载体蛋白（精选九篇）
载体蛋白 篇1
多肽药物是目前新药开发领域非常具有良疗效和安全性的一类药物, 由于其内源性等特征, 其安全性是传统小分子化药所无法比拟的;但是由于其稳定性差、半衰期短等特性, 在成药性方面又具有一定的短板。
多肽的合成和修饰可以从很大程度上解决其稳定性差这一特点, 具有重要的开发价值;尤其近年来, 科学家们通过各种化学修饰可以有效的限制其分子的免疫原性和毒副反应, 使得多肽药化合的成药性有了很大的提升。
2 固相合成的基本原理
2.1 固相合成原理
固相法首先区分于液相法的不同是, 其反应载体不是在溶液中, 是通过一些共价键结构与一定规格的高分子树脂相连接, 然后在此共价键的结构上通过酰胺键的形式逐个链接一个个氨基酸, 最终将按照序列要求连接的肽链从树脂上切割下来, 经过精制纯化等处理, 可得到需要的序列的多肽。本论文提到的序列主要就是采用此固相法进行合成和精制的。
2.2偶联反应
偶联反应的原理是经典的酰胺反应, 通常指将一个氨基酸的羧基与一个氨基酸的氨基进行缩合、脱去一分子水即可形成肽键;可以采用各种缩合试剂促使该反应的进行, 常用的有DIC、HOBT活化酯法接肽。
2.3 裂解及合成肽链的纯化
FMOC法可以直接采用酸解法进行切割, 根据工艺不同, 也可选取其他脱保护和切割的方法, 如:碱、光解、氟离子和氢解等。由于反应步骤较多, 对纯化的要求较高, 常用的有反相HPLC、离子交换色谱等。
3 实验部分
3.1实验器材
玻璃反应柱, 圆底烧瓶, 移液枪, 移液管, 干燥管, 电子天平, 磁力搅拌器, 离心机 (带离心管) , 锥行瓶, 摇床
3.2 原料及试剂
苯丙氨酸王树脂 (产地:上海吉尔) , Fmoc-Gly-OH (甘氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-His (Trt) -OH (组氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Arg (Pbf) -OH (精氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Thr (t Bu) -OH (苏氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Ala-OH (丙氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Ser (t Bu) -OH (丝氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Lys (Boc) -OH (赖氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Cys (Trt) -OH (半胱氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Phe-OH (苯丙氨酸, 产地:苏州天马) , Ho Bt (1-羟基苯并三唑, 产地:苏州天马) 、DMF (N、N-二甲基甲酰胺, 产地:苏州天马) 、DCM (二氯甲烷, 产地:苏州天马) 、DIPCDI (N, N-二异丙基碳二亚胺, 产地:苏州天马) 等。DIPEA (N, N-乙基二异丙胺, 产地:西安美联) , TFA (三氟乙酸) , TIS (三异丙基硅烷) , EDT (1, 2-乙二硫醇) , TFA (三氟乙酸) , Na H2PO4 (产地:山头光华) , KLH (产地:SIGMA) , MBS (产地:SIGMA)
3.3 HF-13 线性肽树脂的偶联
HF-13 肽序:H-His-Gly-Arg-Thr-Ala-Ser-Arg-Thr-LysCys-Arg-Lys-Phe-OH
3.3.1 取1.268g苯丙氨酸王树脂 (0.8mmol) , 置于玻璃反应柱中, 加5ml DMF, 溶胀15分钟, 抽干。
3.3.2 树脂中加入约5ml 20%六氢吡啶的DMF溶液, 进行去保护, 反应5分钟后抽干, 再次加入约5ml20%六氢吡啶的DMF溶液, 反应7分钟后抽干。用玻璃棒取少许树脂做茚三酮检测, 肽树脂为蓝黑色。然后用DMF和DCM洗涤7-8遍, 抽干。
3.3.3 称取1.874g Fmoc-Lys-OH (Fmoc-赖氨酸) 置于柱中, 用约5ml DMF溶解, 加入DIC 0.81ml, 同时调节氮气搅拌使树脂完全搅拌均匀, 反应2个小时。
3.3.4 2小时侯, 用玻璃棒取少许树脂, 进行茚三酮检测, 肽树脂完全透明。
3.3.5 将反应柱抽干, 用DMF洗涤4遍。
3.3.6 重复以上偶联过程3.3.2 到3.3.5 至所有氨基酸偶联完全。
3.3.7 树脂中加入约5ml甲醇使树脂充分收缩, 抽干树脂, 称重得肽树脂2.534g。
3.4 HF-13线性肽树脂的裂解
3.4.1把以上反应好的树脂置于50ml的圆底烧瓶中, 并放入一个搅拌子。
3.4.2 按以下配比配制25ml裂解液:三氟乙酸 (TFA) :三异丙基硅烷 (TIS) :水 (H2O) = 95:2.5:2.5
3.4.3 将裂解液按照每克树脂10ml裂解液的比例, 加入25ml至圆底烧瓶中, 并将圆底烧瓶置于磁力搅拌搅拌器上, 打开电源开关, 并缓慢调节调速旋钮到合适的速度, 搅拌反应2个小时。
3.4.4将裂解液过滤到1L的广口瓶中, 并加入250ml冰冻乙醚, 沉降半个小时, 倒掉上清夜, 将沉淀均分在四个离心管中, 于离心机中离心, 转速3000r/分钟。离心时间3分钟, 取出离心杯, 倾去上清液, 得到粗肽。
3.4.5将以上离心所得粗肽放入真空泵中抽干, 取出, 称重, 1.304g。
3.4.6粗肽送HPLC检测
3.5 HF-13线性肽粗品的纯化
交由公司纯化人员完成, 得到精肽764mg, 并送HPLC检测
3.6 KLH的偶联
3.6.1 buffer B:0.01mol/L Na H2PO4 PH=6 500ml 0.781g
buffer C:0.01mol/L Na H2PO4 PH=7 200ml 0.312g
3.6.2 称取20g MBS溶解于1.6ml DMF中, 另称取200mg KLH (磷酸盐冻干粉) 溶解于6ml H2O中;把MBS溶液加入KLH溶液中, 搅拌反应30min, 溶液总体积7.6ml. (KLH:10mg/ml)
3.6.3 取2g G-25葡聚糖凝胶, 水浴加热煮沸30min, 冷却后装入层析柱, 用蓝色葡聚糖确定柱子前体积约4.5ml。 用buf⁃fer B冲洗柱子约10 个柱体积后, 把3.6.2 中的反应液过柱, 用buffer B作淋洗液, 收取约16ml溶液 (。约2倍原反应液体积)
3.6.4 将精肽20mg加入3.6.3 步收取的反应液, 此时送HPLC检测
用三乙胺调节反应液PH至7.3, 搅拌反应约5个小时。
3.6.5将反应液送HPLC检测, 反应底物吸收峰消失,
反应到达终点, 停止反应。
3.6.6 取3.6.4 中反应液过柱, 用H2O作淋洗液, 收取40m溶液 (约2.5倍原反液体积) 。冻干, 称重的成品85mg。
3.7 结果讨论
1) 固相多肽合成工艺快捷有效, 能克服传统液相合成路线的许多弊端。
2) 用HPLC系统对多肽-蛋白在缓冲体系的在线监测, 经过数小时的反应, 新的物质 (载体蛋白-多肽) 已经生成, 并反应完全。
3) 载体蛋白KLH对多肽的修饰可以在适当的缓冲体系中有效地完成。
参考文献
[1]陈栋梁, 《21世纪-多肽的世纪》。
[2]方宏清, 《多肽类药物制剂研究现状》, 军事医学科学院生物工程研究所, 北京10007
[3]《多肽合成》, 黄惟德、陈常庆, 科学出版社, 1985。
[4]Gilon, C., alle, D., Chorev, M., Selinger, Z., Byk, G., Biopolymers1991, 31, 745-750
[5]Nagele, E.;Schelhaas, M.;Kuder, N.;Waldmann, H.J.Am.Chem.Soc.1998, 120, 6889.
[6]Hocart, Simon J, Jain.Rahal, Murphy, William a, Taylar, JoneE, J.Med.Chem.1998, 41 (7) , 1146-1154
[7]Egan, S.E.;Weinberg, R.A.Nature 1993, 365, 781.
载体蛋白 篇2
通过RT-PCR方法扩增β-酪蛋白基因,扩增产物插入质粒载体pET-28a中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达.利用限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列测定及SDS-PAGE,结果表明,成功地用RT-PCR方法从小鼠乳腺组织中克隆出β-CN基因并构建了重组β-CN的表达载体,并在大肠杆菌获得表达.
