小鼠卵母细胞（精选七篇）
小鼠卵母细胞 篇1
1 材料与方法
1.1 实验动物
6～10周龄清洁级昆明系小鼠, 购自重庆市中药研究所;购得后于实验动物房使其适应新环境一周。控制光照时间为7:00～19:00, 饲喂普通饲料, 自由饮水。
1.2 试剂
孕马血清促性腺激素 (PMSG) 、人绒毛膜促性腺激素 (HCG) 为宁波市第二激素厂;乙醇、透明质酸酶、Hepes等药剂均为Sigma公司产品。
1.3 小鼠MⅡ卵母细胞的准备
卵母细胞的获取:注射hCG后13小时颈部脱臼法处死小鼠, 无菌摘取输卵管, 收集卵丘一卵母细胞复合体, 用M2漂洗3次。300μg/ml透明质酸酶处理2分钟除去卵丘细胞。捡出裸卵, 捡出裸卵, mM16洗5次, 备用。
1.4 小鼠MⅡ卵母细胞的不同激活方法
(1) 7%乙醇分别激活5、7、10min; (2) 4、6、10和14mmol/L的SrC12激活6h; (3) 5μg/mL的Ca-A23187激活5min; (4) 7%乙醇激活5min, 再用2mmol/L的6-DMAP+5μg/mL CB激活3h; (5) 5μg/ml A23187+2mmol/L6-DMAP+CB (3h) 。
激活后培养6h后观察卵母细胞激活情况;第24h观察卵母细胞的卵裂情况;第48h观察4～8细胞期胚胎;在培养96h后, 观察桑囊胚的发育。
1.5 活化结果评定
卵母细胞活化的判断标准:第二极体排出和原核形成或发生卵裂, 均可判断为卵母细胞已被激活;若卵周间隙中出现两个极体而无明显原核形成表明卵母细胞未被激活。
1.6 统计分析
采用SPSS11.5统计软件对各种激活所获得的不同类型孤雌胚的发育进行方差分析, P检验。
2 结果与分析
2.1 7%乙醇不同处理时间对孤雌胚形成及发育的影响
7%乙醇激活卵母细胞时, 以形成单倍体胚为主, 并可发育至桑椹胚或囊胚。5、7、10 min激活组的激活率和卵裂率无明显差异 (P>0.05) , 5min和7min激活组的4～8细胞期胚、桑葚胚发育也无差异, 但7min激活组显著高于其他激活组 (P<0.05) 。因此, 用7%乙醇激活小鼠卵母细胞, 以7min的激活效果及孤雌胚发育较好, 见表l。
2.2 SrCl2浓度及激活时间对孤雌胚形成及发育的影响
刚排出的小鼠卵母细胞于mM16-SrCl2液中20～30min, 则孤雌发育比例下降, 但由于抑制了第二极体的排出, 故大部分为二倍孤雌胚。不同浓度SrC12的卵母细胞激活率无明显差异 (P>0.05) , 但其卵裂率及孤雌胚的后期发育不一致。4mmol/l SrC12激活组的卵裂率、4～8细胞期胚及桑葚胚发育率明显低于其他各激活组 (P<0.01) 。6、10mmol/l SrC12的激活效果明显好于4、14mmol/l SrC12激活组, 其卵裂率、4～8细胞期胚及桑葚胚发育率明显高于这两个激活组 (P<0.05) 。见表2。
2.3 不同激活方式对小鼠卵母细胞孤雌胚形成及发育的比较
5μg/ml Ca-A23l87激活5min、l0mmol/LSrC12激活6h、7%乙醇激活7min、7%乙醇激活5min, 再移入含2mmol/l 6-DMAP+5μg/mlCB的CZB中激活3h、5μg/ml A23187+2mmol/L6-DMAP+CB (3h) 等5种化学激活方法对小鼠卵母细胞的激活效果见表3。单用Ca-A23187处理引起76.80%卵激活, 大部分排出极体, 不形成原核。Ca-A23l87、SrC12激活方法的激活率、卵裂率、4～8细胞期胚发育率和桑葚胚发育率都远低于乙醇激活和乙醇结合6-DMAP+CB激活 (P<0.01) , 乙醇激活的4～8细胞期胚发育率、桑囊胚发育率略低于乙醇结合6-DMAP+CB激活 (P<0.05) 。
3讨论
本实验比较了单个化学激活剂及联合激活剂对小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎形成及发育的影响。结果表明, 7%乙醇激活卵母细胞时, 7min的激活处理, 孤雌胚发育较好, 以形成单倍体胚为主, 并可发育至桑椹胚或囊胚。4～8细胞期及桑葚胚发育率分别为42.86%、30.00%。6、10mmol/l SrC12激活组, 其卵裂率、4～8细胞期胚及桑葚胚发育率明显高于4、14mmol/l SrC12激活组 (P<0.05) 。这可能与SrCl2不仅能激活小鼠卵母细胞, 而且还能抑制第二极体的排出, 能生成二倍体孤雌胚胎有关。钙离子载体A23187 (Calcium Ionophore A23187, CaA) 能引起卵母细胞皮质颗粒的释放、第二极体的排出和原核的形成, 囊胚率为23.20%。由此可见, 三种方法的囊胚率差异不显著, 这说明, 三种方法对孤雌胚发育的影响差异不大, 而SrC12激活后的囊胚率是27.97%, 介于以上两者之间。
注:同一数值右上角标有不同小写字母的数量之间差异显著 (P<0.05) , 相同的小写字母间差异不显著 (P>0.05) 。
本实验中上述三种方法的囊胚率差异不显著, 但当乙醇与6-DMAP+C或钙离子载体A23187与6-DMAP+CB联合应用时, 孤雌胚发育潜能明显提高, 这可能与6-DMAP蛋白质合成抑制剂或/和酪氨酸激酶抑制剂的后续作用密切相关。有研究发现, 6-DMAP能使MPF的组成成分Cdc2磷酸化, 使MPF维持低水平。联合激活的囊胚发育率可高达38.64%。可见, 6-DMAP弥补了乙醇的不足之处, 即在乙醇短暂的使Cycling失活后, 抑制MPF和MAPK等激酶的合成和磷酸化, 从而使它们维持在低水平, 进而更有效地激活卵母细胞。上述研究结果为进一步优化小鼠卵母细胞激活方案, 形成优质的孤雌胚胎及其后期良好的发育创造了条件, 并为下一步进行小鼠核移植研究、孤雌干细胞分离研究提供试验依据。
摘要：为探讨不同激活方式对小鼠卵母细胞孤雌胚形成及其发育的影响, 用乙醇、Ca-A23187、SrC12、乙醇与6-DMAP和CB及Ca-A23187+CHX+CB分别对小鼠卵母细胞进行了激活处理。结果显示, 7%乙醇激活小鼠卵母细胞时, 以7min的激活效果及孤雌胚发育较好, 以形成单倍体胚为主, 桑囊胚发育率可达30.00%;用SrC12激活小鼠卵母细胞时, 6或10mmol/L为最佳处理浓度, 激活后大部分为二倍孤雌胚, 桑囊胚发育率可达27.97%;以7%乙醇激活5min, 再用2mmol/L6-DMAP+5μg/mLCB激活3h效果最佳, 能形成1个原核, 桑囊胚发育率高达38.64%。小鼠卵母细胞经乙醇或Ca-A23187、6-DMAP和CB等联合激活后能较好地发育。
小鼠卵母细胞 篇2
关键词：小鼠卵母细胞,低温(4℃),保存时间,培养液,卵巢
