转移相关基因（精选十篇）
转移相关基因 篇1
关键词：胃癌,原发病灶,转移病灶,侵袭转移,nm23
1材料与方法
1.1材料
检测的胃癌组织, 来源于齐齐市哈尔铁路医院病理科标本及哈尔滨医科大学病理教研室2001至2004年积累的胃癌标本。45例胃癌组织, 以及相对应的胃癌已伴随转移的淋巴结组织。男30例, 女15例, 男∶女为2∶1。最大年龄84岁, 最小年龄37岁, 平均年龄56.8岁。45例胃癌组织, 均为浸润性胃癌, 组织学的分化程度:高、中分化腺癌18例;低分化腺癌20例;黏液腺癌3例;印戒细胞癌4例。所有45例胃癌组织, 均伴有不同程度的淋巴结转移。
1.1.1主要试剂
(1) 0.01mol/L PBS缓冲液 (pH=7.4) ; (2) 0.01mol/L柠檬酸盐抗原修复液~p H=6.0) ; (3) 小鼠抗人nm23单克隆抗体 (武汉博士德生物技术有限公司) ; (4) 即用型第二代免疫组织化学Elivision TM plus试剂盒~迈新生物技术有限公司) ; (5) 辣根过氧化物酶显色剂DAB (福建迈新生物技术有限公司) ; (6) 1%伊红染液; (7) 苏木素染液。
1.1.2主要仪器
(1) 滑动切片机, 德国; (2) 万能显微镜, 日本; (3) 生物显微镜, 日本; (4) 电子天平, 中国; (5) 微波炉, 中国; (6) 微量加样器, 日本。
1.2方法
1.2.1 HE染色 (苏木素-伊红染色)
以上所检肝组织均是由10%甲醛固定、按常规制备HE切片, 具体步骤如下: (1) 脱腊:二甲苯~Ⅰ) 15min→二甲苯~Ⅱ) 15min→二甲苯 (Ⅲ) 15min→二甲苯 (Ⅳ) →100%乙醇5min→95%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→自来水洗。 (2) 染色:苏木素液8min→自来水洗片刻→1%盐酸酒精分化1~2min→自来水洗片刻→0.5%伊红1min→自来水洗。 (3) 脱水、透明、封固:90%乙醇片刻→95%乙醇片刻→100%乙醇5min→100%乙醇5min→二甲苯10min→二甲苯10min→树脂胶封固。
1.2.2免疫组织化学
本实验按胃癌的原发部位和转移部位分为两组, 各45例。免疫组织化学采用s ABC~streptomycin avidin biotin-peroxidase complex) 法, 分别检测两部位nm23的表达情况。
具体步骤如下: (1) 常规组织切片后, 置于65℃烤箱中烘烤4~8h。 (2) 二甲苯脱蜡至水, 后用PBS冲洗。 (3) 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min, PBS冲洗 (5min×3) 。 (4) 采用微波抗原修复法。 (5) 自然冷却至室温, PBS冲洗 (5min×3) 。 (6) 用正常血清封闭15min。 (7) 加一抗, 4℃过夜。 (8) 用PBS冲洗 (5min×3) 后, 加二抗生物素, 室温30min。 (9) 用PBS冲洗 (5min×3) 后, 加辣根过氧化物酶, 室温15min。 (10) 用PBS冲洗 (5min×4) 后, DAB显色。流水去DAB, 苏木素复染, 流水冲洗10min。二甲苯透明, 封片。
1.2.3阳性结果的判定
nm23的表达以细胞胞质呈明显棕黄或棕褐色着色为阳性细胞, 每张切片均在癌细胞区着色细胞数占癌细胞总数比≥25%判定阳性。
1.2.4数据处理
用χ2检验和spearman统计分析, 当P<0.05时, 有显著性差别。
2 结果
2.1 45例胃癌病理组织学
45例胃癌原发部位组织, 高、中分化腺癌18例, 低分化腺癌20例, 黏液腺癌3例, 印戒细胞癌4例。45例胃癌组织, 每一例都有不同程度的淋巴管侵入和淋巴结转移, 即2/5、4/7、1/4、5/6 (分母为所获取的淋巴结数目, 分子为转移的淋巴结数目) 等。转移致胃小弯的淋巴结有6例;转移致胃大弯的淋巴结有10例;转移致胃小弯淋巴结和胃大弯的淋巴结有15例;转移致胃全周的淋巴结有14例。
2.2 45例胃癌组织nm23在原发部位与转移淋巴结中免疫组织化学检测
在胃癌的原发部位, nm23的阳性表达有26例 (26/45, 57.8%) , 在胃癌的侵入淋巴管图和转移致相应的淋巴结中, nm23的阳性表达有27例 (27/45, 60.0%) , 见表1。
3 讨论
肿瘤细胞具有侵袭和转移的能力, 这是恶性肿瘤最基本的生物学特性, 而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因[1,2]。因此, 研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制, 对恶性肿瘤的防治有重要意义。
肿瘤侵袭 (tumor invasion) 是指恶性肿瘤细胞从其起源部位沿组织间隙向周围组织浸润的过程, 其标记是肿瘤细胞突破基底膜, 这是肿瘤扩散的第一步。肿瘤转移 (tumor metastasis) 是恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔, 至靶组织或靶器官, 长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。肿瘤侵袭和转移是两个既有联系而又是不同特点的过程。侵袭性生长是转移的前提和基础, 转移则是侵袭的继续和发展。
肿瘤侵袭和转移的机制, 特别是分子机制虽尚未彻底阐明, 但已获得相当丰富的研究材料, 取得较大的进展。如瘤体内的压力作用;瘤细胞黏着性降低;癌细胞的迁移;细胞黏附分子与肿瘤侵袭和转移;细胞外基质的降解;机体的免疫状态与肿瘤的侵袭和转移等。
到目前为止, 胃癌仍是我国发病率最高的恶性肿瘤, 也是导致人类由于肿瘤死亡的头号杀手[3]。近30年来, 对胃癌的诊断、治疗有了长足的进步, 但侵袭转移和复发仍是影响预后的一个重要因素, 且其过程非常复杂。近年来, 随着细胞生物学和分子生物学的发展, 对此已有了较深刻的认识, 尤其是肿瘤的侵袭和转移。
胃癌的侵袭转移与其他许多恶性肿瘤一样, 是一个多因素、多阶段、多种基因变异积累形成的综合病变过程, 在此, 多种因素参与其中。胃癌细胞脱离原发部位, 其黏附力下降, 也是多因素、多阶段、多种基因变化的结果[4,5,6], 如肿瘤抑癌基因的激活;某些癌基因的活化;一些基因的异常表达等。但是, 胃癌侵袭转移的具体分子机制尚不清楚, 多数专家研究曾提出与胃癌侵袭转移呈正、负相关的一些因素, 如正相关因素有:在各期胃癌中均可出现的抑癌基因p53基因突变;参与信号传导系统的原癌基因c-erb B2;降解局部基质, 促进癌细胞的迁移的基质金属蛋白酶2;介导癌细胞与基质间的异质黏附作用, 也能与细胞内骨架蛋白结合, 调节细胞移动和增殖, 影响肿瘤侵袭和转移的CD44v6;在癌细胞周围的细胞间质和基底膜的破坏过程中起重要作用的尿激酶型纤容酶原激活物 (u-PA) ;在ECM降解及血管生成调节中起重要作用的u-PA的抑制剂 (PAI-1) 。负相关的因素的:上皮钙黏附素 (E-cadherin, E-cad) 的黏附力下降;基质金属蛋白酶组织抑制剂2的异常表达;整合素 (integrin) 蛋白的过度表达等。而nm23RNA基因表达水平与肿瘤转移能力呈负相关。nm23等位基因缺失及突变与肿瘤转移能力呈正相关。
经SPSS软件分析, P=0.459
本实验研究结果发现, nm23蛋白与胃癌肿瘤的大小、发生部位、淋巴结转移均无关, 而且在已发生远处转移的胃癌组织中nm23蛋白与原发部位的表达非常相近 (分别是57.8%和60.0%) , nm23在胃癌的原发部位表达率到转移到远处部位的表达率无差异, 认为nm23蛋白在胃癌转移发生过程中可能没有起到抑制作用。这一实验结果与少部分学者的研究结果相一致。关于nm23在肿瘤中的作用机制, 有必要同时检测原发和转移部位的癌组织的蛋白表达和基因表达情况, nm23在不同癌细胞中的表达情况, 如胃肠道系统的恶性肿瘤;肺癌、肝癌、肾癌等, 进一步证实nm23在肿瘤转移过程中的作用机制。
总之, 肿瘤侵袭和转移是肿瘤病人的主要死因, 它是一个癌细胞与宿主细胞之间相互作用的过程, 是多因素、多基因综合作用的结果, 其机制十分复杂。认识与胃癌预后相关的生物学特征, 将为揭示胃癌侵袭转移本质奠定基础, 同时为肿瘤的根治治疗提供科学的理论依据。
4 结论
(1) 45例胃癌组织, 均为浸润性胃癌, 都伴有不同程度的淋巴结转移。 (2) 在45例原发部位的胃癌组织中, nm23阳性表达率为57.8% (26/45) 。在45例转移至淋巴结内的胃癌组织中, nm23阳性表达率为60.0% (27/45) 。 (3) nm23在胃癌转移发生过程中是否起到起到抑制作用, 有待于进一步研究。
参考文献
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植物基因是如何转移的？ 篇2
转移植物基因的两种方法
一种或多种外源性基因是如何转入另一种植物（作物）体内的呢？可以用一种通俗的比喻来解释。
例如，人类社会是由无数个家庭组成的，每个家庭都有固定的家庭成员，除了血缘的紧密纽带关系外，还有经济和其他的关系把家庭成员固定在一起，家庭成员不会轻易分离，同时一个家庭也不会让陌生人进入。一旦有另一名成员进入一个稳定的家庭，除非是特别亲近的亲属关系或收养关系，都会受到这个家庭成员的排斥，不可能被这个家庭接受，所以被称为“第三者”。
一种植物体内的染色体（DNA）中的基因也是固定的，轻易不能分开和分解，一个或几个外源性基因就是第三者，一般是不会被一种受体植物所接受的，如果受体植物发现了外源性基因，就会用自身的武器，如DNA酶来降解（杀灭）外来基因。因此，为了有效转移外源性基因，如将外源性的抗虫基因——苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）转移到棉花中，就得采取两种办法。一种是载体转移（包装法或间接法）；另一种是直接转移，或强行转移。