作 者：董琼珠 李素萍 秦宜德 方敏 DONG Qiong-zhu LI Su-ping QIN Yi-de FANG Ming 作者单位：安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室,合肥,230032 刊 名：安徽农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2006 33(2) 分类号：Q78 R-332 关键词：β-酪蛋白 RT-PCR 构建★ 携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定
★ 大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定
载体蛋白 篇3
我们在表达IL-1的过程中, 发现在大肠杆菌中难以获得高效稳定的可溶性表达, 其原因可能在于该蛋白在大肠杆菌中较易被蛋白酶降解。我们试验过很多表达载体表达效果均不理想, 如pET系列表达载体、pTYB-11等表达系统对以上蛋白的表达量极低或者几乎不表达, pGEX6p-1虽然表达量较高, 但可溶性目的蛋白所占比例较小。
SUMO (small ubiquitin-like modifier-1) 是一种小分子泛素样修饰蛋白[3,4], 广泛存在于各种真核细胞中, 参与调节细胞凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等多种生理进程[5]。近年来, SUMO被发现可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣, 具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠, 提高可溶性等功能[6,7,8]。小分子泛素样修饰蛋白 (SUMO) 和泛素 (Ub) 在一级结构上只有18%的同源性, 然而, 两者的三级结构及其生物学功能却十分相似[9], 研究表明其作为重组蛋白的融合标签可以增加蛋白的稳定性。现本文以IL-1为例, 试验pHisSUMO蛋白融合表达系统的应用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
质粒和受体菌:质粒pMD18-T-His-IL-1 (pMD18-T为TaKaRa公司的T载体) ;pHisSUMO (购于lifeSensors公司) 、pET-30a (+) 、PTYB-11载体由本实验室提供;受体菌E.coli DH5α、Rosetta (含DE3) 由本实验室提供。
克隆pET30a (+) -IL-1引物:
P1上游:5’GGGGAATTCATGGCACCTGTACGA 3’ EcoRⅠ;
P2下游:5’CCCGTCGACTTAGGAAGACACAAA 3’ SalⅠ。
克隆pTYB11-IL-1引物:
P3上游:5’AACAGAAGAGCACCTGTACGATCACTGAAC 3’ SapⅠ;
P4下游:5’ACGCGTCGACTTCCACATTCAGCACA 3’ SalⅠ。
克隆pHisSUMO-IL-1引物:
P5上游:5’GGTCTCAAGGTGCACCTGTACGATCACT 3’ BsaⅠ;
P6下游:5’CGGGATCCGTACAGCTCTCTTTA 3’ BamHⅠ。
1.1.2 试剂
BsaⅠ、BamHⅠ、SapⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ购自New England Bio Labs公司;pMD18-T、dNTPs、其它限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司, SUMO蛋白酶Ⅰ购自Life Sensors公司。IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) , 溶菌酶, 卡那霉素购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒, 购自上海华舜生物工程有限公司。Ni-NTA琼脂糖颗粒购自QIAGEN公司。
1.1.3 仪器
Milli-Q Ⅱ型纯水仪 (美国密理博公司) 、-70℃超低温冰箱 (日本三洋公司) 、AvantiTM 30型高速冷冻离心机 (美国贝克曼公司) 、DU640紫外分光光度计 (美国贝克曼公司) 、PTC-200梯度PCR仪 (美国伯乐公司) 、ChampgelTM 5000凝胶成像系统 (美国阿尔法公司) 、MA120型垂直板电泳系统 (美国伯乐公司) 、Labo Autoclave高压灭菌锅 (日本三洋公司) 、721分光光度计 (中国上海第三分析仪器厂) 、-20℃冷冻冰柜和4℃冷藏冰箱 (中国海尔) 。
1.2 方法
1.2.1 融合蛋白表达载体的构建
1.2.1.1 pET-30a (+) 表达质粒的构建
以质粒pMD18-T-IL-1为模板, 以P1、P2为引物, 用rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切, 回收酶切片段;将pET-30a (+) 表达载体用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切, 回收酶切载体片段, 将酶切回收后的IL-1 PCR产物与pET-30a (+) 表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α, 提取重组质粒, SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
1.2.1.2 pTYB-11表达质粒的构建
以质粒pMD18-T-IL-1为模板, 以P3、P4为引物, 用rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SapⅠ和SalⅠ双酶切, 回收酶切片段;将pTYB-11表达载体用SapI和SalⅠ双酶切, 回收酶切载体片段, 将酶切回收后的IL-1 PCR产物与pTYB-11表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α, 提取重组质粒, SapⅠ和SalⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
1.2.1.3 pHisSUMO表达质粒的构建
以质粒pMD18-T-IL-1为模板, 以P5、P6为引物, 用rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用BsaⅠ和BamHⅠ双酶切, 回收酶切片段;将pHisSUMO表达载体用BsaⅠ和BamHⅠ双酶切, 回收酶切载体片段, 将酶切回收后的IL-1 PCR产物与pHisSUMO表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α, 提取重组质粒, XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
阳性克隆测序, 具体测序方法见CEQ8000操作流程。
1.2.2 目的基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的纯化
将含有正确序列的重组质粒pET-30a (+) -IL-1、pTYB-11-IL-1、pHisSUMO-IL-1转化至表达菌株Rosetta。转化后的单菌落分别接种至5mL LB培养基中, 37℃培养10h, 以1:100接种于500mL含卡那霉素 (50mg/mL) 的LB培养基中, 37℃培养2h, A600=0.3～0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导, 诱导3h后分别取少量菌体及未诱导的对照样品进行12% SDS-PAGE[11]电泳。收获pHisSUMO-IL-1转化至表达的菌体进行超声破碎后离心[11], 分别取上清和沉淀进行12%SDS-PAGE电泳分析。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导1h、2h、3h、4h、5h, 摸索最佳诱导时间, 分别加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L诱导3h进行浓度梯度诱导, 摸索最佳诱导浓度。
菌体经超声破碎后离心, 上清经Ni-NTA柱亲和层析, 用杂蛋白洗脱液 (30mmol/L咪唑, 300mmol/L NaCl, 50mmol/L NaH2PO4, pH 8.0) 洗去杂蛋白后, 用洗脱液 (250mmol/L咪唑, 300mmol/L NaCl, 50mmol/L NaH2PO4, pH 8.0) 洗脱融合蛋白, 收集洗脱的第一、二峰。取融合蛋白5μl进行SDS-PAGE电泳分析。
1.2.3 融合蛋白的切割
将方法1.2.2收集的pHisSUMO-IL-1融合蛋白 (浓度为1mg/ml) 经PBS透析24h后, 以每10μg融合蛋白: 1U SUMO蛋白酶Ⅰ的比例加入SUMO蛋白酶Ⅰ, DTT终浓度为2mmol/L, 4℃切割过夜, 并取样进行15%SDS-PAGE检测。
1.2.4 成熟蛋白的纯化
切割后产物经PBS缓冲液透析以除去切割液, 再经Ni-NTA颗粒亲和层析, 收集惟一的洗脱峰, 即为IL-1成熟目的蛋白, 用洗脱液 (250mmol/L咪唑, 300mmol/L NaCl, 50mmol/L NaH2PO4, pH 8.0) 洗脱Ni-NTA颗粒结合的小泛素相关修饰物蛋白, 15% SDS-PAGE电泳检测。
2 结果与分析
2.1 pMD18-T-IL-1插入片段克隆
以质粒pMD18-T-IL-1为模板, 以P1、P2为引物进行PCR扩增后, 产物大小为450bp左右与预期产物大小相符 (如图1) 。
测序结果 (略) 与Genebank发表序列一致459bp。
2.2 融合蛋白表达载体的构建
将胶回收的IL-1基因序列与线性化的pET-30a (+) 表达载体、pTYB-11表达载体、pHisSUMO表达载体连接。重组表达载体pHisSUMO-IL-1经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后, 获得产物为450bp左右的条带, 重组表达载体pTYB-11-IL-1经SapⅠ和SalⅠ双酶切鉴定得到450bp左右的条带, 重组表达载体pET30a (+) -IL-1经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定得到450bp左右的条带, 与预期一致 (图2) 。DNA测序结果表明与Genebank发表序列一致。融合蛋白表达载体构建成功。
1:DL2000 DNA ladder;2:The PCR productswith the primer P1 and P2.
1:100bp DNA Marker; 2: pHisSUMO-IL-1; 3: pHisSUMO-IL-1/XbaⅠ+BamHⅠ;4:pTYB-11-IL-1;5:pTYB-11-IL-1/SapⅠ+SalⅠ;6:pET-30a (+) ; 7:pET-30a (+) /SalⅠ+EcoRⅠ.
2.3 pHisSUMO-IL-1融合蛋白的表达
将含有重组质粒pHisSUMO-IL-1、pTYB-11-IL-1、pET-30a (+) -IL-1的Rosetta菌株接种后诱导, 加入IPTG诱导3h后取样电泳分析, 结果显示pTYB-11、pET-30a (+) 系统未能表达IL-1, 而融合蛋白在pHisSUMO表达载体中表达量较高, 且均为可溶性蛋白 (如图3) , 纯化后的pHisSUMO-IL-1融合蛋白上样量为5μl (浓度约为1mg/ml) , 其分子量约为37 000Da (见图4) 。
1:protein molecular mass marker;2:pHisSUMO;3:supernatant of Rosetta cells harboring pHisSUMO-Express-IL-1 3hours after IPTG induction;4:precipitate of Rosetta cells harboring pHisSUMO-Express-IL-1 3hours after IPTG induction;5:supernatant of Rosetta cells harboring pTYB-11 IL-1 3 hours after IPTG induction;6:precipitate of Rosetta cells Harboring pTYB-11 IL-1 3 hours after IPTG induction;7:supernatant of Rosetta cells harboring pET30a (+) -IL-1 3hours after IPTG induction;8:precipitate of Rosetta cells Harboring pET30a (+) -IL-1 3 hours after IPTG induction.
