克隆动物与克隆人（精选十篇）
克隆动物与克隆人 篇1
本节内容为人教版高中生物选修三《现代生物技术》中细胞工程的内容, 课标要求为“举例说出动物细胞融合与单克隆抗体”, 而高考考纲中为较高的Ⅱ级“理解”要求。单克隆抗体的制备和应用是近几年生物科学和医学发展的热点之一, 也是高考的常考题型, 比如2012江苏卷第22题、2011年江苏卷第14题、2010福建理综第32题、2010广东理综第24题、2010江苏卷第17题中都曾涉及。
高二理科学生有较强的自主学习、归纳知识能力, 可以要求学生在课前利用教辅资料和学案进行预习, 完成植物体细胞杂交技术和动物细胞融合的比较表格, 并思考单克隆抗体制备过程的相关问题, 以锻炼学生的自主学习和思考能力。学生在前一节已经学习了植物体细胞杂交技术, 为动物细胞融合的学习做了知识铺垫。单克隆抗体的制备是本节的重点难点, 学生在必修一第6章知道了癌细胞的特点、必修三第2章学习了免疫的相关知识, 这些将有助于对单克隆抗体的理解。制备过程中多次实验操作的原因及结果是学生较难理解的内容, 笔者设计了小组合作进行细胞模型模拟操作的探究活动突破这一难点。
二、教学目标
1.知识与能力
举例说出动物细胞融合与单克隆抗体技术及应用。
2.过程与方法
(1) 运用必修一中细胞的知识分析动物细胞融合与单克隆抗体的理论基础; (2) 小组合作探究活动中培养合作学习、探究式学习的能力; (3) 搜集有关单克隆抗体应用的资料, 进行整理、分析和交流。
3.情感态度和价值观
(1) 感受科学探究的魅力, 受到创新精神的教育; (2) 关注动物细胞融合与单克隆抗体的发展和应用前景。
三、教学重点和教学难点
1.教学重点
动物细胞融合、单克隆抗体的制备和应用。
2.教学难点
单克隆抗体的制备过程。
四、教学策略
通过填写比较表格培养学生的自主学习、知识迁移能力; 通过一段关于“蓝猫———单克隆抗体及生物导弹”视频激发学生兴趣, 让学生获得感性认识;通过利用纸质细胞模型模拟单克隆抗体制备过程的小组探究活动, 培养学生的合作精神和探究学习能力;通过两位学生利用PPT讲解单克隆抗体的应用锻炼学生搜集整理信息的能力、语言表达能力等。
五、教学过程
1.情景引入
(1) 教师行为
课件展示番茄—马铃薯杂交植物图片和必修一中“小鼠细胞和人细胞融合实验示意图”。两幅图片利用了什么生物技 术呢? (细胞融合) 动物细胞是否也能进行融合呢?展示教材中动物细胞融合的图片, 指出这就是要学习的内容:“动物细胞融合与单克隆抗体” (板书) 。
(2) 学生行为
回顾思考上一节课中植物体细胞杂交的知识, 积极思考、回答, 自然过渡到新知识的学习。
(3) 设计意图
温故知新, 体现新旧知识的联系、必修知识和选修知识的联系。
2.动物细胞融合
(1) 动物细胞融合概念、与植物体细胞杂交的比较
①教师行为
课件展示教材中动物细胞融合的概念, 并强调关键词:两个或多个、杂交细胞。
图片展示两个实例:受精作用、鸡血细胞融合。同一张课件中展示植物体细胞杂交和动物细胞融合的图片, 让学生说出两者的相同点和不同点。点评学生的回答。引导学生思考细胞两两融合后可产生几种杂交细胞并讲解。请同学们拿出预 习学案中的比较表格来, 根据PPT中的答案进行更正。
(答案 :全能、增殖、聚乙二醇PEG、灭活的病毒、果胶酶、胶原酶、杂种植物、细胞产品、遗传物质)
②学生行为
理解动物细胞融合的概念, 利用实例加深对概念的认识。填写植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较表格。
③设计意图
通过强调关键词、举例等方法加深学生对概念的理解。学生通过填写与植物体细胞杂交的比较表格培养知识迁移、构建知识网络的能力。 通过让学生思考细胞两两融合后会产生三种杂交细胞为单克隆抗体的知识做好铺垫。
(2) 动物细胞融合的意义与应用
①教师行为
请学生结合植物体细胞杂交的意义思考动物细胞融合的意义。在实际应用中, 多数动物细胞融合都是为了制备单克隆抗体。那么什么是单克隆抗体? 有何作用? 如何制备呢? 播放视频:“蓝猫———单克隆抗体及生物导弹”。请同学们观看的同时思考两个问题:制备单克隆抗体运用了什么技术? 单克隆抗体的优点?
②学生行为
动物细胞融合突破了有性杂交方法的局限, 使远缘杂交成为可能。观看视频, 思考问题。
③设计意图
由动物细胞融合的应用自然引入单克隆抗体的知识, 然后以一段视频展示单克隆抗体的概念、制备, 视频中幽默的语言激发了学生的学习兴趣。
3.单克隆抗体
(1) 传统抗体与单克隆抗体
①教师行为
利用问题串引出单克隆抗体。问题1:获得抗体的传统方法是什么? 有何缺陷? 问题2:抗体由什么细胞产生的? (课件展示:必修三免疫调节一节中的图片, 说明一种B淋巴细胞只能产生一种抗体。) 问题3:如何才能让B淋巴细胞产生单一大量抗体? (课件展示:一个B淋巴细胞→细胞群→抗体, 即为单克隆抗体。) 问题4:什么细胞是可以无限增殖的? (课件展示: 骨髓瘤细胞是一种癌细胞) 问题5:如何才能将两种细胞的特点结合起来? (课件展示:如果将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合, 那么融合后的细胞就可能既能迅速大量繁殖, 又能产生专一抗体。 ) 很好, 同学们都想到了利用动物细胞融合的方法, 其实早在1975年两位科学家成功制备了单克隆抗体, 并因此获得了1984年的诺贝尔奖。PPT展示两位科学家的照片。
②学生行为
依次回答。问题1:向动物体内反复注射某种抗原, 然后从血清中提取。缺陷是产量低, 纯度低, 特异性差。问题2:由B淋巴细胞分化来的浆细胞分泌。问题3:一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群, 就能生产种类单一、特异性强的抗体。问题4:癌细胞。问题5:动物细胞融合。
③设计意图
通过环环相扣、层层递进的问题串引发认知冲突, 引导学生联想到只有将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合才能获得单克隆抗体。充分调动学生的旧知识构建新知识, 体现必修与选修知识的联系, 帮助学生构建单克隆抗体的概念。
(2) 单克隆抗体的制备过程
①教师行为
下面同学们认真理解教材图2-24, 阅读P54, 思考学案上制备过程的8个小问题, 然后分4人一个小组用纸质细胞模型模拟单克隆抗体的制备过程。此时向每个学生小组提供纸质细胞模型和剪刀、双面胶等工具。模型由一张细胞模型和一个流 程示意图组成, 均由一张A4纸打印而成。 (8个问题为:为什么向小鼠注射羊红细胞? 从小鼠脾脏中获到的B淋巴细胞有哪些类型?细胞两两融合后, 产生几种融合细胞?如何把杂交瘤细胞筛选出来?杂交瘤细胞有何特点?如何得到大量杂交瘤细胞?如何挑选出分泌羊抗红细胞抗体的细胞群?利用抗体阳性的杂交瘤细胞得到大量单克隆抗体的两种途径是什么? ) 教师在学生活动期间了解各小组的活动过程, 不时加以指导。随后让某个小组代表展示完成的流程图。教师按照8个问题的顺序讲解单克隆抗体的制备过程, 同时点评学生做的流程图。注意强调三种融合细胞、两次筛选、克隆化培养、抗体检测等知识要点。总 结归纳单克隆抗体的优点, 注意与传统抗体的特点相比较。
②学生行为
学生先自主学习, 阅读教材。再组成探究小组集体讨论每一个实验操作的原理和结果, 以及流程示意图中每个位置应该贴哪些细胞。最后进行粘贴纸质细胞模型的操作, 在操作中体验单克隆抗体制备中的每一个实验步骤的操作及原理。得出单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、可大量制备的特点。
③设计意图
这一部分是本节课的核心环节, 能否有效充分地实施这一环节直接关系到本节课的教学效果。此环节大约需要15分钟。学生在之前的视频中已经对单克隆抗体的制备有了感性认识, 在这一探究活动的开始阶段再结合教师给出的8个问题进行自主学习, 加深了理解。随后小组成员在讨论如何粘贴细胞模型的过程中必然会有观点的交流碰撞, 这种交流又一次加深了学生的认识。学生在探究活动中培养了自主学习能力、小组合作探究和交流能力及动手实践能力, 等等。教师点评一个小组探究结果的同时讲解单克隆抗体制备过程, 强调科学实验的严谨性, 使学生感受科学探究的魅力, 受到创新精神教育。
(3) 单克隆抗体的应用
①教师行为
下面请两位同学与大家分享单克隆抗体的应用。 (点评)
②学生行为
两位学生利用PPT讲解单克隆抗体在诊断试剂、治疗疾病方面的应用。在讲解诊断试剂时, 学生以淘宝店主的身份介绍了验孕棒的原理和使用方法, 其搞笑幽默的语言、夸张的表情博得了学生的阵阵掌声。其后举例说明了生物导弹的原理。
③设计意图
学生对单克隆抗体应用的内容比较感兴趣, 且易于理解, 因此课前让学生小组合作搜集整理信息, 然后在课堂上与全班同学进行分享交流, 培养学生获取整合信息的能力、语言表达能力。学生了解了单克隆抗体的应用的同时体会科学、技术、社会三者的联系, 受到了STS教育思想的影响。
4.课堂小结
(1) 教师行为
以流程图的形式对本节内容进行归纳、总结。
(2) 学生行为
学生随着老师的思路集体回答问题, 总结、归纳、反刍知识。
(3) 设计意图
有利于学生的知识构建, 达到了巩固升华的目的。
参考文献
[1]杜永娟, 樵福奎.小纸片、大用处.中学生物学, 2012 (2) :33-34.