用载体作为媒介进行基因转移就是将目标基因连接或包裹于某一载体DNA中，载体通常是微生物，然后通过载体感染受体植物，将外源性基因转入植物细胞。直接转移是利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源性基因转入植物细胞。
所以，前一种方法是包装法，也是一种蒙蔽或欺骗方法；后一种方法是强硬的，有一点像陌生人或强盗强行闯入别人的家庭，并登堂入室，占据主要位置，或者说反客为主。
载体转移
载体转移又称为农杆菌载体转移。20世纪70年代末80年代初，研究人员发现，野生型Ri（根诱导）和Ti（瘤诱导）质粒可以转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株，此后，以Ti质粒为载体的植物转基因技术逐渐得到应用。今天，农杆菌介导的转基因法是最主要的一种载体转移方法。利用经过改造的农杆菌Ti和Ri质粒为载体可以高效地转移外源性基因。
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，分为根癌农杆菌和发根农杆菌，它们的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒。根癌农杆菌中的Ti质粒可以转化植物细胞而产生冠梁瘤，发根农杆菌的Ri质粒可以侵染双子叶植物而产生大量的不定根（或称之为毛状根）。
无论是Ti质粒还是Ri质粒，其上有一段转移DNA（T-DNA），农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将转移DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代，这就让农杆菌可以把一种或多种外源性基因转移到某种受体植物中。
最初研究人员发现，当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，因而吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中Ti质粒上的转移DNA转移到受伤的植物细胞（受体细胞），并且整合到受体细胞染色体的DNA中。在自然条件下农杆菌只是感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
因此，如果将一段目标基因（外源性基因）插入到Ti质粒的转移DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目标基因进入受体植物细胞，并将其插入到受体植物细胞的染色体中，使目标基因的遗传特性得以稳定维持和表达。抗虫的Bt基因就是这样被转移到棉花或玉米中的。当然，农杆菌介导法起初只用于双子叶植物的基因转移，但是，近年来随着基因工程技术的发展，农杆菌介导的转基因也在一些单子叶植物，尤其是水稻中得到广泛应用。
利用载体对植物进行外源性基因的具体转移过程如下：
一是获取目标基因，即在目标基因被克隆后，用限制性核酸内切酶切割下目标基因。
二是把目标基因与载体相连（构建载体），即用DNA连接酶将目标基因与载体（大多数选用质粒）连接起来。
三是将目标基因导入载体细胞，即把含目标基因的重组质粒导入农杆菌细胞。
四是对目标基因进行检测与鉴定，用DNA分子杂交技术和抗原-抗体杂交技术进行个体生物学水平鉴定，以确定农杆菌细胞中是否包含目标基因。
五是将成功表达外源性基因的农杆菌细胞导入受体植物（如棉花）内，然后再对受体植物进行目标基因的生物学鉴定，如果受体植物中有目标基因的表达，说明转基因获得成功。
目前，利用农杆菌载体进行外源性基因的转移是采用得最多的植物转基因方法。当然，除了Ti质粒和Ri质粒为载体的基因转移外，还可以用脂质体为载体进行基因转移。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，因此可将目标基因包装在脂质体内以避免受体植物细胞中的DNA酶将目标基因降解，从而保证目标基因转入到受体植物的细胞中。
所以，无论是利用农杆菌载体进行转基因，还是利用脂质体为载体进行转基因，都是通过包装的方法进行基因的转移，也能避免受体植物中的DNA酶排斥外源性基因。
直接转移
把外源性基因直接转移到另一种植物中也是一种强行转移。这正如陌生人要进入一户人家，没有钥匙进不了门，没有经过主人允许和开门也进不了门。但是，还有一种方法能进门，即强行入门，强行的方法就包括，撬掉门锁、敲碎窗户以及翻墙进入等。外源性基因的直接转移就是如此。
直接转移一种外源性基因到受体植物中也有多种方法，包括电穿孔法、基因枪法和微注射法（子房注射法）等。
1.电穿孔法
电穿孔法指的是，细胞在外加高压电脉冲电场的作用下，细胞膜表面产生疏水或亲水的105～115微米微小通道，这种通道能维持几毫秒到几秒，然后自行恢复。在此期间生物大分子如基因片段可通过这种微小的通道进入细胞，因此能把外源性基因转入受体植物体内。
现在，这种方法已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物的基因转移，同时也应用于动物的基因转移。早在1995年，美国农业部研究所就用这种方法把两种着色剂——锥虫蓝和荧光素二乙酸盐直接转入到大豆、紫花苜蓿、烟草3种植物的细胞中，并获得高水平的基因表达。到了20世纪80年代末，研究人员也用电穿孔法将新霉素磷酸转移酶基因转入玉米自交系的原生质体，从而生成植株。此后，抗草甘膦除草剂的转基因大豆、棉花、玉米和油菜等也相继问世并获得广泛种植，方法也是采用电穿孔法。
现在，抗草甘膦除草剂的转基因作物已成为全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦杀死杂草的原理在于竞争性抑制植物叶绿体或者质体中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），这种酶是多种植物和杂草所共同拥有的。通过转基因的方法，让受体作物如棉花、玉米、大豆产生更多的EPSPS，就能抵抗草甘膦，从而让作物不被草甘膦除草剂杀死。有了这样的转基因棉花、玉米和大豆，农民就不必使用多种除草剂，只需使用草甘膦一种除草剂就能杀死多种杂草。
2.基因枪法
基因枪法又称粒子轰击技术，是用粒子枪把表面吸附有外源性基因的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于根癌农杆菌仅对某些双子叶植物敏感，而对多数单子叶植物不敏感，从而限制了根癌农杆菌Ti质粒介导法（农杆菌载体）转移基因。但基因枪法不受宿主限制，宿主既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，它们也即受体植物。
基因枪法可控度高，同时不需要去除受体植物细胞的细胞壁，被转化的细胞或组织容易再生成植株。基因枪轰击过程中可根据需要将射弹射入特定层次（位置）的细胞，有利于提高转化效率。基因枪法操作简单、迅速，但费用较高。基因枪法主要用于转移植物基因，也可用于对动物、微生物等的基因转移。
现在利用基因枪法转基因技术获得的转基因园艺植物较少，只有杨树、云杉等，而获得的转基因水稻、玉米、烟草、大豆、木薯等作物较多。基因枪法现在还存在转化效率低、外源性基因向植物中插入不够精确和稳定性不高等缺点。
3.子房注射法
子房注射法也称微注射法。子房是被子植物生长种子的器官，位于花的雌蕊下面，一般略为膨大。子房里面有胚珠，胚珠受精后可以发育为种子。子房由子房壁和胚珠组成。当传粉受精后，子房发育成果实。子房壁最后发育成果皮，包裹种子，有的种类形成果肉，如桃、苹果等。
子房注射法就是使用微注射针或显微注射仪将外源性基因注入处于减数分裂期的受体植物的子房中，借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力，外源性基因可进入受精的卵细胞中，借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象，外源性基因被随机整合到受体作物的染色体上。
20世纪90年代，一些Bt转基因玉米就是用子房注射法进行转基因的，这种转基因玉米可以抗御玉米螟的啃食。目前，子房注射法成功用于玉米、甜瓜和黄瓜等农作物的转基因育种。
子房注射法的步骤是，制备目标基因；根据受体植物受精后其子房的变化特点，确定最佳时间进行外源性基因注射或将离体的受精子房进行外源性基因注射，再对该离体子房进行培养；转化种子及对后代的外源性基因和其表达产物进行分子检测。
子房注射法无需组织培养过程，操作过程简单、便捷，但田间转化过程的工作量大。转化过程中，子房受到机械性伤害易导致转化率和结实率低；易产生基因污染，而且该方法只能在授粉期进行，容易受季节和天气等自然条件影响。由于后代群体规模较大，筛选过程工作量较大。
转移相关基因 篇3
关键词：胃癌肝转移,基因表达,Runx3
胃癌占我国恶性肿瘤的第一位, 肝脏是胃癌最常见、最易发生的转移器官, 肝转移者预后尤差[1]。最近, 科学家们又发现了一种被称为Runx3的基因可能与胃癌的发生相关[2]。我们采用逆转录-多聚合酶链反应 (RT-PCR) 观察Runx3基因在人正常胃黏膜组织、原发性胃癌 (GC) 和胃癌肝转移组织 (ML) 组化的表达情况, 并分析其与临床病理因素的相关性, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 组织来源
3 2例诊断为胃癌肝转移患者的正常胃黏膜组织、原发性胃癌 (GC) 和胃癌肝转移组织 (ML) 来自我院2009年8月至2010年8月的手术标本, 均经病理证实明确诊断。脱氧核苷酸 (dNTPmix) 购自Takaro公司;RT-PCR试剂盒购自Promega公司;DNAmarker购于美国Santa Cruz公司产品;琼脂糖、TRIzol试剂及焦碳酸二乙酯 (DEPC) 购于美国罗氏-葆灵曼公司。PCR仪Gene Amp PCR system2700国产电泳仪;紫外可见分光光度仪PharmaciaBiotech公司;Beckman Microfuge高速冷冻离心机。
