PD-1

关键词： 肿瘤学 肿瘤发生 肿瘤 治疗

PD-1（精选四篇）

PD-1 篇1

1 T细胞的抗肿瘤免疫作用

CD4+Th细胞能激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL),其在抗肿瘤中起到重要作用。CTL主要功能是特异性直接杀伤肿瘤细胞。CD4+Tregs细胞对CTL(CD8+T细胞)具有免疫抑制作用,而CD8+T细胞具有肿瘤免疫监视、杀伤癌细胞和免疫记忆功能。人类CTL特征表型中CD8+T细胞可直接作为效应细胞特异地杀伤肿瘤细胞。恶性肿瘤常导致机体内环境失衡免疫功能紊乱,CD3+、CD4+T淋巴细胞含量明显低于正常人,CD3+/CD8+T淋巴细胞比例上升,CD4+/CD8+比值下降[15,16],肿瘤细胞生长及进展加速。CD8+属抑制性淋巴T细胞,其含量越少机体免疫力越低。研究显示在一些肿瘤中CD8+T淋巴细胞不同程度地表达PD-1,且与临床肿瘤分期、转移相关。PD-1通过与肿瘤细胞表面的配体结合,抑制CD8+T细胞的肿瘤免疫应答,介导肿瘤免疫逃逸在肿瘤发生发展中起作用[17,18,19]。

2 PD-1/PD-L1信号通路及其免疫抑制作用

完整的免疫系统可通过免疫检查来识别和消除肿瘤细胞,但肿瘤却可适应及逃避这些防御机制[20,21,22,23]。PD-1最初在凋亡T细胞杂交瘤中发现[24],PD-1在外周组织中可调节效应T细胞对肿瘤侵袭的效应[25]。PD-L1表达在抗原提呈细胞表面,研究发现在一些肿瘤细胞中高表达[26,27,28]。肿瘤微环境中肿瘤细胞的浸润抑制机体的抗肿瘤免疫效应,其中Treg T细胞与耐受性DCs可能与肿瘤的不良愈后相关[29]。表达于Treg的PD-1可促进Treg细胞的增殖,从而抑制免疫应答[26]。肿瘤细胞高/过表达的PD-1配体,可导致T细胞功能减弱、失能甚至死亡。研究显示,肿瘤相关PD-L1与肿瘤微环境中的TILs耗竭相关,使用抗PD-1或抗PD-L1抗体可以通过抑制Treg细胞及调节耐受性DCs增强效应性CD8+T细胞抗肿瘤效应[29]。Zhang等[17]从21例NSCLC患者中证实在肿瘤组织中CD8+T细胞PD-1的表达远高于外周血单核淋巴细胞(PBMC)中CD8+T细胞PD-1的表达,且无论PBMC中的CD8+T细胞来源于健康人还是肿瘤患者(P<0.01)。并发现对同一患者,其肿瘤组织中CD8+T细胞PD-1的表达也远高于PBMC中CD8+T细胞的表达(P<0.01)。针对PD-1信号通路的药物起到抗肿瘤作用尤其是PD-L1高表达的肿瘤,也与愈后不良相关[31,32,33]。

3 免疫检查点抑制剂抗PD-1、PD-L1抗体与免疫治疗

免疫检查点控制共抑和共刺激信号平衡的作用可调节T细胞应答持续时间和幅值。肿瘤可能采用免疫检查点导致肿瘤不平衡增长及逃避宿主监控。研究证实:PD-1在乳腺癌和黑色素瘤的高表达与肿瘤的分级、大小、淋巴结状态及转移相关[19,30]。PD-L1与黑色素瘤、NSCLS、肾癌的预后、复发相关[34]。现通过针对PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂恢复肿瘤的再平衡与宿主免疫监控来治疗一些肿瘤[35]。

3.1 抗PD-1抗体

Nivolumab(BMS-936558,MDX-1106,ONO-4538)是全人源化免疫球蛋白G4、抗PD-1抗体。2014年美国FDA已批准Nivolumab用于治疗不可切除的或ipilimumab治疗后进展的或BRAF V600突变阳性用BRAF抑制剂治疗后进展的黑色素瘤患者[36]。针对BRAF V600突变的肿瘤患者,Topalian等[26]设计的Ⅰ期试验,共107名患者使用剂量在0.1~10 mg/kg的Nivolumab,每两周一次,共96周。结果显示107名患者中使用17个月后34名患者达32%CR,1年和2年生存率分别为62%和43%。2015年FDA批准Nivolumab用于以铂类为基础化疗后进展的转移性非鳞状NSCLC[1638828]。

Pembrolizumab(MK-3475)是人源化免疫球蛋白G4,最早批准用于治疗晚期黑色素瘤[37]。研究显示MK-3475治疗进展期黑色素瘤和NSCLC的客观缓解率分别为38%和21%[38,39]。

3.2 抗PD-L1抗体

MPDL3280A MEDI4736 BMS-936559是人源化Ig G4抗体。PD-L1存在于肿瘤细胞质膜的细胞质中,但并不是所有的肿瘤细胞都表达PD-L1[40,41]。研究显示,预处理PD-L1直接表达在肿瘤活组织检查采用相应的抗PD-L1治疗,对于一些PD-L1阴性的肿瘤治疗效果不明显[42,43,44]。