[2]孔爱华.“单克隆抗体的制备”的教学设计.生物学教学, 2010 (2) :14-15.
克隆动物与克隆人 篇2
计
一、教材的地位和作用
《动物细胞融合与单克隆抗体》是人教版普通高中程标准实验教科书生物选修3专题二第2节动物细胞工程中第2小节的内容，由于细胞工程是建立在细胞结构、功能、生理等研究基础上的新技术，动物细胞融合又是细胞工程中基本技术之一，所以第2小节教学内容是在高中必修教材基础上的深入和扩展，也是第1小节动物细胞培养教学后的必然及延伸，是安排在学习了免疫、遗传与基因工程的基础上来进行教学的，学生既有一定的知识基础，又能为后面的微生物与发酵工程的教学奠定基础，尤其是为微生物的选种教学打下基础。同时，生物技术中各个分支领域相互渗透、相互促进，细胞融合技术也不例外，它在现代生物技术中具有一定的理论意义和经济意义。
二、学情分析
学生是在学习了《植物细胞工程》和《动物细胞培养和核移植技术》的基础上学习本节的，所以对于动物细胞融合这一部分应该能较轻松的理解，但是单克隆抗体的制备较复杂学生理解起来会有一定的难度，教师应详细介绍。
三、教学目标
根据新标要求和本节的具体内容，结合学生现有的知识水平，拟定下列教学目标。
、知识目标
（1）掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。
（2）简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。
（3）了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。
2、能力目标
（1）由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力、思维能力。
（2）让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。
（3）分析动物细胞融合技术的意义和应用，逐步提高学生独立获取知识、分析问题和解决问题的能力。
3、情感目标
（1）初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。
（2）通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。
（3）关注动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展和应用前景。
四、教学重难点
、重点
（1）动物细胞融合技术。
（2）单克隆抗体的制备过程。
2、难点
单克隆抗体的制备过程。
五、教学实施程序
教师组织和引导
学生活动
设计意图
创设情境，导入新、多媒体播放科幻电影中相关桥段，并展示人-鼠细胞杂交的图片，激发学生的学习欲望，导出本节的题。
2、进行学习目标的解读。、观看电影片段和人-鼠细胞杂交的图片，回忆所学知识。
2、熟悉本节所学内容，把握难点内容。
1、回顾人-鼠细胞杂交试验，让学生对动物细胞融合技术有初步的认识。
2、教学做到有的放矢。
自主学习，知识梳理、多媒体展示相关问题，组织学生进行解答。
2、根据学生的回答了解学生的预习情况。、通过前预习并进行知识梳理，组内讨论，形成统一认知。
2、小组进行展示。
培养学生自主学习的能力，并体现学生的主体地位。
合作探究，班内交流、多媒体展现合作探究内容，引导学生进行相互交流，并进行小组展示。
1、并合作交流，并确定学习难点内容。
培养学生合作精神。
点拨精讲，解难释疑
单克隆抗体制备的过程：
通过多媒体展示单克隆抗体的设计思路及制备过程，同时提出问题，学生讨论。
（教师讲解为主）
合作探究以下问题：
、如何获得B淋巴细胞？
2、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式（类型）？
3、选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么？
4、如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？
本部分知识较难，但学生通过预习能简单的分析出一部分，通过讨论使知识完整培养学生全面思考问题的能力
随堂练习，当堂反馈
多媒体展示相关习题
读题，思考与讨论，并进行解答
、巩固学生对实验分析解读能力。
2、通过对学生练习结果的评价，了解学生对知识的掌握情况，以便确定下一步的补偿性学习的安排。
归纳总结，科评价、多媒体展示“三个重要过程”“三个一”，帮助学生记忆和理解。
2、对学生的堂表现进行评价。
观看多媒体展示内容，对所学内容有一个概括性的总结。
科学评价有利于小组内学生之间的相互团结，培养学生团队合作的意识
七、板书设计
222动物细胞融合与单克隆抗体
一、动物细胞的融合二、单克隆抗体*、概念：、抗体11概念:Ig
2：B细胞
2、方法：
2、概念：杂交瘤细胞、高度单
一、抗体
3、过程
3、制备过程（杂交瘤制备技术）
4、意义：制备单克隆抗体
4、应用：“生物导弹”
克隆动物何以多发异常 篇3
极低的克隆成功率
所谓“克隆”，是指具有完全相同遗传信息（基因）的生物个体。生物细胞（体细胞）的一个个核中包含有构成其身体所必需的一切基因。从这个体细胞直接制造出另一个体的方法就是“克隆技术”。通常孩子是通过精子与卵子结合诞生，但是克隆动物不用经过受精过程就被制造出来。
多莉于1996年7月在罗斯林研究所诞生，次年2月介绍给公众，一时间成为全球瞩目的焦点，并被视为生物技术新时代来临的标志。该研究所采用所谓的“核移植”的方法，从成年的雌绵羊体细胞（乳腺细胞）中取出核，移植到被摘除核的另一个绵羊的未受精的卵中。与此同时，施加电刺激使体细胞的核与卵子融合，犹如受精卵那样开始分裂。由于这些细胞群具有与原来细胞完全相同的遗传基因，所以被称为“克隆囊胚”。多莉的情形是把克隆囊胚培养到由100个细胞左右组成的“胚泡期”，并把它移植到代理母亲的绵羊子宫中使其着床，直至出生。
多莉的出世，有力地促进了克隆技术的研究。1997年夏威夷大学从卵巢中的卵丘细胞（体细胞）成功地制造出克隆鼠，其后，牛（1998年）、猪（2000年）、山羊（2000年）、猫（2001年）、兔（2002年）也相继由体细胞克隆诞生。
但是体细胞克隆制造的成功率还很低，除了流产、死产外，由于脏器或组织异常，刚生下来就死去的也不少。日本京都大学今井教授说：“现在即使在世界顶级的实验室，克隆牛的成功率也就在10%~15%之间，而克隆猪是5%左右，克隆鼠是1%左右”。而且这个数字显示的是移植到子宫的克隆胚胎数对平安诞生的个体数之比，如果把核移植到制造克隆囊胚的阶段考虑在内，成功率会进一步降低。因为经核移植的个体并不是都能成长到胚泡期。多莉是277例试验的核移植中唯一成功的例子，成功率低于0.4%。
成功率低的原因是，制造的克隆胚胎几乎都发生某种形式的异常。尽管不同种类的克隆动物在妊娠、生育过程中出现的形态异常多种多样，它们也会有共同的异常，例如“胚胎的肥大”以及出生时就已经睁开眼睛的开眼异常。
胚盘是由着床在子宫的囊胚腔的外侧部分的细胞群（营养外胚叶）长成的，扮演了与母体的氧气交换或养分的交接等重要作用的器官。在那里因某些问题发生肥大，但这对胎儿的发育产生多大影响，现在还不清楚。
其次，共同发生的异常是“胎儿的过大化”。以牛为例，通常胎儿出生时应该是25千克左右，但是克隆牛出生时却超过了40千克。今井教授指出“这是非常危险的异常，因为这导致克隆动物无法自然分娩，通常要剖腹产子。另外，克隆动物的脐带比正常的粗而短，所以在出生后割断脐带时，会有母子因出血过多而死去。”
即使活了下来，50%左右的克隆牛也会在出生后1周前后死去。幸存的也由于肺的发育尚未成熟，不能很好过渡到肺呼吸（呼吸不全），或由于主司免疫机能的胸腺不足，很容易患传染病。
克隆动物异常的原因
关于克隆动物发生异常的原因，东京农大应用生物学系的河野教授做了如下说明。首先是染色体或基因水平的异常。例如老鼠有20条（40对）染色体，但是在克隆囊胚中会有几条发生缺失这样重大的变异。出现这样的情况，被移植的细胞分裂2~3次（2~4细胞期）就会死亡。另外部分碱基排列替换为别的碱基，或插入新的、或者缺失那样的变异，都会引起克隆囊胚的异常。学界早就预料到这些异常的发生，但是到了近年才获得了全新的认识。那就是加在基因的碱基排列上的化学的修饰（基因修饰）的异常。基因修饰意味着什么呢，我们从受精的情形加以说明。
哺乳动物受精时从精子（父）与卵子（母）各继承了一个同样的基因，通常两个基因都会显现作用。但是在显现作用的过程中，其中一个会受到抑制，仅另一个的机制显现作用。奏效的那个基因会调节所制造的蛋白质的量。