1.2 扩增引物设计
根据Genebank上登录的Runx3序列设计采用Primer premier5.0软件设计引物:Runx3引物序列:上游引物:5’-GGTGAAGTCTTGCCC CTGAA-3’, 下游引物:5’-ATGAGTTCCCTTACGCCTTTT-3’;β-actin引物序列:上游引物:5’-GCGCGGCTACAGCTTCAC-3’, 下游引物:5’-GGGGCCGGACTCGTCATA-3’。
1.3 Trizol法提取总RNA
取出保存的组织标本90 mg, 剪碎后放入玻璃匀浆器中, 再加入1mLTRIzol进行研磨。匀浆后液体置入灭菌微量离心管 (EP) 中, 室温下静置5min, 加入200μL氯仿, 12000r/min 4℃离心15min。取上层水相移入另一灭菌EP管中, 加入0.5mL的异丙醇, 在12000r/min 4℃离心15min, 弃掉上清液, 沉淀半干燥, 倒入50μL水溶解。经电泳证实有三条明显的r RNA带, 5S、18S及28S条带, 三条带间可见拖尾现象。
1.4 RT-PCR扩增
RhoC mRNA及鉴定PCR反应体系包括, 26.0μL自由水;2.5μL DTT 1.0μL dNTP;上、下游引物各4.0μL;10.0μLRT-PCR Buffer;1.5μL模板RNA;1.0μL酶, 配制完成后进行扩增。扩增反应条件:50℃30min, 94℃5 min, 94℃30s, 58℃1min, 72℃1min, 72℃6min, 35个循环。扩增完毕后每个EP管取样7.0μL用于1.5%的琼脂糖电泳。样品的电泳图像用分子定量成像系统进行摄取, 最后利用分析软件计算样品中Rho C m RNA与β-actin的吸光度的比值。以此得到每对样品中癌旁胃黏膜组织、胃癌组织及肝转移灶组织Rho C mRNA表达的相对含量。为增加样品的可比性, 我们使用紫外可见分光光度仪检测RNA的含量及纯度, 当A260nm/A280 nm比值>1.8时样品视为合格。另外, 这种方法, 逆转录与扩增在同一个PCR管中进行, 保证扩增时模板量是一致的。
1.5 统计学处理
应用SPSS13.0软件对数据进行处理, 对计量资料采用t检验, 计数资料采用χ2检验进行组间比较, P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
2.1 Runx3 mRNA的表达
RT-PCR产物中Runx3条带长290bp;β-actin条带长407bp。以β-actin条带为内参照, 各样品的RT-PCR产物由分子定量成像系统分析, 将吸光度值定为1.000, 计算Runx3 mRNA表达的相对吸光度。正常胃黏膜组织的吸光度相对值为 (0.9747±0.0129) , GC组织中Runx3m RNA吸光度相对值为 (0.6346±0.0131) , ML中Runx3 mRNA吸光度相对值为 (0.4106±0.0216) , 正常胃黏膜中表达水平高, 在原发胃癌和胃癌转移组织中均表达水平较低;在胃癌肝转移组织标本中, Runx3基因表达低于原发胃癌组织, 其差异有统计学意义 (P<0.05) 。
注:▲P<0.05
2.2 Runx3基因表达与临床病理因素的相关性
RUNX3基因m RNA表达水平均在浸润周围组织、分化程度、肝内转移、门静脉癌栓等病理因素差异有统计学意义 (P<0.05) , 而在肿瘤部位、肿瘤直径、组织分型的差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。
3 讨论
众所周知, 肿瘤的发生发展是一个多步骤、多因素相互作用的复杂过程, 而在这个过程中最危险的变化就是肿瘤从局限生长型转变成致命的转移型[3]。在肿瘤转移这一复杂的转变过程中发生了许多重要改变, 使肿瘤细胞完成了转移所需的一系列复杂变化[4], 包括肿瘤细胞黏附细胞外基质降解、细胞迁移、细胞增殖及肿瘤血管形成等几个方面。采用先进技术或方法探索与胃癌肝转移相关的基因, 探明其转移的分子机理, 及时诊断、防止胃癌肝转移, 必将有利于胃癌肝转移的综合治疗。
Runx3是一种促进分泌消化酶的基因, 动物实验表明, 这种基因如果失去活性, 细胞数量的调节就会发生障碍, 胃内细胞就会不断增殖和侵袭, 以致发生胃癌及其远处转移[5]。而这种基因随癌症的进展表达数量越来越少, 提示Runx3是一种肿瘤抑制基因, 它的失活可能导致胃癌的发生和侵袭, Runx3作为一个新发现的抑癌基因, 调控细胞的生长发育和细胞的凋亡, 对细胞的信号转导和其他生物学效应有着重要而复杂的转录调节作用[6]。Runx3的缺失或失活可以导致胃黏膜上皮细胞增生和分化异常一, 进而参与胃癌的发生过程。Runx3基因杂合性缺失与表达研究证实, 在人类许多癌细胞株和癌组织中存在Runx3基因杂合性缺失, 包括大肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌和肺癌等, Runx3杂合性缺失与这些癌细胞株或癌组织中的Runx3表达下调有关。本研究结果发现, 正常胃黏膜中表达水平高, 在GC和ML中均表达水平较低;在ML标本中, Runx3基因表达低于GC, 其差异有统计学意义 (P<0.05) 。RUNX3基因mRNA表达水平均在浸润周围组织、分化程度、肝内转移、门静脉癌栓等病理因素差异有统计学意义 (P<0.05) , 而在肿瘤部位、肿瘤直径、组织分型的差异均无统计学意义 (P>0.05) 。浸润周围组织、分化程度、肝内转移、门静脉癌栓等4种临床病理因素和肝癌的恶性度有着紧密的联系, 证明RUNX3基因mRNA表达水平伴着肝癌恶性度的增加而下调, 因此RUNX3基因可能是一种肝癌抑制基因, 并可作为判定胃癌转移的指标。
参考文献
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协助执行产权转移相关问题探讨 篇4
金绍达：法院拍卖房屋时，拍卖的买受人一般不是案件的当事人，因此有些买受人并不重视房屋所有权的转移登记。本来，协助法院执行的登记并不要求当事人申请，但是，有些登记机构担心在受让人还没有缴纳契税时，我们就凭法院生效法律文书和协助执行通知书先给办理转移登记不妥。因为《契税暂行条例》第十一条规定了“纳税人未出具契税完税凭证的……不予办理有关土地、房屋的权属变更登记手续”。而实际上这一担心是没有必要的。
第一，对于依人民法院生效的法律文书登记问题，最高人民法院、国土资源部、建设部联合下发的法发〔2004〕5号文规定了两种情况。一种是按该文件第二十七条的规定，“人民法院应当明确告知权利受让人及时到国土资源、房地产管理部门申请土地、房屋权属变更、转移登记”。这是由当事人自行申请，和正常的登记只有一个差别就是受让人可以单方申请，但申请登记的要件应当齐全。另一种是按该文件第一条规定，“人民法院在办理案件时，需要国土资源、房地产管理部门协助执行的，国土资源、房地产管理部门应当按照人民法院的生效法律文书和协助执行通知书办理协助执行事项”。协助人民法院执行是司法权的延续，也是登记机构应尽的义务，登记机构无须按正常的程序和要件就可以办理。亦即登记的要件不齐全（如没有上一手的权属证书）或是不经正常的登记程序（如当事人一方或双方都不提出登记申请），登记机构都可以办理。
第二，《物权法》第二十八条规定了“因人民法院……的法律文书……导致物权设立、变更、转让或者消灭的，自法律文书……生效时发生效力”。人民法院要求登记机构协助执行的是已经生效的法律文书，在登记机构还没有协助执行之前，在法律上，被执行的房屋所有权已经转移为受让人所有。但是在登记簿上所记载的仍然是被执行人，这就造成了实际权利状态和不动产登记簿所记载的权利不一致，如果长期不予协助，一旦其他法院将该房屋仍然作为被执行人的房屋进行查封，登记机构就很难处理。
《契税暂行条例》规定了承受土地和房屋的单位和个人为契税的纳税人，契税是行为税，只要行为成立，即使不办理不动产登记，也应当缴纳。因此，可以按《契税暂行条例》第十二条的规定，“土地管理部门、房产管理部门应当向契税征收机关提供有关资料，并协助契税征收机关依法征收契税”。由登记机构向契税征收机关提供相关资料，并在今后权利人领取权属证书时，要求权利人提供纳税凭证。
转移相关基因 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集解放军第八一医院全军肿瘤中心2008年1月~2010年3月的186例肺癌切除手术标本。男137例, 女49例, 年龄31~75岁, 中位年龄55岁。肺鳞癌105例, 其中低分化42例, 中分化37例, 高分化26例。肺腺癌81例, 其中低分化35例, 中分化32例, 高分化14例。TNM分期:Ⅰ期40例, Ⅱ期72例, Ⅲ期61例, Ⅳ期13例。同时收集23例距肿瘤边缘>5 cm处的正常肺组织为对照。
1.2 试剂
羊抗人MTA1多克隆抗体和VEGF-C多克隆抗体均购自Santa Cruz公司, 即用型免疫组化超敏S-P试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物试剂开发公司。柠檬酸抗原修复缓冲液、PBS缓冲液、苏木素染色剂、中性树胶封片剂、多聚赖氨酸、石蜡、各种浓度乙醇、甲醛等, 均来自解放军第八一医院病全军肿瘤中心的病理科。
1.3 方法
1.3.1 组织芯片制作
从病理科的存档中选取各型非小细胞肺癌蜡块, 同时调阅相应的HE染色组织切片及患者的病历资料, 同时新近收集肺癌及正常肺组织制备组织蜡块。将所有非小细胞肺癌组织蜡块分类登记, 按文献要求进行设计[4]。对每一组织标本, 均先观察苏木精-伊红切片以确定肿瘤部位, 每一例肺癌蜡块选取4点、正常组织蜡块选取2点, 共制成20×12阵列块。
1.3.2 免疫组化方法
