心脏干细胞研究（精选八篇）
心脏干细胞研究 篇1
1 间充质干细胞的生物学特点
由于MSCs缺乏特异性表面标志物,致使对于MSCs的定义尚无统一标准。国际细胞治疗协会对人的MSCs作了以下规定:①在标准培养条件下能够帖壁生长;②应用流式细胞仪分析,其表面阳性表达CD73、CD90、CD105分子,缺乏造血干细胞表面标志物,如CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b、CD79a;③体外具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力[1]。然而这些标准并不适用于其他种系,从小鼠中提取的MSCs其表面分子就与人的MSCs存在显著差异[2]。MSCs在体内、体外不同生长环境中,其表面分子亦可发生变化。如MSCs在体外培养时,HLA-DR 可阳性表达。因此MSCs存在种系差异,很难对其进行统一命名。
MSCs可从多种组织中提取,如骨髓、脂肪组织、滑膜组织、肺组织、脐带血、外周血等。尽管不同组织的MSCs生长特性存在差异,但均具有相似的表面分子和向中胚层细胞分化的潜能。MSCs可从成年小鼠的各种组织(脑、脾、肝、肾、胰腺、动脉等)中获取,表明MSCs可能存在于出生后所有脏器中。MSCs主要存在于骨髓中,为造血干细胞的生存和分化提供适宜的生存环境,被称作“造血池”。通常MSCs很难自发从骨髓中迁移到外周血,而骨髓动员技术尚不成熟,因此要用MSCs治疗疾病,首先要对其进行提取和体外培养。从骨髓中提取MSCs有3个关键步骤:①利用密度梯度离心法将非核红细胞去除;②MSCs能贴壁生长;③通过胰蛋白酶消化法将单核细胞去除。
2 间充质干细胞的多项分化潜能
干细胞的特征就是具有自我更新、克隆和多系分化潜能。MSCs在40余年前被发现时就被证明具有分化为骨和软骨的特点,而这种多系分化的能力被应用于定义MSCs。MSCs体外培养时,在其培养基内加入地塞米松、β-甘油磷酸、表达碱性磷酸酶的抗坏血酸和钙盐,MSCs可分化为成骨样细胞,这些细胞能够与抗骨原性抗体结合,并表达矿化的细胞外基质。使用地塞米松和TGF-β3 对MSCs进行干预,其可分化为软骨细胞,并分泌细胞外基质,包含Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、阴离子蛋白聚糖。
MSCs具有向心肌细胞分化的特点。对大鼠和人的骨髓MSCs使用5-氮杂胞苷(5-Aza)进行干预,其可分化为具有多核的肌管样结构细胞,此类细胞与心肌细胞类似,表达β-肌球蛋白重链、结蛋白、α-肌动蛋白,并可形成钙通道[3]。对小鼠的骨髓MSCs使用5-Aza进行诱导,其可产生自发搏动,并与周围细胞发生链接,在2～3周后可形成同步搏动。对这些细胞进行电生理检查发现,其可产生2种类型的动作电位,即窦房结样电位和心室肌样电位。逆转录PCR证实此类细胞表达心房利钠肽、脑利钠肽、α和β肌球蛋白重链、NKx2.5和 GATA4基因[4]。
将MSCs与心肌细胞进行共培养,其亦可向心肌细胞方向转化。将小鼠MSCs与大鼠心室肌细胞直接共培养,MSCs可阳性表达α-肌动蛋白,并与心室肌细胞形成缝隙链接,产生同步性收缩。使用半通透膜将MSCs与心室肌细胞隔离,进行间接共培养,MSCs不能表达α-肌动蛋白,表明MSCs转分化需要细胞与细胞的接触[5]。与这些研究结果相反,将大鼠骨髓MSCs与新生大鼠心室肌细胞进行间接共培养时,MSCs可转分化为心肌细胞。1周后这些细胞产生收缩功能,表达肌浆网钙泵、兰尼碱受体、肌钙蛋白T、α-肌动蛋白和肌球蛋白[6]。这些结果表明局部微环境和心肌细胞分泌的细胞因子对MSCs的分化起着重要的作用。
3 间充质干细胞的移植途径
MSCs的静脉移植。通过外周静脉输注MSCs是一最简便、最实用的途径,因该途径创伤小,易操作。但是应用这种方法MSCs需通过肺循环,可减少进入心肌的细胞数量。应用猪制作心肌梗死(心梗)模型,在心梗后15 min,将同种异体MSCs静脉输注体内。12周后心室造影显示MSCs移植组与未移植组在射血分数方面无差异,但MSCs移植组其心室收缩末容积较对照组减少,搏出功较对照组增加。组织学分析显示治疗组血管密度增加、内皮细胞生长因子表达[7]。在另一猪的急性心梗模型中,静脉输注MSCs 3个月后对其血流动力学和电生理检查,实验发现MSCs移植组射血分数增加,心室肥厚较对照组明显减轻。应用共聚焦显像技术发现移植的MSCs主要聚集于肺组织,心肌内仅有少量MSCs。电生理显示MSCs移植组心外膜有效不应期缩短,存在发生室速的危险[8]。
经冠脉途径移植MSCs。冠脉移植MSCs是应用球囊导管技术将细胞输送到目标冠脉,方法是将导管置于病变血管内,使用球囊短暂阻断血流,将细胞从导管输入到血管内。此方法的缺点是将冠脉短时阻断,可造成心肌缺血,而且对于慢性缺血的心肌组织,其内血管少,不能有效地将细胞带到心肌内。其优点是对于急性心肌梗死患者,在完成冠脉介入治疗后即可实施细胞移植。冠脉移植MSCs目前绝大多数用于急性心肌梗死的研究。在猪的心肌梗死模型中,5天后将氧化铁标记的MSCs移植到病变血管内。8周后延迟增强磁共振显像(MRI)显示,与对照组相比,MSCs移植组瘢痕面积减少8%,射血分数提高了15%[9]。
通过导管心肌内直接注射移植MSCs。该方法经X线透视引导或电解剖标测系统导航,将心脏导管置入左室,将MSCs直接注射到心内膜。该方法的优点在于可将干细胞直接注射到梗死心肌内或其周边,其缺点在于可造成心肌穿孔、心包填塞和恶性心律失常。在对猪的急性心肌梗死研究中发现,MSCs心内膜移植具有改善心功能、减少瘢痕面积的作用。在急性心肌梗死3天后,将同种异体MSCs移植到梗死区域及其周边,8周后梗死面积可减少50%,而对照组梗死面积无改变。病理学检查发现,MSCs移植组梗死局限于心中膜,心外膜及心内膜均可见心肌组织,且心内膜有新生组织再生。射血分数在MSCs移植组从25%提高到42%,而对照组无明显改善。压力容积曲线显示,MSCs移植组左室舒张功能和收缩期顺应性得到提高。血管密度在MSCs移植组和对照组均无明显改变,但MSCs移植组血管直径较大,更有利于提高组织灌注[10]。
直接手术行MSCs心肌内注射。该方法移植MSCs需开胸手术,创伤大,易感染。但该手段具有直观性,可选择干细胞心肌注射部位、控制注射时间及细胞数量。目前这种手段已用于大型动物的实验研究。在一项羊的急性心肌梗死的研究中,将STRO-3阳性的间质祖细胞(骨髓MSCs 的一种,具有更强的分化和增殖能力)直接注射到梗死区域,8周后所有干细胞移植组射血分数均得到提高。与安慰剂治疗组相比,小剂量MSCs移植可减少左室舒张末容积,而大剂量却无此疗效[11]。
4 间充质干细胞的临床使用
目前MSCs已用于急性心肌梗死和慢性缺血性心肌病的临床治疗。Chen等[12]对69例急性心肌梗死的患者在经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后进行分组治疗,一组进行自身MSCs冠脉注入治疗,对照组接受常规治疗。3个月 MSCs移植组左室射血分数明显高于对照组[(67±11)% vs (53±8)%,P<0.05],左室收缩末容积和舒张末容量MSCs 移植组与对照组相比明显降低,分别为[(136±31) ml vs (162±27) ml ,P<0 .05]和[(63±20 ml) vs (88±19) ml, P<0.05]。6个月后MSCs移植组心室收缩速率显著快于对照组[(4.2±2.5) cm/s vs (2.2±1.3) cm/s,P<0.05],心功能明显改善。Hare[13]等对39例急性心肌梗死患者通过静脉途径输注MSCs,其研究结果显示同种异体MSCs静脉输注是安全的,与对照组相比无不良反应发生。心电图监测示MSCs移植组室性心律失常的发生率减少,超生心动示患者射血分数平均提高了6%。
Williams[14]等将8例慢性缺血性心肌病患者随机分为MSCs治疗组和对照组,每组4例患者。MSCs治疗组通过心内膜注射的方法将干细胞移植到瘢痕区及其周边,实验发现MSCs移植组心脏缺血区域收缩能力增强,移植的 MSCs转化为心肌细胞,起到抑制心室重构的作用。这些患者1 a后行全身CT扫描无恶性肿瘤发生,动态Holter检查未发现持续性心律失常。C-CURE近期进行了一项临床实验,将45例缺血患者随机分为常规药物治疗组和MSCs治疗组,经6个月随访发现,MSCs治疗组无心律失常及不良反应发生,其收缩末容积及舒张末容积均减少,射血分数较对照组提高5%[15]。
目前有2项大规模、多中心临床试验正在进行,即TAC-HFT和POSEIDON试验,TAC-HFT是一项随机双盲安慰剂对照试验,比较骨髓MSCs和骨髓单核细胞的临床疗效。POSEIDON试验比较同种异体MSCs与自体MSCs治疗缺血性心肌病的临床差异,目前尚无试验结果报道。
5 间充质干细胞移植的安全性
尽管目前众多研究表明MSCs可修复受损心肌,但其移植的安全性备受关注。2005年,Rubio等[16]首次报道脂肪组织来源的MSCs在体外经长期扩增可产生不死性,并自发性恶变。在其随后的研究中表明,此类细胞通过上调c-myc的表达、抑制P16水平、获得端粒酶活性、InK4a/Arf位点缺失、Rb磷酸化使其获得长期生存特性。Chen等[17]将MSCs移植到受损的大鼠主动脉内,与对照组比较发现,MSCs分化为平滑肌细胞,加重了血管内狭窄程度。
总之,MSCs在动物实验及临床使用中已取得令人振奋的成绩,其有望成为不同于药物治疗、心血管介入治疗和外科手术治疗的又一全新治疗方法。
摘要：间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存在于多种组织内,是一种具有自我增殖和多项分化潜能的成体干细胞。MSCs体外易培养,且具有免疫调节特性,使其成为实现组织再生的种子细胞。动物心肌梗死模型证实MSCs体内移植,能够分化为心肌细胞和血管细胞,募集内源性心肌干细胞,分泌系列细胞因子,这些特性能够防止和逆转心室重构。Ⅰ期临床试验表明MSCs移植具有提高左室射血分数、抑制心室重构、减少瘢痕面积的作用。
红外线可激活心脏细胞和耳细胞 篇2
主要研究人员、生物工程学教授理查德•拉彼特说，现在我们用耳蜗植入方法改善耳聋患者有限的听力，“我们将来会用红外线脉冲代替电脉冲与大脑交流。”
研究发表在《生理学杂志》上。这项由美国国家卫生研究院资助的研究还提出发展用光信号代替电信号刺激心脏细胞制作心脏起搏器的可能性。他们发现，通过玻璃光纤释放产生的短波红外线可以激活心脏细胞和内耳细胞。进一步研究又发现，红外线激活心肌细胞是通过使线粒体内外的钙离子产生运动实现的，同样的过程也发现在内耳细胞中。
红外线可以让我们感觉到热，那么心脏和内耳细胞被激活是否与红外线辐射本身无关而是热的原因呢？拉彼特和同事通过实验证明，这些细胞确实是被红外线辐射所激活。
红外线照射内耳细胞和心脏细胞 与激光发射器一样，红外线也是通过二极管产生的，只是波长不同。
研究人员在实验室用红外线照射新生小鼠的心肌细胞和蟾鱼的内耳毛细胞。毛细胞能将声音、重力或运动的机械振动转变成电信号通过相连的神经细胞送入大脑。实验发现，经过红外线照射的毛细胞向给大脑发送信号的神经元释放了神经递质。拉彼特认为，毛细胞的激活是红外线辐射引起的，因为这些细胞充满了线粒体，而它们又是这一波长的主要作用对象。在另一项新生小鼠心脏细胞研究中发现，红外线会影响线粒体内外钙离子的流动。拉彼特认为这一点很重要，因为对于可产生兴奋的神经和肌肉细胞来说，钙离子就像是让这些细胞产生收缩或释放神经递质的扳机。心脏细胞研究发现，一次持續仅仅五千分之一秒的红外线脉冲既可以使线粒体快速摄取细胞内的钙离子，并随后缓慢释放回细胞里，这一循环使细胞产生了收缩。
拉彼特说，“钙离子这种行为正常是由细胞控制的而非我们。所以红外线给了我们控制这些细胞的一种工具。在内耳里，你将控制进入大脑的信号；在心脏，你将控制收缩。”
光-电耳蜗植入将成可能 拉彼特认为这项研究将会带来优于电信号的光信号耳蜗植入。现在的耳蜗是将声音转变成电信号。通常要在内耳耳蜗中放置8个电极，这8个电极只能释放8个频率的声音，而一个健康的成年人能听到的频率超过3000个。如果利用光线刺激，那能听到的就不仅仅是8个频率而是数百个或数千个频率。或许有一天光学耳蜗将使耳聋患者能再一次欣赏音乐，听到一个正常人能听到的所有细微声音。与电流不能集中到一个点上而是广泛分布不同，红外线能聚焦，这样就可以让很多波长的光（相当于不同的声音频率）集中在内耳不同的细胞上。
将内耳声音信号传递给大脑的神经细胞每秒可放电300次以上，而红外线耳蜗就能很好地完成这项工作。实验发现，利用激光脉冲照射毛细胞，可使与之相连的神经细胞每秒放电100多次。对于耳蜗植入来说，这些神经细胞将被红外线激活而非毛细胞。
拉彼特告诫说，开发光学耳蜗可能还需5~10年时间。实际上光学耳蜗所需电量和光源不多，只需像助听器上一样的小电池就可以提供足够的能量。
用光学修复运动、平衡和视觉障碍 目前大脑深部电刺激已被用来治疗运动障碍疾病，如帕金森氏病和家族遗传性振颤。
拉彼特正在进行用光线代替电刺激大脑深部有效性的研究，另外还在尝试利用光学植入治疗平衡障碍的潜力。“我们老的时候会行动缓慢，这不是因为我们的肌肉不行了，而是因为我们的平衡出了问题。”他说。“这项技术将通过恢复耳朵向大脑发送有关你的身体空间运动的信号而恢复你的平衡。”
光学刺激还能为色素性视网膜炎或其它视网膜细胞有问题的患者提供人工视觉。“你可以佩戴在镜框上装有相机的眼镜，相机上的电信号将会转变成红外线辐射脉冲进入到有问题的视网膜上。视网膜不是对光产生反应，而是对红外线辐射发生反应”产生影像，他说。
利用光学进行听觉和视觉植入，设备不必穿透大脑或其它神经组织，因为红外线能够穿透很多组织，所以这类设备“有很好的生物相容性。”拉彼特说。“你可以植入光学设备并终生留在那里。”
心脏干细胞研究 篇3
1 心脏自体干细胞研究概况
心肌细胞因为没有分化和再生能力而被定义为永久性细胞,它一旦受损则永不可逆。2002年,德国Strauer教授[2]开展了自体骨髓单核细胞移植治疗MI的临床研究,并首次成功证明此方法方法是可行的。这项试验开启了干细胞移植治疗MI新篇章,但是干细胞移植受免疫排斥、疗效不确定性及伦理因素的限制,因此寻找合适的移植细胞成为心肌再生领域新的难题。随着研究深入,发现在哺乳动物心脏中存在修复损伤心肌的自身干细胞。2015年干细胞移植专家共识表明:CSC是一组具有自我分裂分化能力的多能干细胞,能在体内分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞[3,4],它有定向分化为心脏细胞系的趋势,CSC所具备的各种优势可能使其在治疗MI方面可能最具有潜力。
2 心脏自体干细胞分类
CSC分类方式多种多样,根据细胞表面的标志和来源不同,可以将其分为8种类型:
2.1 C-Kit+心脏干细胞
2003年,Beltrami等[5]从大鼠心脏中分离出c-Kit+心脏干细胞,发现这些细胞在体外的具有集落生成和分化潜能特性,参与梗死后心肌细胞和血管重生。将其注射在心肌梗死数周后大鼠的心肌受损区域,发现注射该细胞的大鼠较未注射该细胞的大鼠的射血分数有明显提高,并运用荧光原位杂交技术在新生绿色荧光蛋白阳性心肌细胞中检测到12号染色体的克隆[6],由此心肌细胞再生在动物体内得以证实。
2.2 Sca-1+心脏干细胞
Oh等医学家[7]通过抗体靶向作用和磁性分选的方法在小鼠心脏内分离出一种Sca-1+细胞。在小鼠梗死再灌注模型中,将正常小鼠提取的Sca-1+心脏干细胞移植到梗死小鼠的心脏,跟踪2周后发现梗死区有正常小鼠提取的Sca-1+心脏干细胞存活,证明了Sca-1+心脏干细胞能够分化为心肌细胞。同时,实验发现约50%Sca-1+心脏干细胞会和宿主细胞发生融合,但不管是否和宿主细胞融合,分化都是大致相同的[8]。
2.3 The cardiosphere(CSph)
Messina等[9]在小鼠和成人心脏中提取出一种未分化的细胞,它们在传代培养中自我黏附成簇为“心肌细胞球”(the cardio-sphere,CSph)。这种细胞可以分裂、分化、转移并且诱导心肌梗死后心肌和血管再生。将其注入成熟小鼠的心肌梗死区,能够生成心肌谱系细胞,从而部分修复缺血坏死心肌,改善心室功能。
2.4 SP心脏干细胞
Martin等[10]在心肌组织中分离出SP细胞(side population of cells,SP),这些细胞同样能够在体外不断增殖和分化成心肌细胞。目前仅仅能够检测ATP结合转录蛋白———ABCG2表达,但具体分化机制尚不能明确。
2.5 Islet-1+心脏干细胞
Laugwtiz等[11]从小鼠中分离出一种心脏前体细胞,它们利用Islet-1+转录因子作为细胞标记物,发现这些前体细胞能够分化成能产生动作电位和收缩性的心肌细胞,将这类细胞称为“Islet-1+心脏干细胞[12]”。
2.6 SSEA-1+心脏干细胞
Ott等[13]在大鼠心脏中分离出SSEA-1+干细胞,它具有较弱分化为心肌细胞能力,因此其修复心肌和逆转心肌重构的作用并不明显。目前针对SSEA-1+心脏干细胞研究较少,其分化机制仍难以明确。
2.7 心肌球源性干细胞
研究人员在心脏干细胞扩增培养液中放置心肌球后,发现一种可以不断分裂增殖的细胞,称为心肌球源性干细胞(cardiosphere-derived cells,CDCs)。考虑CDCs作用机制可能是通过再生和旁分泌血管内皮生长因子来代替受损组织、改善微循环[14]。
2.8 心外膜派生细胞(Epicardium-derived cells,EPDCs)[15]
EPDCs是通过上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)方式分离出来。据相关研究发现它在成熟心脏内有分化为心肌细胞的潜能。然而,Peralta.M.[16]在研究中发现EPDCs对心肌的恢复作用同样微乎其微。
八种细胞联系:共识认为在一个具体部位中可能存在一种或一种以上的CSC,这些细胞都具有修复损伤心肌的潜能,它们相互联系,共同维持心脏稳态,但具体的协作机制仍不清楚[17]。
3 心脏自体干细胞的来源