在结构上，由于甲基（—CH3）粘在一方基因的碱荃排列上，显现那个基因的开关被控制在“中断”的状态。这种带甲基的基因标志被称为“印记基因”，是基因修饰的一种。在受精过程中印记基因起着非常重要的作用。迄今为止，在老鼠身上识别的印记基因约有70个。
印记基因的存在，表明哺乳动物是通过双亲的基因相互补充，才使个体顺利地发生。在老鼠实验中，如果仅由父亲基因制作的胚（精核发生胚）或仅由母亲基因制作的胚（卵核发生胚），在妊娠10天左右都会死亡。
这是因为两者基因表达的开关都打在通或断，发生所必需的蛋白质完全没有制造或是过分制造所致。即如果来自父亲和母亲的基因组没能融合在一起，就会造成不能很好发生的结构。
通常精子和卵子受精后，会依次启动被印记在基因组上的程序构造身体。沿着这个程序，在体细胞的核上对印记基因或其他基因施行甲基化等修饰（外传的基因修饰）。如果这样，体细胞就能够扮演神经和肌肉等各个特定的角色。
所以没有受精程序的克隆技术，将移植到卵子的体细胞核的程序返回到还未担负角色前的各种细胞具有的状态，即有必要获得全能性，此过程被称为“再编程”。但是几乎所有克隆胚的再编程好像都没有合适地进行。
河野教授解释说：“实际在克隆鼠身上发生广泛的基因修饰的异常。因为在修饰起重要作用的印记基因等的表达变得不正常，才导致各种形态的异常。但是到底那个基因异常对应哪种异常还不清楚。”
专家认为，能够平安出生的极少数克隆动物，可说是“再编程”碰巧完成的结果。但这是否是完美无缺的“再编程”，何以有那样顺利的“再编程”都不清楚。
异常不会传给后代
1998年4月多莉通过自然交配、妊娠，生下了第一个孩子“波尼”，其后多莉又先后生育了3个，证明克隆动物也有生殖能力。
碱基排列上发生的碱基置换等异常肯定，传给子孙，但克隆的基因修饰的异常并不传给子孙。河野教授说：“这是因为在制造生殖细胞最初的阶段，带甲基的标志一下子被去掉了，成为精子、卵子时又被重新进行正常标记的缘故。”
所以由克隆动物生出的后代未见异常。波尼是正常的，克隆鼠的后代也未见异常，这一事实已在河野的实验室得到确证。这些事实将成为证明克隆的异常起因于基因修饰异常的重要证据之一。
克隆动物何以早衰、短命呢？
多莉在死亡约1年前，被发现患有老年羊常见的关节炎症。由于当时多莉刚5岁半，还年轻，所以研究人员怀疑这是克隆技术带来的基因异常所导致的。
如人类的皮肤那样每天都进行新陈代谢，其组织细胞常由新生的替代。但是一般细胞的分裂次数是有限的，在反复分裂的过程中，细胞的老化就会加剧。
染色体的末端部分有称为“端粒”的结构，它扮演着减数计数细胞分裂的时钟作用。端粒是由6个碱基构成的排列反复出现几千次组成的结构。当反复分裂的次数达到50~60次时，细胞就不再分裂。
研究出生不久的多莉细胞的端粒，发现其比同龄羊的短20%左右。这个恰恰相当于提供体细胞的雌羊的年龄（6岁）。那么克隆动物是否在遗传上就注定会寿命短，过于早衰而死亡呢？
关于克隆动物的端粒长度有若干研究报告，有报告称克隆牛既有像多莉那样短的情况，也有像正常受精出生的个体一样长的情况。不可思议的是，也有报告称有比受精个体更长的情况。今井教授说：“因为个体的寿命受生理上的因素影响很大，所以不一定仅限制于连接端粒的长度。关于克隆动物的寿命有长短不同的各种报告，不能一概断言它们都短命。”
寄予克隆技术的梦
众所周知，制造克隆人，不仅涉及“亵渎人类尊严”这样伦理上的问题，而且从科学技术上看，还有堆积如山的未解决的课题，所以许多人对此持反对意见。
但是克隆技术在畜产和医疗领域却有很大的发展空间。它使得像质鲜味美的高产牛这样高品质的食用家畜的大量生产成为可能；如果该项技术与基因重组技术结合，就可以建立在家畜体内生产药用物质的“动物工厂”；通过重组人的基因抑制排异反应，用作脏器移植的克隆猪研究也在进行中。
因为克隆技术的诞生，“再生医疗”正备受期待。所谓的“再生医疗”，就是从自己的克隆胚制造因疾病损坏的身体部分，将它移植到患处进行治疗的方法。此外灭绝动物的再生或许也会成为可能。
揭开克隆动物寿命之谜 篇4
克隆动物的年龄究竟从0岁还是从被克隆动物的年龄开始计算?20年前,科学家用一个成年羊的体细胞成功克隆出一只小羊,她就是著名的克隆羊多莉。多莉因患骨关节炎(一种老年绵羊病)不幸早夭,仅存活了6年半(一般绵羊能活12年左右),因此加重了人们对克隆动物可能比正常动物衰老更快的忧虑。英国诺丁汉大学凯文及其同事研究了1 3只7～9岁的克隆羊,并与5～6岁的对照组进行了对比,没有检测到克隆羊与衰老相关的分子标记,这为研究生命衰老的规律提供了新途径。
克隆动物与克隆人 篇5
1.概念：是指用于快速繁殖优良品种的，叫，
也叫
2.优点：
(1)保持的遗传特性
(2)地实现种苗的
(3)不受自然生长季节的限制(因为在具有一定人工设施的室内生产)
(二)作物脱毒:
1、原理：植物附近(如)的病毒极少，甚至无毒。
2、获得脱病毒的植株的方法：切去一定大小的进行，获得脱毒苗。
3、优点：使农作物，产量
4、实例：、草莓、甘蔗、等主要经济作物
(三)神奇的人工种子：
1.定义：人工种子就是以得到的、、和等为材料，经过包装得到的种子。
2.人工种子制备技术的主要流程图：
诱导植物愈伤组织→体细胞胚的诱导→体细胞胚的成熟→体细胞胚的机械化包裹→贮藏或种植
3.优点：
(1)后代无
(2)在生产上不受、、限制
4.实例：芹菜、花椰菜、桉树和水稻
二、作物新品种的培育：
(一)单倍体育种：
1.过程：通过培养获得，加倍后当年便可得到遗传的优良品种。
2.优点：
(1)后代是纯合子，能
(2)极大地缩短了
(二)突变体的利用：
1.产生：由于培养细胞一直处于不断的，因此容易受到和(如、等)的影响而产生。
2.利用：从产生的突变体中可以出对人体有用的突变体，进而培育成。
三、细胞产物的工厂化生产：
1.细胞产物种类：、脂肪、、药物、、生物碱等
2.技术：植物技术
克隆动物食品渐行渐近 篇6
不同的克隆方式和克隆动物食品
克隆是从英语词汇clone音译而来，意为无性繁殖，指的是用生物(动物和植物)自身生殖细胞或体细胞的DNA来复制繁衍后代。来自克隆动物及其后代的食(产)品就是克隆动物食品。但是，这类食品被英国食品标准署看作是“新食品”，因为它们还没有经过长期实际食用检验。
现在流入英国市场的克隆牛只是一种很普通的克隆牛。英国食品标准署的调查表明，克隆牛最初是在美国克隆产生的。克隆的方式和过程是，先把荷兰奶牛的卵子克隆，再把克隆产生的卵子与普通公牛的精子相结合，产生的胚胎被冷冻后送往英国，并在英国植入母牛体内进行繁殖。
由于克隆牛的母系是著名的荷斯坦品种，产生的后代可以大量产奶和通过这种克隆方式可以更多地繁殖后代，所以才采用了这样的克隆方法来繁殖后代。因此，这样的克隆牛并非是为了获得特殊的生物产品，只是为了更多地获得牛肉和牛乳。这头克隆牛在英国的第一代后代共有8头牛，其中公牛和母牛各4头。在4头公牛中，有两头分别在2007年和2010年5月被宰杀，牛肉已流入市场；并可能已被消费者吃掉。另外两头在自然死亡或被宰杀后，牛肉并未进入市场。
在4头母牛中，一头已死亡并得到妥善处理，另外3头母牛中，已确认一头所产的奶未进入市场，但另外两头产的奶是否进入市场尚不确定。当然，这8头牛在英国也繁殖了后代，但现在还未成长为成年牛，所以英国食品标准署表示将继续对这些克隆牛进行调查。
其实，这样的克隆并非如多利羊那种途径的克隆，而只是部分克隆。现在英国流入市场的克隆牛其实是把母牛的卵子克隆后，再按正常的生殖途径与公牛的精子相结合产生后代。但不管怎么说，这也是一种类型的克隆。
反对克隆动物食品的理由
现在英国的克隆牛食品流入市场后引起的争论主要是，克隆动物食品是否对人安全，是否可以像普通动物食品一样来食用。
对此，英国食品标准署表示，克隆牛奶等来自健康克隆动物的食品目前看起来是安全的，但必须按规定获准才能在英国上市。
但是，公众和一些专业人员则认为，事情并非如此简单，因为迄今为止，既没有证据证明克隆动物食品是有害的，也没有证据证明它们是安全的。相反，人们担心这样的克隆动物食品的害处大于益处。
因为克隆动物出现疾病、畸形和早夭的比例很高，这会让克隆动物食品充满风险，包括养殖和消费的风险。
克隆羊多利就是一个范本，它有多种疾病，并因早衰而被处以安乐死。尽管多利之父伊恩·威尔穆特认为，“它(多利)的疾病可能与克隆技术没有什么关系”，但是相当多的研究提示，多利的疾病和早衰与克隆技术有关。早在1999年6月，苏格兰PPL生物技术医疗公司的保尔·希尔斯等人就发现，多利细胞中的端粒比预期的短20％，几乎与其6岁的母亲(提供细胞核的母羊)的端粒长度一样，说明多利已经提早衰老。由于肺部感染等疾病和提前衰老，1996年7月5日诞生的多利于2003年2月14日被执行安乐死。