采用S-P方法, 柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复。在染色中, 各种抗体染2张TMA的连续切片。另外还选择了10例相应非小细胞肺癌组织标本, 作常规HE切片染色来验证组织代表性。阴性对照以PBS代替一抗。阳性对照以相应抗体的已知阳性切片作对照。结果判定:以非小细胞肺癌胞核或胞浆内出现黄色至棕褐色颗粒, 定位较明确、染色明显的切片视为表达阳性。表达强度的分析, 笔者采用每个切片选取5个视野, Image-Pro Plus (Media Cybe Netics Inc, USA) 图像分析系统进行分析, 测算单位面积平均光密度 (OD) 值。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 12.0处理。计数资料采用百分率表示, 组间对比采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MTA1蛋白的表达
MTA1蛋白表达定位于非小细胞肺癌的细胞核, 呈明显的棕黄色颗粒状。23例正常肺组织中均无阳性表达。在186例非小细胞肺癌中, 共有阳性染色103例 (阳性率为62.8%) ;其中有淋巴结转移的117例非小细胞肺癌中, MTA1表达阳性的共有83例 (阳性率为70.9%) , 无淋巴结转移的69例非小细胞肺癌中, MTA1表达阳性的共20例 (阳性率为29.0%) 。MTA1蛋白的表达与肿瘤病理学各参数间的关系见表l。MTA1蛋白阳性表达在年龄、性别、病理组织类型方面无差异, 但是在非小细胞肺癌的TNM分期、分化程度以及淋巴转移情况等方面差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图1、表1。
2.2 VEGF-C的表达
VEGF-C蛋白阳性染色为棕黄色颗粒, 主要定位于细胞浆。在186例中有119例染色阳性 (64.0%) , 23例正常肺组织中4例阳性表达 (17.4%) , 两者比较差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。有淋巴结转移的117例非小细胞肺癌中, VEGF-C阳性者共98例 (阳性率为83.8%) , 无淋巴结转移的69例非小细胞肺癌中, VEGF-C阳性表达共21例 (阳性率为30.4%) 。VEGF-C蛋白的阳性表达与肿瘤病理学各种参数间的关系参见表l。VEGF-C蛋白的阳性表达在年龄、性别、病理类型、分化程度方面差异无统计学意义 (P>0.05) , 但是在非小细胞肺癌TNM分期、淋巴结转移情况等方面差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图2、表1。
2.3 MTA1蛋白和VEGF-C蛋白阳性表达的相关性
对MTA1、VEGF-C蛋白表达OD值进行了Pearson相关分析, 结果表明两者有相关性 (r=0.175, P<0.01) 。
3 讨论
肺癌的五年生存率仅为16%[5], 而非小细胞肺癌 (NSCLC) 占全部肺癌的80%。影响生存的主要原因是肺癌的浸润和转移。肺癌淋巴结转移状态是一个重要的预后因素, 由于肺内淋巴系统发达, 极易发生淋巴结转移。因此, 阐明肺癌淋巴结转移的分子机制有着重要的临床意义。
VEGF-C是被公认的促淋巴管生成因子, 主要通过其受体VEGFR-2和VEGFR-3发挥作用, 可促进肿瘤微淋巴管生成及肿瘤细胞向区域淋巴结的转移, 并且能够通过淋巴系统向全身各处进行广泛的转移与扩散[6]。Weryńska等[7]研究表明, 肿瘤细胞能够促进淋巴管生成的调控因子VEGF-C的表达, 从而诱导淋巴管新生, 被诱导生成的淋巴管进一步促进了肿瘤淋巴结的转移状况。VEGF-C还可以促进淋巴内皮细胞在肿瘤细胞密集区内的大量生成, 同时可以导致淋巴管明显扩张, 由于新生微淋巴管的结构尚没有发育完善, 依然是高渗漏的状态, 从而利于肿瘤细胞渗漏入淋巴管, 导致转移的发生[8]。
笔者研究显示, 非小细胞肺癌组织中VEGF-C的阳性表达率为64.0%, 正常组织为17.4%。两者比较差异有统计学意义 (P<0.01) , 提示VEGF-C在NSCLC的发生中起重要作用。VEGF-C在性别、年龄、病理组织类型、分化程度方面无差异;VEGF-C蛋白的阳性表达与非小细胞肺癌的TNM分期、淋巴结转移均有显著相关性 (P<0.01) , 说明VEGF-C蛋白在肿瘤的浸润转移中起着显著的作用。
肿瘤转移相关基因1 (MTA1) 是一个在肿瘤转移过程中表达上调的基因, 1993年第一次应用差异杂交的技术, 从鼠乳腺癌细胞株13762NF中分离出一种新的乳腺癌转移相关基因[9]。随后, Toh等[10]应用Southern技术, 找到了其相应的同源基因, 该基因的表达与乳腺癌转移能力呈正相关, 故被命名为MTA1。现已证实MTA1与各种肿瘤的转移密切相关, 并且在信号转导通路中起到相应的作用。Yu等[11]检测INSCLC中MTA1蛋白表达水平, 结果提示, 该基因的表达与NSCLC的分化程度密切相关, 而与患者的年龄、性别和病理类型无相关性。Song等[12]应用免疫组化方法检测了174例食管癌中MTA1表达, 发现MTA1在淋巴结转移患者的过度表达显著高于无淋巴结转移患者。
本研究应用免疫组织化学法检测186例NSCLC患者癌组织中和23例正常肺组织中MTA1蛋白的表达情况, MTA1在非小细胞肺癌的正常肺组织未见表达。在癌组织中的阳性表达者为103例 (55.4%) , 与正常组织相比, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 提示了MTA1基因在非小细胞肺癌的发生和发展过程中起到了一定作用;而在不同性别、年龄及组织学类型中的表达差异无统计学意义 (P>0.05) 。另外, 本研究发现, MTA1蛋白在低分化癌组织中的阳性表达率明显高于中高分化组织 (P<0.05) , 说明MTA1蛋白表达与肺癌的分化程度密切有关, 提示MTA1蛋白可能与抑制癌细胞的分化成熟有关;经临床病理分析发现, MTA1蛋白的表达水平与临床分期及淋巴转移有关, 提示MTA1的表达与非小细胞肺癌的恶性程度、局部的侵袭转移及淋巴转移有关, MTA1高表达的非小细胞肺癌具有更强的侵袭及转移能力。
笔者进行的研究显示, TNM分期晚, 并且有淋巴结转移的肺癌, MTA1、VEGF-C蛋白的阳性表达明显高于TNM分期早并且没有淋巴结转移者, 尤其是两者相关性分析提示, 非小细胞肺癌中MTA1表达与VEGF-C表达呈正相关关系, 由此推断, MTA1与肺癌的发生、发展及淋巴结转移密切相关, 其促进侵袭与淋巴结转移的机制可能与VEGF-C有关, 但两者的进一步关系尚需实验研究来证实。
摘要：目的 采用组织芯片技术研究非小细胞肺癌中肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C的表达, 分析其临床意义及其相关性。方法 制作186例非小细胞肺癌组织及23例正常肺组织芯片, 用免疫组化S-P法检测组织芯片中肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C的表达。结果 在非小细胞肺癌中, 肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C的表达阳性率分别为62.8% (103/186) 和64% (119/186) , 与正常肺组织中的0 (0/23) 和17.4% (4/23) 相比, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C蛋白的阳性表达与非小细胞肺癌患者的TNM分期及淋巴结转移状况有关 (P<0.05) , 而与患者的性别、年龄和组织学类型无关 (P>0.05) 。肿瘤转移相关基因1阳性表达与血管内皮生长因子C阳性表达有关 (P<0.01) 。结论 肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C在非小细胞癌的发生发展过程中起着关键作用, 联合检测肿瘤转移相关基因1和血管内皮生长因子C可作为判定非小细胞肺癌侵袭性和转移性的重要方法。
转移相关基因 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2009 年2 月~2013 年8 月于四川省崇州市人民医院诊治的78 例老年胃癌患者为研究对象,其中男42 例,女36 例,年龄61~79 岁,平均(63.26±5.94)岁。 所有受试对象均经胃镜和组织病理学确诊。TNM分期[5]:Ⅰ期26 例,Ⅱ 期44 例,Ⅲ 期8 例; 浸润深度:T2者49 例,T3者29 例;肿瘤部位:胃窦36 例,胃体28 例,贲门14 例;病理类型:乳头状管状腺癌23 例,低分化腺癌19 例, 黏液腺癌15 例, 印戒细胞癌21 例。 采用随机数字表法将受试对象分为腹腔镜微创远端胃癌D2 根治术组(微创组)和开腹远端胃癌D2 根治术组(传统组),每组各39 例。
纳入标准:①KPS功能评分>70 分;②心、肝、肾、肺功能检查及血液常规等均未发现显著异常;③未罹患免疫系统、心血管系统或神经系统疾病,无严重感染、肝炎、结核和慢性疾病等;④术前3 个月内未行放疗或化疗等其他特殊治疗;⑤合并其他手术治疗禁忌证者;⑥预计生存时间>6 个月。 排除标准:①肿瘤出现周围组织器官转移或远处转移; ②复发或再发者;③术后未进行正规中和治疗或失访。 研究方案通过医院伦理委员会批准,且所有患者均自愿参与本研究项目,并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1微创组
采用腹腔镜微创远端胃癌D2 根治术:行气管插管全身麻醉,将脐孔作为观察孔,左腋前线肋缘下为主操作孔, 分别清扫周围第4、6 组淋巴结,第7、8a、9、11 组,切除残留的小网膜,清扫第1、3 组淋巴结,继续清扫第15 组淋巴结,解剖胃右动脉,清扫第5、12a、12b组淋巴结;随后向上剥离横结肠系膜并清扫静脉根部的淋巴组织(第14v组),利用圆形吻合器行胃-十二指肠吻合, 完成切口外消化道的切除与重建,放置引流管后关闭腹腔。
1.2.2传统组
采用开腹远端胃癌D2 根治术:参照日本胃癌协会第3 版《胃癌处理规约》行胃切除及胃周围淋巴结D2 清扫术[6]。
1.3 近远期临床疗效指标
详细观察并记录两组患者的手术时间、术中出血量、淋巴结清扫数目、胃肠道功能恢复时间及术后并发症的发生情况;术后随访观察两组患者的总生存时间、1 年和2 年生存率、局部复发与转移率。
1.4 免疫功能指标
采用速率散射免疫比浊法测定血清中Ig A、Ig M和Ig G水平,检测仪器7600-020 型生化分析仪购自日立仪器(上海)有限公司,配套试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供。 T细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+)的变化情况由美国贝克曼尔特流式细胞仪检测,采用Cell Quest Pro软件进行数据采集和分析。
1.5 HIF-1α 和MACC1 表达检测
利用酶联免疫吸附试验检测血清HIF-1α 和MACC1 的表达水平, 检测试剂盒均购于美国Cel Signaling Technology有限公司。
1.6 统计学方法
采用SPSS 18.0 统计软件对数据进行分析和处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用独立样本t检验,计数资料采用 χ2检验,生存时间采用Kaplan-Meier法, 采取Log-rank检验分析两组间差异,检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 两组患者近期临床疗效比较
微创组患者术中出血量明显少于传统组,胃肠道功能恢复时间明显短于传统组(P < 0.05);两组患者手术时间和淋巴结清扫数目比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 见表1。
2.2 两组患者并发症发生情况比较
微创组并发症发生率明显低于传统组(P < 0.05)。见表2。
2.3 两组患者远期临床疗效比较
两组患者平均生存时间、1 年生存率、2 年生存率、局部复发与转移率比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。 见表3 和图1。
2.4 两者患者治疗前后免疫功能指标比较
两组患者治疗后的Ig M、Ig G水平较治疗前升高,微创组改善程度优于传统组(P < 0.05);两组患者治疗前后组间及组内Ig A水平比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 见表4。
2.5 两组患者T细胞亚群、HIF-1α 和MACC1 表达水平比较
两组治疗后CD4+、CD4+/CD8+较治疗前升高CD8+、HIF-1α 和MACC1 水平较治疗前降低(P < 0.05)且微创组上述指标的改善程度均显著优于传统组(P < 0.05);两组患者治疗前后组间及组内CD3+水平比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 见表5。
3 讨论
腹腔镜辅助胃癌D2 根治术是临床手术治疗胃癌的主要方式[7,8,9,10]。 本研究以老年胃癌为研究对象,探讨比较了两种手术方式的近远期临床效果, 结果发现,微创组的术中出血量少于传统组,胃肠道功能恢复时间短于传统组,并发症发生率低于传统组,充分体现了微创手术创伤小、术后恢复快、并发症少等优点,这与既往报道结果基本一致[11,12,13,14,15]。 本研究随访观察显示,两组患者的1 年生存率、2 年生存率、平均生存时间和局部复发与转移率比较, 差异无统计学意义,这可能与纳入研究的样本量偏少有关。
注:与同组治疗前比较,*P < 0.05
注:与同组治疗前比较,*P < 0.05;HIF-1α:低氧诱导因子-1α;MACC1:结肠癌转移相关基因1
CD3+、CD4+和CD8+的表达改变是反映胃癌细胞免疫调节状态的关键指标[16,17,18]。 本研究结果显示,两组治疗后CD4+和CD4+/CD8+较治疗前升高,CD8+较治疗前显著下降,而CD3+则无明显变化,且微创组上述指标的改善幅度优于传统组, 提示腹腔镜辅助胃癌D2根治术对细胞免疫的影响更为显著,有利于患者术后免疫功能的恢复。此外,本研究还同时检测了血清免疫功能指标Ig A、Ig M和Ig G的变化情况, 结果发现,两组患者治疗后Ig M、Ig G水平较治疗前明显升高,且微创组的改善程度明显优于传统组,该结果趋势与T淋巴细胞亚群测定结果基本一致,进一步印证了腹腔镜辅助的手术方式可能对患者的免疫促进效应更显著。
转移相关基因 篇7
鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)是疱疹病毒科成员,其基因组庞大,含有多个复制非必需基因,与其他疱疹病毒相似,具备作为病毒载体的条件[4,5,6,7]。鸭肠炎病毒可自然感染鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽及游禽类候鸟,不感染人类[8]。上述水禽正是禽流感的易感者和携带者,如能利用鸭肠炎病毒作为携带禽流感病毒(AIV)保护性抗原基因的载体,可以达到防制禽流感及鸭病毒性肠炎的双重目的。
研究针对这一实际情况构建了携带水禽流感病毒主要亚型(H5N1)HA基因的重组鸭肠炎病毒转移载体,为下一步构建表达水禽流感病毒各亚型分离株HA基因的重组鸭肠炎病毒提供了物质基础。
1 材料
1.1 质粒及菌种
含有H5N1 亚型AIV HA基因的pMD18-T-H5-HA质粒、鸭肠炎病毒通用转移载体pUC-TK-LacZ-2,均由东北农业大学动物医学学院预防兽医系实验室构建;pCDNA3.1、pET-30a及感受态TGI、DH5α,均由东北农业大学动物医学学院预防兽医系实验室保存。
1.2 引物
上游引物5′-AGGCTCGAGCGACAATTGCATG-3′,下游引物5′-CCCCTCGAGCCCCAGCTGGTTC-3′,下划线部分为XhoⅠ酶切位点。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.3 工具酶及主要试剂
dNTP、ExTaq酶、限制性内切酶、DL-15 000 Marker,均为宝生物工程(大连)有限公司产品;T4 DNA连接酶,购自NEB公司;DNA胶回收试剂盒,购自北京百泰克生物有限公司;氨苄西林,购自Sigma公司;胰蛋白胨、酵母粉,OXOID公司产品。
2 方法
2.1 pET-3.1载体的构建
将pCDNA3.1多克隆位点(MCS)的XhoⅠ位点经酶切后补平,使该位点消失,酶切鉴定后将阳性质粒命名为pCDNA3.1-X。以pCDNA3.1-X为模板,扩增CMV启动子、MCS及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)表达元件,回收PCR产物,与pMD18-T载体相连,酶切鉴定后进行序列测定,将阳性质粒命名为pMD18-T-P3。
pET-30a经XbaⅠ和NotⅠ酶切后补平,使这2个酶切位点消失,酶切鉴定后将阳性质粒命名为pET-30a-XN。
用XhoⅠ分别酶切pMD18-T-P3和pET-30a-XN,回收两端带有XhoⅠ位点黏性末端的真核表达元件及pET-30a-XN载体片段,后者去磷酸化,将两者连接、转化、提取质粒,经酶切鉴定及测序分析后把正确者命名为pET-3.1。
2.2 pET-3.1-HA的构建
用HindⅢ和BamHⅠ同时双酶切阳性质粒pMD18-T-H5-HA和pET-3.1,分别回收大小约为1.7 kb和6.3 kb的片段,将两者相连、转化、提取质粒,经酶切鉴定及测序分析后把阳性质粒命名为pET-3.1-HA。
2.3 pUC-TK-LacZ-2-HA的构建
用XhoⅠ同时酶切pET-3.1-HA和pUC-TK-LacZ-2,后者去磷酸化,分别回收上述酶切产物,连接、转化、提取质粒,经酶切鉴定及测序分析后把阳性质粒命名为pUC-TK-LacZ-2-HA。
3 结果
3.1 pET-3.1载体的构建结果
pCDNA3.1经XhoⅠ酶切后补平的阳性质粒pCDNA3.1-X可被BamHⅠ、HindⅢ酶切并获得长5.5 kb的片段,XhoⅠ不能将其切开,表明pCDNA3.1多克隆位点中XhoⅠ位点已经消失,结果见图1。
1.BamHⅠ酶切pCDNA3.1-X;2.XhoⅠ酶切pCDNA3.1-X; 3.HindⅢ酶切pCDNA3.1-X;4.DL-15 000 Marker。
以pCDNA3.1-X为模板进行PCR扩增,获得大小约为1.1 kb的目的片段,该PCR产物不能被XhoⅠ切开,而以pCDNA3.1质粒为模板的对照产物可被XhoⅠ切成大小约为0.8 kb和0.3 kb的2个片段,结果见图2。
1.pCDNA3.1-X的PCR产物;2.PCR阴性对照;3.XhoⅠ酶切 pCDNA3.1-X的PCR产物;4.XhoⅠ酶切pCDNA3.1的PCR 产物;5.DL-15 000 Marker。
上述PCR产物与pMD18-T载体相连获得阳性质粒pMD18-T-P3,该质粒被EcoRⅤ酶切获得长约3.8 kb的片段,被XhoⅠ酶切获得长约2.7 kb的载体片段和1.1 kb的目的片段,结果见图3。测序结果显示该扩增片段与参考序列相比除XhoⅠ位点补平后多出TCGA外,其他序列均与参考序列相同,表明该序列中含有预期的真核表达元件。
1.EcoRⅤ酶切pMD18-T-P3;2. XhoⅠ酶切pMD18-T-P3; 3. DL-15 000 Marker。
pET-30a用XbaⅠ和NotⅠ酶切后补平的阳性质粒pET-30a-XN,可被XhoⅠ酶切成长约5.5 kb的片段,XbaⅠ、NotⅠ不能将其切开,表明该阳性质粒中MCS只有XhoⅠ位点,XbaⅠ与NotⅠ间的其他位点均消失,结果见图4。
1.pET-30a质粒对照;2.BamHⅠ酶切pET-30a-XN;3.NotⅠ酶切 pET-30a-XN;4.XbaⅠ酶切pET-30a-XN;5.XhoⅠ酶切 pET-30a-XN;6.DL-15 000 Marker。
将pMD18-T-P3中的真核表达元件插入pET-30a-XN的XhoⅠ位点获得的阳性质粒pET-3.1,被BamHⅠ、HindⅢ酶切可获得长约6.6 kb的片段,被XhoⅠ酶切可获得长为5.5 kb的载体片段和1.1 kb的目的片段,结果见图5。酶切及测序分析结果表明,真核表达元件已成功克隆于pET-30a-XN的XhoⅠ单一位点间。
1.XhoⅠ酶切pET-3.1;2.DL-15 000 Marker;3.BamHⅠ 酶切pET-3.1;4.HindⅢ酶切pET-3.1。
3.2 pET-3.1-HA的构建结果
将pMD18-T-H5-HA中的H5N1亚型AIV HA基因插入pET-3.1的HindⅢ和BamHⅠ位点间,获得阳性质粒pET-3.1-HA,被XhoⅠ酶切获得长为5.5 kb和2.8 kb的片段,结果见图6。酶切及测序结果表明,HA基因已克隆至pET-3.1中的HindⅢ和BamHⅠ位点间,且两端已携带真核表达元件。
1,2. XhoⅠ酶切pET-3.1-HA;3.DL-15 000 Marker。
3.3 pUC-TK-LacZ-2-HA的构建结果
将pET-3.1-HA中携带真核表达元件的HA基因插入pUC-TK-LacZ-2的XhoⅠ位点,获得阳性质粒pUC-TK-LacZ-2-HA,该质粒被ApaⅠ酶切得到长为12 kb的1个片段,被HindⅢ酶切得到长为6.1,1.6,4.7 kb的3个片段,被XhoⅠ酶切得到长为9.4,2.8 kb的2个片段,被EcoRⅤ酶切得到长为7.6,2.8,2.0 kb的3个片段,结果见图7。酶切及测序结果均表明HA基因表达盒已反向插入pUC-TK-LacZ-2中的TK基因中。
1,3,5 DL-15 000 Marker;2.ApaⅠ酶切pUC-TK-LacZ-2-HA; 4.HindⅢ酶切pUC-TK-LacZ-2-HA;6.XhoⅠ酶切pUC-TK- LacZ-2-HA;7.EcoR Ⅴ酶切pUC-TK-LacZ-2-HA。
4 讨论
通过酶切补平删除了原核表达载体pET-3.1从NotⅠ(166 bp)至XhoⅠ(384 bp)之间序列,其中包括His·Tag、S·Tag及MCS中除XhoⅠ的所有位点。以同样的方法删除了pCDNA3.1MCS中的XhoⅠ,并以改造后的pCDNA3.1为模板通过PCR获得了两端带有XhoⅠ位点的真核表达盒,包括CMV启动子、MCS及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)表达元件。再将该真核表达盒插入上述改造的pET-3.1的XhoⅠ位点,构建了以pET-30a为基本骨架、携带真核表达盒的载体pET-3.1,该载体具有多个可供外源基因插入的MCS,具有的真核表达元件允许外源基因在真核细胞中转录及表达,同时可通过2个XhoⅠ位点将携带外源基因的表达盒切下,插入其他载体中。
研究将H5N1亚型AIV HA基因插入上述构建的pET-3.1 MCS中Hind Ⅲ和BamHⅠ位点间,再通过XhoⅠ酶切获得了HA基因真核表达盒,将该HA表达盒插入东北农业大学动物医学学院预防兽医系实验室已构建的鸭肠炎病毒通用转移载体pUC-TK-LacZ-2中TK基因的XhoⅠ位点,从而获得了携带H5N1亚型AIV HA基因的重组鸭肠炎病毒转移载体,为进一步获得表达HA基因的重组鸭肠炎病毒奠定了物质基础。
摘要：为了获得携带禽流感病毒(AIV)HA基因鸭肠炎病毒转移载体,试验采用基因工程方法构建了带有CMV启动子、多克隆位点(MCS)及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)等真核表达元件的载体pET-3.1,将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入pET-3.1,再将携带真核表达元件的HA基因插入鸭肠炎病毒通用转移载体pUC-TK-LacZ-2中TK基因的XhoⅠ位点。结果表明:获得了携带AIV HA基因的鸭肠炎病毒转移载体。
关键词：鸭肠炎病毒,禽流感病毒(AIV),HA基因,转移载体
参考文献
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转移相关基因 篇8
Twist被认为是一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子,能在转录水平上调控很多基因的表达,进而发挥其在调控细胞增殖分化、器官生长发育等过程中的作用。Twist基因最初在果蝇中被发现,随后陆续在多个物种体内被发现。在不同的种属之间,其核苷酸序列和其蛋白产物的氨基酸序列高度保守,其中小鼠和人类的氨基酸序列具有96%的同源性。不同种属的Twist基因均能编码碱性的螺旋-环-螺旋(basic Helix-loop-Helix,bHLH)的转录因子,都属于bHLH转录因子家族成员,并且在不同的种属中其与DNA结合区域具有100%的序列保守,Twist蛋白通过它们的bHLH膜序识别E-box反应元件(CANNTG),并且履行它们作为转录抑制或激活因子的作用。
正常情况下,Twist在胎盘和中胚层来源的细胞和组织中高表达。Twist对果蝇的原肠胚正常发育及神经嵴细胞生成是必须的,若敲除Twist则会致死于原肠胚期,在这些胚胎中由于胚层缺乏衍生组织而导致腹部扭转。在鼠类,Twist对头间质、体节以及四肢的发生是必需的。鼠杂合子表现出四肢和颅面畸形,若缺失Twist在胚胎第10d死亡并表现出神经管闭合失败、异常肢芽等多种缺陷。在个体出生以后,Twist 表达下降并且只存在于成熟组织的前体细胞。在成体动物,Twist主要表达于骨、软骨母细胞等,保持他们的未分化状态。人的Twist基因突变会导致尖头-并指畸形(Saethre-Chotzen)综合征。最近的研究还发现,Twist作为一个适应性发热的关键性调控因子表达于棕色脂肪组织[1],另外,Twist 对淋巴细胞的成熟和功能发挥及自身免疫性疾病发生也有重要作用[2]。
随着Twist基因在小鼠乳腺癌转移模型中的重要作用被发现,更多的研究发现Twist在许多肿瘤,如乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌等的发生和发展过程中起到重要的作用,还经常表达于黑色素瘤和肉瘤等肿瘤中,并且Twist总是和侵袭、转移、高龄、预后差等相联系。Twist对肿瘤发生发展的作用也是多方面的。对肿瘤血管发生而言,在高表达Twist的MCF7乳腺癌细胞(MCF7/Twist)鼠种植实验动物模型中,肿瘤组织血管流量和血管渗透性有着显著升高[3]。Twist过量表达还可以促进细胞表型的恶性转化、抵抗衰老、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤恶化等。
2 Twist与E-cadherin及EMT
上皮-间质转化(Epithelial-mesenehymal transition,EMT)是指上皮细胞表型向成纤维细胞或间充质细胞表型转变并获得迁移能力的过程。它使特殊部位产生的上皮细胞分离并迁移到其他位置,是个体正常发育、伤口愈合以及转移性肿瘤发生的基础。EMT的具体表现是上皮细胞间的紧密连接,黏附连接以及桥粒消失,细胞骨架重构,细胞极性变乱,基底部完整性破坏,细胞可塑性增强,细胞运动能力增加,上皮细胞的标记表达减少,间质细胞的标记表达增加。EMT过程中的一个重要标志性变化是E-cadherin的表达降低或丢失。若敲除E-cadherin能促进EMT。人E-cadherin基因(CDH1)定位于16q22.1,该区在晚期乳腺癌患者的癌细胞中常有功能丢失,并提示着癌细胞转移和预后不良。和正常乳腺导管上皮细胞相比,在30%导管原位癌及60%转移性导管癌标本中,CDH1启动子区CpG岛甲基化水平升高,提示肿瘤的侵袭能力及恶性程度和E-cadherin的表达水平有相关性。在大多数恶性肿瘤中都发现存在由E-cadherin介导的细胞间黏附功能的减弱或丢失,这使恶性肿瘤细胞容易脱离原发灶向周围组织侵袭及向远处器官转移[4,5]。体外实验也发现,抑制E-cadherin表达能使细胞侵袭性增强,而将E-cadherin cDNA转染入高侵袭性上皮肿瘤细胞并使其表达能明显降低细胞侵袭能力。
由于Twist在胚胎发育过程中能赋予细胞运动迁移能力及调节组织重建。有人研究了Twist能否使人体正常乳腺上皮细胞具有迁移能力。结果表明,表达Twist的细胞为梭形,呈现出E-cadherin等细胞间连接蛋白表达下降、细胞和细胞间黏附作用明显减弱等EMT的特征,这些变化使正常乳腺上皮细胞具有运动迁移能力。Twist使E-cadherin表达下降揭示Twist能直接或间接影响E-cadherin启动子。Twist调节EMT的机制是与靶基因启动子上的E-BOX序列结合,进而调控靶基因的表达。如Twist作用于E-cadherin基因的转录启动序列,抑制该基因的转录,使E-cadherin表达下降,细胞与细胞间的黏附作用降低,从而有利于癌细胞的分离进而在肿瘤侵袭和转移中发挥作用[6,7,8]。应用si RNA技术抑制Twist在转移性癌细胞系的表达,结果发现对Twist基因的抑制不影响原发癌的形成,但明显抑制新的转移灶形成。
3 Twist与乳腺癌的发生和转移
Yang等[9,10]首先证实Twist是一种肿瘤转移因子。随后在人乳腺癌中也发现Twist能通过抑制E-cadherin的表达来促进EMT来促进肿瘤的迁移和侵袭。Sahlin等[11]对多个尖头-并指畸形综合征家族中的数位女性患者展开研究,发现该综合征家族中女性患乳腺癌机率升高且发病年龄提前,进而推断Twist可能是一种乳腺癌易感基因。Hennessy[12]等发现,永生化人乳腺上皮细胞(HMLE)经EMT诱导后可表达干细胞标记物,且更易转化为乳腺癌干细胞,而包括Twist和Snail2在内的各种EMT的诱导因素使乳腺癌干细胞表现出最具进展性的乳腺癌细胞的特性,揭示了Twist及EMT在乳腺癌的发生和发展过程中起着重要的作用。Signoretti等[13]培养了能稳定过表达人Twist的乳腺癌细胞系(MCF-7/Twist)。Twist的过量表达引起了细胞类上皮间质转化(EMLT),并导致了此细胞系运动和侵袭能力增强,且有显著数量的染色体发生异常和畸变,这也可能是肿瘤恶性程度增加,转移性增强的原因之一。Yang等[14]发现Twist在小鼠乳腺组织中能促进类EMT表型改变,此外,Twist基因在转移的小鼠乳腺癌细胞中呈现高表达,在原发癌细胞中表达为阴性。如在高度转移性的小鼠乳腺癌细胞中抑制Twist表达,则可以特异性阻止癌细胞血管内渗以及从乳腺转移到肺部。说明Twist在乳腺癌细胞的血管内渗过程中起重要作用。杨静等[15]使用siRNA沉默小鼠乳腺癌细胞株4T1中Twist表达,能使4T1细胞的肺转移能力得到明显抑制。说明Twist能直接或间接影响癌细胞的转移。
而在临床上,Spaderna等[16]发现Twist在侵袭性较强的乳腺小叶癌中表达明显升高,E-cadherin基因的表达受到了抑制,进而确定由E-cadherin所介导的细胞与细胞间黏附的减少是决定乳腺小叶癌病理表型的重要机制。有人也观察到乳腺小叶癌细胞表现出EMT的很多特点,瘤体中E-cadherin表达水平明显降低。Twist和小叶癌侵袭性之间的联系说明了这类转录因子能抑制E-cadherin的启动并在肿瘤发病机制中扮演重要的角色,也表明Twist表达量高低和肿瘤的良恶性及转移侵袭能力强弱存在相关性。Cheng等[17,18]观察到Twist在早期乳腺癌患者体内表达不明显,而在晚期乳腺癌患者癌组织中表达升高,进而推断Twist的表达水平与乳腺癌的进展有关。对富黏附骨髓细胞的分析揭示Twist在正常志愿者的骨髓细胞中并不表达,相反,Twist的持续表达则反映出化疗后乳腺癌骨微转移。在最近的研究中,付俊江等[19]纯化和鉴定了Twist相关蛋白并确定Twist与Mi2/NuRD的数个组成部分包括MTA2、RbAp46、Mi2和HDAC2相互作用,并共同作用于E-cadherin的启动子近端,发挥转录抑制的作用。在体外及小鼠试验中,若敲除乳腺癌细胞系中Twist/Mi2/NuRD/MTA2,均能有效抑制癌细胞的侵袭和转移。
4 Twist与乳腺癌耐药
Twist除了影响肿瘤的发生和转移外,与肿瘤耐药也有密切的联系[20,21]。Cheng等[22]在乳腺癌细胞系MCF-7中发现,当Twist表达上调时,细胞凋亡比例减小,侵袭能力增加并获得对紫杉醇的耐药性,所以确定Twist与人乳腺癌耐药性相关。李清泉等采用si RNA干扰Twist,在阻断细胞的间充质转变的同时能够部分改善乳腺癌多药耐药性。Wang等[23]研究发现, Twist在侵袭性乳腺癌细胞株中的表达量与癌细胞株的耐药性相关。张飞等[24]比较了乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR与MCF-7中Twist和E-cadherin的表达差异,发现MCF-7/ADR中Twist的表达升高,E-cadherin表达下降,这些变化可能跟细胞转移和耐药相关,也说明多药耐可能和癌细胞转移能力相关。另外,癌细胞的侵袭能力与多药耐药性之间也存在相关性,但具体机制还不清楚。临床观察化疗可能会增加肿瘤的侵袭转移,而转移性肿瘤也具有更强的耐药性。体外实验也表明,多药耐药的乳腺癌细胞株侵袭,转移能力与亲本细胞相比明显增强[25],与临床上所观察到的结果一致。因此,在肿瘤的进展过程中耐药和转移现象可能是相互促进的。这也为进一步研究肿瘤细胞耐药提供了依据。
5 结语
目前治疗乳腺癌提倡早发现、早诊断、早治疗。因此,抑制癌细胞转移以及对抗化疗过程中耐药性获得是以后探索的主要途径之一。目前发现Twist在乳腺癌发生、发展,特别是其在促进肿瘤转移及耐药性获得过程中的作用,对其深入研究可以使其为研究治疗乳腺癌提供更多的依据。在现有的研究基础上,未来进一步的工作可能会建立Twist作为乳腺癌重要的诊断标记和潜在的药物治疗靶点以及临床治疗后预测患者预后的新指标。
摘要：乳腺癌是来源于乳腺终末导管小叶单元上皮的恶性肿瘤,多发生于中老年女性,是目前威胁女性健康常见的疾病之一。其发病率在过去的几十年中逐年增高,已跃居女性恶性肿瘤的首位。近年来的研究发现,Twist作为一种肿瘤相关基因,其在乳腺癌的发生、发展以及诊断、治疗和预后中起着重要作用。
FOXP2基因相关研究综述 篇9
关键词：FOXP2基因 语言和言语障碍
语言的习得是有基因基础的，干扰正常语言习得的神经发育障碍方面的研究也揭示了语言机制的基因构成。至今，被认为直接影响语言和言语障碍的基因就是位于7号染色体长臂区域的FOXP2基因（OMIM605317）。
1.FOXP2基因的发现。FOX转录因子因为自身的特性而被命名：叉头框（forkhead-box）或FOX DNA结合域。对这个基因家族的命名针对不同的物种使用不同的写法：对人类使用全大写字母——FOXA，对老鼠使用小写字母——Foxa，对其它物种使用大小写混合——FoxA。为了研究方便，亚科按照字母顺序命名，至今已有17个亚科被确认（FOXA—FOXQ）。叉头框转录因子管辖着真核基因的表达，并且参与一系列多样化进程，包括形态发生，细胞归化，以及肿瘤生成。
FOXP2的发现源于遗传科学家对英国一个被称作KE家族三代人的研究，人们以KE家族患者（affected KE family members，简称AKEFM）所表现出的语言缺陷和障碍为突破口，进行了人类基因与语言障碍为主要特征的语言习得相关性研究。Hurst等（1990）首先发现了KE家族近半数人患有语言紊乱的疾病或者各种严重的遗传性言语障碍。同时，Gopnik（1990）认为可能是由于身体中的一个常染色体显性基因发生了突变而导致，主要影响以数、性和时态等为特征的形态句法而不是发音。因此，这个基因时常被称作语法基因或者语言基因。Vargha-Khadem（1998）发现这种基因并不专司语法或语言，且AKEFM对物体的命名比较迟缓，并且缺乏准确性。Fisher等（1998）将KE家族基因突变的研究范围缩小并定位于约有70个基因的7号染色体长臂（7q31）区域，并把这个突变基因暂时命名为SPCH1。在基因测序期间，Hurst（1990）又找到了另一位也患有先天性言语障碍但不属于KE家族的病人——一个被称作“CS”的英国男孩。其与AKEFM的障碍都表征为言语（或发音）动作协调能力障碍，也就是在控制发音器官的运动和次序上存在困难，造成语言产出上的缺陷。Lai等（2001）发现，同一个基因在CS男孩和AKEFM身上都发生了突变。根据基因命名法，人们将这个由Lai等人分离出来的基因（SPCH1）称为FOXP2。
2.FOXP2与语言处理神经认知基础。对人类语言能力基因基础进行研究的终极目标是要解释清楚这些基因和突变是如何通过对神经发育和大脑功能的作用来影响社交能力的。我们需要整合来自分子和细胞生物学的试验方法、动物模型和大脑成像技术，从而进一步洞察这些语言障碍的发病机理，最终形成治疗干预。
FOXP2基因的表达不仅限于大脑，还见于其他器官，主要是来自前肠内胚层的器官，比如肺和食管。在人类的大脑中，FOXP2在一系列区域进行表达，包括感知觉和边缘核，大脑皮层和一些动力结构，尤其是纹状体和小脑部分。在这些解剖区域内，FOXP2的表达通常受限于特定的细分和神经元类型（例如深度皮层，纹状体中的中型多棘神经元以及小脑中的浦肯野细胞）。FOXP2突变会在胚胎发育期导致大脑缺陷，从而导致对说话非常重要的神经通路的损坏。FOXP2突变而导致语言障碍患者的一个重要共同点就是FOXP2的蛋白质都减少一半，所以Liegeois等（2003）认为这是导致神经组织异常而破坏语言习得的原因，并认为FOXP2在于学习、制定计划、言语运动序列执行有关的额纹状体和前额小脑的网络发育过程中起着重要作用。
3.FOXP2的演化。在人类的进化过程中，由于对语言的影响，FOXP2中两个氨基酸的替换得到了正向选择。Konopka等（2009）则还发现由于施加在人脑进化过程中的选择压力，对语言回路至关重要的基因网络也得到了正向选择。他们认为FOXP2中两个氨基酸的替换改变了FOXP2转录因子对这个基因表达网路系统的调控路径，人类FOXP2中两个氨基酸的正向选择是FOXP2有关语言进化的一种新的生物功能机制。Enard等（2009）也认为这两个氨基酸的替换改善了人脑的皮质-基底核回路，提高了口面运动和大脑网络之间的协调性，从而出发语言的进化，对人类的说话起着关键的作用。Liegeois等（2003）则发现FOXP2还参与调解镜像神经元（mirror neuron）的发展，并于语音工作记忆（phonological working memory）有关，这意味着FOXP2对布洛卡区的进化及其在语言中的作用具有重要意义。
这些研究使得FOXP2基因与人类细胞功能的相关性得到进一步显现，揭示了其对人类大脑发育、疾病和语言等有直接影响的特异通路。与此同时，研究也证实，FOXP2及其靶位在人类语言神经回路的发展和进化史中可能起着关键的作用，这将成为今后研究人类语言及其进化分子基础的一个新的开端。
参考文献
1.Hurst，J.A.M.Baraitser，E.Auger， F. Graham.&S.Norell.（1990）.An extended family with a dominantly inherited speech disorder.Dev Med Child Neurol，32（4），52-355.
2.Gopnik，M.（1990）.Feature-blind gr
转移相关基因 篇10
必特螺旋霉素(结构见图1)是利用基因重组技术获得的基因工程菌的发酵产物,属于一种新型大环内酯类抗生素,目前已按一类新药标准完成Ⅲ期临床研究,具有很大的应用价值和前景[1]。然而目前国内生产的必特螺旋霉素的药效还有待提高,为了提高产量,作者实验室构建了一个4″-异戊酰基转移酶基因(ist)和其正调控基因(acyB2)共表达的载体pSET152-ia以期提高ist基因的表达,从而提高必特螺旋霉素的产量,然而经过一系列的研究表明该新重组质粒在导入S.lividans TK24之后不能产生必特螺旋霉素,在对该新重组质粒进行基因测序之后发现4″-异戊酰基转移酶基因(ist)和其正调控的调节基因(acyB2)的启动区包含一个点突变。本文首次报道利用引物设计、PCR、基因测序等基因工程技术回复此突变,并构建了两个新的ist-acyB2的重组质粒pKC1139-ia new和pSET152-ia new,检测ist基因在异源宿主中的表达情况,为必特螺旋霉素进一步研究提供一定的参考。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、基因和载体
螺旋霉素产生菌(S.spiramyceticus1941),中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。E.coli DH5α:大肠杆菌质粒转化用受体菌,中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。E.coli DH5α感受态细胞,中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。4″-异戊酰基转移酶基因(ist),从中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室克隆的含ist基因的质粒pSW4中获得;pUC18(AmpR),克隆测序用载体,由中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。pKC1139,温敏型链霉菌/大肠杆菌穿梭载体,含阿普霉素抗性基因,用于构建重组质粒,作者实验室保存。pSET152,温敏型链霉菌/大肠杆菌穿梭载体,含阿普霉素抗性基因,用于构建重组质粒,作者实验室保存。
1.1.2 试剂
琼脂粉购于青岛水产品加工厂,琼脂糖购于Biowest 。溶菌酶为Sigma公司产品。
阿普霉素(Apramycin,Am)、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)、RNase A均购于华美公司。限制性内切酶、去磷酸化酶(CIAP)连接酶、LA-Taq酶、T4聚合酶,均购于TakaRa公司。DNA快速纯化/ 回收试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)回收、提取DNA或质粒。
1.1.3 仪器
PCR扩增仪(2720Thermal Cycler)由Applied Biosystems制造;台式离心机(4214)购于ALC公司;电泳仪(DYY-6C)购于TaKaRa公司;低温离心机(ZK365)由HERMLE制造;凝胶成像仪(alpha 2200),购自安莱生命科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 质粒提取:
按试剂盒说明书进行。
1.2.2 DNA回收与提取:
按试剂盒说明书进行。
1.2.3 分子克隆[3,4]
PCR主要技术参数为:反应体积25μL;退火温度62℃;延伸时间1min;28个循环;72℃延伸7min,结束反应。
2 结果与分析
2.1 pKC1139-ia new与pSET152-ia new重组质粒的构建
重组质粒pSET152-ia 导入S.lividans TK24中之后发现其不能表达产生bitespiramycin,经基因测序发现重组质粒pSET152-ia 上的ist启动区发生了一个碱基突变,该碱基突变可能导致ist基因无法表达,因此,通过PCR引物设计来回复该碱基突变。我们将新扩增出来的两段引物ia-1和ia-2根据需要在上游引物5’端分别加上PstⅠ酶切位点序列和3个保护碱基;下游引物5’端分别加上BamHⅠ酶切位点序列和3个保护碱基,分别对该上下游引物进行琼脂糖凝胶电泳检测其条带大小,并纯化回收。然后将上下游引物用PCR反应组合,获得组合的ia-1+2 扩增片段(约0.7kb),然后把扩增出来的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳检测并纯化回收,克隆到pUC18载体,测序验证无误,再采用BamHⅠ和PstⅠ将ia-1+2序列切下,利用限制酶PstⅠ和XbaⅠ从作者实验室构建好的载体pBlue-ia上把ist基因切下,用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ切下acyB2基因片段,将三个片段按顺序连接到载体pKC1139上得到新的重组质粒pKC1139-ia new(在宿主中以质粒形式存在,见图2)。
同时,我们利用EcoRⅠ和XbaⅠ将pKC1139-ia new中的外源片段切下克隆到整合型载体pSET152上构建出重组质粒pSET152-ia new(整合到宿主细胞基因组中,见图3)。
2.2 启动区点回复突变
2.2 启动区点回复突变
本实验室得到的ist-acyB2重组载体在变铅青链霉菌TK24中中不表达。经多次测序证实此载体中ist-acyB2的启动区序列中存在一个点突变,位于序列的1 272bp处G 突变成了A。此位点位于ist基因和其RBS之间的序列中,很可能对ist基因转录有影响。拟将其突变位点进行回复。采用PCR的方法将突变的点回复过来[5],为此我们设计出两段引物将突变的碱基回复过来,将新扩增出来的两段DNA序列命名为ia-1和ia-2(ia-1上游引物和ia-1下游引物扩增ia-1,ia-2上游引物和ia-2下游引物扩增ia-2)。对两段DNA进行电泳检测,回收。对回收回来的两段DNA,以及对回收的两段DNA片段进行PCR连接,接着进行电泳检测。
设计用于扩增两段序列的引物如下:
引物的设计是通过5’ 端的改造进行设计。将突变位点A改成G。突变回复点后面还必须延长一段,这样才能使得在ia-1和ia-2 PCR连接时连接成功。
在对ia-1和ia-2进行PCR连接时,起初是不用引物,直接将两者加聚合酶进行PCR连接,经过多次实验发现ia-1与ia-2不能够连接起来,经过分析得知如果直接对这两段基因进行PCR连接,两段基因各自解链后连接是这两段基因还是各自进行了连接,并没有发生两段基因重组连接。为此我们改变方法加入ia-1的下游引物和ia-2的上游引物对扩增出两段带有点突变回复的单链[6],以此方法对ia-1和ia-2进行连接,结果显示连接成功。
2.3 基因表达鉴定
通过回收前后的PCR得到ia-1、ia-2电泳(和图5),电泳图上有明显的条带,经测定对比碱基长度分别为500bp和200bp,两者非常吻合。 我们将ia-1和ia-2 整合到PUC18载体上进行测序检测,图6即为测序图谱。通过对比发现770bp到780bp之间有一碱基,由原来的A回复成了G,说明突变回复成功。
1:Marker 3;2:ia-1;3:ia-2.
1:marker 3 ;2:ia-1;3:ia-2;4:ia-1+2.
3 讨论
随着基因工程技术的兴起和快速发展,抗生素生物合成的分子遗传学研究不断深入,越来越多的抗生素生物合成途径及相关基因的功能已被逐渐揭示[7],人们已经可以有目的地对其生物合成基因进行分子遗传学操作,来改造抗生素的结构,以期得到具有更高抗菌活性的结构衍生物。抗生素的生物合成属于次级代谢范畴,与初级代谢相比,具有生物合成途径复杂、生物合成酶对基质特异性不高等特点[8],导致抗生素产生菌可以产生多组分抗生素,往往各组分的化学结构非常相似,而生物活性有时却相差很大[9]。本实验通过构建ist-acyB2重组载体,发现启动区存在一个点突变,并使该突变回复过来,并构建出两个新的重组质粒,从而提高4″-异戊酰基转移酶基因在宿主中的表达水平。在下一步的研究中,可把构建的新重组质粒导入宿主细胞中进行生物转化获得转化子,然后检测获得的转化子螺旋霉素生物转化产物,看是否含有必特螺旋霉素或者其产量比之现有必特霉素生产方法有提高,这方面正在进一步研究。
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