各种不同临床试验阶段免疫检查点抑制剂结果之间的差异可能在于抗体亲和力。应注意的是PD-1、PD-L1阻滞剂仅在高表达PD-1及PD-L1的患者中有效。Brahmer等[45]评估BMS-936558在恶性肿瘤I期临床试验的有效性结果示25例肿瘤患者中9例表现出强烈反应[45],而53例中17例PD-L1阴性患者对阻滞剂无反应[46,47]。这表明PD-L1表达可以作为肿瘤患者进一步分层的一个潜在生物标志物并预测抗PD-L1免疫治疗的疗效。

4 小结

PD-1 篇2

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013-09~2014-11间就诊于贵州医科大学附属医院口腔黏膜病专科门诊,经临床表现和病理特征确诊的36例(男16例,女20例)OLP患者,年龄为12~76岁,平均年龄46.4岁;其中非糜烂型20例和充血糜烂型16例。均排除了患有其它口腔黏膜病、感染过敏性疾病、糖尿病等全身系统疾病;均排除1月内使用过抗生素和3月内使用免疫调节剂的情况。对照组18例来自于健康志愿者,其年龄、性别均与OLP组相匹配。本研究经贵阳医学院伦理委员会审议批准,并获得所有实验者的知情同意。

1.2 主要试剂

6色TBNK检测试剂盒购自美国BD公司,人外周血单个核细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技公司,Trizol试剂、SYBRPremix Ex TaqTM及逆转录试剂Prime ScriptTMⅡReverse Transcriptase等均为Takara产品。q PCR引物β-actin,PD-1,PD-L1均由上海生工设计及合成(表1)。

1.3 免疫功能状况的检测

上午9点前采集OLP患者空腹状态下的外周静脉血,送往贵阳医学院附院中心实验室及微生物免疫实验室,分别采用流式细胞术分析淋巴细胞亚群的百分比(CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+、CD4+/CD8+),散射比浊法检测患者体液免疫指标(lg G、lg M、lg A、C3、C4),以实验室标准值为正常对照。

1.4 实时荧光定量PCR

上午9点前采集患者空腹状态下3 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的外周静脉血,采用Ficoll梯度离心法分离PBMCs,Trizol法提取总RNA,按照逆转录试剂盒说明书合成c DNA,-80℃保存待用。

按SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒说明书在冰上操作,配制10μl q PCR反应体系(表2),在荧光定量PCR仪(CFX96)上机并设置反应条件:预变性95℃3min;变性95℃5 s,退火/延伸60℃30 s,共40个循环。以β-actin为内参基因,每样本重复2次,扩增结束后系统软件自动生成Ct值并绘制扩增曲线融解曲线。本研究中以2-△Ct法计算目的基因相对表达量(△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因),病变组较对照组增高或降低的倍数=2-△Ct(病变组均值)/2-△Ct(对照组均值)[2]。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析,正态分布资料采用±s表示,对偏态分布的数据,经lg10转换成正态分布,用10lg±10lg S描述。用t检验和Spearman相关性分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 口腔扁平苔藓患者免疫检测结果

与正常值相比,OLP患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD16++56+(NK)百分比降低,CD19+百分比增高,差异均有统计学意义(P<0.05)(表3)。OLP患者血清中免疫球蛋白lg M较正常值增高,C3、C4较正常值降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)(表4)。

2.2 荧光定量PCR结果分析

OLP患者外周血中PD-1、PD-L1 mRNA相对表达量均高于对照组(P<0.05)(表5),OLP不同临床类型之间差异无统计学意义(P>0.05)。OLP患者外周血中PD-1、PD-L1 mRNA分别是对照组的15.47、6.54倍。Spearman相关分析显示PD-1 mRNA与PD-L1 mRNA的相对表达量呈正相关(r=0.400,P=0.04)。

(±s)

(±s)

(±s)

2.3 OLP患者外周血中PD-1、PD-L1 mRNA的表达与免疫功能的相关性

Spearman相关分析显示OLP患者PBMCs中PD-1 mRNA的相对表达量与OLP患者CD4+呈负相关(r=-0.387,P=0.035),与lg G呈正相关(r=0.406,P=0.049),PD-L1 mRNA表达水平与CD19+呈正相关(r=0.330,P=0.046)(表6)。

3 讨论

免疫细胞和细胞因子的异常表达与OLP的免疫发病机制相关[3]。我们发现OLP患者外周血中CD3+、CD4+细胞较正常值降低,CD19+细胞较正常值升高;血清中免疫球蛋白lg M、lg G含量高于正常组,与本课题组前期研究一致[1],表明OLP患者机体免疫状况存在T淋巴细胞失衡及体液免疫紊乱。研究发现可通过调节T淋巴细胞的分类比率,改善机体免疫状态来治疗口腔扁平苔藓[4]。

T细胞的活化依赖于双信号刺激,即抗原特异性信号与共刺激信号,缺乏共刺激信号将导致T细胞失能或程序性死亡。PD-1/PD-L1属于B7/CD28家族的一对负性共刺激分子,PD-1主要表达于活化的T、B细胞上;PD-L1主要表达在B细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞、活化T细胞以及实质细胞上。PD-1/PD-L1途径通过抑制初始自身反应性T细胞的扩增和向效应T细胞分化,限制自身反应性T细胞效应功能和靶器官损害,在维持外周耐受和自身免疫疾病中发挥着重要作用。PD-1及PD-L1分子参与多种人类自身免疫疾病的发生,如在干燥综合征、慢性肠炎中PD-1或PD-L1呈高表达状态[5,6];系统性红斑狼疮[7]患者代偿性上调表达PD-1分子的CD4+T细胞有衰竭迹象即效应功能和细胞增殖降低,与细胞免疫缺陷有关。