普遍认为CSC来源于胚胎期和骨髓的心脏祖细胞。骨髓是体内各器官原始细胞的主要来源,这些细胞从骨髓微环境中分化出来后进入血液循环,定居在心脏和其他器官。Fazel教授等[18]发现c-Kit+心肌干细胞起源于骨髓,研究人员建立了一种嵌合体小鼠模型,此小鼠骨髓含有绿色荧光蛋白转基因,分离小鼠心脏干细胞后发现绝大多数c-Kit+细胞携带绿色荧光蛋白基因。因为在心脏胚胎发育过程中发现了Islet-1+细胞的存在,它可分化为心肌细胞[19],因此考虑Islet-1+细胞很可能来自胚胎期心脏祖细胞。尽管如此,CSC的具体来源仍不明确,还需要进一步研究。
4 心脏自体干细胞移植
4.1 自体心脏干细胞移植的方法
目前有两种:经皮冠状动脉输入移植法和开胸心肌层内注射移植法。经皮冠状动脉注入移植法虽然有发生血栓的危险,但操作相对简单,创伤小,移植数量相对多,移植后分布均匀,是CSC最常用的移植方法[20]。开胸心肌层内注射移植法[21,22],常用于开胸手术的患者,但创伤大,而且受很多条件约束。Lee等[22]在动物实验中,开胸直视下分别在猪心脏梗死区受损心肌区和梗死周边区的正常心肌区的心肌层内注射CSC,24h后发现梗死区的新移植CSC存活率为0,而移植到正常心肌区CSC存活率为8%-9%,从而证实CSC在正常心肌区更容易存活,移植效率更高。另外,经皮心内膜穿刺移植法虽然已经被广泛的应用于骨髓源干细胞移植,但对CSC移植的效果还有待考证。同时人们也在寻找不同的移植方法,如通过其他的介质把CSC移植到损伤的心脏区[23]。
4.2 心脏自体干细胞移植时机
CSC移植成功率受心肌微环境的影响,而心肌微环境很大程度上受MI时间长短的影响。心肌梗死早期炎性物质大量分泌,晚期瘢痕组织形成,都严重影响的移植细胞的生存及迁移。目前研究发现CSC移植最佳条件:(1)梗死区炎症反应基本减退。(2)梗死区形成微细毛细血管。(3)尚无瘢痕组织生成。同时大量研究表明在MI后7-8d,心肌分泌细胞血管内皮生长因子达到高峰,此时炎症反应既可以基本消失,瘢痕组织又未形成,为CSC移植的相对最佳时间窗口。虽然目前研究支持上述理论,但CSC移植治疗MI最佳移植时机仍不能确定,需要在以后的研究中继续探索。
4.3 心脏自体干细胞移植剂量
用于小鼠移植干细胞的数量无法推断出人类需要的剂量,剂量过低疗效较差,过高对分化效应的增加也不明显[24]。大多数临床研究表明无论细胞移植的数量多少,其到达梗死区心肌的干细胞数量有限,对于左心室射血分数的改善幅度在10%甚至更低。
4.4 心脏自体干细胞移植效果
大量的动物和前期的临床实验都证明了CSC移植确实能改善心脏功能,但根据最近新的荟萃分析发现干细胞移植对心肌梗死治疗效果仍不明确,若对移植后心脏进行评估影像技术分析:干细胞移植治疗确实可以抑制患者心肌重构,改善心脏功能(如提高左室射血分数等)和减少梗死面积;但通过心脏磁共振成像技术进行分析发现上述疗效并不明显,并不能降低心脏不良事件发生率[7]。同时有类似的研究表明:干细胞治疗组与安慰剂治疗组之间的MI患者全因死亡率相同[25]。目前CSC的移植效果仍有待考证。
5 目前存在的问题
5.1 缺乏标准的评价手段
本就“脆弱”的CSC在心肌缺血、缺氧、代谢废物堆积的损伤部位如何归巢、分化?宿主心肌与新生心肌细胞如何无缝的协调产生机电偶联?目前由于术后在体细胞示踪技术还不完善,以及术后患者心脏功能和I期临床状态的评价方法缺乏统一标准,使得CSC移植后无法及时准确的评价有效性,而且移植后细胞在移植心肌局部微环境中的变化研究也不多。目前仅仅是靠影像学手段(冠脉造影、磁共振扫描、SPECT、心脏超声)来综合评价干细胞移植的疗效。细胞的移植过程和细胞移植后局部微环境对局部心肌的病理生理变化及移植细胞的去向的影响仍然没有一致意见。
5.2 干细胞移植并发症
目前的临床研究多为非随机化小样本的研究,这些小样本临床研究显示CSC移植治疗的疗效优劣不一,移植后的并发症在各种动物及临床试验中引人关注。Vulliet等[26]在动物实验中观察到CSC移植后发生室性心律失常。随后的研究发现干细胞移植有形成钙化[27]、微血栓、肿瘤的倾向[28],但机制仍不能明确。近几年CSC移植已逐步在临床开展开来,但有关不良并发症的报道却很少。有人认为CSC移植移安全且无任何不良并发症[29]。
6 展望
CSC移植治疗MI作为一种新思维、新模式,已成为21世纪治疗MI的重要研究方向,希望最终成为攻克MI愈后差的好办法。目前,CSC移植治疗尚处于快速发展期,仍有许多问题丞待解决,如CSC是如何在心脏的环境内静止以及心肌修复完成后它是怎样被诱导凋亡的;CSC移植治疗所需要的的技术和设备要求较高,操作复杂以及可能引起的微梗死、心律失常等严重并发症。
心脏干细胞研究 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
经病理学或细胞学确诊的晚期癌症152例，男97例，女55例。年龄21～83岁，中位年龄60岁。肺癌63例，肝癌14例，结肠癌12例，直肠癌8例，乳腺癌9例，胰腺癌5例，卵巢癌5例，鼻咽癌5例，宫颈癌4例，胃癌4例，食管癌3例，肾癌3例，淋巴瘤3例，喉癌2例，恶性黑色素瘤2例，胸腺癌2例，胆囊癌2例，输卵管癌1例，腹膜间皮瘤1例，脑胶质瘤1例，上颌窦癌1例，外耳道癌1例，膀胱癌1例。
1.2 DC-CIK细胞培养与回输方法
抽取患者外周静脉血100 ml。随后，经淋巴细胞分离液进一步分离单个核细胞，用生理盐水洗涤3次，再将细胞分别进行DC及CIK细胞的培养。DC细胞在第0天用含IL-4、TNF等细胞因子的培养基进行培养，隔天需半量换液，培养至第9天细胞成熟，再混入CIK细胞培养中，共同培养。CIK细胞第0天加入含IFN-γ、抗CD3单抗等无血清生长培养基。24 h后加入含人重组IL-1、人重组IL-2等无血清生长培养基。每2～3 d更换培养基一次，补加IL-2。培养至第9天时加入DC细胞共同培养。第11天时进行细菌、霉菌等微生物培养检测。第14天时收集DC/CIK细胞，将收集培养的细胞用无菌生理盐水洗涤3次，细胞分成6袋，每袋分别加入5%人血白蛋白配成150 ml含细胞的悬液进行静脉回输。每天回输1次，每次回输细胞数量（1.5～2）×109，连输6次为一个疗程，细胞总数（9～12）×109。每个患者完成2个疗程。
1.3 心电图检查
第一疗程DC/CIK细胞回输之前，常规心电图检查。第二疗程DC/CIK细胞回输之后，再做心电图检查。依据前后两次心电图检查结果，进行对比分析和评估。
2 结果
152例患者在接受DC/CIK细胞治疗前，心电图正常。在完成2个疗程的DC/CIK细胞治疗后，有15例出现心电图异常，发生率为9.8%，其中窦性心动过缓3例，窦性心动过速6例，心肌缺血6例。通过采取积极的护理干预措施后，心脏毒副反应消失，心电图逐步恢复正常，也没有治疗相关性死亡发生。
3 讨论
3.1 DC/CIK细胞治疗对心脏毒性的原因分析
3.1.1 癌症导致的症状
由心脏窦房结发出的兴奋按一定途径和时程依次传向心房和心室，引起整个心脏兴奋，并出现生物电活动，通过心脏周围的导电组织和体液传到体表。如将测量电极置于体表的一定部位，即可引导出心脏兴奋过程中所发生的电变化，这种电变化经一定处理后并记录到特殊的记录纸上，便成为心电图。它可反映整个心脏兴奋的产生、传到和兴奋恢复过程中的生物电变化。如果心脏传导组织异常；钾、钠、钙等离子通道功能异常，心肌电信号传导紊乱，均可导致心律失常的发生[2,3,4]。本组病例均为晚期癌症患者，年龄大多在60岁以上，一般状况相对较差，部分患者伴有疲劳、消瘦、贫血等症，可能导致心电图上出现心率或心肌缺血的改变。
3.1.2 白细胞介素-2毒副作用
DC/CIK细胞在培养时，需加入一定量的白细胞介素-2。在向患者大量输注DC/CIK细胞的同时，白细胞介素-2也随之进入人体。有研究认为，在较大剂量使用时，白细胞介素-2毒副作用较大，例如有肾功能损害、流感样症状、胃肠道症状、呼吸道症状等。心脏毒性反应表现为心律失常、心肌缺血、心肌梗死和心功能衰竭等。血液动力学检查发现，患者在使用白细胞介素-2的过程中，周围和全身血管阻力减少，动脉血压下降，每搏指数和每搏左室容量均减少，心率和心脏指数增加。停止治疗后，这些血液动力学改变在24 h内恢复正常[5,6,7]。
3.1.3 激活的DC细胞所致
心肌炎最常见的症状之一就是心律失常。自体免疫反应在心肌炎的发生发展中起到重要作用。实验研究表明，DC细胞被激活后，可直接引起实验动物产生严重的心肌炎[8,9]。癌症患者在短期内大量输注DC细胞后，激活的DC细胞有可能对人体心肌产生作用，导致心律失常的发生。
3.2 护理干预措施
3.2.1 心理护理
癌症被认为是一种心身疾病，其发生、发展与心理因素有密切的关系[10]。几乎所有的晚期肿瘤患者都会出现不同程度的焦虑、抑郁、厌食、恶心、甚至精神错乱等心理应急反应，严重影响患者心理状态，产生消极的心理反应，通过神经内分泌反射影响人体各个系统的机能状态，导致内环境紊乱，免疫功能下降，如不及时调整，将严重影响肿瘤的治疗配合程度和治疗效果[11]。因此，肿瘤患者心理护理极为重要，需贯穿在整个治疗过程中。DC/CIK细胞免疫治疗不同于化疗和放疗，是一种新型肿瘤治疗手段，患者及家属对其不甚了解，缺乏安全感。所以，在治疗前应详细向患者及家属介绍DC/CIK细胞免疫治疗的原理、临床治疗经过、不良反应、治疗效果、以及与化疗、放疗相比较的优缺点。也可以采用实例向患者讲解该治疗方法的疗效，尽可能的使患者保持愉悦的心情，积极配合治疗。
3.2.2 饮食护理
以高热量、高蛋白、高维生素、低脂肪饮食为宜，鼓励患者多进食富含维生素和蛋白质的食物，如鲜鱼、肉、豆制品、新鲜蔬菜及水果等。要经常更换食物的花色品种，用食物的色香味诱导患者进食，以增强体质，纠正贫血等癌症相关症状，帮助心电图恢复正常。此外，也要戒烟、戒酒、不吃辣椒、不喝咖啡等食品饮料，以免过度兴奋，诱发心律失常。
3.2.3 避免便秘
排便用劲时，可能加重心脏负担，诱发心律失常。因此，保持大便通畅，预防便秘尤为重要。如便秘发生时，可予开塞露20～40 ml由肛门挤入直肠，药液在直肠保留5 min后再缓慢排便。
3.2.4 吸氧
发生心律失常时，可嘱咐患者卧床休息，减少心机耗氧，同时按照医嘱予以氧气吸入，氧流量一般为2～5 L/min。
3.2.5 心电监护
有效的心电监护能及时提供心脏信息，配合心电图检查对心律失常和心肌缺血的诊断尤为重要。因此，护士应该熟练掌握正常心电图的波形组成和各波形的临床意义。监护护士还应认真做好24 h动态观察记录，尤其是夜间，患者入睡后迷走神经张力增高、心肌兴奋性降低、心率相对减慢，发生不良事件的几率增加。
3.2.6 观察病情及处理
通过心电监护及心电图检查，发现心律失常和心肌缺血后，应及早处理。在美国，每年约有39万人死于恶性心律失常[12]，因此避免恶性心律失常的发生极为重要。心动过缓可以引起低血压、房室传导阻滞、最后可引起心脏停跳，为此，监护护士在发现患者有心动过缓时，应立即报告医师，并遵医嘱给予阿托品提高心率，使心率维持在正常水平。窦性心动过速一般仅需密切观察病情，询问患者有无不适，多数患者不需特殊处理，待DC/CIK细胞治疗结束后，基本能恢复正常心率。如心电图显示心肌缺血的改变，应给予护心、扩血管药物处理，避免缺血加重，导致心机梗死。本组有3例发生心动过缓，6例窦性心动过速，6例心肌缺血，因及时观察、尽早护理干预，避免了恶性心律失常的发生。
心脏干细胞研究 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
出生1～3 d的SD大鼠,由河北医科大学动物中心提供。醛固酮、螺内酯、胰蛋白酶、牛血清白蛋白(Sigma公司);DMEM/F12培养基和胎牛血清(Gibco公司);TGF-β1多克隆抗体和纤维连接蛋白单克隆抗体(Santa Cruz公司)。PCR试剂盒(Ta Ka Ra公司);TGF-β1EIA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)。
1.2 心脏成纤维细胞的培养和鉴定[2]
在无菌条件下开胸剪取SD大鼠心室,用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法获得心脏成纤维细胞。实验采用已传2～4代的心脏成纤维细胞,SABC法免疫组织化学染色,纤维连接蛋白染色阳性鉴定为所需的心脏成纤维细胞。
1.3 实验分组
待细胞生长至亚融合状态时,以1%牛血清白蛋白培养液培养预适应24 h后,根据实验分组要求换用加入各种处理因素的1%牛血清白蛋白培养液继续培养。实验分为两部分,第1部分分组为醛固酮(10-7 mol/L)0、1、2、4和8 h组;第2部分分组为正常对照组,醛固酮组(10-9、10-8和10-7 mol/L),醛固酮(10-7 mol/L)+螺内酯组(10-6 mol/L)和螺内酯组(10-6mol/L)。
1.4 细胞培养液中TGF-β1的水平
应用ELISA法,按照试剂盒说明书操作。
1.5 心脏成纤维细胞中TGF-β1的含量
裂解液裂解细胞后取上清,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,每孔上样50μg总蛋白。利用水浴式电印迹法将蛋白转至PVDF膜上,室温下封闭2 h后,加入1∶500的一抗稀释液,4℃过夜,用TPBS液洗3遍;再加入1∶6 500的HRP标记二抗稀释液,室温振摇1 h后用TPBS液洗3遍;DAB显色后用凝胶成像分析系统进行分析,以对照组电泳条带作为参照,结果以积分吸光度的比值表示。
1.6 心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达
TGF-β1引物(上游5'-AATACGTCAGACATT CGGGAAGCA-3',下游5'-GTCAATGTACAGCTCCG TACACA-3')扩增片段498 bp,GAPDH引物(上游5'-AATGCATCCTGCACCAA-3',下游5'-GTAGC-CATATTCATTGTCATA-3')扩增片段515 bp。PCR反应条件:TGF-β1:94℃变性45 s,48℃退火45 s,72℃延伸90 s;GAPDH:94℃变性45 s,48℃退火45s,72℃延伸90 s,32个循环。PCR产物于1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳,用BIO-PROFIF凝胶图像分析系统进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。
1.7 统计学处理
数据以均数±标准差表示,应用SPSS13.0软件进行数据分析处理,多个样本均数间的比较用方差分析,多个样本均数间的两两比较用LSD检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平的变化
与正常对照组相比,醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)作用心脏成纤维细胞48 h,培养液中TGF-β1的水平明显增加,且呈剂量依赖性(P>0.05、P<0.01和P<0.01);以螺内酯(10-6 mol/L)预处理2 h后,再加入醛固酮(10-7 mol/L)作用48 h后,培养液中TGF-β1的水平与对照组相比无明显差异;同时,单独使用螺内酯(10-6 mol/L)并不改变培养液中TGF-β1的水平,见附表。
注:1)与对照组比较,P<0.01;2)与醛固酮(10-7 mol/L)组比较,P<0.01
2.2 心脏成纤维细胞中TGF-β1含量的变化
与正常对照组相比,醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)作用24 h,心脏成纤维细胞中TGF-β1的含量明显增加,且呈剂量依赖性(P>0.05、P<0.01和P<0.01);以螺内酯(10-6 mol/L)预处理2 h后,再加入醛固酮(10-7 mol/L)作用24 h后,心脏成纤维细胞中TGF-β1表达与对照组相比无明显差异;同时,单独使用螺内酯(10-6 mol/L)并不改变TGF-β1的表达,见附表、图1。
1:对照组;2:醛固酮(10-9 mol/L)组;3:醛固酮(10-8 mol/L)组;4:醛固酮(10-7 mol/L)组;5:醛固酮+螺内酯组;6:螺内酯组
2.3 心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的时间效应
在1%牛血清白蛋白心脏成纤维细胞培养液中加入醛固酮(10-7 mol/L)后0、1、2、4和8 h,分别测定TGF-β1m RNA表达水平。结果显示:在4 h时TGF-β1m RNA表达明显增加(P<0.01),8 h达高峰(P<0.01),见图2。
与对照组(0 h)比较,P<0.01
2.4 心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的变化
与正常对照组相比,醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)作用8 h,TGF-β1m RNA表达明显增加,且呈剂量依赖性(P<0.01);以螺内酯(10-6 mol/L)预处理2 h后,再加入醛固酮(10-7 mol/L)作用8 h后,TGF-β1m RNA表达与醛固酮(10-7 mol/L)组相比显著降低,而与对照组相比无明显差异;同时,单独使用螺内酯(10-6 mol/L)并不改变TGF-β1m RNA的表达,见附表、图3。
1:对照组;2:醛固酮(10-9 mol/L)组;3:醛固酮(10-8 mol/L)组;4:醛固酮(10-7 mol/L)组;5:醛固酮+螺内酯组;6:螺内酯组
3 讨论
慢性心力衰竭患者醛固酮水平升高,并且高水平的醛固酮是其死亡率增加的独立预测因子,表明醛固酮在心力衰竭的损伤中起重要作用[3,4]。心脏成纤维细胞占心脏容积的25%和心脏细胞总数的70%,越来越多的证据显示心脏成纤维细胞是醛固酮的主要效应细胞。一些在体研究发现醛固酮促胶原合成的作用不是即刻的,而需要数周的时间,提示醛固酮促心肌纤维化作用可能是间接的,ROM-BOUTS等通过心脏成纤维细胞体外培养实验,进一步证实了这一假设[5]。研究显示醛固酮拮抗剂螺内酯可抑制心脏成纤维细胞增殖[6],改善心肌梗死后心室重建大鼠的左室收缩和舒张功能,并伴有心肌TGF-β1基因表达水平显著下调[7]。醛固酮拮抗剂依普利酮可减轻扩张型心肌病大鼠,血管紧张素Ⅱ诱导的高血压小鼠和鸟苷酰环化酶-A基因编码缺陷小鼠心肌纤维化,减少心肌胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的合成,这一效应与其降低心肌中高表达的TGF-β1基因和蛋白质水平密切相关[8,9,10]。同时,CHUN等人[11]的实验表明TGF-β1中和抗体能够抑制醛固酮的促心肌纤维化作用。这些研究提示醛固酮诱导的心肌纤维化可能与TGF-β1过度表达密切相关。本实验发现醛固酮能剂量依赖性地诱导心脏成纤维细胞TGF-β1m RNA表达以及TGF-β1的合成和分泌。鉴于TGF-β1过度表达在促心肌纤维化中的重要作用,本实验进一步支持TGF-β1是醛固酮促心肌纤维化作用的潜在介导因子。本实验还发现醛固酮的上述作用可被MR的拮抗剂螺内酯所阻断,而单纯给予螺内酯对心脏成纤维细胞无明显影响,表明醛固酮的这种作用可能是通过其特异性受体盐皮质激素受体介导的。
盐皮质激素受体拮抗剂螺内酯可减少慢性心力衰竭患者心肌细胞外基质含量,降低主要心脏事件的发生率[12,13]。本实验结果从细胞、m RNA和蛋白水平观察到醛固酮通过盐皮质激素受体调控心脏成纤维细胞TGF-β1m RNA的表达,以及TGF-β1的合成和分泌,并呈剂量依赖性增加,为临床应用盐皮质激素受体拮抗剂治疗慢性心力衰竭提供了一定的实验依据。
摘要：目的探讨醛固酮对心脏成纤维细胞转化生长因子β(1TGF-β1)的影响。方法采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取新生大鼠心脏成纤维细胞,应用ELISA、Western-Blot、RT-PCR的方法分别测定不同条件下心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平和心脏成纤维细胞中的TGF-β1含量,以及TGF-β1mRNA的表达。结果醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)可剂量依赖性地促进心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达以及TGF-β1的合成和分泌,同时醛固酮(10-7mol/L)以时间依赖的方式促进TGF-β1mRNA的表达,在作用4h后表达开始增加,8h达高峰。提前给予螺内酯(10-6mol/L)能抑制醛固酮(10-7mol/L)的上述作用。结论醛固酮能促使心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达以及TGF-β1的合成和分泌,且此作用可能是通过盐皮质激素受体介导的。
心脏干细胞研究 篇6
1 临床资料
病例1:患者3岁, 体质量15 kg。即往无手术史、麻醉史、药物过敏史。术前诊断VSD, 在静吸复合麻醉体外循环下行心内直视修补术。机器预充液组成为全血800 m L, 血定安500 m L, 乳酸钠林格氏液180 m L, 15%氯化钾6 m L, 25%硫酸镁4 m L, 磷酸肌酸5 g, 头孢克肟1.0 g。血液稀释后Hb 76 g/L, 稀释量26 m L/kg, 晶胶比0.60ı1。常规CPB准备, 动静脉、主动脉灌注及左、右心吸引核对正确无误, 开始并行降温, 鼻咽温监测提示已降至30℃, 依次阻断升主动脉、上、下腔静脉, 机灌心肌停跳液 (St Thomas液) 200 m L。30 min重复机灌半钾停跳液, 剂量为200 m L。CPB过程中动、静脉平衡良好, 氧合效果满意。体外循环期间测得最低鼻温24.3℃, 最低肛温32.1℃。转前、转中、转后钾、钠、氯、钙及血气分析值在正常范围, 手术进展顺利。当鼻咽温及肛温复温至30℃时出现肉眼血红蛋白尿, 急查血钾为6.59~6.88 mmol/L, 立即给予地塞米松5 mg, 碳酸氢钠50 m L, 速尿20 mg。开放升主动脉后心脏自动复跳。术后测得鼻温36.4℃, 肛温36.1℃, 已经达到复苏的温度标准。CPB辅助15分停机, CPB总体时间51分25秒, 手术结束送心外ICU。患者回ICU 4 h后血红蛋白尿未见缓解, 反而有加重趋势。经与心脏外科、检验科、中心血站联系复检确认血型无误, 方考虑到患者是PCH。采取立即保温, 应用患者其父亲血液中提取的新鲜洗涤红细胞200 m L加温输注, 给予甲基强的松龙30 mg/kg, 5%碳酸氢钠6 m L/kg, 速尿10 mg, 26 h后血红蛋白尿完全消失。经实验室及中心血站共同检测DONATH-LANDSTEINER实验为阳性。
病例2:患者9岁, 体质量25 kg。即往无手术史、麻醉史、药物过敏史。术前诊断ASD+PH, 拟在静吸复合麻醉低温体外循环下行直视修补术。术前准备完善, 将行择期手术。术前临床计划配血后, 实验室检查提示患者有冷凝集现象。经与实验室、输血科、中心血站共同确认, 患者检测DONATH-LANDSTEINER实验为阳性。全院会诊意见暂停手术, 可选择介入治疗方法。后经介入伞堵治疗痊愈出院。
2 讨论
自身免疫性溶血性贫血又称阵发性寒冷性血红蛋白尿症 (PAROXYSMAL COLD HEMOGLOBINURIA) 是一种罕见的变态反应症。近年来, 国外有关此类的报道日渐增多。在国外, 不规则抗体检出率为0.29%, 其中冷自身抗体、非特异性不规则抗体、抗-Mur、抗-M、抗-Leb、抗-Lea、抗-P等均有详实的报道。如果患者的体内含有Ig M型冷反应型抗体 (冷溶血素) , 在医疗特殊需求的环境下, 温度如果接近于20℃左右, 冷溶血素便牢固地结合于自身红细胞表面。当温度逐渐恢复到约37℃时, 体内全补体成分迅速被激活而发生急性血管内溶血, 导致进行性血红蛋白尿出现甚至加重。从1986年至今, 我们所接触的2千余例先天性及后天获得性心脏病患者, PCH仅2次遭遇。由于PCH是一种特殊罕见的变态反应症, 如果中心血站、实验室、输血科在输血配型时不能检出, 临床科室在应用前很难发现。因为急性血管内溶血需要特定的环境条件, 在医疗区域内, 只有体外循环心脏直视手术中, 患者的体温才能达到发生急性血管内溶血的必须条件。在手术中、手术后患者出现明显肉眼血红蛋白尿, 血钾升高及进行性贫血, 除外其他因素, 才有可能考虑到是PCH的发生。国内外个别报道, PCH严重者术后可出现肾功能不全, 黄疸, 肝大, 脾大等。在心脏直视手术期间, 一旦发生持续性血红蛋白尿并伴有进行性贫血, 并且除外其他因素, 应高度警惕PCH的发生, 应及早采取措施。目前国内外采取的主要处理方法是:①充分把住输血前的检验关、配型关;②尽可能避免PCH发病条件, 在不影响手术操作要求的前提下, 努力保持恒温状态, 勿使手术中温差过大;③注意保持患者的有效循环量, 避免血流动力学的剧烈变化。选择应用血液制品, 除非特殊需要一般不给血浆, 最好从直系亲属的血液中提取洗涤红细胞或红细胞悬液为首选;④溶血后的红细胞碎片可能会直接造成肾损害, 应及时应用肾上腺皮质激素, 硷化尿液, 合理给予利尿剂以保护肾功能;⑤注意维持水电解质及酸碱平衡, 应特别警惕高钾血症的发生。一旦发生高钾血症, 务必及时处理, 因为手术后的心脏有个修复期, 难以承受额外的打击;⑥目前有在PCH治疗中应用抗免疫药的应用如硫唑嘌呤、环磷酰胺等, 也有试用抑肽酶的相关报道, 无论哪种方法都是寻求抗免疫方面有所突破, 可根据实际条件与能力选择;⑦已经发生PCH的患者除采取上述必要措施外, 还应及时检查Hb、RBC、FDP、血涂片红细胞形态学检查、网织RBC计数、尿胆原测定等, 以了解PCH其进程, 有效指导临床的针对性治疗。
心脏干细胞研究 篇7
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
恒温振荡器(THZ-C)购于中国江苏太仓试验设备厂;PCR仪购于ABI公司;GDS-8000凝胶成像分析系统购于美国UVP公司;DU70紫外分光光度计购于美国Beckman公司。胎牛血清购于中国北京索来宝公司;D-葡萄糖(分析纯)购于重庆北碚化学试剂厂,按浓度分为正常血糖浓度(5.5 mmol/L,NG)和高糖浓度(30 mmol/L,HG);Ros购于美国Santa公司;兔抗大鼠Ⅰ型前胶原抗体购于美国Santa公司;Trizol试剂购于SBS公司。
1.2 细胞提取及培养
日龄2~3 d Sprague-Dawley大鼠,雌雄不限,清洁级,由河北医科大学实验动物中心提供。剪取乳鼠心脏前1/3的心室部分,利用消化酶法及差速贴壁法去除未贴壁的心肌细胞,提取培养乳鼠心脏成纤维细胞,传代培养,实验用2~3代传代细胞。
1.3 分组及处理
将D-葡萄糖溶解、过滤除菌后加入6孔板中,每孔2 mL,配制分组,30 mmol/L高糖孵育6 h后,应用0.1%胎牛血清DMEM培养基继续培养24 h,将细胞进行分组,其中3组分别加入终浓度为20、30、50μmol/L的Ros干预12 h以检验不同浓度Ros对Ⅰ型前胶原表达的影响;另有3组均加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36 h以检验不同干预时间对Ⅰ型前胶原表达的影响。另设HG模型组(仅HG干预)及空白对照组(0.1%胎牛血清DMEM培养基+NG干预)。即8个分组分别为:(1)空白对照组(0.1%胎牛血清DMEM培养基+NG);(2)HG模型组;(3)HG+10μmol/L Ros组;(4)HG+30μmol/L Ros组;(5)HG+50μmol/L Ros组;(6)HG+30μmol/L Ros 18 h组;(7)HG+30μmol/L Ros 24 h组;(8)HG+30μmol/L Ros 36 h组。
1.4 Real-timePCR检测Ⅰ型前胶原mRNA的表达
检测物(Ⅰ型前胶原)的引物序列全部由美国GeneCopoeia公司提供。Ⅰ型前胶原引物序列:上游5′-GGACCTGTG ATGTGCAAAGT-3′,下游5′-CACGGGTAATTCTGTTCT TC-3′,扩增片段418 bp;以β-actin作为内参照,引物序列:上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′,下游5′-ATCGTACTCCTGCTYGCTGA-3′,扩增片段232 bp。采用TRIZOL法遵照SBS公司相关说明书进行心脏成纤维细胞总RNA的提取:取适当稀释的RNA样品,用DU70紫外分光光度计测定所抽提RNA的浓度和纯度,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。A260/A280=1.8~2.0方可使用,总RNA浓度=A260×稀释倍数×0.04(μg/μL),用前调整为1μg/μL。按M-MLV Reverse transcriptase操作说明合成cDNA第一链;取反转录产物进行Real-time PCR反应,反转录产物50倍稀释后按以下体系进行Real-time PCR反应:2×ALL-in-One qPCR Mix(10μL);ALL-in-One qPCR primer 2μL;1st strand cDNA(5倍稀释液)(2μL);50×Rox Reference Dye(0.4μL);ddH2O(5.6μL)Final Volume(20μL),反应条件:95℃10 s,60℃20 s,72℃15 s,反应40个循环,反应结束后,立即进行融解曲线分析。GDS-8000凝胶成像分析系统测定电泳条带的光密度值,根据Comparative Delta-deltaC法ΔΔCt=干预组(Ctm RNA-CtGAPDH)-对照组(Ctm RNA-CtGAPDH),利用2-ΔΔCt计算干预组mRNA光密度与对照组光密度的比值×100%。
1.5 Western blot分析检测Ⅰ型前胶原蛋白的表达
胰酶消化收集心脏成纤维细胞于离心管中,离心后加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂RIPA,离心后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量,分装上清用于加样。配制9%的分离胶及4%的浓缩胶,将总蛋白加至上样孔中,进行SDS-PAGE恒压电泳,染色转膜后,杂交、显色,用封闭液将一抗稀释(抗Ⅰ型前胶原1∶500)。包被一抗、二抗,膜用TBST液洗3次,每次5 min,采用ECL发光试剂盒显色。膜洗涤完毕置于保鲜膜上,滴加底物工作液后用保鲜膜包好,放入暗室。在暗室中将X光片小心地压到保鲜膜上,依顺序进行曝光、显影、定影。采用凝胶图像分析系统对吸光度进行测量。
1.6 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析,正态分布计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用Student-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度罗格列酮对高糖诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA及蛋白表达的影响
基础生理状态下,体外培养的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白呈低表达,HG模型组Ⅰ型前胶原mR-NA[(109±11)%]和蛋白(1.57±0.02)的表达与空白对照组[(40±3)%、(0.82±0.04)]比较显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。浓度依赖性实验结果显示,HG+10μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±9)%]和蛋白(1.35±0.03)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(62±5)%]和蛋白(1.08±0.04)的表达低于HG+10μmol/L Ros组[(91±9)%、(1.35±0.03)];HG+50μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(51±4)%]和蛋白(0.93±0.02)的表达低于HG+30μmol/L Ros组[(62±5)%、(1.08±0.04)],差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示,Ros呈明显的浓度依赖性的下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达。见表1、2及图1。
注:与空白对照组比较,(1)P<0.05;HG:高糖
注:与HG模型组比较,(2)P<0.05;与HG+10μmol/L Ros组比较,(3)P<0.05;与HG+30μmol/L Ros组比较,(4)P<0.05;HG:高糖;Ros:罗格列酮
1:空白对照组;2:HG模型组;3:HG+10μmol/L Ros组;4:HG+30μmol/L Ros组;5:HG+50μmol/L Ros组;HG:高糖;Ros:罗格列酮
2.2 罗格列酮(30μmol/L)不同干预时间对Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白表达的影响
30 mmol/L的HG孵育心肌成纤维细胞6 h后,以含0.1%胎牛血清DMEM培养基继续培养24 h,再加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36 h,结果显示,HG+30μmol/L Ros18 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±10)%]和蛋白(1.31±0.07)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros 24 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(67±6)%]和蛋白(1.01±0.04)的表达低于HG+30μmol/L Ros 18 h组[(91±10)%、(1.31±0.07)];HG+30μmol/L Ros 36 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(42±4)%]和蛋白(0.87±0.01)的表达低于HG+30μmol/L Ros 24 h组[(67±6)%、(1.01±0.04)],差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示,相同浓度Ros呈明显的时间依赖性下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达。见表3及图2。
注:与HG模型组比较,(1)P<0.05;与HG+30μmol/L Ros 18 h组比较,(2)P<0.05;与HG+30μmol/L Ros 24 h组比较,(3)P<0.05;HG:高糖;Ros:罗格列酮
1:HG模型组;2:HG+30μmol/L Ros 18 h组;3:HG+30μmol/L Ros 24h组;4:HG+30μmol/L Ros 36 h组;HG:高糖;Ros:罗格列酮
3 讨论
糖尿病合并心肌病患者的心肌损害包括心肌细胞及心肌间质细胞两个方面。已有的研究主要集中于心肌细胞的损伤,近年来,心肌间质的纤维化及其在糖尿病心肌病的发生、发展中的作用越来越多地受到研究者的重视。糖尿病患者的心肌纤维化进展到一定程度后会导致心室的收缩、舒张功能失调,加速心功能恶化,当心功能出现失代偿时便会出现心力衰竭症状。因此预防和减轻心肌间质胶原沉积及纤维化已成为糖尿病心肌病治疗的重要目标和手段。既往的研究显示,高血糖可导致心肌间质胶原蛋白沉积,从而导致纤维化。高血糖导致胶原大量沉积的机制为高浓度的葡萄糖一方面可促使胶原蛋白的糖基化,另一方面可降低胶原蛋白的降解,引起胶原沉积与心内膜下,导致心肌的纤维化及重构;另外,高血糖会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可上调致纤维化的细胞因子的表达[5],激活PKC信号系统的关键信号蛋白———成纤维细胞生长因子(FGF)的表达[6],而且高血糖可使转化生长因子-β(TGF-β)异常高表达,后者与其受体Ⅱ结合后可以诱导组织型基质金属蛋白酶抑制剂合成,抑制细胞外基质(ECM)的降解[7],加重心肌纤维化程度。
PPAR-γ作为一个重要的细胞分化的转录因子,在血管与心肌组织均有表达,它能调节糖和脂质代谢,发挥抗炎、抗氧化、抗增殖作用。Guo等[8]报道,上调PPAR-γ的表达后可以明显抑制肝星状细胞胶原蛋白的分泌作用,TZDs药物的典型代表——Ros主要通过活化细胞内的PPAR-γ、增加对胰岛素的敏感性来减轻肝脏、脂肪、肌肉等器官或组织对胰岛素的抵抗。研究报道,Ros通过降低血管紧张肽受体-1的表达[9,10],可部分阻断AngⅡ的促纤维化作用,从而减轻了胶原的聚集。还有研究显示,BDL大鼠用感染表达PPAR-γ的腺病毒载体后,ColⅠmRNA表达明显降低[13,14,15]。李洁等[16]研究发现,Ros可减轻胶原蛋白沉积,且这种作用不依赖于血糖的变化,其机制可能与阻断或下调NF-κB信号转导系统或肾素-血管紧张素-醛固酮系统有关。本研究的浓度依赖性实验结果显示,HG+10μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±9)%]和蛋白(1.35±0.03)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(62±5)%]和蛋白(1.08±0.04)的表达低于HG+10μmol/L Ros组;HG+50μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(51±4)%]和蛋白(0.93±0.02)的表达低于HG+30μmol/L Ros组,差异均有统计学意义(P<0.05)。本研究时间依赖结果显示,HG+30μmol/L Ros 18h组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±10)%]和蛋白(1.31±0.07)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros 24 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(67±6)%]和蛋白(1.01±0.04)的表达低于HG+30μmol/L Ros 18 h组;HG+30μmol/L Ros 36 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(42±4)%]和蛋白(0.87±0.01)的表达低于HG+30μmol/L Ros 24 h组,差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示,不同浓度或相同浓度Ros可明显下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达,提示Ros在抑制高糖刺激下心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达、抑制心肌纤维化的过程中发挥了作用。
综上所述,Ros对高糖刺激下新生大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达的调节在浓度及时间上均呈现依赖关系,可能为临床糖尿病心肌病的有效预防和治疗提供新的思路与切入点。
摘要：目的 观察罗格列酮(Ros)对高糖刺激下新生大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达的调节。方法 30 mmol/L高糖(HG)孵育新生大鼠心脏成纤维细胞,其中3组分别加入终浓度为20、30、50μmol/L的Ros干预12 h以检验不同浓度Ros对Ⅰ型前胶原表达的影响;另有3组均加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36 h以检验不同干预时间对Ⅰ型前胶原表达的影响;另设HG模型组(仅HG干预)及空白对照组[0.1%胎牛血清DMEM培养基+常规血糖浓度(NG)干预]各1组。应用Real-time PCR法测定心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达;Western blot检测Ⅰ型前胶原蛋白质的表达。结果 HG模型组Ⅰ型前胶原mRNA[(109±11)%]和蛋白(1.57±0.02)的表达与空白对照组[(40±3)%、(0.82±0.04)]比较显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。浓度依赖性实验结果显示,HG+10μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±9)%]和蛋白(1.35±0.03)的表达低于HG模型组;HG+30μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(62±5)%]和蛋白(1.08±0.04)的表达低于HG+10μmol/L Ros组;HG+50μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(51±4)%]和蛋白(0.93±0.02)的表达低于HG+30μmol/L Ros组,差异均有统计学意义(P<0.05)。时间依赖结果显示,HG+30μmol/L Ros 18 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±10)%]和蛋白(1.31±0.07)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros 24 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(67±6)%]和蛋白(1.01±0.04)的表达低于HG+30μmol/L Ros 18 h组;HG+30μmol/L Ros 36 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(42±4)%]和蛋白(0.87±0.01)的表达低于HG+30μmol/L Ros 24 h组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Ros可呈浓度和时间依赖性地下调高糖刺激下新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达,可能在抑制心肌纤维化的过程中发挥了作用。
心脏干细胞研究 篇8
1 Materials and methods
1.1 Culture and identification of cardiac fibroblasts
Male Sprague-Dawley rats(1～3 days old)were purchased from the Animal Center,Hebei Medical U-niversity(Shijiazhuang,P.R.China).All experiment procedures were performed in accordance with the Guidelines of Animal Experiments from the Committee of Medical Ethics,Ministry of Health of P.R.China.Primary cultures of neonatal rat cardiac fibroblasts were isolated by trypsin digestion and different speed adherence as previously described[4].The cardiac fibroblasts were maintained in a 1∶1 mixture of Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12(DMEM/F12)(Gibco,USA)supplemented with 10%fetal bovine serum(FBS)(Gibco,USA).Experiments were performed on second to fourth passage cells.The fibroblasts were determined by morphological characterization and by positive staining for fibronectin(Santa Cruz,USA)(Figure 1).
1.2 Experimental groups
Cardiac fibroblasts were cultivated in 25 cm2-flasks at a density of 2×105cells/cm2.To achieve quiescence,the cells were incubated with DMEM/F12containing 1%bovine serum albumin(BSA)(Sigma,USA)for 24 hours.After being starved,the cells were incubated with aldosterone(Ald,10-7mol/L)(Sigma,USA)for various incubation periods as 0,1,2,4,8and 16 h.Cardiac fibroblasts were also pre-incubated with various concentrations of atorvastatin(Ato,10-6,10-5and 10-4mol/L)and mevalonate(Mev,10-3mol/L)(Sigma,USA)for 24 hours:1,Control;2,Ald(10-7mol/L);3,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-6mol/L);4,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-5mol/L);5,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L);6,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L)+Mev(10-3mol/L).
1.3 RT-PCR for TGF-βRⅠmRNA expression
Cardiac fibroblasts were rinsed twice with PBS and total RNA was prepared for reverse transcription.TGF-βRⅠprimers(upstream primer,5'-TAGAAC TCCCAACTACAG G-3';downstream primer,5'-ATAATCCGACACCAACCA-3')and GAPDH primers(upstream primer,5'-AATGCATCCTGCACCAA-3';downstream primer,5'-GTAGCCATATTCATTGTCA-TA-3')weresynthesizedinBEIJINGSBS GENETECH CO.,LTD(Beijing,China).PCR amplification was then performed with synthetic gene-specific primers for TGF-βRⅠ(533 bp)and GAPDH(515bp),using a DNA PCR kit(TaKaRa Dalian,China)in a GeneAmp model 9600 thermocycler(Perkin-Elmer;Norwalk,CT)for 32 cycles(TGF-βRⅠ:45 s at94℃,45 s at 55℃,90 s at 72℃;GAPDH:45 s at94℃,45 s at 48℃,90 s at 72℃).A final extension at72℃for 10 min was performed to ensure that all reactions were completed.PCR products were separated by electrophoresis on 1%agarose gel and were visualized by ultraviolet-induced fluorescence.The intensity of each band was quantified using BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++(VILBER LOURMAT,France).The resulting densities of the TGF-βRⅠmRNA were expressed relative to the corresponding densities of the GAPDH bands(internal control)from the same RNA sample.All experiments were repeated three times.
1.4 Statistical analysis
Data were expressed as the mean±SD.Differences between groups were assessed by one-way ANOVA followed by the Student-Newman-Keuls post hoc test.Differences were considered statistically significant at P<0.05.
2 Results
2.1 Effect of al dosterone on TGF-βRⅠmRNA
1,Control;2,Ald(10-7mol/L);3,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-6mol/L);4,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-5mol/L);5,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L);6,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L)+Mev(10-3mol/L).1)P<0.05 vs Control group;2)P<0.05 vs Ald(10-7mol/L)group;3)P<0.05 vs Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L)group
expression
The cells were incubated with aldosterone(10-7mol/L)containing 1%BSA for 0,1,2,4,8 and 16 h.As shown in Figure 2,aldosterone sig nificantly increased TGF-βRⅠmRNA expression as early as in4 h,and then reached the maximal level at 8 h.
2.2 Effect of atorvastatin on aldosterone-induced TGF-βRⅠmRNA expression
Cardiac fibroblasts were also pre-incubated with varying concentrations of atorvastatin(10-6,10-5and10-4mol/L)for 24 h.As shown in Figure 3,aldosterone stimulated TGF-βRⅠmRNA expression,which was inhibited by atorvastatin(P<0.05).To investigate the pathway of atorvastatin inhibiting aldosterone-activated TGF-βRⅠmRNA expression,the cardiac fibroblasts were pre-incubated with mevalonate.The results showed that mevalonate effectively restored aldosterone–induced increase in TGF-βRⅠmRNA expression.
3 Discussion
It has been rep orted in both clinical researches and animal experiments that atorvastatin is able to improve cardiac remolding,independent of its ability to lower total and low-density lipoprotein cholesterol[5].Alarge body of evidences demonstrated that atorvastatin may exert several inhibition effects on cardiac fibroblasts,such as cardiac fibroblasts proliferation,tansforming to myofibroblasts,collagen synthesis and extracellular matrix deposition[5,6].However,no data have been found,at this time,about the mechanisms of atorvastatin on these effects.Our previous study showed that atorvastatin reduced cardiac fibrosis by significantly down-regulating the over-expression of endothelin-1/endothelin-A receptor system in aldosterone-induced cardiac fibroblasts[7,8].TGF-β1,existing in the extracellular matrix and in the circulation,play an important role in cardiac fibrosis by acting upon heart cells through the TGF-βRI and then propagating downstream intracellular signals,contributes to fibrogenic responses[9].Sakata and assistants further indicated that transforming growth factorbeta receptor antagonism attenuates myocardial fibro-sis in mice with cardiac-restricted over-expression of tumor necrosis factor[10],confirming that TGF-βRI isresponsible for the development of myocardial fibrosis.Taken together,it was speculated that atorvastatin may contribute to its anti-cardiac remodeling effects via a mechanism that involves the expression of TGF-βRⅠ.In supporting this hypothesis,our study revealed that atorvastatin dose-dependently inhibits TGF-βRⅠmRNA expression in cultured rat cardiac fibroblasts induced by aldosterone.Thus,the current study supports the hypothesis that the anti-remodeling effect of atorvastatin is mediated by down-regulating TGF-βRⅠm RNA level.In addition,the inhibitory effect of atorvastatin on the expression of TGF-βRⅠm RNA was abolished by mevalonate,which might be related to the inhibited synthesis of other isoprenoid intermediates in the signaling pathway[11].This strongly suggested that atorvastatin exerted pleiotropic effects through these intermediates inhibits small GTP-binding proteins prenylation[12,13],Rho and Ras induce the accumulation of small GTP-binding proteins and block the intra-cellular signal transduction.This signal transduction pathway contributes to gene expression,separated from that of statins on lipids.Our results showed that inhibitory effects of atorvastatin on TGF-βRⅠmRNA expression stimulated with aldosterone were restored by mevalonate.This strongly suggested that atorvastatin exerts its effects through the mevalonate pathway.
In conclusion,in the present study we showed that atorvastatin down-regulates the aldosterone-induced expression of TGF-βRⅠmRNA in cardiac fibroblasts by a mevalonate mechanism.Because pathologically elevated TGF-βRⅠmRNA expression is thought to enhance the role of TGF-β1 in the development of cardiac fibrosis,these data suggested a new possible mechanism by which statins attenuate cardiac
摘要：目的 探讨阿托伐他汀对醛固酮诱导的新生大鼠心脏成纤维细胞转化生长因子-βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)mRNA表达的影响。方法 采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取和培养乳鼠心脏成纤维细胞,应用RT-PCR检测心脏成纤维细胞TGF-βRⅠmRNA的表达。结果 给予醛固酮(10-7mol/L)4h后,TGF-βRⅠmRNA表达开始增加,8h达高峰;提前给予阿托伐他汀(10-6,10-5,10-4mol/L)能剂量依赖性地抑制醛固酮诱导的TGF-βRⅠmRNA表达,而甲羟戊酸可逆转阿托伐他汀的这种抑制作用。结论 阿托伐他汀可抑制醛固酮诱导的心脏成纤维细胞TGF-βRⅠmRNA表达,其机制可能与甲羟戊酸代谢途径有关。