2.3.1 pHisSUMO-IL-1融合蛋白时间梯度诱导
从电泳结果分析, 蛋白的表达量并不是随着时间的延长表达量逐渐增加。在未诱导时, 无表达, 3h以前表达量逐渐增大, 当诱导至3h时, 蛋白质的表达量最大, 以后表达量无显著增加。由此推出最佳诱导时间为3h。
2.3.2 pHisSUMO-IL-1融合蛋白IPTG浓度梯度诱导
1: supernatant of Rosetta cells harboring pHisSUMO-IL-1 without IPTG induction;2: supernatant of Rosetta cells harboring pHisSUMO-IL-1 1 hours after IPTG induction;3: supernatant of Rosetta cells harboring pHisSUMO-IL-1 2 hours after IPTG induction;4: protein molecular mass marker;5: supernatant of Rosetta cells harboring pHisSUMO-IL-1 3 hours after IPTG induction;6: supernatant of Rosetta cells harboring pHisSUMO-IL-1 4 hours after IPTG induction;7: supernatant of Rosetta cells harboring pHisSUMO-IL-1 5 hours after IPTG induction.
从IPTG浓度梯度诱导表达结果分析, 随着IPTG终浓度的增加, 融合蛋白的表达量也逐渐增加, 当增加到0.5mmol/L时, 蛋白的表达基本稳定不再增加, 确定IPTG终浓度0.5mmol/L为最佳诱导剂量。
1, 2, 3:pHisSUMO-IL-1 induced at concentration IPTG 0.1mmol/L, 0.2mmol/L, 0.3mmol/L f or 3h;Lane 4:Protein molecular weight standards;Lane 5, 6:pHisSUMO-IL-1 induced at concentration IPTG 0.4 mmol/L, 0.5mmol/L for 3h;Lane 7:pHisSUMO induced at concentration IPTG 1.0mmol/L for 3h.
2.4 pHisSUMO- IL-1融合蛋白的纯化
1: Purified pHisSUMO-IL-1 protein; 2: Protein Marker.
2.5 融合蛋白的切割与成熟蛋白的纯化
pHisSUMO-IL-1融合蛋白经蛋白酶切割效率较高, 切割后的产物, 置于PBS缓冲液中透析24h, 再经Ni-NTA颗粒亲和层析, 收集惟一的洗脱峰, 即为IL-1成熟蛋白, 15%SDS-PAGE电泳检测。 (图7) 。
1: pHisSUMO-IL-1 fusion protein; 2: Protein Marker; 3: The products of pHisSUMO-IL-1 fusion protein after cut with SUMO proteaseⅠ;4: Purified IL-1.
3 讨论
本实验构建了pET、pTYB和pHisSUMO表达系统, 并利用pHisSUMO表达系统成功地表达和纯化了IL-1, 利用SUMO蛋白酶Ⅰ切割获得了具有纯度较高的成熟蛋白。由于SUMO蛋白酶Ⅰ和SUMO蛋白引入了多聚组氨酸, 可以与Ni-NTA琼脂糖颗粒结合, 因此可以利用Ni-NTA亲和层析分离出有活性的成熟蛋白。
IL-1在大肠杆菌中难以获得高效可溶性表达, 最初我们使用pET系列和pTYB表达系统, 但目的蛋白表达量极低。而通过分子伴侣进行融合表达如pGEX表达系统 (结果略) , 尽管可以提高蛋白的表达量以及成熟蛋白的收获率, 但多数融合蛋白是以包涵体的形式表达, 复性比较困难, 在此过程中我们也摸索了很多诱导条件, 但表达效果均不理想。
SUMO近年来被发现可用作分子伴侣来增加外源蛋白的稳定性和可溶性, 其作用机理可能是SUMO蛋白作为一个高度疏水的核心为目的蛋白的折叠提供成核位点[11,12,13], 促进蛋白间的相互作用并使其正确折叠, 最终增强了融合蛋白的可溶性[14]。时间对于融合蛋白pHisSUMO-IL-1的诱导表达量影响较大、诱导3h, 4h时蛋白表达量较高, 当诱导过夜时融合蛋白含量较少推测可能被菌体内的蛋白酶降解了。为避免纯化时杂蛋白含量较高, 我们选择了诱导3h, 并制备出纯度较高的融合蛋白。并且该融合蛋白在利用SUMO蛋白酶Ⅰ进行切割时可保证无氨基酸残留, 不影响蛋白活性。
pHisSUMO表达载体是蛋白表达纯化领域中的一个新的表达体系, 其优点为表达产物可溶且表达量高, 现已成功地表达了很多传统情况下难以表达或可溶性不好的重组蛋白。为生物技术领域中重组蛋白的研究和应用提供了有用的工具。
摘要：目的:构建含有IL-1基因的原核表达质粒, 并对其原核表达情况进行检测, 验证pHisSUMO表达载体的高效可溶性表达。方法:以质粒pMD18-T-IL-1为模板, 利用PCR获得IL-1基因克隆并将其与表达载体pET、pTYB、pHisSUMO连接, 重组质粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5α中, 并检测其蛋白表达情况。结果:仅在pHisSUMO表达系统获得了IL-1融合蛋白的高效可溶性表达。利用Ni-NTA纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶Ⅰ切割, 获得了纯度较高的成熟蛋白且不残留任何氨基酸残基。结论:实验证明pHisSUMO表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量。
载体蛋白 篇4
采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术进行烟草红素氧还蛋白基因NtRD1(Nicotianatabacum rubredoxin1)全长cDNA的克降,获得了全长808 bp的cDNA,该cDNA具有完整的.开放阅读框架,编码204个氨基酸,其中包含一个保守的红素氧还蛋白结构域.同源分析结果表明,NtRD1与其它植物已克隆的RDs具有较高的一致性.系统发育分析结果表明,NtRD1与其它物种RDs的亲缘关系由近及远依次是马铃薯、水稻、葡萄、拟南芥和藻类.根据RNAi(RNA interference)载体构建原则,成功地构建了干扰NtRD1的RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-NtRD1-RNAi,为进一步探明该基因在烟草中的功能奠定了基础.
作 者：冯仁军 卢利方 程萍 袁克华 张银东 Feng Renjun Lu Lifang Cheng Ping Yuan Kehua Zhang Yindong 作者单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101;海南大学农学院,海口,570228 刊 名：热带作物学报 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS 年，卷(期)：2008 29(3) 分类号：Q943.2 关键词：烟草 RACE 全长cDNA NtRD1 RNAi★ 《红高粱家族》读后感
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载体蛋白 篇5
病毒感染宿主的过程中涉及病毒与宿主的相互作用, 研究蛋白之间的相互作用是理解病毒致病机制的一个重要方向。酵母双杂交系统是研究基因功能及蛋白质-蛋白质之间相互作用的重要方法, 利用该方法可以得到与诱饵蛋白相互作用的未知功能蛋白。本试验拟构建RHDV病毒蛋白酵母双杂交诱饵载体, 并检测其是否具有自激活活性和毒性, 为进一步利用酵母双杂交技术筛选与RHDV存在相互作用的宿主蛋白奠定基础。
1 材料与方法
1.1 毒株、菌株和主要试剂
RHDV (HYD株) 和E.coli DH5α感受态细胞, 哈尔滨兽医研究所自然疫源性人畜共患病创新团队保存;酵母菌株 (AH109) 、诱饵载体p GBKT7、捕获载体p GADT7、p GBKT7-Lam/p GADT7-T阴性对照、p GBKT7-53/p GADT7-T阳性对照、X-α-Gal及各种酵母培养基和相关试剂, 均购自Clontech公司。SD/-Trp、DDO (SD/-Leu/-Trp) 、QDO (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp) 、QDO/X-α-Gal培养基按常规方法制备;反转录酶 (M-MLV) 、DNA聚合酶、限制性内切酶、p MD18-T载体及DNA A-Tailing Kit, 均购自Ta KaRa公司;胶回收试剂盒, 购自AXYGEN公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 引物的设计与合成
根据Gen Bank中已公布的RHDV HYD株 (登录号为JF412629.1) 全基因组序列, 参考FRG株 (NCBI No.NC_001543.1) 对RHDV结构蛋白VP60、小结构蛋白VP10以及7个非结构蛋白的序列长度进行分段, 使用Oligo 6.0软件设计引物 (序列见表1) , 引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。
1.3 RHDV病毒蛋白基因的扩增
