼠54只, 体质量220～250g, 黑龙江中医药大学实验动物中心提供, 随机分为缺血再灌注组、假手术组和电针治疗组各18只。3组按再灌注时间3h、24h、72h的时间点抽血。
1.2 局灶性脑缺血再灌注模型的建立
注:缺血再灌注组与假手术组、电针治疗组比较, *P<0.01;电针治疗组与假手术组比较, **P<0.01。
采用线栓法建立动物模型。采用6%水合氯醛 (300mg/kg体重) 腹腔麻醉, 将大鼠仰卧位固定于动物手术台上, 常规消毒大鼠颈部皮肤, 颈正中切开, 分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。游离颈外动脉, 在颈总动脉近分叉位置剪一小“V”形口, 插入涂以硅胶的尼龙线进入颈内动脉, 深入以距颈总动脉分叉处1.8～2.0cm。60min后将尼龙线拔出进行血液再灌注。实验动物在规定时间点取血备用, 假手术组除不插尼龙线外余步骤同上。大鼠神经行为评分采用Kuluz神经缺陷三级评分标准。
1.3 治疗方法
电针治疗:将大鼠固定于自制束鼠器操作台上, 应用0.40mm×25mm不锈钢毫针, 针刺大鼠“百会”、“水沟”、“足三里”, 取穴参照《大鼠穴位图谱的研制》标准进行腧穴定位。针刺后接上海产G6805治疗仪, 以连续波, 频率为2Hz, 强度以大鼠肢体轻度抖动为度, 1次/d, 时间20min。假手术组和模型组不予治疗, 只做抓取1次。
1.4 血清TNF-α含量测定
三组大鼠分别于相应时间点进行腹动脉采血法采集血清标本3mL, 放于促凝管中, 冰冻保存备用。采用酶联免疫吸附法 (ELISA法) 检测血清TNF-α含量。
1.5 统计学方法
所有实验数据采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析。检验显著性水平定于P<0.05, 或P<0.01。
2 结果
缺血再灌注组结果示, 大鼠再灌注3h后, 血清TNF-α含量达到峰值, 在24h、72hTNF-α含量呈下降趋势, 但仍维持较高水平, 与假手术组、电针治疗组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。电针治疗组与缺血再灌注组进行比较, 再灌注3h、24h和72h后大鼠血清TNF-α含量下降, 两组各时间点分别对应比较, 差异均有统计学意 (P<0.01) , 提示电针治疗能够拮抗TNF-α生成, 使炎性反应程度和脑组织损伤程度减轻。具体见表1。
3 讨论
脑组织对缺血、缺氧等损伤敏感程度较高, 当脑血流阻断数秒后即可发生脑代谢改变。有研究表明, 脑缺血后白细胞浸润是缺血后级联式的炎性反应的特征[3]。TNF-α是机体内最主要的炎性介质之一, 是重要的促炎性细胞因子, 与炎症反应、血管反应及血栓形成的发生密切相关, 不仅能刺激内皮细胞的合成, 并释放白细胞介素1 (IL-1β) , 还可诱导细胞凋亡。再灌注后炎症反应可加剧脑损伤, 在脑缺血过程TNF-α能增加神经组织损伤程度[4]。
近年来, 针刺在中风病的临床及基础实验研究均取得了理想的效果。本研究采用电针疗法对脑缺血-再灌注大鼠模型进行干预。选用中风病常用腧穴。百会位于巅顶, 诸阳之会, 统领一身之阳, 且内系于脑;水沟居是督脉、手足阳明之会, 具有明显的醒神开窍作用;足三里属足阳明胃经, 阳明多气多血, 阳主动, 具有行气活血之功。三穴配合应用能起到醒脑开窍、通调经络、调和阴阳的作用。
本实验结果示, 大鼠脑缺血后, 3～72h血清TNF-α含量维持较高水平, 电针治疗组脑缺血再灌注模型大鼠血清TNF-α含量明显低于模型组。提示电针疗法能够降低脑缺血再灌注损伤后TNF-α含量, 使因TNF-α引起的炎症反应及脑组织损伤减少, 可能是电针防治脑缺血再灌注损伤的重要机制, 其确切关系有待于继续深入研究。
摘要：目的 探讨电针对脑缺血再灌注大鼠模型血清中TNF-α含量的影响。方法 采用线栓法建立脑缺血再灌注大鼠模型。随机分为缺血再灌注组、假手术组和电针治疗组。3组按再灌注时间3h、24h、72h的时间点抽血, 检测血清TNF-α含量。结果 大鼠再灌注3h后, 血清TNF-α含量达到峰值, 在3h、至72hTNF-α含量维持较高水平, 与假手术组、电针治疗组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。电针治疗组与缺血再灌注组进行比较, 再灌注3h、24h和72h后大鼠血清TNF-α含量下降, 两组各时间点分别对应比较, 差异均有统计学意 (P<0.01) 。结论 电针治疗能够拮抗TNF-α生成, 使炎症反应程度和脑组织损伤程度减轻。
关键词：缺血再灌注,针刺,TNF-α,模型大鼠
参考文献
[1]周利, 张红星, 刘灵光, 等.头针对急性脑缺血再灌注大鼠促炎性反应因子TNF-α、IL-1β含量的影响[J].针刺研究, 2008, 33 (3) :173-175.