在多利之后，世界各地的各种克隆动物联袂结队，翩翩而来，出生时可谓风光一时，但不久便产生这样或那样的疾病或问题。1998年2月20日法国克隆小牛玛格丽特刚出生不久就死亡，后来确认，玛格丽特之死与严重的基因缺陷有关。同样日本2001年克隆出了8头牛，但出生后不久就有4头死亡，也是因为免疫系统功能低下而不能抵御感染而死亡。中国2000年诞生的克隆羊元元在出生后不到两天死亡也是因为有严重的遗传缺陷。
美国华裔科学家杨向中于2002年5月公布的一项研究结果对克隆动物做了比较有说服力的总结：克隆牛(动物)容易夭折的最主要原因是，克隆母牛的x染色体基因不能正常表达。其他克隆动物也存在这个问题。
克隆动物食(产)品的未来
克隆动物食品能否为人们所接受，能否在未来的消费市场占据一席之地，取决于几个因素。一是克隆动物产品，包括食品能否成为人类巨大的需求，二是这类产品是否能产业化并获得巨额利润，最后是这类产品是否安全，以及是否符合当代社会的伦理原则，包括动物权利。
现在，人类对克隆动物产品的需求正在增多，并且克隆的技术手段日益丰富，产品也逐渐增多，但安全性和伦理原则却有待评估，后两者便成为克隆动物产品发展的瓶颈。
欧盟委员会发言人马利尼霍尔茨纳指出，全世界现在约有2000头克隆动物，其中欧盟有200头左右，不过这些牛或猪完全是作为科学研究之用，并未流入食品市场。然而，实际上全球的克隆动物远不止这个数，克隆动物食(产)品也层出不穷。仅以中国而言，克隆动物的发展就叹为观止。
现在的克隆动物和产品主要分为三类。一种是为了提高动物食品如肉类和乳类的产量和质量而进行克隆。例如，中国克隆的冀南牛是中国特有的优良地方黄牛品种，分布在我国河北，主要特点是耐寒、肉多脂少。二是为了保护濒临灭绝的动物，如大熊猫。同时，对冀南牛的克隆也有一部分原因是为保护这类优质牛，因为目前这类牛数量急剧减少，已濒临灭绝。三是为了获得一些特殊的功能性动物食品，甚至包括药物。例如，韩国的CHOA制药公司于2010年8月9日宣称，他们成功培育出了拥有人类生长激素基因的转基因克隆猪，方法是在猪体细胞内注入人类生长激素基因，再将其移植到无核卵子内复制，最后培育出了克隆猪，可以生产人生长激素。当然，由于人类需求的扩大，转基因克隆动物还可以生产出各种凝血因子，如凝血因子Ⅷ、人血清白蛋白、乳铁蛋白、红细胞生成素等。
从市场需求来看，第一类和第三类克隆动物是人类最为需要的，但是，如果以餐桌上的食物而言，则第一类克隆动物食品是人类最大的需求，因为通过克隆能在数量和质量上满足日益增长的人口的饮食消费需求。但是，随之而来的便是安全问题。对于克隆动物食品的安全，发达国家分成两派。一派是美国，认为克隆动物食品是安全的，另一派是欧盟，认为还没有完全的证据证明克隆动物食品是安全的。
美国食品与药物管理局(FDA)用了6年时间组织科学家对600多头克隆动物(猪、牛)的肉和奶进行了检测。FDA于2006年和2008年陆续发布对克隆动物检测的消息，称经过各项指标的化验和比对认定，克隆动物食品中所含的维生素、脂肪、蛋白质、氨基酸等含量与普通动物食品并无两样。而且，那些经克隆动物食品喂养长大的实验鼠也没有出现什么不良反应。
随后，欧盟食品安全机构(EFSA)也对克隆动物肉奶制品发表了意见，称来自克隆动物及其后代的食品与那些传统养殖的动物食品相比，几乎没有什么两样。目前看来，克隆动物也没有给环境带来影响。但是，欧盟的下属咨询机构“科学与新技术伦理欧洲小组”(EGE)则发表长达55页的意见书，称“还没有令人信服的论据证实克隆动物食品的安全性”，在克隆食品进入欧盟市场前，必须充分考虑其对人类健康的影响，保证动物福利达到世界动物健康组织标准。EGE还建议，除了EFSA所调查的克隆猪和克隆牛品种外，最好再对其他克隆物种作进一步的研究。
当然，克隆动物食品最大的通行证应当是人们的认可。但目前无论在美国还是欧盟国家，人们都对克隆动物食品持保守态度。大部分人对克隆动物食品感到不太放心。
所以，克隆动物食品尽管有巨大的市场需求，但在近期和可以看到的未来都不可能大量地进入人们的肠胃，除非是生产者和商家偷偷摸摸地把这类食品放入超市让人购买。但是，在解决了安全和心理问题后，克隆动物食品有朝一日会成为人类餐桌上一道平常的菜肴。
哺乳动物克隆技术的研究进展 篇7
所谓克隆指的是遗传物质完全相同的个体集合, 比如自然发生的单卵双生的双胞胎个体。而用人工的方法获得克隆, 主要有两种方法:一是人工的分割卵裂球或桑椹胚以至囊胚所得到的来自同一受精卵的个体。二是用核移植的方法, 将来源于同一受精卵的着床前胚胎细胞, 或者成体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中, 以获得遗传物质相同的个体。该方法即人们通常所说的克隆。利用着床前胚胎细胞做供体制备克隆动物已经在小鼠、绵羊、兔、猪、牛、猴等多种哺乳动物上获得成功。利用成体体细胞做供体, 首例突破是1997年多利的诞生。实验者将一成年母羊的乳腺上皮细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中, 经胚胎移植获得了克隆羊。这一划时代的成果, 彻底结束了人们对分化细胞的命运已经决定, 不能重新获得分化潜能的论断。随之而来的是通过在克隆技术和方法上的改进, 以适应不同物种的特殊性, 在牛、小鼠、猪、兔、猫、大鼠、骡、马和狗等动物上也获得了成功。最近, 克隆雪貂也获得了成功。同时, 对哺乳动物体细胞重编程机理的研究也得到了进一步的深入。哺乳动物体细胞克隆的成功使人们对个体发育过程中的诸多观念的认识发生了重大的改变。同时也给发育生物学、生物工程学、遗传育种学和生物医学带来了新的机遇与挑战。
2 体细胞克隆的方法研究进展
2.1 胞质受体的选择
胞质受体的选择是克隆动物的第一步。对于核移植的早期研究, 人们首先采用的是去掉原核的受精卵, 由于受精卵的细胞质已经激活, 对供体细胞核进行重新编程的能力差, 所以对于体细胞克隆来说MⅡ期的卵母细胞被大多数人认为是合适的胞质受体 (犬科动物的卵母细胞停留在第一次减数分裂前期) 。MⅡ期的卵母细胞已经成熟, 维持的时间长, 并且有较高的MPF活性, 有利于供体细胞核的重编程。
对于MⅡ期的卵母细胞, 有人认为早期的, 也就是第一极体刚排出不久的卵母细胞更有利于供体细胞核的重编程。2003年陈大元等用体外培养19h后第一极体刚刚形成的卵母细胞作受体获得克隆牛, 囊胚率为26.63%。但是在用猪的MI期的卵胞质做受体克隆猪胚胎时, 其发育率低于MⅡ期的卵母细胞胞质。这可能与早期的卵母细胞胞质没有完全成熟有关。2002年Chesne等用HCG注射后16h收集的卵母细胞做胞质受体, 用颗粒细胞做供体获得了克隆兔, 其囊胚率为47%。他们所用的采卵时间和其他的试验小组相比较, 晚2～3h。
对于用激活以后的MⅡ期的卵母细胞做受体仅在克隆山羊上有一例成功, 在多数的实验中激活的卵母胞质不能够支持重构胚的发育, 这可能由于激活后的MPF下降有关, 也可能是由于物种的不同。而对于激活MⅡ期的卵母细胞, 待其排出第二极体时再去核的方式在兔、猪和小鼠上都有应用, 并在猪和小鼠上获得成功, 在兔上的应用获得发育至15天的胎儿。
由于试验过程中实验动物排卵的时间跨度很长, 不同时期所排出的卵用于核移植的结果差别很大, 但以排卵过程中间时段排出的卵较好。同样, 体内成熟和体外成熟的卵母细胞差别也很大, 这主要是由于一些物种的体外培养系统不够完善所至。而对于牛、猪以及羊, 这些物种的卵母细胞体外成熟培养体系已经比较完善, 已有多例克隆动物来源于体外成熟的卵母细胞。由于体外培养系统更容易获得刚刚排出第一极体的卵母细胞, 而且时间比较一致, 也能够节约动物, 是未来克隆动物较好的胞质受体来源。只是需要进一步针对不同物种研究体卵母细胞体外成熟培养的最佳条件。
2.2 供体细胞的选择
合适的供体细胞是克隆成功的先决条件。自然状态下, 卵泡内的颗粒细胞是公认的适于做供体的细胞, Wakayama等 (1998) 和Chesne等 (2002) 的工作很好地说明了这一点。这主要是由于新鲜的颗粒细胞多数处于G0/G1期 (>90%) , 以及颗粒细胞内组蛋白的特殊性造成的。对于培养的成体细胞, 心肌细胞、神经细胞、乳腺上皮细胞都能用于制备克隆动物, 但比较常用的是成纤维细胞。
对于细胞所处的周期, 人们普遍接受的是用的G0/G1期细胞, S期的细胞核进入受体卵母细胞后会发生碎片化, 而M期和G2期容易造成多倍体。G0/G1期细胞的获得常用的方法是靠血清饥饿培养诱导, 但长时间的血清饥饿会导致细胞凋亡。Kues等 (2002) 在对培养猪的胎儿成纤维细胞进行不同程度的血清饥饿培养后发现, 0.2%的血清饥饿5天可以导致接近40%的细胞发生凋亡。而Gibbons等利用roscovitine处理供体细胞, 获得了6%的克隆牛出生率, 明显优于血清饥饿培养的细胞。这可能与roscovitine能使细胞周期更一致, 且不影响细胞的活性有关。但是G0/G1期细胞并不是唯一的选择, 利用卵母细胞在激活后会排出第二极体的现象, 在小鼠和猪的克隆中, 用处于M期的供体细胞与去核卵母细胞融合, 然后激活使其排出一半的遗传物质, 也可以获得克隆动物。