本研究显示,OLP患者PBMCs中PD-1、PD-L1mRNA的相对表达量较对照组增加(P<0.05),提示上调表达的PD-1、PD-L1 mRNA可能参与OLP的致病过程。与Zhou等[8]发现OLP患者外周血中CD3+PD-1+、CD3+PD-L1+细胞数目增多类似。OLP患者中PD-1 mRNA相对表达量与CD4+T呈负相关。当封闭PD-1或PD-L1后可提高T细胞的功能,包括增强细胞增殖及细胞因子IL-2、INF-γ的分泌[8]。OLP患者血清中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平降低,Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平增高,提示OLP患者外周血中Th1/Th2平衡向Th2漂移,与细胞免疫低下、OLP的慢性炎症形成有关[9,10]。PD-1与PD-L1结合后能显著抑制TCR关键靶基因的表达,其中PD-1/SHP-2/STAT1/T-bet信号轴介导PD-1对Th1型免疫反应的抑制作用[11],阻断PD-1/PD-L1通路后Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ显著增加,Th2型细胞因子IL-4无明显变化[12]。此外,PD-1/PD-L1途径抑制CD4+T细胞向Th1细胞分化,促进其向Th2细胞分化[13]。OLP患者外周血中上调表达的PD-1/PD-L1分子可能通过抑制Th1细胞的增殖及其功能,影响OLP患者外周血中Th1/Th2平衡、降低OLP患者的细胞免疫功能。

本研究发现OLP患者中PD-1 mRNA相对表达量与lg G水平呈正相关;PD-L1 mRNA与CD19+呈正相关(P<0.05)。CD19+的高低代表B细胞的水平。PD-1/PD-L1作为生发中心滤泡状辅助细胞(T follicular helper,TFH)和B细胞相互作用的一对分子,影响生发中心B细胞的生存、长寿型浆细胞的发育及抗体的产生[14],提示OLP患者外周血中升高的PD-1/PD-L1分子可能通过促进TFH细胞与B细胞的相互作用引起体液免疫紊乱。

综上所述,外周血中表达上调的PD-1、PD-L1mRNA与OLP患者的免疫功能状况相关,提示该通路可能参与了OLP的免疫发病机制。但PD-1/PD-L1信号途径在OLP疾病中具体的作用和机制还需进一步阐明。

摘要：目的:了解口腔扁平苔藓(OLP)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA的表达及意义。方法:分别采用流式细胞术和散射比浊法分析36例OLP患者外周血淋巴细胞亚群(CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD19~+、CD16~++56~+)状况和检测患者体液免疫指标(1gG、1gA、1gM、C3、C4)。采用荧光定量PCR法(qPCR)检测36例OLP患者及18例健康对照组PBMCs中PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA的表达情况并分析其与OLP患者免疫功能状况的相关性。结果:OLP患者外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD16~++56~+(NK)均低于正常值(P<0.05),CD19~+(B)高于正常值(P<0.05);血清补体C3、C4较正常值降低(P<0.05),免疫球蛋白1gM较正常值增高(P<0.05)。OLP患者PBMCs中PD-1 mRNA及PD-L1 mRNA的相对表达量均高于对照组(P<0.05)且PD-1 mRNA与PD-L1 mRNA的相对表达量呈正相关。PD-1 mRNA的相对表达量与OLP患者CD4~+呈负相关,与1gG呈正相关;PD-L1 mRNA的相对表达量与CD19~+呈正相关。结论:OLP患者PBMCs中PD-1、PD-L1 mRNA的表达上调与OLP患者免疫功能状况相关,提示PD-1/PD-L1通路可能参与OLP的免疫发病机制。

PD-1 篇3

PD-1抗体就是对某一个生物或者是细胞在一个特定的生理时期内全部低相对分子质量代谢产物。同时开展定性以及定量分析一门新的学科。它主要是以组群的指标分析作为基础, 以高通量的检测以及数据的处理作为主要手段, 以信息的建模以及系统的整合作为目标的系统生物学的一个分支。比较先进的分析检测技术并且结合相关模式识别以及专家体系等计算分析的方法是PD-1抗体进行研究的基础方法。PD-1抗体是继基因组学以及蛋白质组学之后发展起来的一门新的学科, 是系统生物学中的一个非常重要的组成部分。基因组学以及蛋白质组学两者分别都是从基因以及蛋白质层面探索和寻找和生命有关的活动[1,2]。而在实际当中, 细胞里面的许多生命的活动都是产生在代谢物层面上的, 比如细胞信号 (cell signaling) 的释放、细胞间通信、能量的传递等这些都是受到代谢物的调控的。PD-1抗体正是分析和研究代谢组在某一个时刻细胞里面全部的代谢物的集合的一门新学科。基因以及蛋白质两者的表达是紧密相连的, 而代谢物则是更多地反映出细胞所处的环境如何, 这又和细胞本身的营养状态、药物、环境、其他外界因素的影响有着密切的关系。所以, 有些人就认为:“基因组学以及蛋白质组学会告诉你可能会发生一些什么, 然而PD-1抗体就会告诉你真正发生了什么。”