采用TRIzol法提取RHDV (HYD株) 总RNA, 以6 nt随机引物和M-MLV进行c DNA第一链的合成, 然后以c DNA为模板, 用特异性引物扩增RHDV结构蛋白和非结构蛋白基因, PCR反应体系如下:上、下游引物各0.5μL, pfu DNA聚合酶0.5μL, c DNA2μL, 2.5 mmol/L d NTP 2μL, 10×pfu缓冲液2.5μL, 加dd H2O补至25μL。PCR反应条件:98℃5 min;98℃15 s, 55℃ (RdRp) /58℃ (P29) /60℃ (VPg、VP10) /61℃ (3C-like protease) /62℃ (P23、2C-like protein、VP60) 30 s, 72℃3.5 min, 共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 胶回收目的片段, 用DNA A-Tailing Kit添加“A”尾后连接到p MD18-T载体, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 获得重组质粒进行酶切及PCR鉴定, 选择阳性菌送哈尔滨博仕生物公司测序部进行测序。应用Meg Align软件对测序结果进行分析, 并将鉴定正确的阳性克隆命名为p MD18-T-X。
1.4 诱饵载体p GBKT7-X的构建
将阳性质粒p MD18-T-X用相应的限制性内切酶双酶切, 定向克隆到经同样酶切的线性化载体p GBKT7中, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 提取重组诱饵质粒经PCR和双酶切鉴定, 并将鉴定正确的重组诱饵质粒命名为p GBKT7-X。
1.5 诱饵载体转化酵母菌AH109
按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2 (Clontech) 制备AH109酵母感受态细胞, 在EP管中加入待转化质粒1μL (100 ng/μL) , 再加入Yeastmaker Carrier DNA 5μL (10μg/μL) 、酵母感受态细胞50μL、新鲜制备的PEG/Li Ac 500μL, 混匀, 30℃水浴30 min (每隔10 min轻轻振荡混匀) ;每管加入20μL DMSO, 混匀, 42℃水浴15 min (每隔5 min轻轻振荡混匀) ;15 000 r/min离心15 s;弃上清液, 沉淀用100μL生理盐水重悬, 取35μL重悬菌液滴加到酵母培养基平板, 30℃倒置培养3~5 d, 待酵母菌落长出。
1.6 诱饵载体p GBKT7-X的毒性检测
将p GBKT7空载体和p GBKT7-X诱饵载体分别转化入AH109酵母感受态细胞, 转化产物涂布于SD/-Trp平板上, 30℃倒置培养3~5 d, 观察比较菌落的大小, 并挑取单菌落至5 m L SD/-Trp/Kan (20μg/m L) 液体培养基中进行生长速度 (OD600值) 的比较。若含诱饵载体的酵母菌落大小和生长速度与含空载体的酵母菌差异不显著, 则判定该诱饵载体无毒性, 否则判定为有毒性。
1.7 诱饵载体p GBKT7-X的自激活活性的检测
将诱饵载体p GBKT7-X和空载体p GADT7共转化AH109酵母感受态细胞, 转化产物涂布于DDO、QDO和QDO/X-α-Gal平板上, 30℃倒置培养3~5 d;p GBKT7/p GADT7和p GBKT7-Lam/p GADT7-T设为阴性对照组, p GBKT7-53/p GADT7-T设为阳性对照组, 观察酵母菌AH109在各个平板上的生长情况。如果诱饵质粒能够自激活报告基因, 那么DDO、QDO和QDO/X-α-Gal平板上均有菌落生长, 且QDO/X-α-Gal平板上为蓝色菌落;否则仅DDO平板上有白色菌落, QDO和QDO/X-α-Gal平板上无菌落生长。
2 结果
2.1 RHDV病毒蛋白基因的扩增结果
以提取的RHDV (HYD株) 基因组RNA为模板, 经RT-PCR扩增, 产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 扩增片段大小均与预期相符 (见图1) 。序列比对显示, 测序结果与RHDV (HYD株) 完全一致, 成功克隆到各基因。
2.2 诱饵载体p GBKT7-X的构建及鉴定结果
将重组诱饵质粒用相应的限制性内切酶做双酶切, 核酸电泳结果表明, 得到与预期大小一致的目的基因片段和p GBKT7片段, 说明诱饵载体p GBKT7-X均构建正确。酶切结果见图2。
2.3 诱饵载体p GBKT7-X的毒性检测结果
空载体p GBKT7和诱饵载体p GBKT7-X分别转化AH109酵母感受态细胞, 30℃倒置培养3 d后, SD/-Trp平板上的菌落大小无明显差异。分别挑取单菌落至SD/-Trp/Kan (20μg/m L) 液体培养基培养, 30℃振摇培养约24 h后, 测定酵母菌AH109的OD600值。结果表明, 酵母菌AH109 (p GBKT7-X) 与酵母菌AH109 (p GBKT7) OD600值相近 (见图3) , 说明构建的诱饵载体对酵母细胞无毒性作用。
2.4 诱饵载体p GBKT7-X的自激活检测分析
诱饵载体p GBKT7-X和空载体p GADT7共转化AH109酵母感受态细胞, 30℃倒置培养3 d后, 在DDO培养基上均长出白色菌落, 而QDO和QDO/X-α-Gal培养基上均无菌落生长。阴性对照p GBKT7/p GADT7和p GBKT7-Lam/p GADT7-T仅在DDO培养基上长出白色菌落, QDO和QDO/X-α-Gal培养基上均无菌落生长;阳性对照p GBKT7-53/p GADT7-T在DDO和QDO培养基上均长出白色菌落, 且QDO/X-α-Gal培养基上为蓝色菌落 (见258页彩图4) 。由此证明:诱饵载体p GBKT7-X不会自激活酵母报告基因的表达, 无自激活活性。
3 讨论
病毒感染宿主以吸附到宿主细胞表面起始, 之后将核酸注入到宿主细胞, 并在其中大量繁殖。该过程需要宿主细胞膜上的病毒受体及细胞中的相关蛋白辅助完成[8];因此, 研究病毒与宿主的相互作用对阐明RHDV在细胞核内的转录调控机理及感染机制具有重要意义。
酵母双杂交系统是研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种快速、灵敏、有效的研究技术, 其建立基于对真核细胞调控转录起始过程的认识[9]。研究发现, 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域 (domain) 组成的, 其基本原理是将诱饵基因X和文库基因Y分别连接到GAL4的DNA结合域 (DNA binding domain, DNA-BD) 和转录激活域 (transcription activation domain, AD) 基因片段的下游使之融合表达, 当X和Y有相互作用时则可将BD和AD蛋白在空间上的距离拉得很近, 从而激活上游UAS序列, 使下游的报告基因得到表达。其优点是酵母细胞为真核细胞, 可对蛋白质进行翻译、加工、修饰使其更接近天然结构, 但其融合蛋白发生相互作用激活报告基因发生在细胞核内, 因此对胞外蛋白互作的筛选受限;同时对需要几种蛋白同时存在形成蛋白复合体才发生互作的情况也不适用[10]。目前, 杨宗伟等[11]利用真核细胞双杂交系统验证了RHDV VP60与VP10之间存在相互作用, 穆亚芳等[12]利用表达性克隆法筛选与VP60相互作用的宿主蛋白, 但利用酵母双杂交技术筛选RHDV基因组所编码的全部病毒蛋白与宿主之间相互作用的研究还未见报道。
为了筛选与RHDV病毒蛋白互作的宿主蛋白, 本试验构建了用于酵母双杂交筛选的RHDV非结构蛋白诱饵载体p GBKT7-P16、p GBKT7-P23、p G-BKT7-2C-like protein、p GBKT7-P29、p GBKT7-VPg、p GBKT7-3C-like protease、p GBKT7-RdRp和小结构蛋白诱饵载体p GBKT7-VP10以及主要结构蛋白诱饵载体p GBKT7-VP60, 经PCR、测序和酶切鉴定均构建正确。诱饵载体p GBKT7-X含有色氨酸编码基因, 故只能在SD/-Trp平板上生长, 且菌落大小和生长速度与空载体p GBKT7无显著差异, 表明诱饵载体p GBKT7-X无毒性。共转化诱饵载体p G-BKT7-X和空载体p GADT7至酵母菌AH109, 仅能在DDO平板上长出白色菌落, 证明p GBKT7-X无自激活活性, 从而排除了假阳性的可能。综上所述, 试验成功构建了RHDV病毒蛋白诱饵载体p GBKT7-X, 为利用酵母双杂交技术筛选与其相互作用的宿主蛋白和阐明RHDV在细胞核内的转录调控机理及感染机制奠定了基础。
摘要：为了研究兔出血症病毒 (RHDV) 蛋白与宿主蛋白的相互作用, 试验采用RT-PCR技术从病毒基因组中扩增病毒的7种非结构蛋白P16、P23、2C-like protein、P29、VPg、3C-like protease、RNA复制酶 (RdRp) 及小结构蛋白VP10、主要结构蛋白VP60, 测序正确后, 定向克隆至p GBKT7载体, 经转化酵母菌AH109验证诱饵载体p GBKT7-X的自激活活性和毒性作用。结果表明:诱饵载体p GBKT7-X对酵母细胞无毒性作用, 且对报告基因无自激活现象。说明构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统筛选与RHDV相互作用的宿主蛋白。
关键词：兔出血症病毒 (RHDV) ,酵母双杂交,诱饵载体,自激活作用,毒性作用
参考文献
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载体蛋白 篇6