至于细胞培养的代数, 一般认为长时间的传代培养会导致供体细胞染色体的畸形率增加, 但由于各个实验室的培养技术和所用培养条件差别很大, 结果也就很不相同。一般为10代内为好, 最好不要超过15代。这主要是考虑减少体外培养导致的突变在培养过程中的积累。
2.3 克隆胚胎的构建方法
去除MII期卵母细胞核比较常用的方法是用带有锋利小尖的玻璃管针将MⅡ期的卵母细胞的纺锤体连同极体一起吸出, 然后将供体细胞放入卵周隙内, 之后用细胞融合的办法使去核的卵母细胞与供体细胞融合。
2.3.1 去核方法
在已知的哺乳动物的卵母细胞中, 只有小鼠和大鼠的卵母细胞在微分干涉相差显微镜下可以看见纺锤体, 其他动物难以看见, 所以针对不同物种, 发展了不同的方法。
盲吸法。由于在卵母细胞完成第一次减数分裂后的一段时间内, 纺锤体位于第一极体下方, 所以吸去第一极体和其下方的约1/4的卵胞质, 基本上可以去掉纺锤体。这种方法避免了染色剂和紫外线的使用, 减少了对卵胞质的伤害, 并在一些动物上克隆获得了成功。但由于物种的差异, 有很多物种卵母细胞的纺锤体并不在极体的下方, 导致该方法去核不完全, 尤其是兔, 经过脱除颗粒细胞的挤压和随着卵母细胞卵龄的增加, 纺锤体往往离开第一极体甚至到了第一极体的对面, 造成用盲吸法去核率达不到50%。在去核不完整的情况下会造成多倍体或者融入的核不发育而形成孤雌胚胎。这样会导致效率的低下和发育率统计的错误。因此这种方法正逐渐为人们所放弃。
荧光染料法。根据某些荧光染色剂可以与DNA相嵌合的原理, 在染色剂的帮助下的, 通过紫外线看见细胞核然后去除之。该方法去核准确, 但染料和紫外线对卵母细胞有毒害作用, 所以去核时间不能过长。Yang等在胚胎细胞克隆兔的试验中发现在紫外线照射下超过30秒, 兔卵母细胞的活性显著降低。尽管如此, 通过这种方法已有多种克隆动物出生。
化学法去核。先激活MⅡ期的卵母细胞, 待其排出第二极体时加入抑制剂使卵母细胞停留在MIII期, 然后将凸出卵母细胞膜含有细胞核的部分去掉, 该去核的方式在兔、猪和小鼠上都有应用, 并在猪和小鼠上获得成功。
Spindle view系统下去核。由于构成纺锤体的微管蛋白具有极性, 所以当594 nm的光通过时会发生偏转, 由此科学家设计了一种设备, 即Spindleview系统, 可以在特定的自然光谱下看见纺锤体, 装备了这种设备的显微镜称为极化显微镜。在极化显微镜的帮助下可以看见纺锤体的位置, 使去核变得安全高效。据我们所知, 该方法正在为大多数核移植试验室所采用。
另外还有改变渗透压、离心、物理照射等方法去核, 但这些方法对卵母细胞都有一定的伤害。
2.3.2 核转移的方法
为达到细胞核的转移, 常用的有两种方法:
细胞融合法。最早使用的融合方法是用仙台病毒或PEG介导融合, 这种方法效果很不稳定而且毒性大。而Willadsen等 (1986) 在利用胚胎细胞克隆羊试验中采用的直流电击介导细胞融合的方法, 简便而且高效, 目前已广泛使用。由于试验者限于技术方法及设备的原因, 操作过程中容易引起卵的激活, 尤其是融合过程中的电击, 在细胞膜外钙离子进入和细胞内钙离子释放的情况下, 极易导致在融合的过程中使大部分卵激活, 缩短了体细胞重编程的时间, 使克隆的效率下降。于是有人采用了降低或去除钙离子的融合液。
胞质内注射法。该方法最早是用尖细的玻璃针将供体细胞核直接注入到卵母细胞内, 由于损伤大, 使用较少。但是最近几年出现的Piezo设备, 利用压电装置可以在较小损伤的情况下, 将卵母细胞去核, 并移入供体细胞核。由于操作过程避免了对卵母细胞的过早激活, 使克隆效率提高。由于该设备的使用, 使克隆小鼠变为可行, 而且重复性好。且在其他物种克隆中也有应用, 并获得成功。
2.4 新的核移植技术
2003年Oback等在克隆牛的过程中发明了一种徒手克隆的方法。该方法是在经酶消化除去透明带后, 将卵母细胞用利刃切成两部分, 将含有核的一半去掉, 用余下的半个卵母细胞与供体细胞融合, 之后再和另外的半个卵母细胞融合, 重构成一个胚胎。这种方法的优点是在核移植过程中大大减少了显微工具的使用。
2003年陆长富等使用的先导入供体细胞核, 激活以后在原核期再去掉卵母细胞核的方法, 获得了人的克隆胚胎, 这显然是一个新颖的思路, 它可能更好地启动了卵母细胞的发育程式。
2003年周琪等使用激活抑制剂 (MG132) 克服了大鼠卵母细胞自发激活的特点, 获得克隆大鼠成功。
2004年在利用有丝分裂终末的神经元-嗅细胞克隆小鼠的实验中, 试验人员采用了从来源于嗅细胞的克隆胚胎中分离出胚胎干细胞, 然后将胚胎干细胞注入四倍体的囊胚腔中继续发育, 获得了来源于嗅细胞的克隆小鼠。
2004年Sullivan等在克隆牛的实验中用M期细胞的提取物经渗透法进入G0/G1期的细胞, 使之发生PCC, 剥脱掉大量蛋白质, 然后再封闭后用于核移植, 获得了克隆牛, 并提高了成活率。
这些例子说明克隆技术本身还有很多可以挖掘的地方, 需要人们不断摸索和尝试。
2.5 克隆胚胎的激活
对克隆胚胎的激活的方法, 一般都来自于受精过程研究的启示。卵母细胞在排卵发生后停滞在MII期, 这时卵母细胞内MPF的含量维持在高水平。MPF由cdc2和cyclinB构成, 它由CSF调控, 而CSF包含Mos, MAPK和p90。虽然卵母细胞在受精过程中激活的机制至今没有完全清楚, 但有两点可以肯定:一是由于精子进入带来的Ca2+浓度的上升和随后卵母细胞内Ca2+的周期性波动。二是由与Ca2+浓度上升介导的信号传递, 导致MPF的降低。为此, 模拟受精过程产生的Ca2+波动和降低MPF的水平是激活卵母细胞最直接的思路。
化学药物或者物理刺激都可以使卵母细胞内Ca2+浓度升高。化学试剂有钙离子霉素、7%的乙醇、氯化锶和IP3等, 物理的方法有针刺、微注射Ca2+和电刺激等。其中应用最广泛的方法是电刺激。其基本原理是在瞬间高压下, 细胞膜上形成可恢复的微孔, 让融合液中的Ca2+进入卵母细胞内, 造成Ca2+浓度的升高。在小鼠克隆过程中7%的乙醇, 氯化锶更为常用, 而在克隆牛的实验里钙离子酶素则是首选。在兔卵的激活过程中, 电脉冲则是常用的方法。对不同动物使用不同的激活方式可能与不同卵母细胞的卵膜性质不同有关。
针对性地降低MPF活性也是卵母细胞激活的方法。一是抑制MPF的亚基合成, 如CHX和嘌呤霉素。二是用蛋白激酶的抑制剂, 比如6-DMAP、十字孢碱和H7等抑制MPF的生成, 从而导致MPF的彻底消失, 使卵母细胞激活并形成原核。但是由于这些抑制剂的底物具有普遍性, 往往会对细胞骨架和DNA复制产生负面影响, 从而影响胚胎的发育, 所以使用时间不能过长, 最好联合使用, 以缩短时间。
使卵母细胞内钙离子浓度升高, 可以激活卵母细胞, 但这种激活是不彻底的。而仅仅依靠MPF的抑制剂也不能激活卵母细胞。1994年SuskoParrish等的结果表明, 牛卵母细胞在仅用电击的情况可以启动减数分裂, 但不能形成原核;只有在Ca2+浓度升高和6-DMAP联合使用时卵母细胞才进入有丝分裂。1999年Mitalipov在融合液中加入IP3激活兔卵的试验中, 发现仅用IP3只能30%激活卵母细胞, 没有获得囊胚。而将IP3和6-DMAP联用可以84%激活卵母细胞, 并获得50%的囊胚率。
由于受精过程带来的钙离子波动以及相关蛋白的变化极其复杂, 所以人工的激活往往不能完全模仿受精过程。所以有人提出用精子提取物激活卵母细胞的方法, 2000年Machaty等用猪的精子提取物可以89%地激活猪卵母细胞至出现原核, 但囊胚率仅有2%。2002年Choi等在生产克隆马的胚胎的过程中用马的精子提取物, 但效果并不理想。
3 克隆动物细胞核重编程研究进展
3.1 供体细胞核膜破裂和PCC