2 PD-1抗体在黑色瘤研究中的优势

2.1 整体性

恶性黑色瘤的发生、发展是多基因调控和多因素调节的共同结果, PD-1抗体采用计算机辅助的高级统计学方法和模式识别技术, 通过对高通量试验得到的包含大量信息的代谢图谱的解析, 同步研究多种代谢物的变化, 利用大量信息的集成系统来解释黑色瘤发生、发展的时空动态性变化, 并分析其代谢途径。PD-1抗体在基因组学和蛋白质组学寻找特异性的单一生物标记物的基础上开创了寻找特异性的一组标志物群的模式, 拓展出黑色瘤诊断方法研究的新方向。

2.2 灵敏性伴随着“组学”的深入研究和分析, 许多的科学家就发现, 基因组发生的变化在蛋白水平不一定能够得到表达;虽然某一些蛋白的浓度有所升高, 但很可能不具有活性;基因或者蛋白具有补偿作用功能, 最后所反映出来的净结果很可能是零, 发生的这些变化对生物系统都不会产生什么影响。而细胞里面的许多活动全部都是在代谢层面上发生的, 内源性小分子代谢物发生的变化才是所有事件的最终结果, 也只有它才可以更加准确的反映出生物体系的状态如何。

2.3 动态性

恶性黑色瘤的发生、发展是一个具有持续性动态演变的过程, 在临床病理不同的分期, 与其对应的体液当中或细胞里面的代谢物都有发生变化。PD-1抗体可以定量地对生物体当中因为基因遗传的变异或病理的生理性刺激所引发的, 随着时间的变化而改变的代谢物开展动态的跟踪检测, 然后将这些生物学事件和代谢信息进行相关性的分析, 确定发生变化的代谢途径以及代谢的节点, 并确定与其相关的生物标志物。

2.4 通用性

在样本的采集以及处理上面, PD-1抗体和基因组学以及蛋白质组学相比, 检测的方法比较简单, 测定的速度比较快;而且每个生物体系当中的代谢产物都具备类似性。因此, PD-1抗体在黑色瘤的研究当中所利用的技术具有通用性;分析方法成熟, 能进行定性定量分析。另外, 由于检测样品为生物体液 (血液、尿液等) 、细胞提取物和组织等, 能实现无创或微创操作的临床癌变生物标记物筛查。

3 PD-1抗体在黑色瘤研究中的应用

3.1 恶性黑色瘤诊断

恶性黑色瘤筛查的目的是基于早期诊断能提高病人5年生存率, 病人就诊时, 恶性黑色瘤分期越晚, 根治性手术机会也越小, 综合治疗效果越差。最适合开展筛查试验的病种是在疾病早期具有治愈手段的病种。有效的筛查试验具有的特点是高灵敏性、高特异性、较高的效益成本比、受条件限制少、能广泛开展、病人易于接受。PD-1抗体具有非侵入性、高通量和高效益成本比, 能将代谢性生物标志物的检查应用于恶性黑色瘤的早期诊断。尽管目前PD-1抗体在临床上的应用还处于探索阶段, 需要后续的深入研究, 但是目前的研究已经证实, 多种黑色瘤病人的代谢谱和健康人群存在差异[3]。

3.2 恶性黑色瘤病人一般护理常规病人入院后按病情轻重及不同病症分别送至指定床位, 向病人介绍病区环境和有关制度, 介绍主管医生、护士。测体温、脉搏、呼吸、血压、脉象、体重等, 通知相关医生。心理护理:在各种疾病中, 很少有如癌症给人以巨大的精神压力, 癌症不仅影响一个人的正常生活, 也危害其家庭, 不仅破坏机体正常功能, 也可造成身体形象的改变, 以及病人在家庭中角色的转换, 加重了恐惧、有罪、愤怒、抑郁、绝望等情绪反应, 这些消极情绪对机体免疫功能有抑制作用, 致使癌细胞活跃, 肿瘤发展。因此, 给予病人心理安慰, 帮助建立积极的情绪, 锻炼坚强的意志和对生活充满希望, 是战胜癌症的重要精神支柱;病室内保持清洁、安静、空气流通, 根据病征特点调节适宜的温湿度;新病人入院后, 每日测体温、脉搏、呼吸4次, 连续3d。体温在37.5℃以上者每日测4次, 体温达39℃以上者, 每4h测体温1次, 体温恢复正常3日后改为每日1次。每日记录二便1次, 每周测体重1次。

3.3 疗效评估

与基因组学和蛋白质组学相比, 代谢组对外界刺激具有更迅捷的反应应答, 也就是说, PD-1抗体能更好地评估黑色瘤对外在环境变换的反应, 比如对药物治疗或手术切除效果的近乎实时的评估。通过对特异性生物标记物的筛查和鉴定, 实现早期疗效评估、药物毒性监测。这不仅有利于治疗疗效的提高, 还能同时避免或减轻药物不良反应事件的发生。虽然这个领域的研究才起步不久, 但是无论是动物模型还是人体研究都表明其具有广阔的前景。