目前在生产上应用的主要是商品化弱毒苗，几种商品化弱毒苗在减少PRRS疾病损失方面发挥了一定的作用，但PRRS疫苗的使用仍然存在着不少问题：(1)疫苗毒能在猪体内持续性存在，能从免疫猪传给非免疫猪，从免疫猪群传到非免疫猪群，公猪免疫后可通过精液传播，母猪免疫后可经胎盘造成胎儿的先天性感染;(2)血清型不同时，保护作用不完全，且持续时间较短，对于新出现的超强毒株则完全无保护作用;(3)疫苗免疫后并不能明显减少强毒株在猪群内的传播;(4)疫苗毒能返强而致病，免疫后抗体水平低下时，有诱发ADE作用的可能，反而使病情加剧。因此，对于PRRS弱毒疫苗应采取谨慎使用的态度，研制高效安全的疫苗乃当务之急。
2 PRRSV结构蛋白及活载体疫苗开发
随着新型疫苗的不断涌现，PRRS活载体疫苗也逐渐成为国内外研究的热点。活载体疫苗主要针对PRRSV的三种主要结构蛋白：GP5/E蛋白(囊膜糖蛋白)、ORF6编码膜基质蛋白(M蛋白)及OFR7编码核衣壳蛋白(N蛋白)。
2.1 GP5/E蛋白PRRSV
E基因长603 bp左右，编码GP5糖基化包膜蛋白(又称E蛋白)，在所有结构蛋白中是变异程度最高的一种蛋白，但GP5是重要的抗原保护性蛋白，能诱导高滴度的中和性抗体，具有最强的中和能力，在保护性免疫应答中发挥重要作用。Rodrigue等研究缺失跨膜区的GP5基因在大肠杆菌中获得良好的表达，且表达产物可与PRRS阳性血清发生阳性反应。Gonin等将PRRSV-GP5克隆到融合有GST蛋白基因的pGEx-4T-1载体中，结果其表达产物可用于病毒血清学检测。谷红等将中国分离的BJ-4株缺失N端疏水序列的PRRSV-dGP5克隆到原核高效表达载体pGEX-4T-2中，在E.coli BL21细胞中成功表达了重组蛋白GST-dGP5，表达产物以包涵体形式存在，表达量为20.8%，利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白。陈建君等将中国GD株GP5克隆到原核表达载体pBAD/g III C中，将该片段定向插入到转化大肠埃希氏菌中，重组质粒用阿拉伯糖诱导表达，用Western blotting鉴定表达蛋白，结果证明GP5基因得到表达。目前国内外学者虽然已对E蛋白的本质及其原核表达、免疫反应特征、在保护性免疫中的作用等方面进行了大量的研究工作，并取得了较大的进展，但仍有很多方面尚不十分明确。
2.2 ORF6编码的非糖基化蛋白（M蛋白）
ORF6基因长525bp左右，编码M蛋白，具有高度保守性。在所有蛋白中M蛋白刺激引起的T细胞增殖反应最为强烈，可见M蛋白与PRRSV诱导的细胞免疫有关。另外，M蛋白上至少存在4个线性抗原表位和3个构象性表位，能诱导低滴度的中和抗体产生，这对PRRSV基因工程疫苗的设计具有重要的指导意义。王娇等采用原核表达载体pET-32a(+)表达了河北地方珠PRRSV-ORF6蛋白，经Western-blotting分析表明，表达蛋白与阳性血清发生了特异性反应。综合这些研究结果，一方面可以利用该原核表达产物建立反映机体抗体水平的特异性诊断方法;另一方面，该特异性抗体的制备对以M蛋白为基础的PRRSV新型基因工程疫苗的研制以及对疫苗激发免疫反应的检测提供了基础材料。
2.3 ORF7编码核衣壳蛋白（N蛋白）
N基因及其编码蛋白长372 bp左右，主要编码核衣壳蛋白，是一种碱性磷酸蛋白，N蛋白和M蛋白一样具有高度保守性，N蛋白的抗原位点分散于整个N蛋白上，没有一个N蛋白氨基酸片段能模拟完整N蛋白的抗原性，且美洲型毒株和欧洲型毒株的N蛋白上存在着能发生交叉反应的保守性抗原位点，同时也存在着不同反应性的特异性抗原表位，这些针对共同抗原表位的特异性单抗，对于PRRSV的诊断以及鉴别美洲型和欧洲型PRRSV感染均具有重要意义。与其他蛋白相比，N蛋白激发的体液免疫反应最强，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的。另外，猪感染PRRSV后，针对各种结构蛋白的抗体成分的出现时间不同，而N蛋白抗体出现较早，最早于感染后一周即可检出N蛋白抗体，且N蛋白抗体维持时间较长，其下降速度也明显慢于M和GP5抗体。因此，N蛋白可作为诊断抗原用于PRRS的抗体检测。国内外学者利用此原理对ORF7基因进行了原核高效表达，以达到诊断应用的要求。夏平安等将N蛋白基因亚克隆到原核表达载体p ET-32a中，构建了重组表达质粒p ET-N，用Western blotting分析纯化后的融合蛋白，结果显示出良好的生物学活性;再利用纯化融合蛋白作包被抗原，同时优化ELISA反应条件，建立了可检测抗PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法(N-ELISA)，并将所建立的N-ELISA与国外进口的PRRS检测试剂盒IDEXX-ELISA同时对200份临床送检血清进行平行检测，结果阳性符合率为92.7%，表明本试验建立的N-ELISA与IDEXX-ELISA具有同样高的特异性。
3 结语
目前国内外的研究显示原核表达系统能高效表达PRRSV的主要结构蛋白，并经体外试验检测，所表达的蛋白抗原具有很好的免疫原性，这对开发研制新型的高效免疫疫苗及诊断方法具有重要意义。
摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的持续性感染和潜在的免疫抑制现象已成为困扰当前世界养猪业健康发展的主要问题之一。目前国内外学者成功地克隆了PRRSV三种主要结构蛋白——GP5、ORF6、ORF7的基因序列,并采用原核表达载体成功地进行了表达,构建了活载体基因工程苗,经体外试验检测该重组蛋白具有良好的生物活性。
关键词：原核表达,活载体疫苗,猪繁殖与呼吸综合征病毒
参考文献
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载体蛋白 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂与设备
PGLV/H1/GFP vector、p Helper 1.0、p Helper 2.0、Lentivirus-NC病毒液、质粒中量抽提试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司;ds DNA oligo由上海吉玛制药技术有限公司合成;Bam HⅠ和Eco RⅠ购自NEB公司;DNA纯化试剂盒、r Taq DNA聚合酶购自Ta Ka Ra公司;Trizol、Lipofectamine 2000购自Invitrogen;Trypsin-EDTA购自Gibco;MMLV Reverse Transcriptase购自Promega;Real-time PCR引物由上海吉玛制药技术有限公司合成;一抗FLG购自Convance。
1.1.2 细胞株及培养
人HACAT细胞为山东大学附属济南市中心医院中心实验室所储存。
1.2 方法
1.2.1 针对基因FLG的慢病毒载体构建
设计针对FLG基因m RNA序列 (NM-002016.1) 的4个干扰靶序列, 编号为721 (GTTGGCTCAAGCATATTATT T) 、722 (CACCACTGATAGTCTATTATT) 、723 (CCAC GAGCAATCGGTAAATTT) 和724 (GTCCCATCAAGA AGATAGATT) 。使用Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切使PGLV/H1/GFP载体线性化, T4 DNA连接酶22℃连接1 h, 转化至JM 109感受态细胞。挑取重组阳性克隆测序鉴定。
1.2.2 慢病毒包装及滴度测定
吸取高纯度无内毒素抽提制备好的重组病毒质粒PGLV/H1/GFP-sh FLG (20μg) , 根据Invitrogen公司Lipofectamine 2 000的使用说明书将辅助质粒p Helper 1.0 (15μg) 与p Helper 2.0 (10μg) 一起转染293T细胞。转染后8 h更换为完全培养基, 于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48 h后收集富含慢病毒颗粒的上清, 浓缩纯化后得到高滴度的慢病毒, 分装病毒浓缩液-80℃长期保存, 取其中一支按以下步骤进行病毒生物学滴度测定。用逐孔稀释滴度测定法和PCR测定其病毒滴度 (TU/m L) 。
1.2.3 重组慢病毒感染HACAT细胞
HACAT细胞以10×105个/孔的浓度接种6孔板, 慢病毒原液200μL, 用10%FBS的DMEM培养液5倍稀释。每孔加入上述1 m L稀释的病毒液, 同时利用LentivirusNC病毒液设立空白对照组培养24 h, 吸弃6孔板中的稀释病毒液每孔加入1.5 m L 10%FBS的DMEM培养液继续培养, 荧光显微镜下观察GFP表达判断转染效率 (效率约70%以上) , 72 h及96 h后分别收样, 所得细胞用于Real-time PCR检测。实验分组:B组 (Blank) 为未感染任何病毒的细胞组;NC组 (Negative control) 为加阴性对照病毒的细胞组;721、722、723和724组为加不同RNA干扰靶点病毒感染的细胞组。
1.2.4 RT-PCR
各组细胞用Trizol试剂抽提总RNA, 在MMLV逆转录酶作用下合成c DNA第一条链, RT-PCR检测干扰后和阴性对照FLG的表达差异。GAPDH上游引物为CATGAGAAGTATGACAAC AGCCT, 下游引物为AGTCCTTCCACGATACCAAAG T;FLG上游引物为CACAAGATTCTGCGTATCACTC AGG, 下游引物为GCCTTTCAGTGCCCTCAGATTG。反应条件:95℃3 min变性;95℃30 s, 62℃40 s, 共40个循环。以GAPDH基因作为内参, 对各病毒感染后FLG m RNA含量结果进行处理, 并计算其与阴性对照中FLG m RNA的比例。
1.2.5 Western blotting
收集感染病毒72 h和96 h后的HACAT细胞, 加入裂解液进行蛋白的抽提, BCA法蛋白的定量。每个样品抽取20μL凝胶电泳, 经转膜, 封闭一抗, 4℃过夜, 二抗孵育2 h, 洗膜, ECL发光, 胶片曝光、显影定影后, 使用Gel-Pro Analyzer软件分析处理。
2 结果
2.1 慢病毒表达载体PGLV/H1/GFP-sh FLG的构建与鉴定
每个连接反应挑取5个菌落, 接种到含50μg/m L氨苄青霉素的LB培养集中, 摇出的菌液随机挑2个送去测序, 测序正确的菌株采用高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提, 所得质粒可以用于常规的分子生物学实验和细胞学实验。
2.2 慢病毒载体的包装及滴度测定
3种质粒共转染293T细胞, 通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞, 并结合稀释倍数计算病毒滴度。经测定慢病毒浓缩后的滴度为108 IU/m L。见图1。
2.3 慢病毒感染HACAT细胞
PGLV/H1/GFP-sh FLG MOI值50时干扰HACAT细胞, 于转染72 h后观察绿色荧光的表达, 感染效率达到80%。见图2。
2.4 Real-time PCR检测有效片段筛选
病毒感染HACAT细胞后, 通过RT-PCR检测转染72 h后FLG基因表达。采用定量数值及分析 (2-△△CT分析法) , RT-PCR检测结果显示, 相对于B组及NC组, 721、722、723及724均匀不同的沉默率分别为91%、77%、97%及33%, 其中721和723基因敲除率均超过90%以上, 均为非常理想的片段。见图3。
2.5 Western blotting检测有效干扰片段的筛选
结果显示721及723的沉默率达到87.5%与83.8%, 与RT-PCR结果相符合。见图4、5。
3 讨论
丝聚合蛋白 (filaggrin, FLG) 是哺乳动物表皮细胞分化终末阶段产生的一种阳离子蛋白, 1993年由SIMON等[7,8]首先成功通过人表皮分离并部分纯化, 它与角蛋白等相互作用, 构成真核细胞骨架。人类丝聚合蛋白的编码基因FLG位于1q21, 包含3个外显子。丝聚合蛋白是皮肤表皮角质层的角质包膜 (CE) 的一个重要的组成蛋白, CE是形成表皮机械性防御屏障的基础, 因此filagghn表达的缺失和减少和皮肤干燥有关[9,10,11]。
RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 技术是抑制基因表达的常用手段, 又叫基因沉默。RNA干扰的原理是当细胞中导入与内源性m RNA编码区同源的双链RNA时, 该m RNA发生降解而导致基因表达沉默[12,13]。目前基因治疗的载体主要有非病毒载体及病毒载体, 然而非病毒载体无法满足长时间的表达, 这一缺陷无疑被病毒载体填补。近年来慢病毒介导的RNA干扰技术在研究中已经取得了良好的开端[14,15]。本实验选用的第3代复制缺陷型慢病毒载体是自杀性病毒, 可以在体内较长时间表达且安全性高, 能很好地解决RNA干扰技术基因治疗的靶向性、安全性、整合效率等问题。因此慢病毒载体介导的RNA干扰效应在靶细胞内长期存在, 可为更好发挥干扰作用创造条件。
针对FLG靶基因本研究根据在线原则设计出4个有效干扰序列, 通过重组的慢病毒干扰载体系统构建包装获得PGLV/H1/GFP-sh FLG, 通过检测靶细胞中FLG基因m RNA表达水平, 筛选出最有效干扰片段, 不仅克服非病毒载体的低转染效率, 也避免了重组腺病毒产生的免疫原性, 表达时间较短等缺点, 这种重组的慢病毒载体是“自杀性”病毒, 比较安全, 能整合到宿主的基因组中并稳定表达, 不会导致插入失活, 使得干扰作用更加持续, 具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点, 为有关FLG基因的进一步研究奠定良好的实验基础, 并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
摘要：目的 构建丝聚合蛋白 (FLG) 基因RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 慢病毒表达载体。方法 设计针对人FLG基因的mRNA干扰靶序列, 合成相应双链DNA, 通过BamH I和EcoRI酶切后的PGLV/H1/GFP载体连接产生shRNA载体, 并与pHelper 1.0、pHelper 2.0两种载体共转染293T细胞培养, 获得重组慢病毒载体后, 转染目的细胞, 实现针对FLG基因的RNA干扰。结果 经鉴定该实验的慢病毒载体, 对人正常皮肤细胞HACAT干扰效果达75%95%, 以RNAi3的沉默效应最佳。结论 重组的慢病毒载体为有关FLG基因的进一步研究奠定良好实验基础, 并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
载体蛋白 篇8
胰蛋白酶抑制剂( Trypsin inhibitor) 是一类分子量较小的天然多肽,能够特异性地抑制胰蛋白酶( 或糜蛋白酶) 的活性。胰蛋白酶抑制剂的抑制中心突出于抑制剂三维结构的表面,可以与靶酶的活性中心形成氢键,结合成稳定的复合物,从而导致靶酶活性中心闭锁,使靶酶失活［1 － 3］。Kunitz蛋白酶抑制剂是植物中存在较为广泛的一类胰蛋白酶抑制剂, 由1条或2条肽链组成,分子量在20 k Da左右,立体结构主要由 β - 折叠与Loop结构组成［4 － 5］。
Kunitz蛋白酶抑制剂与植物抗御微生物、病虫害的能力息息相关,通过转基因技术,将外源Kunitz蛋白酶抑制剂基因导入烟草等植物,能够明显提高转基因植物的抗性［6］。尽管,已从大豆、山合欢、菠菜与苦荞等多种植物中分离得到Kunitz蛋白酶抑制剂［7 － 12］,然而,由于Kunitz蛋白抑制剂氨基酸序列同源性较低( 只有30% ~ 46% ) ,这为基因的克隆带来了较大困难［4］。目前NCBI中Kunitz蛋白酶抑制剂的基因序列远远少于氨基酸序列,极大程度限制了Kunitz蛋白酶抑制剂的应用。因此,获得重复的Kunitz蛋白酶抑制剂基因序列,并展开功能研究是当前有关Kunitz蛋白酶抑制剂研究的热点。
决明子为豆科植物决明( Cassia obtusifolia) 的干燥成熟种子,为传统中药材,在我国有着悠久的药食两用历史［13 － 15］。作者课题组前期研究已发现决明中含有一种胰蛋白酶抑制剂,其对菜青虫消化酶有较强的抑制活性。近期［16］,我们已利用RACE方法从决明种子中获得决明Kunitz蛋白酶抑制剂( Cas- sia obtusifolia trypsin inhibitor,COTI) 的5' 端和3' 端的c DNA序列,并利用DNAMAN软件拼接得到全长序列( Gen Bank number KM670436) 。为了鉴定COTI重组蛋白的功能,需要首先构建重组载体,因此,本文从决明种子中提取决明Kunitz蛋白酶抑制剂的总RNA,并根据COTI的转录组数据,设计引物,通过RT - PCR得到COTI全长c DNA,构建原核表达载体,这为研究COTI的功能和转基因植株的构建奠定了基础。
1材料与方法
1. 1实验材料
1. 1. 1材料
成熟决明种子( Cassia obtusifolia) 购买于成都市中药公司。将种子种植于含有土壤混合物的花盆中,25℃下16 h光照和8 h黑暗交替培养。收集开花30 d的决明种子作为RNA的提取材料。感受态DH5α、表达载体p ET - 28a( + ) 由作者实验室保存。
1. 1. 2试剂
Ex - Taq DNA聚合酶、d NTP、AMV反转录酶、T载体p MD19、RNAase Inhibitor、核苷酸末端转移酶( Td T) 、氨苄青霉素、限制性内切酶、DNA - T4连接酶、DNA分子量标准DL - 2000均由大连宝生物工程公司提供; 胰蛋白胨和酵母提取物为OXIAID产品; 琼脂糖和琼脂粉为Amersham产品; 其余试剂为国产分析纯。
1. 1. 3仪器
台式高速冷冻离心机( TGL - 16K,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司) ; 电泳仪( DYY - 4C,北京市六一仪器厂) ; 培养箱( DHG303 - 0,上虞市沪越仪器设备厂) ; 微波炉( P70D20P - TF( W0) ,格兰仕微波生活电器有限公司) ; PCR仪( Sure Cycler 8800, 安捷伦科技公司上海分公司) ; 分析天平( FA2104A, 上海精天电子仪器有限公司) 。
1. 1. 4培养基
用到的培养基有LB培养基和加Amp( 氨苄青霉素) 的LB培养基［17］。
1. 2方法
1. 2. 1引物设计与合成
用Primer Premier 6. 0引物设计软件,根据COTI的全长序列设计一对酶切引物,上游引物加EcoRⅠ 酶切位点,下游引物加XhoⅠ酶切位点( 下划线碱基为酶切位点) 。这对引物理论跨幅包括COTI的开放阅读框序列630 bp,由成都擎科梓熙生物技术公司合成。
上游引物: 5' - CCGGAATTCATG AAG ACT ACC ACT CCC TTA - 3'
下游引物: 5' - CGGCTCGAGTCA CAC CAC CAT GGA TAGATT - 3'
1. 2. 2决明种子总RNA的提取
将决明种子放入研钵中,加液氮研磨。决明种子总RNA用OMEGA公司的植物RNA提取试剂盒提取,其完整性用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 3决明COTI基因c DNA的合成
以决明种子总RNA为模板,以Oligd( T)18AP: 5' - GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACA GTG - 3' ( T )18为特异引物,采用Reverse Tran- scriptase XL( AMV) 进行逆转录,20 μL反应体系如下: RNA 11 μL,5 × buffer 4 μL,10mmol/L d NTP 2 μL,RNase抑制剂20 U,Oligo( d T)18AP 50 pmol / L, AMV RTase 10 U。70℃ 反应10 min,42 ℃ 保温1 h, 70℃ 反应15min,冰上冷却10 min以上,所得的c D- NA保存在- 20 ℃ ,备用。
1. 2. 4 RT - PCR体外扩增目的片段
以COTI基因c DNA为模板,PCR扩增出COTI的开放阅读框序列。
PCR反应体系是: 50 μg / μL DNA模板2. 5 μL, 10 × PCR buffer 2. 5 μL,25 mmol / L Mg Cl21. 5 μL,10 μmol /L引物各1. 0 μL,2. 5 mmol /L d NTPs 2. 0 μL, 5 U / μL Taq聚合酶0. 2 μL,加dd H2O 16. 8 μL。
PCR反应条件为: 94℃ 预变性4 min,94℃ 变性30 s,66℃ 退火30 s,72℃ 延伸90 s,循环35次。
1. 2. 5 PCR产物的克隆与测序
将经1% 的琼脂糖凝胶电泳纯化产物与p MD19 - T载体16℃ 连接过夜,连接体系为: solutionⅠ5 μL ,回收的DNA片段4. 5 μL,PMD19 - T载体0. 5 μL。 将连接液转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中,取100 μL涂于加有氨苄青霉素的LB培养基上,培养12 h。提取质粒,然后PCR和双酶切鉴定,将鉴定结果正确的质粒,送由成都擎科梓熙生物技术公司测序。
1. 2. 6 COTI原核表达载体的制备
提取p ET - 28a ( + ) 质粒,具体步骤按照Bio Te Ke公司的质粒小量制备试剂盒说明书进行。 将含有目的片段的p MD19 - T载体和p ET - 28a ( + ) 质粒同时用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,分别用1% 琼脂糖凝胶电泳纯化后,用T4 DNA连接酶16℃ 过夜连接,构建重组质粒p ET - 28a( + ) /COTI。将该重组质粒转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞中, 取100 μL涂于加有卡那霉素的LB固体培养基上, 培养12 h。挑单克隆于1 m L含50 mg /m L卡那霉素的LB液体培养基上,37 ℃振荡培养12 h,经PCR和双酶切鉴定正确后测序。
2结果与分析
2. 1决明总RNA的鉴定
通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量,28S核糖体RNA和18S核糖体RNA条带明亮而且清晰, 且28S核糖体RNA和18S核糖体RNA的亮度比呈2∶ 1,说明RNA较完整,可用于后面的试验,见图1。
2. 2 COTI基因的克隆
以决明种子总RNA为模板逆转录合成c DNA第一链,利用RT - PCR扩增得到约630 bp大小的片段,该片段与预期的大小一致( 图2) 。测序结果表明,该DNA片段与目标序列KM670436,一致性为100% ,表明我们已成功克隆得到COTI基因的全长c DNA序列。COTI基因全长为630 bp,含有一个完整的开放阅读框,编码一条含有209个氨基酸的肽链。COTI的抑制中心主要由L84 - V85 - R86 - P87 - T88等5个氨基酸残基组成( 请见图3中下划线残基) ,其中R86为P1残基,推测该残基能与胰蛋白酶的活性Asp残基形成氢键,从而抑制胰蛋白酶的活性。另外,在COTI上发现4个较为保守的Cys ( 64、108、156、164) 残基( 请见图3中加粗残基) ,有可能形成两个二硫键,维持COTI高级结构的稳定性( 图3) 。Blast分析发现,COTI与印加豆( Inga lauri- na) 、大豆( Glycine max ) 、洋紫荆( Bauhinia varie- gate) 、野生大豆( Glycine soja) 等植物的Kunitz蛋白酶抑制剂的同源性分别为46% 、38% 、38% 、37% ,表明其属于Kunitz蛋白酶抑制剂。
图 1 决明总 ＲNA 琼脂糖凝胶电泳注: M: DNA marker; 1: 总 ＲNA。Figure 1 Agarose gel electrophoresis of thetotal ＲNA of C． obtusifolia seedsNote: M: DNA marker; 1: Total ＲNA．
图 2 COTI 的 PCＲ 扩增结果注: M: DNA marker; 1: COTI 的 PCＲ 扩增产物。Figure 2 PCＲ of COTINote: M: DNA marker; 1: PCＲ of COTI．
图 4 重组质粒双酶切鉴定注: M: DNA marker; 1: 重组质粒双酶切。Figure 4 Dual － digestion of p ET28a( + ) － COTINote: M: DNA marker; 1: Dual － digestion of p ET28a( + ) － COTI．
2. 3重组质粒的构建与鉴定
将连接在PMD19 - T载体上的COTI与p ET - 28a( + ) 分别经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后构建的重组质粒,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,然后用1% 的琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示电泳出现两条带,其中一条为表达载体p ET - 28a( + ) ,约5 500 bp,另一条带为所克隆的COTI片段,约630 bp( 图4) 。同时,提取质粒经PCR检测,得到约630 bp大小的片段,与COTI片段大小一致( 图5) 。
测序结果表明,该转化菌的质粒中确实含有630 bp的目的基因,且读码框正确,重组质粒p ET - 28a( + ) / COTI构建成功。
图 5 重组质粒 PCＲ注: M: DNA marker; 1: 重组质粒 PCＲ 产物。Figure 5 PCＲ of p ET28a( + ) － COTINote: M: DNA marker; 1: PCＲ of p ET28a( + ) － COTI．
3讨论
Maria Luiza V. Oliva等［18］根据肽链组成与半胱氨酸数目将植物Kunitz蛋白酶抑制剂分为了6个亚类,其中豆科含羞草亚科植物所含的Kunitz蛋白酶抑制剂主要为第二亚类( 2条肽链,4个半胱氨酸) 。 蝶形花亚科与云实亚科植物所含的Kunitz蛋白酶抑制剂则分属于多个亚类。由于COTI、大豆Kunitz蛋白酶抑制剂、洋紫荆Kunitz蛋白酶抑制剂与野生大豆Kunitz蛋白酶抑制剂均由一条肽链组成,并含有4个半胱氨酸,因此它们属于第一亚类( 1条肽链,4个半胱氨酸) 。但是,与COTI同源性最高的印加豆Kunitz蛋白酶抑制剂却属于第四亚类( 1条肽链,2个半胱氨酸) ,表明Kunitz蛋白酶抑制剂结构的多样性。
除了在植物抗虫防御过程中发挥作用,Kunitz蛋白酶抑制剂也是食品、药物领域研发的重点对象之一。Vinayak R Tripathi［19］等对Cassia tora中的CTTI研究发现,CTTI能够抑制黄曲霉( Aspergillus flavus) 的萌发与生长。Kunitz蛋白酶抑制剂还通过对凝血因子的抑制作用,参与凝血过程的调控［20］。 Sumikawa J T等［21］发现Bauhinia rufa胰蛋白酶抑制剂分子中的RGD序列与该抑制剂的抗肿瘤活性密切相关,我们也发现COTI分子中也含有RGD序列( 见图3中下划线) ,推测COTI可能也具有抗肿瘤活性,这有待进一步研究。由于Kunitz蛋白酶抑制剂广泛的应用前景与重要的功能,对于该家族成员的研究日益受到关注,有关该抑制剂家族成员的功能鉴定已经成为该领域在国际上研究的热点。
本文从决明子中成功分离了COTI基因,并将COTI基因克隆到原核表达载体p ET - 28a ( + ) 中, 成功构建了重组质粒p ET - 28a ( + ) /COTI,经PCR、双酶切鉴定及测序分析,表明该重组质粒含有目的基因片段,且构建正确,为开展COTI的抗虫性功能研究奠定了基础。
摘要：[目的]克隆决明胰蛋白酶抑制剂全长cDNA序列,并构建原核表达载体。[方法]从决明种子中提取胰蛋白酶抑制剂总RNA,通过RT-PCR得到胰蛋白酶抑制剂cDNA,纯化后与PMD19-T载体连接,转化至大肠杆菌DH5α,获得了决明胰蛋白酶抑制剂基因的全长序列,并将该序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)/COTI。[结果]决明胰蛋白酶抑制剂基因核苷酸长度为630bp,编码一条长度为209个氨基酸的多肽。决明胰蛋白酶抑制剂与不同植物来源的Kunitz蛋白酶抑制剂有高度的同源性,表明其属于Kunitz蛋白酶抑制剂家族成员。所获重组质粒pET-28a(+)/COTI经过双酶切鉴定,其含有目的片段,且重组质粒构建正确。[结论]克隆了决明胰蛋白酶抑制剂的全长cDNA序列,并成功构建了含有该基因的原核表达载体,这为该基因的进一步表达及功能鉴定奠定了基础。