由于操作方法和所用的受体胞质的不同, 供体细胞核将有两种命运:一种是保持不变, 一种是核膜破裂, 核纤层解体, 染色质凝集 (PCC) , 形成新的纺锤体。通过不同供体细胞与受体胞质细胞周期的配合研究发现, PCC有利于供体细胞核的重编程, 这可能是PCC过程中染色质暴露于胞质中, 更有利于重编程的因子与之接触。但也有实验证明, 不发生PCC的胚胎也能发育。但是, 核膜的破裂或者透化是必需的。Kim等 (2002) 的工作表明, 在核移植小鼠的一细胞期供体细胞核内的TBP (TATA-box binding protein) 的清除和重建, 以及细胞核对DNA酶I的敏感性的升高, 是克隆胚胎正常发育所必需的。而这种变化是以高的MPF活性为基础的。将卵母细胞先激活后再进行核移植的胚胎不发生以上变化, 体细胞核发生的这种变化和卵母细胞成熟过程中GVBD或者受精后精子的核膜解体类似, 在PCC过程中发生了大量的蛋白质的交换。由于PCC过程发生迅速而且剧烈, 所以S期的供体细胞常常发生碎解。
3.2 组蛋白H1的变化
体细胞核重编程过程中一个重要的变化是H1的变化。Bordignon等 (1999) 在克隆牛实验中发现, 体细胞的H1在移植后6h消失, 而在8细胞期, 也就是ZGA时重新出现。Bordignon等 (2001) 在胚胎细胞核移植小鼠上的结果和在体细胞核移植小鼠的结果还说明, H1的丢失和核膜的完整与否与卵母细胞所处的细胞周期有关。核膜完整时不会失去H1, 但在PCC发生后, H1将很快消失, 而H1的移除是形成染色质前复制复合体 (pre-replication complex) 的关键步骤。最近在小鼠上的研究表明, H1的另一种相关组蛋白H1FOO在核移植后5min内即在核内聚集, 30min后代替H1原来的相关蛋白并与染色体紧密结合。而且小鼠卵母细胞清除H1的能力在激活2～4h后消失。H1FOO在克隆胚胎发育到2-细胞时开始被体细胞组蛋白H1替换, 这种替换在4-细胞时基本完成。
3.3 DNA甲基化和基因印记的变化
DNA甲基化在哺乳动物中广泛存在。在胚胎发育过程中, 个体通过对基因组的甲基化来改变DNA和蛋白质的相互作用。在体细胞中DNA复制过程中, 甲基化是靠DNA甲基转移酶 (DNMT1) 维持在两条链之间传递的, 在正常胚胎发生过程中, DNA的去甲基化发生在胚胎早期, 大部分在8细胞以前;而后随着胚胎的分化过程, 重新发生不同的甲基化模式。胚胎通过甲基化和去甲基化开放或关闭某些基因, 以适应不同时空的的发育要求。例如胚外组织X染色体先于胚内组织失活。另一个去甲基化和甲基化的活跃期是配子发生期。通过不同的甲基化图谱形成不同的基因印记, 含有不同基因印记配子, 通过受精结合, 可以获得正确的基因印记图谱。而在核移植的过程没有配子发生的过程, 因此容易导致DNA甲基化的异常。Ohgane等 (2001) 在小鼠体细胞克隆过程中发现, 与正常的受精的小鼠相比较, 经过克隆出生的小鼠和死胎中的甲基化图谱及基因印记发生了变化, 而且不同个体之间的变化不同, 这种变化好像是随机的。Bourchis等 (2001) 发现克隆牛胚胎的DNA甲基化图谱与合子中也不相同, 克隆胚胎的着丝粒区异染色质呈现比正常胚胎的更高程度的甲基化。克隆胚胎可以保持供体来源的甲基化至少两个细胞周期。这些不正常的甲基化和基因印记可能是导致克隆技术效率低下和克隆动物发育不正常的主要原因。
3.4 端粒长度的变化
端粒是染色体末端的的重复性结构, 在DNA复制的过程中由于DNA聚合酶是由5’到3’合成的, 这样5’端的端粒每次有丝分裂都会减少200bp的长度。由于端粒的长度有限, 所以导致细胞有丝分裂的次数有限。已知有些组织或细胞含有能使端粒修复的端粒酶, 比如原生殖细胞和ES细胞有比较高的端粒酶活性, 可以无限分裂。但对于克隆动物端粒的长度, 自多利羊诞生以来一直是人们关注的焦点。克隆动物的端粒长度与正常动物比较的结果有较大差异。1999年Shiels等的研究表明, 多利羊的端粒比正常的羊短了20%, 由于供体羊年龄和体外培养造成的端粒的短缺在多利羊克隆过程中没有被修复。但是在用牛的成纤维细胞和类ES的克隆试验中却发现端粒长度得到了恢复甚至延长。2002年Miyashita通过多种类型的供体细胞克隆牛的端粒比较后发现, 细胞类型对端粒的长度有影响, 来自上皮细胞的克隆牛的端粒最短。最近的研究表明, 在小鼠和牛的胚胎中端粒长度的恢复主要集中在胚胎从桑椹胚到囊胚转化的过程中, 这时的胚胎有高的端粒酶活性, 在克隆胚胎中这种现象同样发生。
4 哺乳动物异种克隆的研究进展
异种克隆是指把一种动物的细胞核移入另一物种的去核卵母细胞内, 继续完成其发育到囊胚甚至个体的过程。由于哺乳动物的卵比较小, 难于操作, 而且从每个个体得到卵的数量较少, 所以哺乳动物异种克隆较两栖类和鱼类的研究起步晚, 直到多利羊出生以后才有这方面的研究工作开展。
1999年Dominko等以牛的卵母细胞为受体, 分别获得了猴-牛, 绵养-牛, 猪-牛, 大鼠-牛的异种克隆胚胎。同年Lanza等将人的体细胞移入牛的卵母细胞, 10只克隆胚胎中, 有1只发育超过16细胞期。2000年Lanza等把野牛的皮肤成纤维细胞移植进入家牛的去核卵母细胞中, 克隆胚胎移植进入家牛体内后可以发育到复杂的器官形成。2001年Loi等将已经死亡的欧洲盘羊的颗粒细胞移植进入绵羊的卵母细胞, 发育到囊胚后, 移入受体绵羊子宫, 产下一只正常的盘羊。2003年Chang等获得了来自于人成纤维和牛卵母细胞克隆胚胎发育而成的囊胚。
由于供体和受体的遗传来源不同, 所以异种克隆是研究细胞质与细胞核的相互关系的良好模型。对卵母细胞质在ZGA之前对不同供体细胞的重编程的过程以及对异种克隆胚胎发育中ZGA的指导作用的研究, 将对发育生物学、动物分类学和分子生物学的研究起到极大的推动作用, 使人们对蛋白质和核酸的相互关系的研究更加深入。同时, 异种克隆给挽救濒危哺乳动物提供了一个崭新的思路。
5 治疗性克隆研究进展
治疗性克隆的概念是哺乳动物体细胞克隆技术和胚胎干细胞技术相结合的产物。在器官移植和组织细胞移植治疗疾病的过程中有两大障碍:一是免疫排斥;二是供体来源。治疗性克隆具体思路是利用患者自身的体细胞做供体, 经核移植后得到克隆胚胎, 在从发育到囊胚阶段的克隆胚胎中分离出胚胎干细胞 (ntES) , 再将ntES诱导分化成所需要的细胞、组织或器官类型, 然后移植给病人。这样就解决了免疫排斥和供体来源的问题。
治疗性克隆的概念一经提出, 便有了迅速的发展。首先这一思想在小鼠上得到实现。2000年Munsie等首先获得了小鼠颗粒细胞的ntES。不久Kawase等获得了胎鼠细胞的ntES。2001年Wakayama等获得了35株小鼠的颗粒细胞和鼠尾细胞的ntES。2002年Hochedlinger等获得了来自T、B淋巴细胞的ntES。2002年Rideout等获得了一个来源于基因敲除导致免疫缺陷的小鼠的ntES系, 他将该ntES细胞的突变位点经过基因打靶修复后, 诱导分化成造血干细胞, 然后移植给该位点发生突变的小鼠, 部分改善了突变小鼠的免疫系统的功能。这是治疗性克隆能够实行的一个很好的例证。
至于人的治疗性克隆, 虽然伦理上的问题一直在讨论, 但一些有益的工作已经开展。1999年Lanza等将人的体细胞移入牛的卵母系胞, 10只克隆胚胎中, 有1只发育超过16细胞期。2003年卢光琇等用人的颗粒细胞和成纤维细胞做供体获得了克隆囊胚。我实验室将人的皮肤成纤维细胞, 移植进入兔子的去核卵母细胞, 获得了异种克隆囊胚, 并从中分离出ntES。以上工作说明分离人的ntES是可行的。至于如何高效获得人的ntES, 并在体外安全诱导分化, 以及最后应用于临床, 还有相当多的工作要做。但我们有理由相信, 这一天不会让人们等太久。
6 克隆技术在转基因中的应用研究进展
基因转移技术自1980年首次在小鼠上获得成功以来, 经过多次的改进和发展, 已经在研究基因表达与调控、生产具有人类遗传病的模式动物、生产动物生物反应器和制备人类器官替代品等方面显示出了巨大的潜力。最初的转基因技术用的是原核注射法, 该方法生产转基因动物的效率低, 而且是随机插入组合。而随着基因同源重组技术 (基因打靶) 的应用和干细胞技术的发展和应用, 将大量的转基因后的筛选工作由个体的水平转为细胞水平, 大大改善了转基因的效率和效果。该方法是将构建的与小鼠基因组功能序列部分同源的目的基因, 导入大量的ES细胞, 经过筛选获得基因打靶成功的ES, 经过体外培养扩增, 然后将基因打靶成功的ES细胞转移入正常小鼠的囊胚, 一起发育成个体, 经交配获得转基因的小鼠。但由于目前只在小鼠上建立了可以制作种系嵌合体的ES细胞系, 所以打靶成功的动物基本都是小鼠。而体细胞克隆技术的出现, 使人们能够从一个培养的细胞获得一个克隆个体, 为其他物种的转基因带来了便利。
1997年多利诞生以后, 利用转基因的细胞构建克隆动物的试验迅速展开, 首先是同年Schnieke等获得了含有人凝血因子Ⅸ的转基因克隆羊。2000年McGreath等将克隆技术和基因打靶技术结合获得了基因打靶克隆羊。旅美学者赖良学博士等2002年获得的敲掉a1, 3-半乳糖苷转移酶的克隆猪, 这种猪可以为人的器官移植提供无免疫排斥供体。另外2006年赖良学博士等又获得了富含ω-3脂肪酸的转基因克隆猪, 为生产具有保健作用的猪肉产品开辟了道路。