4 小结

正电子发射断层显像作为一种众所周知的代谢成像技术, 在临床上已广泛应用于多种黑色瘤的诊断、分期和疗效评估上。其原理是通过测量体内放射性元素标记的葡萄糖、胆碱或胸苷的浓聚情况来反映体内组织生命代谢活动。如用18F脱氧葡萄糖 (18F-fluorodeox-yglucose) -PET预测伊马替尼 (imatinib) 对复发性胃肠道间质瘤 (gastrointestinal stromal tumors, GIST) 的疗效时, 其比传统的CT要早很多。

摘要：恶性黑色瘤通过刺激免疫系统的抑制受体改变原有免疫反应, 进行免疫逃逸。通过阻断T细胞抑制受体, 阻断恶性黑色瘤的发生, 为抗黑色瘤免疫提供了潜在的治疗方法。PD-1是T细胞抑制受体, 在T细胞功能性紊乱时持续表达, 其可作为停止信号在黑色瘤中限制T细胞的效应功能。阻断PD-1信号可有效帮助衰竭T细胞, 促进抗恶性黑色瘤免疫应答。PD-1抗体在癌症治疗及免疫刺激中具有重要作用。

关键词：恶性黑色瘤,PD-1抗体,临床护理

参考文献

[1]Gleisner MA, Reyes P, Alfaro J, et al.Dendritic and stromal cells from the spleen of lupic mice present phenotypic and functional abnormalities[J].Mol Immunol, 2013, 54 (3/4) :423-434.

[2]Inamine A, Sakurai D, Horiguchi S, et al.Sublingual administration of Lactobacillus paracasei KW3110inhibits Th2-dependent allergic responses via upregulation of PD-L2on dendritic cells[J].Clin Immunol, 2012, 143 (2) :170-179.

PD-1 篇4

程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)及其配体程序性死亡配体-1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是近年研究比较透彻的免疫检查点分子。PD-1是T细胞表面重要的抑制分子,其配体为PD-L1和PD-L2。PD-1的胞浆结构域包含了免疫受体酪氨酸抑制基序及免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptoe tyrosine-based swith motif,ITSM),PD-1与PD-L1相结合后通过ITSM募集含有酪氨酸磷酸酶的SH2结构域抑制TCR信号,从而传递负性信号[2]。激活的T细胞一过性表达PD-1,而PD-1持续性表达则与T细胞耗竭及无能相关[3]。肿瘤细胞可固有或诱导性表达PD-L1,其与肿瘤浸润T淋巴细胞(tumour-infiltrating lymphocytes,TILs)表达的PD-1相互作用从而发挥重要的负性调控作用,是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一[4]。迄今已在多种肿瘤中发现癌细胞表达PD-L1与预后不良相关。2012年新英格兰医学杂志报道了抗PD-L1、PD-1抗体在晚期肿瘤患者中获得了持久的肿瘤消退及疾病稳定期,这两个里程碑式的临床试验使肿瘤免疫治疗进入了一个新时代[5,6]。不断累积的研究结果还提示:肿瘤细胞表达PD-L1及增加的TIL密度可能是抗PD-1/PD-L1免疫治疗有效的预测因素[7]。因此明确肿瘤组织TIL密度及PD-L1表达既有助于了解肿瘤微环境的免疫状况、评估预后,此外可作为生物标记物筛选适宜的患者行免疫治疗。本研究检测了116例卵巢浆液性腺癌患者的肿瘤组织CD8+TILs密度及PD-L1的表达情况,并分析了CD8+TILs密度及癌细胞PD-L1表达水平与患者预后的关系,希望为卵巢浆液性腺癌患者行肿瘤免疫分型、合理实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗提供基本的信息。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2004年7月至2010年12月于上海交通大学医学院附属仁济医院行肿瘤细胞减灭术的116例卵巢浆液性腺癌患者组织标本,每例患者临床病理、手术及随访资料完整。患者年龄30~81岁,平均年龄58岁;FIGOⅠ、Ⅱ期患者34例,FIGOⅢ、Ⅳ期患者82例。所有卵巢浆液性腺癌患者均为初发,术前未行新辅助化疗。每例卵巢癌标本行CD8+TIL密度及PD-L1检测。

1.2 主要试剂

山羊抗人PD-L1多克隆抗体、小鼠抗人CD8单克隆抗体及小鼠Ig G1同型对照均购自英国Abcam公司,山羊Ig G同型对照抗体购自美国Gene Tex公司,免疫组织化学二抗试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司,其他试剂及仪器由中心实验室提供。

1.3 实验方法

采用免疫组织化学PV二步法。标本蜡块制备成4μm连续切片,经脱蜡和水化后,滴加3%过氧化氢溶液室温作用10分钟,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍,每遍5分钟,置于p H 6.0柠檬酸盐缓冲液中微波加热20分钟进行抗原修复,自然冷却至室温,PBS冲洗3遍,每遍5分钟,滴加一抗,即山羊抗人PD-L1多克隆抗体(抗体终浓度4μg/ml)或小鼠抗人CD8单克隆抗体(1∶50)或同型对照抗体,4℃孵育过夜,PBS冲洗3遍,每遍5分钟,使用相应的二抗试剂盒,每张切片滴加二抗50分钟,室温下DAB避光显色,在光学显微镜下控制显色时间,3~5分钟后蒸馏水冲洗终止显色。苏木精复染1分钟,自来水冲洗返蓝,梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封片。研究中使用人胎盘组织作为PD-L1表达的阳性对照。