载体蛋白 篇9
近年来, 人们越来越重视卵母细胞发育成熟的分子调控, 相继在脊椎和部分无脊椎动物中开展了研究, 如哺乳类[1]、两栖类[2,3,4]、鱼类[5,6,7,8]及海星[9]。经研究发现, 卵母细胞的发育与成熟需要细胞内各信号通路的协同调控, 其中Mos/MAP通路与plx1/cdc25/cyclin B-P34cdc2通路是孕酮诱导下启动卵母细胞成熟的中心环节, 且细胞周期蛋白B (Cyclin B) 及其相关调控蛋白cdc25等起了关键性的作用[10]。
Cyclin B又称周期素B, 在G2期或G2/M转变期发挥着重要的作用。催化亚基P34cdc2和Cyclin B结合, 组成物种间高度保守的刺激因子MPF (cyclin B-P34cdc2) , 在卵母细胞减数分裂过程中起中心调控作用。在甲壳动物中, 对于卵巢发育的分子调控机理尤其是卵母细胞成熟的分子调控机制还知之甚少。目前也仅限于Cyclin B基因克隆及mR-NA水平表达的研究, 如斑马纹贻贝 (Dreissena polymorpha) [11]、中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) [12]、日本囊对虾 (Marsupenaeus japonicus) [13]、斑节对虾[14,15]等。因此, 对于Cyclin B在甲壳动物卵巢发育中调控卵母细胞成熟的作用机制还有待深入研究。研究发现, Cyclin B基因存在多个亚型, 且不同亚型在卵巢发育过程中发挥不同作用[16,17,18,19,20,21]。已报道的斑节对虾Cycling B[14,15]基因与人类的细胞周期蛋白B1 (Cyclin B1) 具有较高的同源性, 达到60%。Cyclin B1为有丝分裂期 (M期) 细胞周期蛋白, 是成熟促进因子 (maturation promoting factor, MPF) 的调节亚单位, 含有一段约100个氨基酸的保守序列, 介导其与MPF的催化亚单位———细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinase, CDK1) 结合, CDK1只有与Cyclin B1结合才具有激酶的活性, CDK1/Cyclin B1即MPF在G晚期积聚, 其生物学功能为启动真核细胞有丝分裂[22]。因此, 文章拟通过构建含有PmCy B基因的重组慢病毒载体, 研究其对干扰了Cyclin B1基因的人类Hela细胞增殖影响, 为斑节对虾卵巢发育的分子调控机理提供一定的基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
Xba I和Bst BI等内切酶购置于NEB公司;Kod plus、T4 ligase以及DNA Marker均购置于takara;质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒购置于天根;293T细胞和Hela细胞购置于ATCC;lipeofectamine-2000、无血清DMEM培养基和细胞总RNA提取和RT-PCR试剂盒购置于英俊公司;MTT和DMSO均购置于sigma;慢病毒表达载体质粒p EGH及慢病毒包装复合物购置于思路迪生物技术有限公司;人类 (Homo sapiens) Cyclin B1 siRNA (Mir1-4 siRNA) 及阴性对照siRNA (NC siRNA) 序列由上海生物工程公司设计并合成, 其中NC siRNA合成时含有红色荧光标记。Mir1 siRNA正义链序列为5'-TAACAAAGTCAGTGAACAA-3', Mir2 siR-NA正义链序列为5'-GGATAATGGTGAATGGACA-3', Mir3 siRNA正义链序列为5'-AGAATGTAGT-CATGGTAAA-3', Mir4 siRNA正义链序列为5'-GT-GAACAACTGCAGGCCAA-3', NC siRNA正义链序列为5'-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。
1.2 方法
1.2.1 p3D-LV-OE-018EGH-Cop GFP-Pm Cy B慢病毒质粒的构建及鉴定
根据Gen Bank中斑节对虾Cyclin B的mRNA序列 (EF015589) , 以斑节对虾未成熟卵巢c DNA为模版, 用PCR法扩增获得Pm Cy B基因。对扩增出的Pm Cy B和p3D-LV-OE-018EGH-Cop GFP用Xba I, Bst BI进行双酶切, 胶回收、连接并转化到感受态细菌中。挑选阳性克隆送英俊公司进行测序。
1.2.2 慢病毒包装
把构建好的慢病毒表达载体与慢病毒包装复合物质粒共转染293T细胞。转染前一天胰酶消化处于对数生长期生长状态良好的293T细胞, 以合适比例接种至若干个100 mm细胞培养皿内。细胞接种24 h后按lipeofectamine-2000的说明书进行转染操作, 把慢病毒表达质粒及慢病毒包装复合物共转染到293T细胞中。48 h后收取上清病毒液, 再加细胞培养液培养24 h后收取上清病毒液。纯化后测定病毒滴度 (根据GFP荧光表达情况, 病毒滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量) 。
1.2.3 重组慢病毒感染目的细胞
胰酶消化处于对数生长期生长状态良好的Hela细胞, 以合适比例接种至96孔细胞培养板中进行培养, 37℃, 5%二氧化碳 (CO2) 。细胞接种24 h后分别用4个干扰组Mir1-4siRNA和对照组NC siRNA分别转染Hela细胞, 沉默Cyclin B1基因。4 h后荧光显微镜下观察, 是否转染入Hela细胞, 换液。细胞转染24 h后取样, 利用RT-PCR检测干扰效果。同时在4个试验组和对照组分别感染上述收集的含Pm Cy B基因病毒液及阴性对照病毒液, 每孔加100μL病毒粗液。感染后24 h, 换液。培养72 h后进行四甲基偶氮唑盐比色法 (MTT法) 检测细胞浓度。
1.2.4 统计学分析
应用SPSS 13.0统计软件处理数据, 两样本率的比较采用χ2检验, 组间差异比较用方差分析, P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Pm Cy B重组慢病毒表达载体的构建与鉴定
将PCR扩增获得的Pm Cy B基因和p3D-LV-OE-018EGH-Cop GFP载体酶切、连接、转化, 挑克隆进行PCR鉴定。PCR鉴定阳性克隆再用Xba I, Bst BI进行双酶切鉴定, 酶切鉴定阳性者可在2 000bp处见一特异条带 (图1) 。此外, PCR鉴定阳性克隆送测序, 测序结果显示Pm Cy B基因序列与Gen Bank中序列一致, 无缺失或突变。以上结果表明, p3D-LV-OE-018EGH-Cop GFP-Pm Cy B慢病毒表达载体构建成功。
2.2 重组慢病毒p3D-LV-OE-018EGH-Cop GFP-Pm Cy B的包装
把构建好的慢病毒表达载体与慢病毒包装复合物质粒共转染293T细胞, 转染24h后倒置荧光显微镜观察培养细胞可见大量的绿色荧光蛋白的表达 (图2) , 转染效率将近100%。收集并浓缩病毒液, 得到含有Pm Cy B基因的病毒液和空白对照病毒液。
2.3 对照组NC siRNA检测Cyclin B1 siRNA转染Hela细胞效果
对照组NC siRNA转染进入细胞24 h后, 荧光镜检Hela细胞可见散在分布于细胞中的颗粒状红色荧光, 证实siRNA成功转染了Hela细胞 (图3) 。
2.4 Cyclin B1 siRNA对Hela细胞其mRNA表达水平的影响
4个干扰组Mir1-4siRNA和对照组NC siRNA分别转染Hela细胞24 h后, 经实时荧光定量PCR检测发现4个干扰组的Hela细胞Cyclin B1 mRNA表达量与阴性对照组之间差异显著 (P<0.05) (图4) , 结果表明4个干扰组的Hela细胞Cyclin B1的表达显著下调。
*.差异显著 (P<0.05) ;后图同此*.significant difference (P<0.05) ;the same case in the following figures.
2.5 Pm Cy B基因对干扰了内源Cyclin B1的Hela细胞增殖的影响
转染了Mir1-4siRNA以及NC siRNA的4个干扰组和1个对照组Hela细胞24 h后, 再把含PmCy B基因的慢病毒液和对照组病毒液分别感染4个干扰组和对照组Hela细胞。24 h后荧光镜检Hela细胞, 显示绿色荧光, 表明慢病毒液成功感染了Hela细胞 (图5, 图6) 。转染病毒液72 h后用MTT比色法检测Hela细胞增殖情况, 结果显示感染了含有Pm Cy B基因慢毒液的4个干扰组的Hela细胞增殖速度虽然略低于NC对照组的细胞, 但显著高于转染了对照病毒液的4个干扰组的细胞增殖速度 (表1, 表2, 图7) 。
3 讨论
病毒载体比非病毒载体转染效率高, 是应用最为普遍的基因转移工具[23,24,25,26]。目前可供利用的病毒可分为逆转录病毒、慢病毒与腺病毒。与其他病毒载体相比, 慢病毒载体最大的特点就是强大的穿透性[27]。慢病毒属于逆转录病毒, 可将其携带的外源基因高效整合到宿主细胞中, 且外源基因可在细胞内长期稳定表达。文章成功构建了Pm Cy B慢病毒表达载体, 即p3D-LV-OE-018EGH-Cop GFP-Pm Cy B。该载体含有GFP报告基因, 具有很强的实用性, 同时GFP报告基因以加强型真核启动子h EF1-HTLV启动子启动, 其表达效率高, 观察结果方便快捷, 为后续研究, 尤其是为研究Pm Cy B基因过表达对斑节对虾卵巢发育分子调控的作用机理研究奠定基础。