[2]杨养贤, 延卫东, 乔晋, 等.黄芩苷对大鼠缺血再灌注脑组织TNF-α、IL-1β表达的影响[J].西安交通大学学报, 2005, 26 (3) :220-223.
[3]Mergenthaler P, Dirnagl U, Meisel A.Pathophysiology of stroke:lessons from animal models[J].Metab Brain Dis, 2004, 19 (3/4) :151-167.
模型灌注 篇7
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SD大鼠35只，由广州中医药大学动物实验中心提供[许可证号：SCXK（粤）2008-0020]雌雄不限，体质量（200±10)g。随机分为正常组（n=5）、对照组（n=15）、实验组（n=15）。
1.2 实验材料
常规手术器械、传统的微型动脉夹、改良后的新型动脉夹（图1）、2%戊巴比妥钠、注射器等。
1.3 颈总动脉阻断法建立全脑缺血再灌注模型
2%戊巴比妥（40mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰卧位固定。颈中切口，钝性分离筋膜，分离暴露双侧劲总动脉，然后使用动脉夹夹闭双侧的劲总动脉，同时开始计时，本实验缺血共计20min。正常组仅分离暴露劲总动脉，不进行夹闭；实验组采用新型的动脉夹进行夹闭；对照组采用传统的微型动脉夹进行夹闭。
1.4 达到全脑缺血所需时间的测定
当颅内供血出现不足时可观察到大鼠的眼球由红色变逐渐转变为白色或透明，由此可反映出全脑缺血的状态。通过夹闭双侧颈总动脉，在一定时间间隔内观察记录其眼球的颜色改变。
1.5 缺血过程中动脉夹的状况
在夹闭双侧颈总动脉的时候，由于CCA所在的位置较深，故夹闭后较容易出现松动、滑脱、夹闭不全等现象。缺血过程中需实时观察并记录动脉夹的夹闭情况。
1.6 统计学分析
所得数据使用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计数资料采用卡方检验进行分析处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠脑组织大体标本
正常组大鼠脑组织无肿胀，脑沟脑回清晰，皮层颜色较红润；浅表血管丰富，充盈好，鲜红；对照组大鼠脑组织皮层颜色微红、表面血管部分塌陷，血流减少程度不及实验组明显；实验组大鼠脑组织有明显肿胀，脑沟脑回表浅，皮层颜色苍白，表面血管塌陷，血流极少，部分基本无血流，出现血液无复流的现象见图2。
(A.正常组;B.对照组;C实验组)
2.2 各组大鼠达到全脑缺血所需的时间
实验组在10min内即达到全脑缺血状态的有4例，而对照组没有（P<0.05）；对照组在25min内还未达到全脑缺血状态即缺血失败的有3例，而实验组没有（P<0.05）；其余时间段内达到全脑缺血状态的两组间差异无显著性（P>0.05），但从总体的趋势可发现实验组较对照组在达到全脑缺血所需的时间更短。详见表1及图3。
注：二者相比，*P<0.05
2.3 各组缺血过程中动脉夹出现的情况
在缺血过程中，对照组有6例出现了动脉夹的松动，5例出现了动脉夹滑脱的现象；而实验仅有3例出现了动脉夹的松动，无滑脱现象。
3 讨论
现今急性心脑血管疾病由于其高发病率、高致残及致死率，给我国带来了极大的经济及社会负担[1]。目前针对心脑血管的基础研究越来越热门、广泛，在大部分实验中都采用SD大鼠来建立全脑缺血再灌注模型，其中的方法包括：二血管阻断加低压法、Pulsinelli四血管法、颈动脉负压法等，国外报道及运用较为多的是二血管阻断加低压法，因为此法较其他方法比较损伤小、对原有的血液流变学影响最轻，故更符合临床上的实际情况[2,3]。而此方法中涉及到对双侧颈总动脉（CCA）进行夹闭，由于双侧颈总动脉位于颈部较深的位置，分离后在夹闭时对动脉夹的要求较高，除了构造微小外对其夹闭性能也有较高的要求。在实际操作中，现有的微型动脉夹由于是平口设计，常存在夹闭不全的现象，并且由于CCA位置较深、周围组织多且血管比较光滑的缘故，常出现动脉夹松动、滑脱等现象，这严重影响了对血流的阻断作用，使脑组织缺血不完整，所以很难达到实验所需的要求[4]。本实验在现有的动脉夹基础上做了如下的改进。
在传统的微型动脉夹基础上增加了吻合口，其中包括由同一金属丝形成的夹身（图1中C+D）和夹口（图1中B），夹身由圆环（图1中D）以及从圆环伸出的两臂交叉(图1中C）后形成，夹口由交叉后继续延伸的两臂夹紧形成，在夹口的一臂上设有专门设立了凹槽(图1中A），夹口的另一臂上设有与凹槽相吻合的凸起(图1中A）。夹身、夹口、凹槽与凸起位于同一平面，凹槽为圆弧状，其边缘较为圆润，在夹闭的过程中能尽可能地降低对血管的机械损伤，圆弧的弧长及弧度可以根据所需夹闭的血管进行选择。与凹槽对应的凸起为实心凸起。并且为了进一步增加作用在血管上的面积，夹口的宽度大于夹身的宽度（此处的宽度是指侧面的宽度，即垂直于微型动脉夹所在平面的宽度），为夹身宽度的1.5～3倍。圆环与夹身两臂为同一金属丝绕成，因此两臂具有弹性，按压圆环两臂即可使夹口打开，松开圆环两臂即可使夹口关闭。夹闭血管时只需将血管置于凹槽内，通过凹槽与凸起的吻合即可达到阻断血流的效果。
通过在实验中的实际应用，观察、对比新型动脉夹与传统动脉夹的在缺血过程中的状况及相关参数，并结合实验结果，发现与现有技术相比，改良后的新型动脉夹具有以下优点：(1)现有的动脉夹为平口设计且夹口和夹身的宽度相同，作用在血管上的面积较小，而改良后的新型动脉夹由于夹口的宽度增加，夹闭时作用在血管上的面积增大；(2)在原有的基础上添加凹槽与凸起，进一步的提高阻断血流的效果，避免动脉夹的松动与滑脱；(3)夹口阻断处为圆弧设计，边缘较为圆润，可以进一步减轻夹闭过程中对血管壁的损伤。
综上所述，经改良后的新型动脉夹，通过添加吻合口可以有效的克服现有微型动脉夹夹闭不全、松动和滑脱等的缺陷，能够更好的发挥止血、夹闭血管的作用。其具体能够阻断血管内血流的百分比有待后续做血管造影等相关检查得出。
摘要：目的 评估新型带吻合口动脉夹在急性全脑缺血再灌注模型中的应用价值。方法 健康SD大鼠35只,随机分为3组:正常组(n=5):只暴露血管不夹闭;实验组(n=15):使用新型的带吻合口微型动脉夹进行夹闭;对照组(n=15):使用传统的微型动脉夹进行夹闭。采用颈总动脉(CCA)阻断法建立全脑缺血再灌注模型,分离暴露双侧颈总动脉后予以微型动脉夹夹闭,进入缺血期,夹闭20min后移去微型动脉夹去除双侧颈总动脉的夹闭,进入灌注期。实验结束后处死大鼠取全脑大体标本。观察大鼠达到全脑缺血所需的时间、脑组织大体标本、缺血过程中动脉夹的夹闭状况。结果 正常组大鼠脑组织大体标本皮层颜色较红润、浅表血管丰富;实验组大鼠脑组织皮层颜色苍白、表面血管塌陷,血流大量少,其中部分出现血液无复流的现象;对照组大鼠脑组织皮层颜色微红、表面血管部分塌陷,血流减少。实验组动脉夹在缺血过程中仅3例出现松动,而对照组动脉夹在缺血过程中有6例出现松动、5例出现滑脱。达到全脑缺血所需的时间实验组较对照组更快。结论 新型带吻合口动脉夹可以有效的对血管进行夹闭,使缺血更加彻底,并且在夹闭的过程中有较高的稳定性,可以有效的避免动脉夹的松动、滑脱等现象。
关键词：动脉夹,吻合口,缺血-再灌注模型
参考文献
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模型灌注 篇8
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康成年雄性SD大鼠45只,由山西医科大学实验动物中心提供,体重210g~260g。实验大鼠按照随机数字表法分为正常假手术组(Sham组)15只,糖尿病模型组(DM组)15只,糖尿病心肌缺血再灌注损伤模型组(DM+I/R)15只。
1.2 糖尿病大鼠模型的制备
SD大鼠在实验前12h禁食,DM组和DM+I/R组在空腹状态下通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),其浓度为0.1mmol/L,以枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液(pH=4.2)溶解STZ,按照60mg/kg剂量[2]进行注射,sham组大鼠经腹腔注射等量的枸橼酸钠缓冲液做对照。分别于造模前,注射STZ1周、2周、3周、4周后测空腹血糖、体重、尿量、饮水量。
1.3 糖尿病心肌缺血再灌注损伤大鼠模型的制备
选取4周后存活的3组大鼠,均麻醉后仰卧固定后行颈部正中气管切开,气管插管后连接ALC-V8型动物呼吸机(上海奥尔特生物科技有限公司)行机械通气,同时行右颈总动脉穿刺置管术,连接BL-410型生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)连续监测大鼠心率和血压。DM+I/R组开胸暴露心脏,于左心耳根部与肺动脉圆锥之间用6-0丝线结扎左冠状动脉前降支(LAD),心电图示ST段抬高、T波高耸,表明心肌已缺血。30 min后松开止血钳,复灌心肌,并持续120min,心电图示ST段明显下降,表明心肌再灌注成功。Sham组与DM组只在LAD下穿线。
1.4 空腹血糖、体重、尿量、饮水量的测定及成模率
注射STZ后分别测1周、2周、3周、4周大鼠的空腹血糖,实验期间每周称大鼠体质量并用代谢笼记录大鼠24h饮水量和尿量。以空腹血糖值≥16.7 mmol/L,并且有明显体重降低,多尿多饮为成模标准。实验期间动物的死亡数不计入成模率内,成模率=空腹血糖≥16.7mmol/L未死亡动物数目/实验动物总数。
1.5 心肌梗死面积百分比测定
再灌注120min后,经右颈总动脉逆行注入1%伊文氏蓝染液3mL,取出心脏,磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗之后,用电子天平称湿重,分离左心室,秤重后置于-20℃冰箱中冷冻15min,垂直心脏左心室长轴将每个心脏切成厚2mm厚薄片,置入1%四氮唑蓝溶液中,37℃恒温孵育15min。非缺血区为蓝色,缺血区内的非梗死区心肌成砖红色,而梗死区心肌细胞为灰白色。孵育结束后,取出心肌组织置于10%甲醛中固定12h,分离缺血区和梗死区,用天平精确称重,计算梗死区质量与缺血区质量的比值,即心肌梗死面积百分比(%)。
1.6 HE染色
再灌注120min后立即处死大鼠,取缺血区心肌组织,切成约1mm×1mm×1mm小块,石蜡切片行HE染色,光学显微镜下(×400)观察缺血区心肌病理学结果。
1.7 统计学处理
所有数据采用SPSS16.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示。组间均数比较采用方差分析,两两比较采用SNK法;组间率比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物数量分析与成模率
在糖尿病大鼠模型的制备过程中,根据大鼠腹腔注射STZ空腹血糖≥16.7mmol/L标准判断,有27只大鼠造模成功。在心肌缺血再灌注损伤大鼠模型的制作过程中,DM+I/R组中有2只大鼠在术中死亡,其余大鼠心电图示ST段明显下降,表明心肌再灌注成功。糖尿病模型成模率为90%,糖尿病合并心肌缺血损伤模型的总成模率为87%。
2.2 3组大鼠一般情况比较
Sham组大鼠随着时间的推移体重逐渐增加,比较活跃,毛发光亮洁白。糖尿病大鼠(DM组和DM+I/R组)造模1周后空腹血糖均>16.7mmol/L,并且在造模后1周、2周、3周、4周后稳定于较高水平,糖尿病大鼠(DM组和DM+I/R组)空腹血糖、体重、尿量与饮水量与同一时间点Sham组空腹血糖、体重、尿量与饮水量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。随着糖尿病程延长,大鼠活动减少,出现消瘦,皮下脂肪明显减少,皮毛松散,暗黄无光泽。详见表1。
2.3 3组大鼠心脏情况比较
与Sham组比较DM组和DM+I/R组大鼠体重、心脏湿重和左心室质量降低,DM+I/R组心肌梗死面积百分比增加(P<0.05);与DM组比较,DM+I/R组大鼠体重、心脏湿重和左心室质量比较差异无统计学意义(P>0.05),心肌梗死面积百分比增加(P<0.05)。详见表2。
2.4 心肌HE染色
光镜下Sham组心肌结构清晰整齐,染色均匀,细胞形态正常;DM组心肌纤维排列基本整齐,细胞轻度水肿,可见少量的炎症细胞侵润;DM+I/R组心肌细胞肿胀,心肌纤维弥漫性缺血坏死,排列不规则、断裂,形态扭曲,边界不清。详见图1。
3 讨论
糖尿病病人因胰岛素抵抗,可能通过改变体内糖代谢平衡、增加心肌细胞凋亡等机制损害血管及心肌细胞,并增加其对IRI敏感性[4],提示糖尿病加重IRI。目前临床上多以控制血糖防治糖尿病进一步恶化,但尚无缓解其加重IRI的方法。近年来研究者[5,6]采用大鼠作为研究对象,探讨药物处理对糖尿病心肌IRI的保护作用,因此建立稳定的糖尿病IRI模型至关重要。
STZ是一种广谱抗菌素,具有抗菌、抗肿瘤性能和致糖尿病的作用。STZ可选择性损伤胰岛β细胞,导致β细胞数量减少,胰岛素合成和分泌减少,最终导致糖代谢紊乱,血糖升高[7]。本实验结果显示:一次性给大鼠腹腔注射60mg/kgSTZ后,模型成功率为90%,其中1只大鼠血糖未升高,2只大鼠前2周死亡,死亡率为7%。其余大鼠4周内血糖均维持在较高水平范围,且第3周血糖波动明显,大鼠出现体重下降,进食量、饮水量和尿量增加等症状,与黄彦峰等[8]报道一致。模型的稳定性符合药效学研究的实验要求。
糖尿病病人发生IRI后,其心肌细胞死亡数量及心功能损伤程度均显著高于非糖尿病病人[1],直接表现为心肌梗死面积增加及心肌病理学损伤加重[9]。本研究在实验性糖尿病模型的基础上参考文献[3]制备IRI模型,结果显示,DM+I/R组大鼠体重、心脏湿重、左心室质量较sham组明显降低,表明糖尿病大鼠可能发生心脏器质性病变;心肌梗死面积百分比较Sham组和DM组明显增加,提示在糖尿病基础上结扎LAD可造成心肌的缺血性损伤。光镜下观察,Sham组和DM组心肌形态基本正常,而DM+I/R组心肌细胞肿胀,心肌纤维弥漫性缺血坏死,排列不规则、断裂,形态扭曲,边界不清,心肌病理学损伤加重,进一步表明本研究诱导糖尿病后心肌缺血再灌注损伤模型建立是成功的。
综上所述,通过对SD大鼠腹腔注射STZ并结扎LAD的方法成功建立糖尿病缺血再灌注损伤模型,该造模方式简单易行,成模率高,稳定性好,是糖尿病心肌缺血相关研究理想的动物模型。
参考文献
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