1.4 结果判定标准

免疫组化切片均由2名资深病理科医师双盲独立观察评估。PD-L1以细胞质或细胞膜出现黄至棕褐色颗粒为阳性显色。PD-L1表达采用半定量积分法,结合染色强度和阳性细胞百分比来评定阳性表达病例。因PD-L1在胎盘组织固有表达,以胎盘组织作为阳性对照,染色强度计分:0分为不染色;1分为弱染色;2分为中度染色但弱于阳性对照;3分为染色强度等同或强于阳性对照。先在低倍镜下观察整张切片,将肿瘤组织分成2个区域:癌巢和间质。于癌巢区随机选择5个高倍视野(400×),以着色肿瘤细胞占视野中肿瘤细胞的百分比进行观察评分:阳性细胞率<5%为0分、≥5%~<25%为1分、≥25%~<50%为2分、≥50%~<75%为3分、≥75%为4分。两项相乘后5个视野求算数平均数得到最后的评分:0~<2分为阴性表达;≥2~<4分为弱阳性;≥4~<8分为中度阳性;≥8~12分为强阳性。低表达组:阴性+弱阳性;高表达组:中度阳性+强阳性。

此外,通过计数胞膜上有CD8阳性染色的淋巴细胞个数检测CD8+TILs的浸润情况。先在低倍镜下观察整张切片,分别在癌巢及间质区选取CD8阳性细胞丰富的3个高倍视野(400×)计数阳性细胞,并求平均值。以癌巢内CD8+TILs的中位数作为临界(cut-off)值,≤中位数为CD8+TILs低密度组,>中位数为CD8+TILs高密度组。基于癌巢中CD8+TILs数量与癌细胞PD-L1表达水平的免疫分型分为4组:PD-L1高表达CD8+TILs高密度组、PD-L1高表达CD8+TILs低密度组、PD-L1低表达CD8+TILs高密度组、PD-L1低表达CD8+TILs低密度组,分析4组不同免疫分型患者的生存时间。

1.5 随访

采用查阅住院及门诊病历和电话联系的方式对116例浆液性卵巢癌患者进行随访,所有患者随访资料完整。生存时间计算按确诊至死亡时间或确诊至末次随访时间,按月计算。末次随访时间为2015年12月。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。肿瘤细胞PD-L1表达水平与癌巢及间质CD8+TILs数目的关系采用Spearman相关性分析。以寿命表法计算116例浆液性卵巢癌患者的中位生存时间(OS)及5年生存率;采用乘积极限法(Kaplan-Meier)进行单因素生存分析,绘制生存曲线,对数秩检验(Log-Rank Test)进行生存曲线比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-L1蛋白在卵巢浆液性腺癌组织中的表达情况

PD-L1蛋白表达主要定位于卵巢浆液性腺癌细胞的细胞质和细胞膜。卵巢浆液性腺癌PD-L1高表达的比例为70.69%(82/116),在PD-L1高表达病例中癌细胞往往呈弥散性表达PD-L1(见图1),PD-L1局限性高表达于肿瘤侵袭区域的现象并不常见。

2.2 卵巢浆液性腺癌组织中CD8+TILs的数量

116例卵巢浆液性腺癌组织癌巢内CD8+TILs的中位数为7.5个/HPF(1~28个/HPF),间质内CD8+TILs的中位数为11.5个/HPF(2~30个/HPF)。图2显示癌巢及间质内CD8+TILs。

2.3 卵巢浆液性腺癌组织中CD8+TILs的数量与癌细胞PD-L1表达的相关性

采用Spearman相关性分析发现,癌细胞PD-L1高表达与癌巢内的CD8+TILs数目呈显著的负相关(r=-0.210,P=0.024),而与间质内的CD8+TILs数目无相关性(r=-0.147,P=0.117)。

2.4 基于癌巢中CD8+TILs数量与癌细胞PD-L1表达水平的免疫分型的构成比

以癌巢内CD8+TILs的中位数7.5个/HPF为临界值,PD-L1高表达CD8+TILs高密度组、PD-L1高表达CD8+TILs低密度组、PD-L1低表达CD8+TILs高密度组、PD-L1低表达CD8+TILs低密度组的标本分别为36例(31.03%)、46例(39.66%)、22例(18.97%)、12例(10.34%)。

2.5 基于癌巢CD8+TILs密度及癌细胞PD-L1表达水平的不同免疫分型患者的生存时间

116例浆液性卵巢癌患者的中位OS为47个月,5年生存率为39%。采用Kaplan-Meier进行基于癌巢CD8+TILs数量的单因素生存分析,癌巢CD8+TILs低密度组患者的中位OS为43个月,癌巢CD8+TILs高密度组患者的中位OS为64个月,对数秩检验对两组患者生存曲线进行比较,结果提示生存率曲线分布差异有统计学意义(P=0.001)。

Kaplan-Meier分析基于癌巢CD8+TILs数量及癌细胞PD-L1表达水平的不同免疫分型患者的生存时间,PD-L1低表达CD8+TILs高密度组患者的中位OS未得到,PD-L1高表达CD8+TILs高密度组、PD-L1高表达CD8+TILs低密度组、PD-L1低表达CD8+TILs低密度组患者的中位OS分别为53、42、51个月。对数秩检验对4组不同免疫分型患者生存曲线进行比较,结果提示PD-L1低表达CD8+TILs高密度组患者生存期最长,且4组生存率曲线分布差异有统计学意义(P=0.001),见图3。