在科技发展日新月异的今天,胚胎生物技术也在迅速发展,如卵子体外成熟、体外受精、胚胎冷冻、体细胞克隆技术及干细胞技术等方面,学者们都在从不同的途径及模式进行相关发育机理的研究[1,2]。而不管从事何种胚胎生殖领域的研究,卵母细胞都是不可或缺的试验材料[3,4]。由于受某些试验材料及试验条件的限制,如珍稀动物的死亡、屠体的直接保存十分困难以及卵巢运输途径的限制等,导致不能立即处理卵巢以获取卵母细胞[5,6,7],低温保存卵巢成为一种适宜的方法。而目前关于4℃保存卵巢后卵子体外发育是否可行还未见系统的报道。试验以SPF级昆明小白鼠为试验动物,模拟小鼠死亡后4℃条件下保存不同时间后卵子体外发育的可行性,为后续其他物种尤其是大型珍稀动物的相关研究提供理论参考。
在目前的小鼠卵母细胞体外培养研究中,M2和M16培养液均为实验室体外培养细胞的常用试剂,其中M2培养液是由M16培养液改进而来,仅将M16培养液中的碳酸盐替换为HEPES缓冲液以维持正确的p H值。有研究表明,M2培养液中的缓冲体系不适于较高温度下的培养箱,因此不适于在培养箱内培养,大多用于培养箱外操作,但目前对两者培养液的培养效果的真实差异还未见报道。研究旨在通过对4℃条件下小鼠卵巢保存时间及不同培养液对后续卵母细胞发育的研究进行探讨,期望得到合适的培养液及保存时间,为后续其他物种的相关研究提供理论依据。
1 材料
1.1 试验动物
小鼠为试验用SPF级昆明小白鼠(6周龄、体重25 g左右),购于广西医科大学实验动物中心。饲养环境温度为(25±5)℃,自然光照,自由采食及饮水。
1.2 试验试剂与器材
孕马血清促性腺激素(PMSG),由宁波市激素制品有限公司生产;氯化钠、氯化钾、丙酮酸钠、碳酸氢钠、青霉素G钾盐、链霉素、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸(EDTA)、透明质酸酶,由Sigma公司生产;L-谷氨酰胺,由上海生工生物工程技术服务有限公司生产。
移液器,由美国Eppendorf公司生产;细胞培养箱,由美国热电公司生产;超净工作台,由苏州苏净集团有限公司生产;水平离心机,由日本Nikon公司生产;培养液M2、M16的成分配方参照参考文献[8]。
2 方法
2.1 小鼠卵巢的获取
选择体重大于20 g的健康雌性小白鼠,于腹腔注射10 IU的PMSG,24 h后利用脱臼法处死小鼠,立即用70%乙醇喷洒小鼠腹部消毒,在腹部皮肤开口,向头部和尾部拉伸使腹腔完全打开并暴露卵巢。用镊子将输卵管、卵巢和脂肪垫拉出体腔,重新定位镊子的位置夹住脂肪垫,用精细的剪刀在输卵管与卵巢、脂肪垫与卵巢之间分别剪开,完整地取出卵巢,尽量少带出脂肪垫和输卵管。将卵巢放入调好的4℃冰箱中,并分别记录保存时间。
2.2 小鼠未成熟卵子的获得
在灭菌的培养皿上小心地剔除卵巢周围的输卵管和脂肪组织,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗几次以洗去血液和脂肪。在实体显微镜下用刀片将卵巢剁碎,使待成熟受抑制状态的生发泡期(GV期)的卵子释放出来。收集并挑选出卵丘完整且致密、胞质颜色正常且均匀、卵母细胞性状规则的GV期卵子。
2.3 培养微滴的制备
用50μL枪头在35 mm无菌的塑料组织培养皿底部制作6个规则排列的培养微滴,然后在培养液滴上覆盖石蜡油。让石蜡油缓慢覆盖微滴,并放入培养箱中平衡数小时,备用。
2.4 微滴的培养
将收集到的小鼠GV期卵细胞和合子用M2培养液洗涤3次,洗去残留的透明质酸酶、卵丘细胞及杂质,再分别用成熟培养液的微滴洗涤3次。将洗涤好的细胞或合子放入平衡好的微滴中,每个微滴中放30枚GV期卵母细胞或20个合子。置于37℃、5%CO2的培养箱内进行培养。
2.5 卵母细胞成熟的判定
将培养成熟后的卵母细胞用PBS清洗3次,在显微镜下进行观察,以第一极体的排出为成熟标志。
2.6 试验步骤
2.6.1 4℃低温保存对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
将获得的小鼠卵巢随机分为4组,分别在4℃低温条件下保存0 h、6 h、18 h、24 h。取出后在室温下平衡10 min,用刀片将卵巢剁碎,使卵母细胞释放出来,然后移到M2培养液中洗涤3次,再将细胞移入M2培养微滴中,在37℃、5%CO2培养箱中培养并统计计数。
2.6.2 M2和M16培养液对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
将外观形态正常的卵母细胞随机分为2组,分别移入平衡好的M2、M16培养微滴中,在37℃、5%CO2培养箱中培养12 h并计数。
2.7 数据的统计分析
采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。
3 结果与分析
3.1 卵母细胞体外成熟后各阶段的判定
将培养成熟后的卵母细胞用PBS清洗3次,在显微镜下进行观察,见卵子内有未破裂的核仁为GV期,卵子内核仁消失只见均一胞质为减数分裂Ⅰ中期-后末期(MⅠ-AT期),见卵子排出第一极体为减数分裂Ⅱ期(MⅡ期),见289页彩图1。
3.2 4℃不同保存时间对小鼠卵母细胞体外发育效果的影响
结果见图2。
由图2可知:保存0小时时小鼠卵母细胞MⅠ-AT期所占比例高于其他各期;而保存24小时时MⅡ期所占比例最低,且GV期所占比例最大。体外保存6小时和18小时时,虽然GV期所占比例略有上升,但MⅡ期所占比例有所下降。
3.3 4℃不同保存时间与卵母细胞体外发育各阶段的相关性
结果见表1。
注:数据肩标*表示与其他2个时期相比差异显著(P<0.05)。
由表1可知,这几个发育阶段与保存时间均为负相关,其中MⅠ-AT期所占比例负相关系数最小,而MⅡ期所占比例与保存时间负相关系数为-0.597,差异显著(P<0.05)。
3.4 M2和M16培养液对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
为了考察M2和M16 2种不同培养液对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,试验以不同培养液作为变量,设置M2、M16两组试验,在相同条件下培养一段时间后所得结果见表2。
枚
由表2可知:使用M16培养液的小鼠卵母细胞GV期为46枚,MⅡ期为64枚;使用M2培养液的小鼠卵母细胞GV期为53枚,MⅡ期为47枚。
4 小结与讨论
随着胚胎生物技术的迅速发展,学者们正在应用各种试验动物及试验方法进行相关的发育机理及技术推广研究,卵母细胞作为胚胎生物工程研究中最为基础也最为核心的试验材料[9,10]。目前,由于某些条件的限制,如卵巢运输条件及卵巢获得地点(如自然保护区、离体卵巢)无法立即进行培养,为了不使卵母细胞失去生物活性,低温保存卵巢成为一种适宜的方法。
R.Solano等[11]报道了母牛卵巢在4℃条件下保存12 h和24 h后与不保存的对照组相比,卵母细胞的体外成熟率、卵裂率均无显著影响,但没有报道囊胚发育情况。谭世俭[12]研究表明,母牛卵巢在长时间(14 h)的收集及运输过程中,由开始的30~35℃缓慢下降到在实验室时的20~22℃,牛卵巢离体后保存时间为7 h仍能获得较高的卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚率。N.Songsasen等[13]研究表明,22~24日龄时将雌性小鼠处死后在室温下保存24 h,其体内的卵巢未成熟卵经体外成熟后受精能力降低,但仍能受精成功。
目前,在4℃条件下不同保存时间对小鼠卵母细胞体外发育情况的研究中,所得文献未见相关报道。张秋婷等[14]对4℃保存GV期小鼠卵子成熟后发育情况进行了报道,但对保存后卵子各时期发育比例未进行检测,研究表明,在4℃条件下,随着保存时间的延长,体外成熟效果逐渐下降,当保存时间延长到24 h时GV期所占比例上升,MⅡ期所占比例急剧下降。在4℃条件下保存6小时和18小时时,虽然MⅡ期所占比例有所下降,但与对照组(0 h)相比差异不显著,这一结果与张秋婷等[14]的研究结果相似,这可能是由于时间的延长,卵母细胞内某些机制发生了变化,相关机理还有待于进一步研究。在4℃条件下,随着卵巢保存时间的延长,卵母细胞发育效率下降,但在4℃条件下小鼠卵巢保存18 h具有一定的可行性。
牛卵母细胞孤雌激活研究 篇3
为了克服胚胎体外激活、融合中存在的缺陷, 近年来人们对牛卵母细胞的激活体系和方法进行了系统研究。牛卵母细胞的人工激活方式很多, 目前常用的激活方法是物化联合激活法, 电激活与乙醇、6-D M A P联合使用可取得较佳的激活效果, 但最佳的激活方法目前还不一致。电激活可使一部分重构胚发生碎片化和死亡, 相当一部分重构卵在电激活后死掉或者发生形态异常, 所以有必要对融合条件进行探索。孤雌激活是很好的技术工具, 本文研究了牛卵母细胞孤雌激活方法的优化。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究用于卵母细胞成熟、激活以及孤雌胚发育的生化试剂:TCM199 (GIBCO) 、胎牛血清F C S (G I B C O) 、双抗 (P/S, GIBCO) , 其它均购自Sigma公司。电融合仪 (澳大利亚CryoLogic, VOL TAINEP-1) 。配制各种液体所用的水均为Milli Q过滤的超纯水。
1.2 方法
1.2.1 卵巢卵母细胞的采集
屠宰场采集牛卵巢, 为本地黄牛和奶牛卵巢。将采集的卵巢置于38.5℃含青霉素100IU/ml, 链霉素100μg/ml的灭菌生理盐水的保温瓶中, 2h内运回实验室。用预温的生理盐水清洗卵巢。用带12#针头的10mL注射器吸取卵巢表面2-8mm大小的卵泡, 卵泡液收集于6cm灭菌培养皿中。然后在体视显微镜下挑选含有完整卵丘细胞层且胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体 (COCs) , 并用DPBS (136.87mmol/L NaCl+2.68mmol/L KCl+1.47mmol/L KH2PO4+8.09 mmol/L Na2HPO4+0.33mmol/L丙酮酸钠, 用时加入10%的FCS) 清洗后备用。
1.2.2 COCs筛选与体外成熟培养
培养前, 将洗卵液H-M199和成熟培养液分别置于35mm玻璃皿中和四孔板中加入500ul成熟液并覆盖300ul的石蜡油, 在38.5℃、5%CO2、饱和湿度下培养箱中平衡2h。收集的COCs先用H-M199 (TCM199+10μg/mlHepes+0.05%FBS+100IU/mlP/S) 洗涤, 再用成熟培养液 (含25mM Hepes, 0.55mg/ml丙酮酸钠, 10%FCS, 10μg/mLFSH, 20μg/mL LH, 1μg/mL 17-E2, 100IU/mlP/S的TCM-199) 中洗涤。然后, 将COCs移入成熟培养液中, 在培养箱中成熟培养22h。
1.2.3 体外成熟卵的检查
观察第一极体排出情况:将充分扩展的COCs置于含0.2%或0.5%透明质酸酶的H-M199中, 培养箱中消化颗粒细胞10min或5min后, 将带有少量致密卵丘的卵母细胞移入新鲜的H-M199中, 用100μL的移液枪反复吹打去掉成熟卵母细胞表面的卵丘细胞, 使卵母细胞成为裸卵。在体视显微镜下, 选择排出第一极体进入MⅡ期的卵母细胞进行孤雌激活。
1.2.4 牛卵母细胞的孤雌激活及发育培养
1.2.4. 1 电激活
选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞, 在激活液FM (0.3mol/L甘露醇、0.5mmol/L Hepes、0.05mmol/L CaCl2、0.1mmol/L MgCl2、0.05%BSA) 中平衡1-2min后转入充满融合液的极间距为0.1mm的融合槽中, 在解剖镜下用吸管调整各个卵母细胞之间的距离进行激活, 激活后的卵放到F M液中, 待全部激活后将卵移入H-M199中洗涤, 然后放入IVM中, 在培养箱中培养30min。计算融合率。实验分6组, 固定脉冲时间为20μs, 在3种电压 (1.7k V/cm, 1.6kV/cm, 1.5kV/cm) 下分别对卵母细胞通以一个直流脉冲和两个直流脉冲 (2次激活间隔时间0.5s) 。评估不同的直流脉冲对卵母细胞电融合率的影响。
1.2.4. 2 乙醇, 6-DMAP的激活和发育培养
将电激活后的卵放入无水乙醇7%+IVC中静置激活7min, 再在含2mmol/L 6-DMAP的培养液中, 于38.5℃、5%CO2和饱和湿度条件下活化4h。待激活完毕, 用I V C液洗涤3次, 然后移入I V C (S O F-aa+3mg/ml BSA) 培养, 第2天起检查卵裂率, 培养7d后检查囊胚率。
1.2.5 数据分析
所有试验重复3次以上, 采用SPSS统计软件检验, 进行差异显示性分析。
2 结果
2.1 HYA对卵母细胞体外发育的影响
卵母细胞经HYA处理后, 本实验采用1.6kv, 20us, 脉冲次数为两次来激活卵母细胞。0.20%HYA作用10min和0.50%HYA作用5min两种方法都有较高的卵裂率, 0.20%HYA作用5min或0.50%HYA作用10min处理卵母细胞, 其卵裂率仅为50%和21.4%, 与前两者相比差异显著。
2.2 不同电激活方法对牛卵母细胞激活的影响
卵母细胞经脱卵丘后, 各组的激活率, 卵裂率, 囊胚率见表1。1.6k V/cm, 直流脉冲重复次数为1次的效果最好, 但与1.6kV/cm, 直流脉冲重复次数为2次的差异不显著, 说明在1.6kV/cm的直流电压下可以很好的激活牛的卵母细胞。
2.3 化学激活与电激活方法比较
见表2, 乙醇+6-DMAP和电激活+乙醇+6-DMAP两种激活方法都对卵母细胞有较高的激活率, 两者的差异不显著。核移植时, 当供体细胞移入受体细胞时, 需要对卵母细胞进行融合。这说明采用电激活 (1.6kv/cm, 1次) +乙醇+6-DMAP可以用于核移植。
3 讨论
大部分理化激活方法, 都是在透明质酸酶对COCs脱颗粒细胞后进行的。对未脱颗粒的COCs, 透明质酸酶可作用于COCs颗粒细胞间质, 并刺激卵母细胞, 破坏, 溶解透明带, 从而加速卵母细胞内外物质的交换, 促进卵母细胞的活化。这说明透明质酶酸是一种较温和的激活剂。本实验采用HYA不同时间和浓度作用于卵母细胞, 随着作用时间和浓度的增加, 对卵母细胞的溶解, 破环增强。表明选择适当的浓度和作用时间对卵母细胞的继续发育有促进作用。
孤雌激活的胚胎发育能力受激活方法的影响很大, 电脉冲激活因其方便、高效、稳定性及重复性好, 不但可以使卵母细胞激活, 同时还有重组胚融合的作用, 因而被广泛应用。电激活的原理是卵母细胞在短暂高压电击下, 细胞膜上形成很多可恢复的微小孔, Ca2+可通过微小孔进入卵胞质中, 使细胞内Ca2+脉冲式升高。控制电刺激参数, 模拟正常受精过程Ca2+的节律性脉冲升高, 可有效地刺激卵母细胞完成第二次减数分裂[1]。研究表明, 随着电刺激活次数的增加, 卵母细胞活化率亦增加, 但激活次数过多, 囊胚率反而下降[2]。这与本实验的结果相同。联合几种方法激活可取得较好的效果。罗光彬[3]等采用直流电脉冲+乙醇+CHX复合激活处理后的卵母细胞激活率明显高于单一的乙醇或电脉冲处理的卵母细胞。叶荣等[4]研究采用4次电脉冲结合6-DMAP+CB处理, 均能获得较高的活化率, 卵母细胞在1.5kV/cm, 80μs和1.8kV/cm, 80μs两种场强刺激下的4-8细胞发育率出现显著差异, 表明加大电脉冲强度会影响活化后卵母细胞的发育。采用电刺激法处理时, 电激液、脉冲强度、电激次数等因素显著影响激活率[5]。本实验在不同的电压与脉冲次数激活卵母细胞均有卵裂率, 但有些后期没有发育到囊胚, 说明在高电压, 多次脉冲激活下和低电压, 脉冲次数为一次时 (没有有效引起钙离子波动) 均不能使卵母细胞发育到囊胚。发生作用的适宜参数还需要进一步证实。本实验采用物化联合的激活方法, 与化学方法相比差异不显著。这对体外生产核移植胚胎提供了一种可行的方法。
摘要：本文探讨了HYA (透明质酸酶) 的浓度和作用时间对牛体外成熟卵母细胞脱卵丘的影响, 不同强度电脉冲+乙醇+6-DMAP对牛体外成熟卵母细胞的孤雌激活作用以及和乙醇+6-DMAP激活的比较。对电融合脉冲强度, 脉冲次数进行了优化。结果表明:卵母细胞成熟培养22h, 用0.20%HYA作用10min或050%HYA作用5min效果较好。在激活电压16kV/cm、20μs/次、间隔1s, 脉冲次数为1次的条件下的激活效果较好, 在此条件下与乙醇+6-DMAP激活相比较, 孤雌激活胚胎的囊胚率分别为19.6%和26.9%, 差异不显著。
关键词：牛,卵母细胞,孤雌激活
参考文献
[1]廉莉, 廉颖, 吴琪等兔卵母细胞的孤雌激活[J].中国兽医科技.2003, 33 (4) :17-19.
[2]罗光彬, 金花子, 郑英彩等.体外成热培养20-22小时牛卵母细胞激活及孤雌发育的研究[J].中国畜牧牧杂志.2004, 40 (3) :10-12.
小鼠卵母细胞 篇4
1 犬卵泡发育的生理特性
卵泡是哺乳动物卵巢结构和功能的基本单位,卵母细胞在卵泡中发育成熟。犬卵泡发育历时170 d(由原始卵泡到排卵),卵泡最后增长开始于排卵前60～100 d,即休情期卵泡已开始增长[2]。犬卵泡颗粒细胞(GC)出现LH受体的时间比其他哺乳动物早。通常哺乳动物卵泡直径达到排卵前二分之一时才有LH受体的表达(例如牛卵泡直径达到1 cm时出现LH受体,2 cm时排卵[3]),而犬卵泡直径达到800 μm,即排卵卵泡直径的四分之一时就可检测到LH结合位点[4]。
犬卵泡黄体化不是发生在排卵后,在排卵前LH峰出现时,颗粒细胞已转化成大小黄体细胞。在发情早期(排卵前36～50 h)血清中,孕酮浓度为2 ng/mL,排卵时达到6 ng/mL。
犬多卵卵泡发生比例较高,1～2岁的雌犬中多卵卵泡的发生比例高达14%,7～11岁的雌犬中多卵卵泡的发生比例还维持在5%。由于从输卵管中冲出的卵母细胞数量大于卵巢表面黄体的数量,推测多卵卵泡可以排卵。尽管多卵卵泡可以排出多个卵母细胞,这些卵母细胞是否具有成熟、受精的能力还未被证实。通过对多个多卵卵泡卵丘卵母细胞复合体(COC)的形态及卵丘扩展现象评估,证实每个多卵卵泡中包含一个高质量的卵母细胞[5,6]。
2 犬卵母细胞成熟的生理特性
犬卵母细胞早期发育的许多超微结构变化与其他哺乳动物卵母细胞相同,但犬卵母细胞卵黄内含有大量脂类,使卵母细胞在镜下呈现黑色。卵泡生长时犬卵母细胞开始合成脂类物质,这也是卵母细胞开始成熟的标志。排卵后,犬卵母细胞外仍包裹卵丘细胞,卵母细胞在输卵管内停留较长时间,在此期间几乎不发生卵丘扩展,即使受精后放射冠仍然贴附在卵母细胞表面。
在犬、狐狸及其他犬科动物发生排卵时,卵母细胞处在第1次减数分裂前期,也就是说生发泡完整、第一极体还未排出时已排卵,因此犬卵母细胞离开卵泡后存活时间较长。排卵后卵母细胞成熟程序在输卵管内恢复,排卵后2～3 d卵母细胞成熟。
犬科动物卵母细胞卵泡外成熟时间,即在输卵管内存活的时间有种属特异性。犬卵母细胞在输卵管内长时间存活,经历成熟、受精(在输卵管峡部)、受精卵发育至胚泡期,因此至少在输卵管内滞留8.5～9 d,而不是其他哺乳动物的3～4 d。犬卵母细胞排出4 d后仍具有受精能力,因此排卵前2,3天到排卵后1周犬都可以配种,卵母细胞成熟过程中精子已可结合到卵丘卵母细胞复合体上。犬精子可在雌犬生殖道内存活11 d。
犬排卵时卵母细胞处于减数分裂前期Ⅰ,排卵后不立即恢复减数分裂。许多哺乳动物排卵前几小时,LH峰诱导生长卵泡卵丘扩展,卵母细胞减数分裂恢复(从前期Ⅰ到MⅡ期)。然而犬排卵前LH峰的功能还不清楚,LH峰持续24～72 h,LH峰后36～50 h排卵,见图1[6]。
3 犬排卵的生理特性
确定犬排卵的方法有几种,各种方法准确程度差别很大。最常用的方法是阴道涂片法,但这种方法的准确度不高。观察犬行为变化也是判断其是否排卵的一种方法,研究表明犬排卵发生在雌犬接受交配后的24～48 h。然而交配和排卵间时间差距因个体差异变化很大,通常排卵前5天到排卵后3天雌犬都接受交配。因此,依据雌犬行为不能精确判断排卵时间。
犬排卵的确切时间可以根据LH和孕酮浓度推断,LH峰的出现与排卵间的时间差距约为2 d(36～50 h)。然而LH峰的监测既耗时又昂贵,因此检测血清中孕酮浓度成为判断犬排卵的常用方法,排卵时血清中孕酮浓度为5～7 ng/mL。剖腹手术是另一种准确检测犬排卵的方法,可以打开腹腔观察卵巢表面卵泡发育情况,但这种方法对犬身体有伤害,需要麻醉,还有可能影响排卵。目前,比较常用的方法是腹腔超声波诊断法,对犬身体没有影响还可以准确检测卵泡的发育,但是临近排卵时需要每天观察2～3次。
排卵前,经一系列内源性LH峰的刺激,围绕在卵母细胞周围的紧实的卵丘细胞发生扩展,这种现象称为卵丘扩展或黏液化。犬LH峰后很短时间即发生卵丘扩展,直径为4～4.5 mm的卵泡具备发生卵丘扩展的能力[6],但是排卵后2～3 d仍有2～3层颗粒细胞紧紧包裹卵母细胞不发生扩展[6]。这说明颗粒细胞在犬卵母细胞减数分裂恢复过程中可能起重要作用。
犬排卵时,卵母细胞连同2～3 mL卵泡液排出卵泡,进入输卵管伞。排卵后44小时,卵母细胞位于输卵管中部,仍处于前期Ⅰ。排卵后48小时,卵母细胞恢复减数分裂(见图1),此时可观察到MⅠ期的卵母细胞,成熟的卵母细胞出现在排卵后48～54 h。犬卵母细胞在MⅡ期发生受精作用,但体内未成熟卵母细胞也可发生受精作用,只是比例很低(例如30只雌犬有112个MⅠ期卵母细胞发生受精作用)。犬MⅡ期卵母细胞在排卵后92～127 h降解,排卵后7天卵母细胞仍具备受精能力,9天时丧失受精能力[7]。
4 生殖激素对卵母细胞成熟的影响
卵巢内、外及卵泡内调节因子参与卵母细胞成熟,但这些调节因子是如何起作用的机理不清。哺乳动物卵泡生长主要受LH、类固醇激素作用,发情期血清中LH和类固醇激素浓度的变化能影响位于卵泡内的卵母细胞。犬发情期前血中卵泡刺激素(FSH)浓度约为100 ng/mL,排卵前LH峰出现时FSH浓度也增加。由于雌二醇负反馈作用,发情前期LH浓度非常低,几乎检测不到。排卵LH峰出现前1～2 d LH增加到8～50 ng/mL(平均20 ng/mL),雌激素水平变化很大,在发情期前或发情早期浓度达到50～110 pg/mL。
犬不同于其他家养动物的显著特点就是卵母细胞所处的卵泡内分泌环境,因排卵前卵泡颗粒细胞黄体化,孕酮浓度显著高于其他动物。犬排卵前卵泡液平均孕酮浓度(LH峰之后,血清中LH浓度达到6 ng/mL)达到7 700 ng/mL。
发情期,血清中雌激素浓度降低,孕酮浓度增加[从发情前期很低的浓度(0.8 ng/mL),到排卵前LH峰前急速增加(>1 ng/mL)]。犬血清中高浓度孕酮出现的时间与卵母细胞减数分裂恢复时间一致,因此孕酮可能在犬卵母细胞成熟过程中起重要作用,但其排卵前卵泡黄体化及孕酮分泌机制尚不清楚。一些研究表明,孕酮在卵母细胞减数分裂恢复过程中不起作用,这是由于犬卵母细胞体外成熟(IVM)时添加孕酮不能提高减数分裂恢复率[8],并且卵母细胞完全成熟时输卵管液中孕酮浓度很低。
雌激素能调节输卵管中分泌细胞的形态和功能,分泌依赖于雌激素的高分子糖蛋白,此糖蛋白是排卵、受精、胚胎早期发育时输卵管腔中主要的非血清蛋白。研究证实,犬编码输卵管中三部分糖蛋白的RNA与其他哺乳动物输卵管糖蛋白RNA高度相似。目前,输卵管糖蛋白在生殖过程中的功能还不清楚,只知道输卵管糖蛋白能导致精子获能、超激活,促进精子穿卵。
5 细胞因子对犬卵母细胞成熟的影响
多种细胞因子参与调控卵母细胞核、细胞质成熟。LH峰驱动的细胞间联系、细胞内离子组成的改变、细胞信号通路的启动导致卵母细胞核成熟启动和完成。促成熟因子(MPF)和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)是细胞周期活化的2个主要因子。触发犬排卵后减数分裂恢复的因子还不清楚,几乎没有关于犬卵母细胞信号通路机制的报道。已有研究证实,犬卵母细胞生发泡破裂(GVBD)时MPF有活性,随后染色质重排时MPF与微观组织者有关。因此,尽管犬排卵过程很特别,但其卵母细胞成熟的生化环境仍与其他哺乳动物有很多相似之处。
通常人们认为,哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复是颗粒细胞内高浓度的cAMP通过缝隙连接进入卵母细胞质,导致DNA去凝缩,抑制减数分裂恢复。LH峰后颗粒细胞和卵母细胞间的缝隙连接消失,卵母细胞内cAMP浓度降低,减数分裂恢复,即LH峰后卵丘细胞和卵母细胞解偶联触发减数分裂恢复[9],但犬卵母细胞减数分裂恢复的机制尚不清楚。
在犬卵丘卵母细胞复合体中,放射冠细胞发出缝隙连接通过透明带到达卵膜[10],甚至能达到核附近。犬排卵后2～3 d,卵丘颗粒细胞仍紧紧地黏附在卵母细胞周围,排卵后第2天缝隙连接开始萎缩,第3天完成颗粒细胞、卵母细胞解偶联[11]。在体外培养时,卵母细胞自发脱离,减数分裂恢复,卵母细胞中期率增加[12]。在培养液中,添加蛋白激酶A抑制因子RpAMPc和cAMP类似物——双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cAMP) 都不能使卵母细胞中期率增加,因此颗粒细胞在犬卵母细胞减数分裂恢复过程中发挥重要作用,但不是以cAMP为介质。
犬卵母细胞减数分裂恢复延迟可能因缺乏某种因子导致,这种因子来源于输卵管液或卵母细胞自身合成。同其他哺乳动物一样,排卵时犬卵母细胞转录失活,排卵后27～33 h核结构重排,转录启动。基因活动时间恰巧出现在减数分裂恢复之前,有助于更好地理解犬卵母细胞减数分裂恢复。
6 结语
许多哺乳动物包括人在内,可通过体外成熟、体外受精(IVF)技术获得胚胎。然而,目前尚无通过体外受精技术获得的幼犬。犬卵母细胞体外成熟技术不成熟是限制犬科动物辅助生殖技术发展的主要原因。犬卵母细胞体外培养时多数细胞胞质发育不成熟,导致体外成熟比例非常低,只有10%～20%的卵母细胞能达到MⅡ期,其余的卵母细胞都退化了。对犬科动物卵泡发育和卵母细胞减数分裂恢复机制的深入研究将有助于体外成熟技术的发展。
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小鼠卵母细胞 篇5
1 材料
卵母细胞,采集自北京市昌平屠宰场屠宰母猪卵巢,置于37℃添加双抗的生理盐水的不锈钢保温桶内运送回实验室。试验所用精液,均为全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心实验室制做的颗粒冷冻精液;一次性培养用具,CORNING公司生产;TCM-199,GIBCO公司生产;孕马血清促性腺激素(PMSG),天津市浮华高新生物技术公司生产;特级胎牛血清,天津TBD公司生产;如未标明均为Sigma公司产品。
2 方法
卵母细胞成熟(IVM)方法参考杨喜等[2]的体外成熟方法,选取包裹至少2层卵丘细胞、胞质均一的卵母细胞,卵母细胞成熟培养液以NCSU-23(北卡罗林那州大学23培养液)为基础,添加10 IU/m L PMSG,10 IU/m L人绒毛膜促性腺激素(h CG),25 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)以及0.1μg/m L 17β-雌二醇(17β-E2)。卵母细胞在39℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养48 h后,以排出第一极体为成熟判定标准。OPS的制作方法参照戴志俊等[1]的方法。
TCM-199+20%特级胎牛血清(FCS)并梯度添加蔗糖浓度分别为0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L、0.75 mol/L配制成梯度解冻液,置于培养箱内平衡,备用。解冻时将卵母细胞从液氮中取出在空气中停留1~3 s,再依次经过含0.75 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.1 mol/L蔗糖的解冻液脱去冷冻保护剂,解冻液处理时间分别为5 min、2 min、2 min、5 min,然后将解冻的卵母细胞移入平衡好的成熟液中,备用。解冻后未成熟的卵母细胞继续培养至成熟。
二乙酰荧光素(FDA)染色是鉴定卵母细胞是否存活的方法之一[3]。FDA可以检测冷冻对细胞膜及细胞内酯酶系统完整性和活性的影响。卵母细胞解冻后经FDA处理,在荧光显微镜下发出强绿色荧光判定为细胞存活,反之则细胞死亡。
采用罗丹明123(R123)检测线粒体损伤:将解冻后的卵母细胞置于39℃含0.11μg/μL R123的染液中染色10 min,洗脱染液观察,发强荧光的为存活卵母细胞。
2.1 冷冻保护剂[4]、卵母细胞成熟阶段对冷冻保存效果的影响
玻璃化冷冻液1:TCM-199+20%FCS分别添加1 mol/L、4 mol/L、6 mol/L甘油,处理时间分别为5 min、2 min、30 s,虹吸入OPS管内直接置于液氮中保存。
玻璃化冷冻液2:TCM-199+20%FCS分别添加10%、20%、30%、40%乙二醇,处理时间分别为5 min、2 min、1 min、30 s,虹吸入OPS管内直接置于液氮中保存。
玻璃化冷冻液3:TCM-199+20%FCS+5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分别添加10%、20%、30%、40%乙二醇,处理时间分别为5 min、2 min、1 min、30 s,虹吸入OPS管内直接置于液氮中保存。
分别选择卵母细胞体外成熟0 h、12 h、48 h 3个时期,解冻后继续成熟培养至48 h,观察成熟率、形态完整率、FDA阳性率、R123阳性率、卵裂率,对所得数据进行差异显著性分析。
2.2 程序化冷冻和OPS玻璃化冷冻的比较
用玻璃化冷冻液3作为OPS冷冻保护剂,选择体外成熟12 h和48 h的卵母细胞,比较程序化冷冻和OPS玻璃化冷冻的效果。其余方法同2.1。
2.3 数据的统计分析
所有试验均独立重复3次,并采用SPSS软件对数据进行统计分析。
3 结果与分析
3.1 冷冻保护剂、卵母细胞成熟阶段对冷冻保存效果的影响(结果见表1、表2)
%
注:同列同项数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05);同行数据肩标大写字母不同表示差异显著(P<0.05),大写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
%
注:同列同项数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05);同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表1、表2可知,体外成熟培养12 h的猪卵母细胞用乙二醇添加PVP进行玻璃化冷冻,解冻后体外成熟率、细胞的形态完整率与未经体外成熟的卵母细胞相比差异显著(P<0.05),与成熟培养48 h卵母细胞相比差异不显著(P>0.05)。但体外成熟培养12 h的猪卵母细胞用乙二醇添加PVP作为冷冻保护剂组的卵裂率和桑椹胚率要显著好于48 h组(P<0.05)。
3.2 程序化冷冻和OPS玻璃化冷冻效果的比较(结果见表3)
由表3可知,OPS玻璃化组与程序化组相比,体外成熟率、FDA阳性率、R123阳性率、细胞的形态完整率差异显著(P<0.05)。
4 讨论
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注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05);同行数据肩标大写字母不同表示差异显著(P<0.05),大写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
冷冻保存中最常用的冷冻保护剂是甘油、乙二醇、1,2-丙二醇和二甲基亚砜。玻璃化冷冻液是将一种或多种冷冻保护剂结合使用。将卵母细胞置于冷冻保护剂中,随着平衡时间的延长,卵母细胞的发育率降低。造成这种结果的主要原因是冷冻液中保护剂的化学毒性[5]。朱捷等人研究了乙二醇、甘油、1,2-丙二醇的化学毒性,结果表明,乙二醇对细胞的保护效果最好,化学毒性最小。化学毒性与温度有关,还与保护剂的种类有关。4种渗透性冷冻保护剂化学毒性由小到大依次为乙二醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜、甘油[6,7]。
冷冻保护剂浓度的选择十分重要,而且冷冻保护剂渗透性和毒性随着温度的升高而增大,因此在冷冻过程中常用不同浓度组合的玻璃溶液在不同温度下分2~3步对卵母细胞进行处理,来完成对卵母细胞的玻璃化过程。因此,卵母细胞玻璃化冷冻,既要使冷冻保护剂渗透充分,又不能使平衡时间过长,防止化学毒性对卵母细胞的损伤。
乙二醇作为冷冻剂,其特点是分子质量小、渗透性强、对细胞的化学毒性小。已经被证实乙二醇对鼠卵母细胞是无毒性的,并且还可以提高冷冻解冻后牛卵母细胞的存活率[8]。试验也证实乙二醇作为冷冻保护剂冷冻效果要优于甘油,这可能是由于乙二醇的化学毒性小于甘油。试验中添加5%非渗透性冷冻保护剂PVP,进一步提高了冷冻液的玻璃化程度,同时也可能进一步降低乙二醇的化学毒性。
不同发育阶段的卵母细胞对冷冻的耐受能力和冷冻损伤的修复能力也不尽相同,许多研究都已证明,未经体外培养的卵母细胞对冷冻的耐受能力和冷冻损伤的修复能力最差,与本试验结果一致。经过12 h的培养,卵母细胞恢复进一步发育的能力,但纺锤体等大的细胞骨架还没有形成,此时冷冻造成的损伤最小,解冻后进一步进行体外培养,有足够的时间修复冷冻造成的损伤。试验中,经体外成熟培养12 h后进行冷冻保存的效果也是最好的。
由于OPS玻璃化冷冻法使用管壁极薄的OPS管,最后装管是靠虹吸作用完成的,玻璃化液只有几十微升,其降温速率可达20 000℃/min,因其快速的冷冻速率可有效克服程序化冷冻中低温对卵母细胞的负面影响,使卵母细胞快速通过危险温区和冰晶形成的温区,有效避免了降温对卵母细胞的损伤,并且由于降温十分迅速不能形成冰晶,也将冷冻过程中的机械损伤降到最低[9,10]。试验中,用OPS玻璃化冷冻12 h猪卵母细胞解冻后成熟率达到(44.85±2.77)%,显著高于程序化冷冻组(P<0.05)。但在冷冻过程中所用高浓度抗冻剂对卵母细胞也可能造成毒性和渗透压损伤,因此今后研究的重点将是如何降低冷冻保护剂的化学毒性和渗透压损伤。
摘要：为了研究猪卵母细胞的开放性拉长脉管(OPS)玻璃化冷冻保存,试验采用不同的冷冻保护剂对比生发泡期(GV期)(体外成熟12 h)和成熟期(MⅡ期)(体外成熟48 h)猪卵母细胞的冷冻保存效果。结果表明:GV期猪卵母细胞的冷冻保存效果要优于MⅡ期和未经体外培养的猪卵母细胞;不同的冷冻保护剂相比,5%PVP+梯度乙二醇的冷冻保存效果最好。
小鼠卵母细胞 篇6
为了应对D S B s损伤, 生命体进化D N A损伤应答 (DNA-damage response, DDR) 机制, DNA损伤修复基因可修复由不同原因导致的DNA损伤, 防止错误遗传信息的传递, 保护遗传信息的完整性。现在已知有两种机制参与DNA DSBs的修复。一种是同源重组 (Homologous recombination, HR) , 也称为同源末端链接 (homologous e n d-j o i n i n g, H E J) ;一种是非同源性末端链接 (n o nhomologous end-joining, NHEJ) [2]。NHEJ在有丝分裂G1/G0期中起主要作用, 而HR在减数分裂, 有丝分裂晚期S/G2期以及胚胎细胞修复中发挥重要作用。DSBs由包括信号 (激酶) 或修复活性的蛋白识别。其中最重要的成员是是共济失调毛细血管扩张症突变基因 (ATM) 和同源的ATR蛋白, 两者皆由DSBs激活[3]。一旦被激活, ATM通过Mre11-Nbs1-Rad50复合体被募集到DNA双链断裂处, ATM磷酸化并激活细胞凋亡、细胞周期停滞以及DNA修复等的多个下游效应分子。ATM和ATR有三个重要功能:调节和刺激DSB修复, 细胞周期信号调控以及通过p53调控细胞凋亡[4]。
以前对于DSBs损伤修复通路研究最多最广泛的是癌症医学的靶向治疗方面。最初的研究发现, 患癌后经过化疗幸存的年轻女性, 其卵巢储备功能显著下降, 许多患者癌症化疗后生育能力显著下降或丧失, 提示化疗药物可能损伤卵巢功能和卵子质量[5]。进一步人的卵巢组织体外培养和小鼠体内实验发现, 化疗药物能够对人和啮齿类动物初级卵泡, 卵母细胞以及颗粒细胞以剂量依赖的方式造成大量的DNA双键断裂损伤, 而且这一损伤与卵母细胞凋亡以及ATM的激活有关[6]。不同的是, 啮齿类动物卵母细胞有通过基因毒性应激修复DSBs的能力[7]。乳腺癌敏感基因1即BRCA1 (breast cancer susceptibility gene1) 是ATM介导的DSBs修复基因家族中的关键成员。BRCA基因的突变, 是乳腺癌、卵巢癌和其他癌症发生的高危因素。随后的研究发现, BRCA1突变的女性在控制性超数排卵时, 往往伴随卵巢低反应的发生, 并且有卵巢早衰现象[8,9]。这些发现说明, DNA DSBs的修复能力对于卵巢储备和卵子凋亡都有十分密切的关系。
根据哺乳动物物种的不同, 卵母细胞停滞在生发泡期 (germinal vesicle, GV) 长达几个月甚至几十年之久, 直至它们恢复第一次减数分裂。这一长时间的静止期, 使得卵母细胞染色质能够遭受各种体内外因素影响, 从而导致DNA发生DSBs, 影响卵母细胞发育潜能和雌性生殖力。雌性的生殖力随着年龄的增加是逐步下降, 直至丧失的。随着年龄的增加, 雌性哺乳动物的卵巢储备功能而降低, 卵母细胞损失的比率明显增高。而所有的细胞, 包括卵母细胞和颗粒细胞, 其DNA损伤都是随着年龄的增加而加剧的。
γH2AX是研究DNA DSBs的标志基因。DNA双键断裂后, 组蛋白H2AX在DNA双键断裂处迅速磷酸化形成γH2AX焦点 (γH2AX foci) , 它的表达量可以衡量DSBs发生的程度。有研究发现, 老龄猕猴卵泡中颗粒细胞上γH2AX表达量相较于年轻猕猴显著增加, 但是BRCA1在卵子和颗粒细胞中的表达却是降低的[10]。人和啮齿类动物相应的研究发现, 卵母细胞中DNA DSBs随着年龄的增长而增加, 与此形成对应的是一些DSBs修复基因 (如BRCA1) 在卵母细胞中表达降低[11]。这说明, 卵母细胞中增加的DSBs与年龄引起的DNA损伤修复水平降低有关。但是在牛上的研究结果显示, IVM过程中DNA修复基因RAD51, APEX-1和MLH1的表达量升高, 但是只有RAD51的表达在年轻和老龄的供体牛中有差异[12]。
IVM和IVP过程中, 有些研究运用了许多方法制造DNA双键断裂, 如激光显微切割和药物处理, 从而揭示DSBs对于卵母细胞减数分裂进程以及后期胚胎发育的影响。博莱霉素 (Bleomycin, BLM) 或激光显微切割处理小鼠卵母细胞, 能够降低GVBD的发生, 并延长GVBD的时间。第一极体的排出也受到延迟, 但是一旦GVBD发生, 第一极体排出并不受影响[13]。这些经过DSBs损伤最终成熟的小鼠的卵母细胞能够被孤雌激活, 但是胞质内会形成多核或多微核。这说明在小鼠上DSBs抑制或延迟G2/M转变, 但是一旦GVBD发生, DNA损伤的卵母细胞可以完成染色体分离和第一极体排出, 此时纺锤体组装检验点 (SAC) 活性很高, 导致卵母细胞内形成多微核。进一步小鼠的体内外对比实验发现, 体外DSBs导致小鼠卵母细胞体外成熟过程中纺锤丝检测点的激活, 并且影响纺锤体微管着丝粒连接中断。尽管体外培养过程中发生了严重的DSBs, 还是会有卵母细胞能够成熟。但是腹腔注射BLM后对小鼠进行超排, 获卵数显著降低, 且卵子凋亡比例显著升高[14]。激光处理小鼠合子中的雄原核或雌原核, 胚胎发育能力显著降低, 这些合子最终形成不了囊胚。激光处理部分卵裂球最终发生凋亡, 而未处理的卵裂球则继续发育形成囊胚, 但是囊胚形成率和细胞数显著降低[15]。BLM处理猪的卵母细胞, DSBs的发生呈剂量依赖性, 但并不影响GVBD, 却阻碍卵母细胞的最终成熟, 表现为第一极体不排出[16]。
体外胚胎发育过程中, DSBs修复机制的研究意义是巨大的。尽管胚胎发生DSBs后会影响发育, 但是与体细胞相比, 胚胎的DSBs修复机制和能力是不同的。有研究发现, 猪的孤雌胚胎中, 早卵裂的胚胎DSBs较少, DSBs修复基因表达水平较低。早卵裂和晚卵裂的胚胎DSBs水平, 在囊胚期无差异, 这表明只有较少DNA损伤或者有超强DNA修复能力的胚胎才会发育至囊胚[17]。由于与人在卵泡波出现, 卵泡选择, 排卵以及和年龄相关的内分泌变化方面都特别相近, 牛已被公认作为一个合适的动物模型研究生殖力保存。在牛上, 体外受精胚胎合子期γH2AX的表达量显著高于孤雌胚胎和体细胞核移植胚胎。但在随后的发育阶段, γH2AX的表达量各组相当[18]。此外, 该研究中γH2AX表达量在体外培养的牛的胚胎中从1cell期到囊胚期是减少的, 这说明在牛体外胚胎发育过程中DNA修复机制发生作用, 但是这一机制是怎样参与调控的目前尚无报道。
尽管DSBs影响卵子质量与胚胎发育的研究已有报道, 但是只是针对某一修复通路里的某几个关键基因的表达。在配子发生和胚胎发育过程中, DSBs引起的DNA修复应答机制和关键通路的系统研究报道较少。综上研究显示, DSBs对不同物种卵母细胞、颗粒细胞和胚胎发育的影响是有差异的, 对同一物种体内外成熟的卵母细胞的影响也是有差异的, 甚至胚胎发育进程不同的胚胎影响也有差异。这些影响与DNA修复水平密切相关, 但是又存在许多差异, 需要系统的研究。
在不同的外源因素和内源生理状况下, 卵子发生和后期胚胎发育过程中, 参与DSBs损伤修复机制的基因, 是怎样突破染色体精确结构, 最终完成DNA修复, 维持基因组稳定或启动细胞凋亡过程的, 这一复杂调控机制尚不十分明确, 亟需进一步研究。
摘要：在体细胞中, DNA双键断裂 (DNA doubled-strand breaks, DSBs) 是目前已知DNA损伤中最为严重的一种。进一步的研究发现, DSBs能够引起哺乳动物卵母细胞凋亡, 导致生殖能力下降。针对DSBs后机体进行的DNA损伤应答通路的研究在生殖领域也成为热点。但是卵子发生和后期胚胎发育过程中, 参与DSBs损伤修复机制的基因, 是怎样突破染色体精确结构, 最终完成DNA修复, 维持基因组稳定或启动细胞凋亡过程的, 这一复杂调控机制尚不十分明确, 亟需进一步研究。
小鼠卵母细胞 篇7
关键词：Ghrelin,绵羊卵母细胞,体外受精(IVF),受精率
Ghrelin作为一种内源性生长激素促分泌素受体的天然配体[1],最早由Kojima发现,Ghrelin及其受体( growth hormone secretagogue receptor,GHS - R) 具有很强的促进生长激素释放的作用。Ghrelin在下丘脑、垂体、肾脏、胰脏、肠道、肺脏、胎盘、睾丸、卵巢等[2,3]多种组织中均有表达,在组织中的广泛表达决定了其功能的多样性。Ghrelin可以调节机体参与能量代谢[4],影响细胞增殖,促进个体生长发育; 另外其在生殖系统中的高表达充分说明Ghrelin对生殖系统也有重要作用[5]。随着对Gherlin的深入研究和相关技术的进步,使Ghrelin在畜牧业生产中的应用前景更加广阔,但仍有一些认识不是很全面。白瑞霞[6]研究发现,Ghrelin对卵母细胞的体外成熟有促进作用,那么在随后的体外受精过程中Ghrelin是否也有相应的作用。试验探索Ghrelin及其受体颉颃剂D - Lys3 - GHRP - 6 对绵羊卵母细胞体外受精的初步影响,为研究Ghrelin在生殖系统中的作用规律提供重要参考,为更好地满足科研和生产需求奠定更充实的试验基础。
1 材料
1. 1 样本采集
绵羊卵巢,采集于内蒙古呼和浩特市屠宰场,随机获得。冷冻精液,购自内蒙古呼和浩特市改良站。
1. 2 试剂
Medium 199,GIBCO公司生产; 促卵泡素( FSH) 、促黄体素( LH) ,宁波三生药业生产; 体外受精( IVF)液、胚胎培养液( Vltrolife) 、胎牛血清( FBS) ,由内蒙古农业大学兽医学院组织胚胎与发育生物学实验室自制; Percoll、雌二醇( E2) 、碳酸氢钠( Na HCO3) 、肝素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、青霉素、庆大霉素、链霉素、石蜡油,均由Sigma公司生产。
2 方法
2. 1 卵母细胞的获得及体外成熟
于内蒙古呼和浩特市屠宰场随机收集健康绵羊卵巢,并于1 ~ 2 h内用盛有生理盐水的保温杯运送到实验室。去除卵巢周围多余的结缔组织,并用卵巢保存液( Na Cl 8. 9 × 103mg + Mg Cl22 × 102mg + Ca Cl22 × 102mg + Ampicillin trihydrate 69 mg + Streptomycin sulfate 190 mg) 清洗卵巢2 ~ 3 次。运用刺剖法获得卵母细胞,并于显微镜下观察收集优良和较好的卵母细胞,卵母细胞的评价标准[7]为优良的卵母细胞: 卵母细胞周围有多层形态一致,胞质完整均匀的卵丘细胞; 较好的卵母细胞: 卵母细胞周围有较少或一层形态一致,胞质完整均匀的卵丘细胞; 较差的卵母细胞:卵母细胞很少或者没有卵丘细胞。用洗卵液( Medium 1 999. 5 mg + Na HCO32. 2 mg + sodium pyruvate0. 22 mg + HEPES 5. 958 mg + Ampicillin trihydrate0. 1 mg + Gentamine sulfate 7. 5 × 10- 3mg + streptomycin sulfate 0. 1 mg + 2. 5% FBS) 清洗卵母细胞2 ~3 次,再用成熟液IVM ( 8. 5 g / L Medium 199 +1. 9 g / L Na HCO3+ 10% FBS + 1 × 10- 2g / L FSH +7 × 10- 3g / L LH + 1. 3 × 10- 3g / L E2) 清洗卵母细胞2 ~ 3 次。将卵母细胞移入盛有成熟液的四孔板中,提前于37 ℃、适宜湿度、5% 的CO2培养箱中平衡30 min,于37 ℃ 、适宜湿度、5% 的CO2培养箱中成熟培养18 ~ 24 h。
2. 2 冻精激活
将冻精从液氮中取出后立刻放入40 ℃水浴中解冻,将Percoll浓度梯度离心液( 45% /90% ) 置于37 ℃ 、适宜湿度、5% 的CO2培养箱中平衡30 min,并将解冻好的精液置于其中,第1 次1 800 r/min离心6 min,弃上层离心液,取适量絮状沉淀再于1. 5 m L高氧液( HSOF) 液中1 200 r/min离心4 min,弃上清液,取少量沉淀于显微镜下检查离心后精子活力情况。准备好的获能精子有“swim up”的运动状态[8],收集活力较好的精子,备用。
2. 3 体外受精及胚胎发育
成熟培养优质和较好的卵母细胞用移液器吹打几次,去除周围的卵丘细胞,得到单个成熟的卵母细胞,于HSOF液中洗2 ~ 3 次,再于添加Ghrelin( 0 μg/L、300 μg/L、600 μg/L、900 μg/L、1 200 μg/L) 及受体颉颃剂D - Lys3 - GHRP - 6( 0 μg /L、10 μg /L、100 μg / L、1 000 μg / L) 的体外受精液中洗2 ~ 3 次,最后将清洗好的成熟卵母细胞移到盛有石蜡油覆盖的IVF小液滴的一次性平皿中。再将激活的精液以( 1 ~ 5) × 106/ m L的浓度加到含有卵母细胞( 20 ~30 / m L) 的IVF小液滴中,将混合的配偶子于38. 5 ℃ 、适宜湿度、5% CO2的培养箱中培养24 h,于倒置显微镜下观察受精情况,将已受精的受精卵用HSOF液洗2 ~ 3 次,充分洗去精子后,用胚胎培养液洗2 ~ 3 次后移入覆有石蜡油且含有胚胎培养液的液滴中连续培养7 d,每48 h更换1 次胚胎培养液,以保证胚胎发育有充足的养分。根据卵裂率观察统计添加不同浓度Ghrelin及其颉颃剂D - Lys3 - GHRP- 6 对体外受精率的影响情况。
2. 4 数据的统计分析
采用SPSS软件进行单因子方差分析( one - way ANOVA) 并进行数据统计,数据以平均值 ± 标准误表示,每组重复3 次。
3 结果与分析
3. 1 精卵结合后受精情况观察
精子与卵子结合后,镜下可明显观察到精子与卵母细胞周围开始出现精子聚头( 见图1) ,并推动卵母细胞旋转。
3. 2 不同浓度Ghrelin及其颉颃剂D - Lys3 - GHRP -
6 对绵羊卵母细胞体外受精率的影响( 结果见表1、表2)
由表1、表2 可知,Ghrelin及其颉颃剂组与对照组相比差异均不显著。
4 讨论
注: 括号内数据为百分数。
注: 括号内数据为百分数。