摘要：本文针对近年来的哺乳动物克隆技术的研究热点, 分别从体细胞克隆方法, 克隆动物的细胞核重编程, 异种克隆及治疗性克隆等方面进行了分析, 最后就克隆技术在转基因中的应用进行了总结。
AIDA-1基因的克隆与鉴定 篇8
AIDA-1为革兰氏阳性菌的IV型分泌系统, 可在革兰氏阴性菌表面形成桶装结构, 展示其N-端携带的蛋白[1~3]。IV型分泌系统在革兰氏阴性菌表面展示外源蛋白的过程中, 无需其他因子的辅助, 因此是方便高效的细菌表面展示系统。该展示系统在疫苗的研制及表位筛选等方面具有很大的优势。本研究拟通过PCR方法, 获取AIDA-1基因。
2材料与方法
2.1引物设计
根据NCBI上公布的AIDA-1的序列设计了上、 下游引物。
2.2 PCR扩增
取1mL对数生长期的大肠杆菌E393, 煮沸10 min, 12000rpm离心2min, 取上清作为PCR模板[4~6]。 PCR反应体系为50μL其中包含:5μL大肠杆菌模板, 5μL PCR反应缓冲液, 1μL dNTP, 上、下游引物各1 μL, Taq酶1μL, 灭菌超纯水36μL。将PCR反应混合液混匀后, 通过如下程序进行PCR扩增:94 ℃ 4min, 94 ℃ 1min、57 ℃ 1min、72 ℃ 2min共30个循环, 72 ℃ 10min, 4 ℃ 10min。取20μL的PCR产物, 在1% 的琼脂糖凝胶中进行电泳, 条件为80V50min。
2.3 PCR产物的回收及连接
按照凝胶回收试剂盒说明回收AIDA-1产物。分别取4μL PCR产物、1μL pMD19-T simple载体及5 μL连接缓冲液, 轻轻混匀后置于4 ℃连接过夜。
2.4转化及序列测定
取10μL连接产物, 加入到100μL新鲜的DH10B的感受态细菌中, 轻轻混匀, 冰浴30min;在42 ℃水浴锅中热休克90s;立即加入800μL的LB培养基, 并轻轻混匀, 置于37℃摇床中培养50min。取400μL培养物涂布于含有IPTG、V-gal及氨苄青霉素的LB平板中, 37 ℃培养过夜。挑取平板上的白色菌落进行测序分析。
3结果与结论
通过PCR成功扩增出目的片段, 经DNA测序表明AIDA-1基因被成功克隆至T载体中。克隆的AIDA -1基因片段, 可广泛应用于革兰氏阴性菌表面展示。 该表面展示系统可以在细菌表面展示外源蛋白, 可与流式细胞术等高通量的检测及分离方法结合, 应用于疫苗的制备、生物吸附剂的研制及抗原表位的筛选等领域。 因此, 本研究克隆的AIDA-1基因为我们后期的研究提供了材料基础, 具有广泛的应用前景和应用价值。
摘要：为了克隆AIDA-1基因并对其定序, 通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1基因, 通过酶切的方法克隆到pMD19-T simple载体中, 再转化入感受态大肠杆菌, 并通过基因测序的方法测定了AIDA-1的序列。结果表明:成功克隆并测定了AIDA-1的序列, 为蛋白展示、疫苗开发提供了重要的材料。
关键词：克隆,测序,AIDA-1基因
参考文献
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克隆动物与克隆人 篇9
目前, 尚未见有关于兔musclin基因的研究报道。本试验利用RT-PCR技术克隆了兔musclin基因, 并将序列提交Gen Bank收录 (EF547185) , 为进一步研究musclin在兔骨骼肌中的生物学功能提供了一些基础资料。
1 材料与方法
1.1 酶与试剂
试验所用到的引物、酶等试剂均购于宝生物 (大连) 有限公司, 仅RNA提取试剂-动物RNAout购于绵阳高新区天泽基因工程有限公司。
1.2 肌肉素基因的克隆
1.2.1 引物设计与合成。
依据大鼠的m u s c l i n基因序列 (NM_207612) 设计了上游引物, 牛电子克隆的osteocrin基因序列 (X M_5 8 8 3 9 0) 设计了下游引物, 分别为:F 1:5’-AGATGCTGGACTGGAGATTGGC-3’, R1:5’-GGAATCCATTAGCCTCTG GAATTTG-3’。引物在宝生物 (大连) 有限公司合成。
1.2.2 肌肉组织中总RNA的提取。
取0.1g兔的骨骼肌组织, 采用RNA OUT提取总RNA, 溶解于15µL DEPC水中备用。
1.2.3 RT-PCR扩增、反转录体系:
反应程序为:25℃10min, 42℃60min, 72℃15min, 后冰浴2min, 得到c DNA, 以此为模板进行PCR扩增目的基因。反应程序为:95℃预变性5min, 然后95℃变性30S, 50℃退火30S, 72℃延伸45S, 最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并纯化。
1.2.4 DNA序列测定。
将筛选出阳性克隆取三份, 送由北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。
1.2.5 DNA序列分析序列分析。
在NCBI网站中运行blast、Signal P3.0 Server、DNAstar及Bio XM软件分析。
2 结果与分析
2.1 兔肌肉素的RT-PCR扩增及克隆
以兔骨骼肌中的总RNA为模板, 利用肌肉素特异的上下游引物, 采用RT-PCR的方法, 扩增得到相应的基因, 1%琼脂糖凝胶电泳检测的结果表明, 得到了长度为409bp的目的片段 (图1) 。
2.2 兔Musclin的c DNA序列
克隆的兔Musclin基因包含一个完整的开放阅读框架 (open reading frame, ORF) , 全长为409bp, 编码由132个氨基酸残基组成的Musclin前蛋白, 其中酸性氨基酸为22个, 碱性氨基酸为24个, 分子量为14.72k Da, 等电点为10.099。预测的信号肽区为27~28个氨基酸.成熟的Musclin由104~105个氨基酸组成。通过预测的氨基酸序列分析, 在序列中含有“KKKR”结构 (下划线1) 和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域 (下划线2) , 结构特征 (见图2) 。
3 讨论
3.1 兔Musclin基因c DNA序列的种属差异
兔Musclin基因 (Gen Bank No.EF547185) 的ORF与小鼠、大鼠、人、猪和鸡的同源性分别为78.2%、79%、87.9%、98.2%和46.7%.
3.2 兔Musclin基因氨基酸序列的种属差异
兔Musclin的氨基酸序列与小鼠、大鼠、人、猪和鸡在基因进化方面的关系:兔和猪的同源性较高, 小鼠和大鼠的同源性较高, 而鸡的与以上五种的同源性较差。兔Musclin基因预测的氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为87.9%、74.2%、73.1%、96.2%和56.8%。
有关musclin的生物学功能尚不十分清楚。Nishizawa H, et al. (2004) [1]研究证实, 进食影响musclin的表达, 禁食48h后, 小鼠腓肠肌中musclin的m RNA表达几乎消失, 重新进食后24h, m RNA表达恢复;STZ诱导的胰岛素缺陷小鼠腓肠肌musclin的m RNA表达显著降低;在胰岛素抵抗小鼠模型musclin的m RNA表达均显著升高;离体实验中发现胰岛素和IGF-1呈浓度依赖的升高肌细胞musclin的m RNA表达, 而肾上腺素、异丙肾上腺素及forskolin则明显降低musclin的m RNA表达;在C2C12细胞, musclin明显的抑制胰岛素促进的葡萄糖的摄人及糖元的合成。因此, musclin可能是肌细胞的能量调节因子。PPARγ激动剂Troglitazone可诱导人肌细胞Musclin的表达, 但其信号传导途径尚不清楚[10]。
本试验克隆了兔musclin基因, 为下一步musclin基因的全长克隆和musclin生物学功能的进一步研究奠定了基础。
参考文献
[1]Nishizawa H, Matsuda M, Yamada Y, et al.Musclin, a novel skeletal muscle-derived secretory factor[J].J Biol Chem, 2004, 279 (19) :19391-19395.
人NLK上游启动子区的克隆与鉴定 篇10
随着研究的深入，许多转录调节因子作为NLK的底物而得到鉴定[5]。例如，c-Myb是调节造血干细胞增殖与分化的转录因子，在非洲绿猴肾细胞系CV-1细胞中，NLK磷酸化c-Myb，导致后者的降解。Foxo家族的转录因子能够对涉及细胞周期、DNA修复及应激等过程的靶基因进行转录调节[6]，而NLK则对Foxo家族的部分成员，如Foxo1、Foxo3a等进行磷酸化修饰，进而影响其功能。由于NLK参与的肿瘤信号转导途径非常广泛，其自身的调节，尤其是转录调控，愈来愈受到重视[7,8,9,10,11]。现根据生物信息学分析结果，以BEAS-2B细胞基因组DNA为模板，通过PCR获取了NLK基因翻译起始位点上游约1958bp的DNA序列，以EcoRⅠ及PstⅠ为酶切位点，将以上序列连接入PGL3basic中，后将上述构建好的质粒转染入HEK293细胞中，48 h后观察细胞无污染，检测其转录活性，为此后研究该基因在肺癌中的转录调控奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
NLK的引物购买自生工生物工程股份有限公司(上海)，TIANamp Genomic DNA Kit、凝胶回收试剂盒由第四军医大学生化教研室提供，dNTP、Taq DNA聚合酶、核酸Marker、EcoRⅠ、PstⅠ等限制性内切酶、T4DNAligase、10×T4DNAligase buffer、质粒提取试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司。大肠杆菌DH5a为本实验室制备。
1.2 方法
1.2.1 引物设计
首先从NCBI基因数据库中查找出NLK基因5’端的上游序列，以Promoter Inspector软件行启动子区预测分析，根据以上结果设计引物，上游引物加入EcoRⅠ酶切位点5’-CGGAATTC GAGGCTCCT-GAGAATCAACC-3’，下游引物引入PstⅠ酶切位点5’-AAAACTGCAG GTGACCAGAAAGTGTGCCAC-3’。
1.2.2 基因组DNA的提取
取1瓶汇合度达90%的25 cm培养瓶的BEAS-2B细胞，按天根公司所提供的细胞基因组DNA提取试剂盒说明书步骤提取其基因组DNA。
1.2.3 PCR扩增启动子
以该基因组DNA为模板，分别以Primer1-Primer6为引物行PCR，扩增LNK上下游基因片段，PCR扩增体系20μL，包括:PCR反应用Premix Taq(DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture)10μL、引物(10 mol/L)各1μL、去离子水7μL;反应条件为:95℃5 min预变性，95℃35 s变性，53℃50 s退火，72℃90 s延伸，72℃10 min延伸，4℃30 min冷却，共25个循环。分别取上述PCR扩增产物5μL小心加样到1%琼脂糖凝胶电泳槽中，设置100 V电压，电泳30 min，观察凝胶无破损，将凝胶小心置于紫外凝胶成像仪拍照;以上述PCR产物为模板，以带切点Primer1-Primer6为引物行PCR扩增，扩增体系为50μL，包括:PCR反应用Premix Taq(DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture)25μL、引物(10 mol/L)各1μL、去离子水各23μL;反应条件为:95℃5 min预变性，95℃变性35 s,53℃50 s退火，72℃90 s延伸，72℃10 min延伸，4℃30min冷却，共25个循环，取上述反应产物40μL行琼脂糖凝胶电泳，后于紫外照射仪下仔细切胶，上述产物严格按照天根公司所带凝胶回收试剂盒说明书的回收纯化。
1.2.4 NLK真核表达载体的构建及鉴定
取上述双切胶回收后的DNA片段11μL，以T4DNA ligase0.5μL为连接酶，和双切胶回收(EcoRⅠ、PstⅠ)的PGL3basic载体进行连接，上述连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5a中，按步骤于冰块中冰浴30 min,42℃水浴锅中热休克90 s，再次冰块冰浴5 min，加入200μL无抗LB,37℃摇床慢摇(30转)60 min，涂于含100μg/L Ampicillin的LB平板中，37℃孵育14 h后挑取克隆，接种于100μg/L Ampicillin的LB培养液中，37℃240转震荡培养14 h，以5 m L菌液按宝生物公司说明书提取重组质粒，以菌液为模板，Pimer1-2为引物进行PCR鉴定。
1.2.5 瞬时转染
采用Lipofectamine2000为转染试剂，参照其说明书进行转染。将生长状态良好、无污染的HEK293细胞传代培养后，于转染前12 h接种于24孔板，轻摇至混匀，轻置于37℃，5%CO2孵箱中培养，次日显微镜下观察细胞汇合度达70%，细胞状态良好，此时进行转染，每种处理设5个复孔。每一孔中加入JN-luc 0.8μg，放置混匀后共转入pRL-TK质粒15 ng作为内参。
1.2.6 荧光素酶报告基因活性检测
于转染48 h后，观察每一个转染孔无污染，以Dual-Luciferase Reporter Assay System做荧光素酶报告基因检测，轻轻倒掉培养液，无菌PBS洗一遍，吸干PBS，每孔中加入事先稀释好的1×细胞裂解液100μL，封闭后放置入冰盒中，室温摇床120 r/min振摇20 min，振摇结束后观察无贴壁细胞，收集上述细胞裂解液分别移置于1.5 m L EP管中，置于事先降温至4℃的离心机中，12 000 r/min离心10 min，取离心后的上清液，置于冰中，避光状态下以双荧光报告系统检测仪检测每一个EP管中荧光素酶的活性，首先取上述裂解液上清10μL，移置于高压灭菌后的1.5 m L EP管中，然后加入荧光素酶检测试剂LAR II50μL，以100μL移液器轻吹匀，上机检测荧光素酶活性值，再加入SGB buffer 10μL轻混匀将上述反应，将其淬灭，再次放置于检测仪上，启动海肾荧光素酶反应并测量其活性值。
2 结果
2.1 生物信息学分析
以Promoter Inspector软件做启动子分析的预测，通过检测我们发现，在距离NLK基因翻译起始位点上游约1 958 bp的位置存在可能的启动子区，再以promoter2.0软件检测，发现在距NLK基因翻译起始位点上游300 bp的位置存在可能的转录起始点，附近并未发现传统的TATA-box存在。
2.2 NLK基因的上游启动子区扩增
以事先提取的BEAS-2B基因组DNA作为模板，通过PCR的方法扩增出NLK基因上游序列，并获取了与预期大小一致的约为1 958 bp的目的片段(图1)。
(M:DL 2 000 Marker;1～7:目的片段1 958 bp)
M:DL 2 000 DNA Marker)
2.3 NLK启动子报告基因重组质粒的构建
将之前获取的1 958 bp的胶回收片段收集后，以EcoRⅠ及PstⅠ行双酶切，连接入先前备好的PGL-3basic vector中，成功构建了JN-luc荧光素酶报告基因重组体质粒，重新行PCR发现重组质粒酶切结果位置正确(图2)。上述所有的克隆均经测序结果确认序列正确。
(M:2 000 bp DNA ladder marker;1～7:重组质粒NLK-luc EcoRⅠ及PstⅠ双酶切产物)
2.4 荧光素酶报告基因实验对转录活性的检测
将事先已构建好的含有NLK-luc上游启动子区重组质粒按先前方法转染于HEK293细胞中，以PGL-3basic vector空载体作为内参，同步转染pRL-TK质粒作为内参照，48 h后显微镜下观察未见细胞污染，按前述方法放置于实验室荧光素酶报告基因检测仪器中进行其荧光素酶活性比值的检测(图3)，根据检测到的每一管中的Luciferase来反映上述启动子的活性。实验结果发现，与转染对照组PGL-3basic vector相比，重组质粒NLK-luc的活性明显高于对照组。
3 讨论
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)恶性程度极高，由于绝大多数患者确诊时已处于进展期或晚期，故其5年生存率仅为15%。多种基因功能突变或功能失调在NSCLC的发生、发展中起到重要作用。有研究指出，与肿瘤发生相关的基因，如p27、p53及β-catenin等均参与其中。但是，目前人们对肿瘤相关基因的表达变化依然知之甚少。因此，迫切需要更多的标记分子来阐明肿瘤的发生机制，以利NSCLC的诊断、治疗及预后的判断。
NLK是丝/苏氨酸激酶，它隶属于细胞外信号调节激酶/微管相关蛋白激酶(Erks/MAPKs)的家族成员。NLK能够调节多种下游转录因子的活性，这些转录因子包括Smads、AP-1、p53及NF-κB等，这表明NLK在多种肿瘤的发生过程中起关键作用。比如，若NLK在胰腺癌中表达下降，可诱导胰腺癌细胞的凋亡;NLK表达增加可诱导人结肠癌细胞生长抑制或凋亡等。近来有研究指出，NLK在人NSCLC组织中的表达较癌旁组织显著降低，当NLK的表达被下调后，NSCLC细胞的增殖显著增加，高表达NLK的NSCLC患者生存率更高，表明NLK是NSCLC的负性调节分子，但是，NLK在NSCLC中的表达的调节，尤其是其转录调节，目前仍然知之甚少。因此，研究NLK的转录调控，对进一步认识该分子在NSCLC中的表达特性及NSCLC的发生机制十分重要。
通过生物信息学分析，对NLK翻译起始位点上游约1 958 bp的序列进行分析，结果发现，其中含有可能的启动子区域，同时预测了其基因转录起始位点。从人BEAS-2B细胞基因组DNA中成功地扩增出了位于NLK基因翻译起始位点上游约1 958 bp的序列，经送生工测序检测正确，后将该产物克隆入PGL-3basic荧光素酶报告基因的载体中，后以HEK293细胞检测其转录活性。根据实验结果，我们发现，Nlk-luc具有一定的启动子活性，有关上述序列是否受到其他相关转录因子的特异性调控还不得而知。简而言之，NLK上游启动子区的成功克隆，为下一步研究其基因的表达调控奠定了非常重要的基础。
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