3 讨论

3.1 卵巢浆液性腺癌肿瘤细胞PD-L1的表达

肿瘤细胞表达PD-L1及增加的TILs密度可能是抗PD-1或PD-L1免疫治疗有效的生物标记物,因此明确肿瘤组织PD-L1表达情况具有重要的临床意义[8]。然而令人遗憾的是,有关卵巢浆液性腺癌组织中PD-L1的表达情况及其与患者预后的关系却所知甚少。本研究首次检测了国内较大样本量的卵巢浆液性腺癌组织中PD-L1的表达,结果显示70.69%(82/116)的肿瘤组织中癌细胞高表达PD-L1。迄今除我们的研究外,另一项样本量较大的研究由日本学者Hamanishi等[9]报道,该团队检测了70例石蜡包埋的卵巢癌组织标本,结果发现75%(21/28)的卵巢浆液性腺癌、63.64%(14/22)的卵巢透明细胞癌、81.82%(9/11)的卵巢子宫内膜样腺癌、0(0/2)的卵巢黏液腺癌高表达PD-L1。两项研究中卵巢浆液性腺癌高表达PD-L1的比例较接近。

正常组织极少表达PD-L1,而多种癌细胞如肺癌、恶性脑瘤、黑色素瘤、胃癌及胰腺癌细胞高表达PD-L1,此外肿瘤微环境中的髓系细胞也可表达PD-L1[4]。什么机制促使癌细胞PD-L1表达上调呢?目前已知可能有2种方式,即固有表达及适应性免疫抵抗途径[10]。固有表达指肿瘤细胞的癌基因通路启动了PD-L1表达,这种情况下PD-L1往往在癌细胞呈弥漫性表达,如在脑胶质瘤中,PTEN基因缺失或沉默促进了癌细胞PD-L1表达上调[11]。癌细胞PD-L1表达上调的另一种机制是适应性免疫抵抗。具体而言,当T细胞识别肿瘤细胞特异性抗原时,来自TCR的信号可产生干扰素,与此同时T细胞上激活诱导的调节受体如PD-1的表达也被上调。干扰素可增强免疫应答,但又能诱导肿瘤细胞反应性高表达PD-L1,PD-L1使PD-1+T细胞耗竭和无能[3]。干扰素诱导的PD-L1表达有特征性表现,即PD-L1往往在肿瘤组织T细胞富集区,尤其肿瘤侵袭边缘局限表达或高表达[12]。

卵巢浆液性腺癌细胞PD-L1表达上调是固有表达还是适应性免疫抵抗?在我们的研究中,PD-L1高表达病例中卵巢浆液性腺癌细胞往往呈弥散性表达PD-L1,PD-L1局灶性高表达于肿瘤侵袭区域的现象并不常见;此外,癌细胞PD-L1表达水平与间质内的CD8+TILs数目无显著相关性,且与癌巢内的CD8+TILs数目呈现显著的负相关,而非局灶性共表达,上述研究结果提示,卵巢浆液性腺癌细胞PD-L1为固有表达的可能性较大,而驱动PD-L1表达上调的癌基因信号通路有待进一步研究。

3.2 卵巢浆液性腺癌组织局部免疫微环境状态与预后

T细胞是机体抗肿瘤免疫的核心执行者。对186例晚期卵巢癌冰冻切片的分析显示:癌巢内存在CD3+TILs的患者5年存活率为38%,而癌巢内缺乏CD3+TILs的患者5年存活率仅为4.5%。癌巢内T细胞是PFS及OS延长的独立预后因素[13]。Sato等[14]的研究进一步发现,上皮性卵巢癌癌巢内CD8+TILs高密度者较低密度者OS显著延长(55月vs 26月)。本研究中癌巢CD8+TILs低密度组患者的中位OS(43月)低于高密度组(64月),差异有统计学意义(P<0.05),说明高密度组患者生存期较长,且基于癌巢CD8+TILs数量及癌细胞PD-L1表达水平的不同免疫分型患者的生存时间分析显示,癌细胞PD-L1低表达癌巢CD8+TILs高密度组患者的预后较好。

目前临床上判断卵巢癌进展程度及预后的最常用指标是FIGO分期,但由于这种分期系统仅以肿瘤组织本身的特征来划分,没有考虑患者整体免疫状况,更没有分析肿瘤病灶组织的免疫特性,故对于术后肿瘤患者的生存预后尚不能提供很好的预测效果,即同样FIGO分期的卵巢癌患者可能预后迥异,因此急需在FIGO分期之外引入肿瘤分子分型、免疫评分等指标来评估预后。现已有一个国际机构开始在常规的临床工作中验证和推广免疫评分,其结果可能将使免疫评分整合到目前的肿瘤分期系统,即TNM-I(TNM-Immune)[15]。鉴于PD-L1及癌巢中CD8+TILs密度在卵巢浆液性腺癌微环境的重要作用,我们建议卵巢浆液性腺癌患者常规检测肿瘤细胞PD-L1表达水平及癌巢中CD8+TILs密度,这将为判断患者预后提供重要信息。

3.3 基于卵巢浆液性腺癌肿瘤组织免疫分型选择免疫治疗方法的选择策略

近来有学者提出基于T细胞浸润及PD-L1表达水平不同的肿瘤免疫分型学说[16]。Ⅰ型为肿瘤组织PD-L1+TILs+(即PD-L1高表达CD8+TILs高密度)提示肿瘤组织内一度存在活跃的抗肿瘤免疫应答,但之后因癌细胞产生适应性免疫抵抗而阻断了免疫应答;Ⅱ型为PD-L1-TILs-,提示为免疫忽略;Ⅲ型为PD-L1+TILs-,提示PD-L1为固有表达;Ⅳ型为PD-L1-TILs+,提示可能存在其他途径诱导了免疫耐受。基因突变、癌驱动基因及组织起源的不同,使得不同肿瘤的免疫分型构成比不同。对于Ⅰ型肿瘤,抗PD-1及PD-L1抗体治疗最有可能获得满意的疗效;对于肿瘤组织内缺乏T细胞的Ⅱ型及Ⅲ型肿瘤,必须采用联合的免疫治疗策略,如CTLA-4抗体联合PD-1及PD-L1抗体治疗。

根据以上肿瘤免疫分型学说,本研究中卵巢浆液性腺癌组织PD-L1高表达CD8+TILs高密度(免疫分型Ⅰ型)、PD-L1高表达CD8+TILs低密度(免疫分型Ⅲ型)、PD-L1低表达CD8+TILs高密度(免疫分型Ⅳ型)、PD-L1低表达CD8+TILs低密度(免疫分型Ⅱ型)的标本分别为36例(31.03%)、46例(39.66%)、22例(18.97%)、12例(10.34%)。尽管卵巢浆液性腺癌细胞PD-L1高表达的主要原因可能为癌基因信号通路激活的固有表达,但PD-L1高表达CD8+TILs高密度(Ⅰ型)患者仍然最有可能对抗PD-1/PD-L1免疫治疗产生疗效。本研究中Ⅰ型患者占比为31.03%,这部分人群最有望从抗PD-1/PD-L1免疫治疗得到获益。迄今已报道的抗PD-L1/PD-L1免疫治疗卵巢癌的临床试验为数尚不多。Hamanishi等[17]的研究中20位铂耐药卵巢癌患者给予PD-1单抗nivolumab,总的客观有效率为15%,其中2例患者获得长期的完全缓解,中位PFS为3.5个月,中位OS为20个月。在Keynote-028临床试验中,26个晚期卵巢癌患者纳入研究并给予PD-1单抗Pembrolizumab,其中51%患者癌细胞PD-L1表达阳性,客观有效率为11.5%,1位患者完全缓解,2位部分缓解,6位患者疾病稳定[18]。在PD-L1单抗的多中心临床试验中,17位患者为卵巢癌,其中1例获得部分缓解,3例疾病稳定[6]。基于抗PD-L1/PD-L1免疫治疗卵巢癌的临床试验结果,总的客观有效率并不十分理想,一部分原因可能为未根据肿瘤组织免疫分型入选患者。特异性募集免疫分型为Ⅰ型的卵巢癌患者行抗PD-1/PD-L1免疫治疗有望进一步提高疗效。

综上所述,卵巢浆液性腺癌肿瘤微环境免疫分型与患者预后密切相关,癌巢CD8+TILs高密度组患者的中位OS显著高于低密度组患者;癌细胞PD-L1低表达癌巢CD8+TILs高密度组患者的预后较好。重视卵巢癌肿瘤微环境的免疫分型有助于评估患者预后及募集合适患者实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗。近年来免疫治疗日益成为恶性肿瘤的重要治疗手段,期待有更深入的基础研究和大规模临床试验探索抗PD-1/PD-L1免疫治疗在卵巢癌综合治疗中的价值。

摘要：目的:研究卵巢浆液性腺癌肿瘤微环境中CD8~+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)密度及癌细胞程序性死亡配体-1(PD-L1)的表达情况与临床意义。方法:收集2004年7月至2010年12月于上海交通大学医学院附属仁济医院行肿瘤细胞减灭术的116例卵巢浆液性腺癌患者组织标本,免疫组化检测肿瘤组织CD8~+TILs密度及癌细胞PD-L1表达情况;Spearman相关性分析癌细胞PD-L1表达水平与癌巢及间质CD8~+TILs数目的关系;采用乘积极限法进行基于癌巢CD8~+TILs密度及肿瘤细胞PD-L1表达的单因素生存分析。结果:卵巢浆液性腺癌PD-L1高表达的比例为70.69%(82/116)。癌细胞PD-L1表达强度与癌巢内的CD8~+TILs数目呈显著负相关(P=0.024),而与间质内的CD8~+TILs数目无相关性(P=0.117)。癌巢CD8~+TILs高密度组患者的中位生存时间(64月)显著高于低密度组(43月),差异有统计学意义(P<0.05);乘积极限法的亚组分析显示肿瘤微环境中癌细胞PD-L1低表达癌巢CD8~+TILs高密度组患者的预后较好。结论:卵巢浆液性腺癌肿瘤微环境中癌巢CD8~+TILs密度及癌细胞PD-L1表达水平与患者预后密切相关,重视肿瘤微环境的免疫分型有助于评估患者预后及筛选合适患者实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗。