胰岛移植（精选五篇）
胰岛移植 篇1
1胰岛细胞的来源
1.1 同种异体移植
异体胰腺 (尸体或死婴) 分离纯化获取胰岛, 是提供临床胰岛移植的主要来源。理想胰腺供体应该是来自脑死亡志愿捐献者心脏停搏前的健康胰腺。成人尸体胰腺与死婴胰腺相比可供分离的胰岛虽然较多, 分泌胰岛素稳定, 但成人胰岛免疫原性强, 耐免疫排斥差, 需终生采用免疫抑制。胎胰岛免疫源性弱, 增殖力强, 但胎胰岛含量少, 数个供体方能满足一个受体需要, 且在伦理方面存在争议。
1.2 异种移植
异种移植供源有限, 学者们积极寻找异种胰岛来源。研究显示, 实验鼠、猪胰岛移植对高血糖动物均有可靠的降糖作用[2]。猪胰岛素与人胰岛素的氨基酸排列最接近, 仅有一个氨基酸不同, 已用于临床治疗T1DM数十年。猪是临床胰岛移植的最佳异种供体之一。但人体存在天然抗体, 临床研究发现对受体的免疫耐受和免疫抑制仍存在很多尚待解决的问题, 所以异种移植成活率低, 加上种间疾病传播的可能性, 异种 (猪) 供体用于临床胰岛移植尚需深入研究。近年来, 国内学者探索并验证了不同人种异种胰岛移植免疫排斥的特殊规律, 为解决胰岛移植的供体来源辟出了新途径。
1.3 干细胞移植
干细胞移植是具有巨大潜力的新型移植方式, 为自体细胞移植提供了广阔前景。关于胰腺干细胞的定位有以下观点: (1) 胰腺导管; (2) 胰岛; (3) 胰腺腺泡。胰腺干细胞的提取方法通常是对动物模型采用胰管结扎、胰腺大部分切除及STZ诱导建立再生模型, 将新生细胞置于培养基中使其向胰岛素分泌细胞分化, 运用RT-PCR、免疫组化及免疫荧光染色等技术对其表面标志物进行检测。目前, 已经发现许多种可能的胰腺干细胞标志物, 由于对胰腺干细胞的定位比较模糊, 因此在许多研究中, 把一些能够向胰腺细胞横向分化的其他谱系的干细胞标志物 (如神经干细胞、骨髓干细胞及肝干细胞) , 也看作是胰腺干细胞可能的表面标志。目前已被发现的标志物: (1) 神经巢蛋白 (nestin) ; (2) 胰十二指肠同源异型盒基因 (pancreatic/duodenalhomebox-1, PDX-1) ; (3) 细胞角蛋白 (cytokeratin, CK) 。已经发现胰腺内多种细胞如胰腺导管上皮细胞[3]、nestin阳性细胞[4]具有诱导分化为产胰岛素细胞的能力, 但并不能成为它们就是胰腺干细胞的直接证据。Dor等[5]通过实验认为, 在胰腺部分切除的小鼠体内, 新生的β细胞来源于胰岛内原先即已存在的β细胞的自我复制, 而不是来源于胰腺干细胞。由于器官发育起源时期的同源性以及发育过程中体内多种因子作用的复杂性, 胰腺干细胞的标志物呈现多样性。仅仅通过一种表面标志物就对胰腺干细胞定位定性颇有难度, 这种方法灵敏度较高, 但特异性不高。对于目前已经发现的多种可能的胰腺干细胞, 在体外应该对其如何处理, 即通过何种方法可以诱导其成为令人满意的内分泌细胞, 将其移植到人体后, 需要通过何种途径才能控制和操纵使其发挥正常的作用而避免其生长失控产生不良后果 (如畸胎瘤形成) 还需进一步探讨[6]。
2胰岛细胞制备技术
2.1 胰岛的分离和纯化
供胰岛缺血时间>30min时胰岛产量和活性降低, 冷缺血时间>12h人胰岛产量明显减少[7], 大多数学者认为不应>8h, 胰岛细胞收量要求在6 000～8 000 IEQ/kg以上。胰岛分离纯化方法很多, 一般采用胶原酶灌注-不连续密度梯度法分离胰岛。将尸体胰腺经腹主动脉灌注4℃的UVV (VVisconsin) 液后切取胰腺, 置0℃的UVV液中保存。胶原酶灌注步骤:无菌条件下切取胰体尾部用于胰岛分离 (胰体尾部含大量胰岛且胆汁污染机会少) , 经主胰管灌注胶原酶。胶原酶为金属蛋白酶, 通过分解胶原蛋白松解胰腺组织获得胰岛。其活性发挥依赖金属离子锌和钙, 因此消化液中应加入钙成分。通过机械扩张和酶的消化, 将胰岛组织分离出来, 然后移入全自动细胞分离机分离纯化胰岛, 在体外严格筛查和鉴定, 进一步离析杂质, 达到纯化目的[8]。胰岛分离纯化过程影响因素很多, 如:胰腺消化过程中产生的凝胶样物质量, 分离纯化技术及设备条件等都会影响胰岛产量。原位整体灌注法获得的细胞团块较多, 单细胞较少, 移植效果好。相关实验证实, 单细胞在移植后耐免疫排斥, 保持细胞膜完整性及分泌胰岛素功能比胰岛细胞团效果差。但London发现, 胶原酶分离胰岛的方法是易变和不可预测的, 原因是胶原酶的性质不稳定及组织在胶原酶作用下有修复和保存的双重作用。提高离心后纯度值关键是调整好梯度密度的溶剂组成, 而困难在于找到一种既不损害胰岛产量和成活率, 又能最大限度减少腺泡组织膨胀的溶剂。Huang等[9]使用UVV液配制Euro-Fi-coll的连续密度梯度离心纯化胰岛, 可进一步提高胰岛的纯度>95%, 而胰岛的收获量由每次分离218 000个提高到435 318个, 胰岛细胞活力由65.4%上升到92.1%。将不同浓度的乌司他丁加入灌注液中, 乌司他丁可有效抑制消化胰腺过程中释放出的胰蛋白酶, 减少了其对胰岛的破坏作用, 提高了胰岛的质量和数量[10]。
2.2 胰岛细胞的培养和保存
胰岛细胞经分离后应经过一段时间才能形成成熟的稳定结构, 因此在移植前应对胰岛进行适当的培养。经过培养, 可减少胰岛移植物的免疫原性, 提高其分泌功能。将胰腺置于4℃Hanks液漂洗2次, 清除胰腺包膜、周围血管和结缔组织, 制成1mm小碎片进行培养。培养液多采用RPMI 1640或TCM-199液, pH 7.2, 于37℃含5%的CO2孵箱培养2～40d, 经检验无菌和胰岛功能良好即可移植。Lione用胎牛血清 (FBS) 和鼠血清 (RS) 分别培养, 进行pseudo胰岛的基因表达和再聚集能力的评价, 结果证实RS培养液中的pseudo胰岛基因表达和再聚集能力是FBS的10倍, 因此认为RS可作为培养pseudo胰岛的首选。
超低温利于胰岛细胞保存和成活, 且低温保存的胰岛具有良好的胰岛素反应性。保存温度通常在-196℃, 保存数月或数年。维持复温后移植物活性关键是冷却度和复苏率的控制。
2.3 移植物的质量评价
成年大鼠胰岛用双硫腙 (DTZ) 进行胰岛细胞鉴别染色, 胰岛呈鲜红色, 对细胞毒性小, 且染液易保存, 而吖啶橙 (AO) -碘丙啶 (PI) 染色能识别凋亡细胞, 可见绿色及红色荧光, 绿色荧光为胰岛活细胞, 死亡细胞发出红色荧光, 着色鲜明, 荧光持久。上述两种染色能对胰岛的纯度、数量和成活率作出精确鉴定。
3免疫隔离技术
3.1 微囊化处理
宿主对移植物的免疫排斥反应导致移植失败, 一直是阻碍器官移植技术发展的一个重大难题。随着生物工程技术的发展, 尤其是微囊化人工细胞技术的诞生, 为解决这一难题提供了新的契机。目前多采用具有较好的生物相溶性海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠 (alginate-polylysine-sodium, APA) 膜。微囊化人工细胞即是制备具有半透膜功能的小球囊, 将功能细胞包裹于此球囊内, 微囊膜允许通过小分子物质, 囊内的细胞可以透过微囊膜与外界进行物质交换, 获得营养和排出代谢废物, 而大分子量的免疫球蛋白不能通过, 从而避免免疫损伤。微囊直径越小越好, 一般在0.4～0.6mm, 由于多聚赖氨酸成本高, 价格昂贵, 目前有研究表明可以采用壳聚糖替代[11]。孙铭等[12]采用APA微囊包埋猪胰岛, 在16d的培养期间可持续分泌胰岛素, 囊内胰岛细胞生长良好, 微囊无溶解和破碎。糖尿病大鼠体内移植微囊杂种猪胰岛5 000～6 000U, 可明显降低动物模型血糖, 并持续7～11d。国外已开始微囊化人胰岛细胞移植治疗糖尿病的临床研究, Claiborne等[13]报道2例微囊化同种异体胰岛细胞移植治疗1型糖尿病有效的病例。
3.2 其他人工细胞技术
大囊包被技术是用直径0.6～0.8cm琼脂糖和胶原大囊包被大鼠胰岛, 是移植前长期保存胰岛的理想方法, 其机理可能与琼脂糖形成的人工膜能将异种胰岛与宿主免疫系统隔离, 使其逃离免疫识别并阻止其对宿主免疫系统的刺激有关。弥散腔人工胰岛技术是利用硅晶片制成弥散腔, 表面覆盖多晶硅滤过膜, 膜上有大小一致直径20nm的孔洞, 对O2、葡萄糖、胰岛素具有良好的通透性。能有效防止免疫分子和移植物病原体通过。中空管状膜血管内装置利用中空纤维作为动静脉短路形式的移植, 使植入的胰岛直接从血循环中获得营养物质和氧供应, 移植后胰岛细胞具有良好的血糖-胰岛素反应, 周围无免疫细胞浸润, 但易于形成血栓、管腔吻合口感染。
3.3 抗体预处理
胰岛移植后免疫排斥主要是细胞免疫[14]。激活受体CD4阳性细胞, 引起细胞免疫排斥反应的是MHCⅡ类分子, 主要存在于抗原递呈细胞 (APC) 和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等细胞表面。移植物成人胰岛经抗MHCⅡ类单抗预处理或短期24℃培养, 能明显减弱其免疫原性, 对胰岛功能无明显影响[15], 可以减轻移植排斥反应, 减少术中及术后免疫抑制剂用量。亦有研究正在进行对猪的HLA基因实施敲除后培养繁殖, 后代的胰岛细胞移植入人体后可望突破排斥和猪内源性逆转录病毒传染的瓶颈。
3.4 免疫特惠部位移植
胰岛移植部位要求可重复, 安全有效。有人研究了猪胰岛在糖尿病大鼠脑室、胸腺、肾包膜下、门静脉等具有“免疫特惠”部位移植的效果, 认为从免疫学角度看脑室是最适宜猪胰岛移植的部位;但多数胰岛移植采用门静脉灌注入肝脏的方法, 因为在生理功能上门静脉内是作用最迅速的部位。Posslet等[16]报道, Lewis和VVF大鼠间的胸腺内胰岛移植, 同时单次应用抗淋巴细胞血清, 移植物获长期存活。单纯胸腺内移植, 胸腺对其内部的胰岛移植物应该有一定的保护作用, 移植物存活时间应该明显长于单纯肾包膜下移植, 但有人在实验中发现2组移植物存活时间比较, 无显著差异, 可能为受体免疫系统已经发育成熟, 外周淋巴细胞可独立完成免疫排斥反应, 对植入抗原发起攻击。说明免疫特许也是相对的不完全的, Valdes-Gonzalez等[17]报道了墨西哥Infantil医院的猪胰岛移植结果, 他们采用共移植睾丸sertoli细胞和胰岛细胞来治疗糖尿病。证明了sertoli细胞对猪胰岛的保护作用, 提示共移植此2种细胞有可能避免强排斥反应。但有人在猴身上重复了这一实验, 未取得明显效果[18]。
胰岛移植治疗DM显示了巨大的临床价值和前景。但供体来源及免疫排斥问题以及合理的免疫特惠部位植入方法选择仍是当前面临的主要问题。随着干细胞研究的深入, 分子生物学的发展, 新型免疫诱导及抑制剂的研发, 胰岛移植必将成为T1DM治疗的有效手段。
治疗糖尿病的胰岛细胞移植 篇2
近日，一位被这一顽疾折磨多年的16岁少女却从“病魔的掌心中”成功获救，而令她重获新生的“法宝”，就是基于一项最新研究成果的——
16岁少女朴雯楠这是和妈妈第二次从老家庆安来到哈尔滨，目的是到哈尔滨医大附属第一医院进行身体复查。与她们第一次来此相比，心境是迥然不同的，可谓天壤之别。这是为什么呢?
朴雯楠患有I型糖尿病，由于胰岛细胞功能丧失，她只能靠注射胰岛素来维持血糖水平，然而低血糖、休魔、酮症酸中毒仍在不断地威胁着她的生命。抱着最后一丝希望，妈妈带着她第一次来到哈尔滨。在被列为卫生部细胞移植重点实验室的哈尔滨医大附属第一医院的外科病房里，专家们在对朴雯楠进行了细致检查后认为：由于注射胰岛素这种外源性的补救方法存在着治标不治本的问题，而治疗此类患者的关键是在于重建胰岛细胞分泌胰岛素的功能。因此，决定为朴雯楠施行世界上首例人胚与成人胰岛细胞联合移植术。
所谓胚胎胰岛细胞和成人胰岛细胞联合移植技术，就是先从成人胰腺中提取出20万个胰岛细胞，从胚胎中提取1．1万个胰岛细胞，经分离纯化，在严格的时间限制内注入到患者体内(图1)。注射部位选择在肝脏门静脉系统，因为这个地方有着丰富的血液供应和特殊的压力组织结构，非常利于移植胰岛细胞的长期存活，以及发挥胰岛细胞的分泌功能(图2)。就这样，在医生利用介入技术把提取到的胰岛细胞注入到朴雯楠体内后(图3)，母女两心情忐忑又满怀希望地离开了哈尔滨。
那么，这次来哈尔滨的复查结果如何呢?
经过复查，胰岛细胞联合移植的排斥反应比较小，只用了极少量的抗排斥药物就解决了人们最关心也是最担心的受体对外来细胞的排斥问题。如今，朴雯楠的各项指标都很正常，表明移植的胰岛细胞已经存活并开始发挥其重要功能。
胰岛移植 篇3
1 胰岛移植的分类
目前, 胰岛移植可分为胰岛细胞移植和胰岛干细胞移植2种方法。胰岛细胞移植是提供正常胰岛细胞组织来替代病人体内已被疾病所破坏的胰岛细胞, 从而维持正常血糖水平, 阻止并发症的发生。胰岛细胞移植可以分为自体胰岛细胞移植、同种异体胰岛细胞移植、异种胰岛细胞移植等。而胰岛干细胞移植又可分为成体干细胞移植与胚胎干细胞移植两大类。细述如下。
2 胰岛细胞移植的基础研究与临床应用
2.1 自体胰岛移植
自体胰岛移植主要适应证为慢性胰腺炎伴随顽固性疼痛或者引流失败的病人在全胰切除后所致的外科源性糖尿病。虽然移植效果较好, 但胰岛细胞移植需要解决移植部位的选择、移植量的确定和免疫排斥反应几个关键问题。目前多通过介入的方法行肝动脉或门静脉内胰岛细胞移植, 但可能引起血栓形成或炎症反应;机体维持正常代谢所需动用的胰岛与人体含有的全部胰岛数目相差悬殊。内环境代谢水平的波动要求机体随时调整所动用的胰岛数目[2]。故而, 要使IDDM病人取得胰岛素非依赖的确切胰岛移植量还很难确定。
目前, 对于免疫排斥的防治有以下几个方面:改变供体免疫源性、诱导免疫耐受、基因工程、免疫抑制剂应用和免疫隔离 (微囊) 技术。就免疫抑制剂而言, 仍然有必要探索更有效的免疫抑制方案。Edmonton方案无疑是重要的一步, 也证明低剂量FK506和雷帕霉素联合、以抗IL-2R单克隆抗体诱导、无激素的免疫抑制方案是较为理想的组合[3]。
2.2 同种异体胰岛移植
同种异体胰岛移植是目前研究的热点。同种异体胰岛移植主要适应证为1型糖尿病并发晚期肾功能衰竭和上腹部恶性肿瘤联合脏器切除后所致的外科源性糖尿病。2000年, 胰岛细胞同种异体移植取得很大进展, 加拿大Edmon2ton的Shap iro实验室的移植方案 (Edmonton方案) 使连续7例胰岛移植病例在术后1年保持胰岛素非依赖。这一方案成功的关键在于严格的病例选择、及时分离胰岛、使用不含激素的免疫抑制方案和足够的移植数量, 其移植的胰岛数量达到9000mol/L, 平均每个受体接受了2~4个供胰的胰岛[3]。
2.3 异种胰岛细胞
异种胰岛移植有可能成为最先获得成功的临床异种移植。来源的首选是猪胰, 原因在于猪胰来源广泛, 其血糖调节范围与人近乎相同, 而且猪胰岛素已用于治疗IDDM多年。胰岛组织本身不具有强烈的种属抗原性, 而且异种胰岛与人的MHC不相容, 理论上不应受到自身免疫的破坏。由于猪胰岛素结构与人胰岛素的结构十分相似, 已多年用于糖尿病治疗, 因此分离、培养后抗原性弱的胎猪胰岛细胞是异种移植最有希望的器官[2], 可解决供体短缺的问题, 而且在1型糖尿病中还可以避免移植人胰岛可能招致的自身的免疫攻击。
2.4 胰岛干细胞移植
(1) 成体干细胞移植:研究发现, 正常的胰腺组织中, 有0.01%的导管上皮细胞能够表达胰岛细胞相关激素的基因, 并在一定的刺激下经过形态学的变化, 形成新生胰岛。这一诱导过程在实验室里可通过大豆胰酶抑制剂, 或高浓度的γ2干扰素, 或特异性生长因子刺激, 也可通过胰腺部分切除或是将胰头用玻璃纸包裹而诱发。研究报道从长期培养的糖尿病鼠胰腺导管上皮细胞中分化出有功能的胰岛组织。含有的胰岛细胞, 可表达相关的分子标志, 在糖尿病小鼠体内移植后能够矫正其血糖水平, 使动物摆脱胰岛素依赖[3]。
(2) 胚胎干细胞移植:1998年Thomson等首次报道体外成功地培养了人胚胎干细胞, 此后胰岛干细胞也逐渐成为热点。首例造血干细胞移植治疗1型糖尿病在上海解放军四五五医院获得成功, 这标志着1型糖尿病治疗获得突破性进展, 该患者已停止使用胰岛素注射1年多。造血干细胞可以协助患者重建正常的免疫系统。而目前采用的非清髓造血干细胞移植治疗1型糖尿病方案, 药物副作用小, 安全系数高。根据国外5年长期随访跟踪结果显示, 移植后的1型糖尿病患者有90%以上停用或减少了胰岛素注射。
3 展望
虽然胰岛移植治疗1型糖尿病还有许多要做的工作, 但是我们认为胰岛移植治疗1型糖尿病有着很大的应用前景和潜力, 也存在很多问题和难点需要解决, 尚须大量的重复实验和深入研究。
摘要：众所周知, 1型糖尿病是一种自身免疫性疾病, 1型糖尿病患者大约占总糖尿病患者的5%～10%, 为儿童与青少年最常见的内分泌疾病。研究认为它的产生根本原因是在于多种因素共同作用下, 机体对胰岛素多种抗原成分免疫欠耐受, 导致了针对胰腺β细胞的自身免疫性破坏。
关键词：1型糖尿病,基础研究,临床应用现状
参考文献
[1]邵成雷, 张玲.1型糖尿病治疗研究进展[J].广州医药, 2004, 35 (1) :6～9.
[2]田志杰, 岳嘉宁, 全志伟.胰岛移植治疗1型糖尿病的研究进展[J].中国实用外科杂志, 2006, 26 (2) :142～144.
胰岛移植 篇4
与胰腺移植相比胰岛移植风险较小
随着科技的发展，医疗技术的不断创新，大家将治疗糖尿病的方法关注在器官移植上，即：胰腺移植。2002年公布的胰－肾联合移植结果表明，接受移植者3年内生存率为70％～80％，与其他类型的移植结果相当。对于胰腺移植成功者，其糖尿病的治疗作用相当有效，血糖控制可以达到正常，体位性低血压(站立时血压过低)、腹胀、腹泻症状均显著改善，寿命延长。单纯进行胰腺移植10年内血糖稳定者，其原有的肾脏病变可以逆转。因此，美国糖尿病学会在2000年和2002年均推荐需要进行肾移植的糖尿病，肾病患者，在肾脏移植的同时进行胰腺移植，对于经严格内科治疗不能实现良好血糖控制，血糖波动较大，影响生活质量的患者，有条件时可以考虑进行单纯的胰腺移植。虽然胰腺移植已经成为一种临床选择，但由于其属于有创大手术，对组织配型、免疫抑制(避免器官排异)要求较高，仍有20％～30％的死亡率，因此仍仅限于因肾功能衰竭以及危及到生命的情况。胰岛移植由于不需要开腹手术，手术风险较小(胰岛移植过程见附图)，因此，有可能将来代替胰腺移植成为治疗1型糖尿病的手段之一。那么，开展的胰岛移植能否成为今后治疗1型糖尿病的常规方法呢?
胰岛移植具有美好的前景
胰岛移植开始于1894年，由于当时没有采取抗免疫排斥治疗以及采用的是羊胰腺，移植治疗注定了失败。1972年，利用正常大鼠的胰岛治疗一种1型糖尿病模型大鼠获得成功；1980年，自体胰岛移植在人体试验获得成功，同年的同种异体胰岛移植也获得成功。此后，胰岛移植病例逐年增加，但是全球胰岛移植成功率仅在10％左右，非常令人失望。
2000年，加拿大埃德蒙顿报道采用了一种非皮质激素抗排斥方案以及多次重复移植策略，使胰岛移植的成功率达到100％(7例病人)，再次使人看到了胰岛移植治愈糖尿病的希望。2001年之前共进行493例同种异体移植，240例自体移植。为此，2001年美国国立卫生院专门斥资成立了北美合作胰岛移植注册移植研究(CITR)。该组织在2001～2004年期间共进行了138例胰岛移植，其中118例为单独进行胰岛移植，19例联合肾移植，1例为自体移植。138例接受移植者1年后58％的患者完全脱离胰岛素；33％的患者虽然减少了胰岛素剂量，但是仍需要胰岛素治疗；9．1％的移植手术失败。1／3的患者只接受一次移植，1／2的患者进行了2次移植治疗，1／5的患者进行了3次治疗，1例患者进行了4次治疗。接受胰岛移植的患者血糖均达到血糖控制的目标。相关不良事件共发生287次，其中114次属于一般不良事件，52次属于严重不良事件，均与抗免疫排斥和胰岛输注有关，经过住院治疗，没有死亡事件发生。这再一次证明了胰岛细胞移植对1型糖尿病的治疗作用，但也同时提示成功的胰岛移植需要以下先决条件：足够的胰腺来源(50％的患者需要进行2次治疗)；安全有效的抗免疫排斥治疗；胰腺组织新鲜程度、胰腺消化处理、体内移植熟练程度也是影响移植成功的因素。2005年，日本京都的医疗小组进行了全球第一例活体胰岛移植，更是给胰岛移植带来了光明前景。
条件制约胰岛移植普及仍需等待
目前需要进行胰腺移植和胰岛移植的人数大大超过供体的数量，严重限制了该项治疗技术的推广应用。解决这个问题需要加大投入寻找其他替代品，如干细胞、其他动物源细胞研究等。目前，此两类来源细胞要想用于人类，为期还十分遥远。
在其他器官移植，如肾移植。肝移植等，用于抗免疫排斥的药物使用增加了糖尿病的发病率，提示抗排斥药物会严重影响胰岛移植的成功率，虽然埃德蒙顿免疫抑制方案已大大地提高了胰岛移植的成功率，但是目前也只有3年的应用经验，随着移植时间的延长，接受移植者的胰岛素非依赖状态逐年减少，可能提示除了胰岛细胞的自然死亡外，也不能排除抗排斥药物对胰岛细胞的毒性作用，因此，仍需大力研究对胰岛细胞毒性更小的抗免疫排斥的药物或方案。而经肝门静脉胰岛移植者除了免疫排斥药物的不良反应外，有些患者还发生了静脉血栓形成、腹腔内出血，需要抗凝治疗，个别患者甚至需要开腹手术治疗。虽然没有发生死亡事件,但是仍旧有危及生命的风险。另外，需要明确的是目前公认1型糖尿病是自身免疫性疾病，糖尿病患者已经激活的免疫反应的持续存在也将影响胰岛移植的成功率。有研究显示，1型糖尿病相关的自身抗体的持续存在是影响移植成功率的关键因素之一，为此探讨可以实现持久免疫耐受的机制和方法也是今后研究的重大课题。再者，目前仍缺乏胰岛移植后长时间的胰岛功能维持的情况、胰岛移植对慢性并发症的影响、胰岛移植的长期安全性等问题。最重要的是目前成功率仍不能完全达到100％，有部分患者虽花费巨大，仍旧移植失败。
根据我国国情胰岛素注射仍是首选
胰岛素及其注射技术的改进已经大大提高了糖尿病的治疗水平。目前胰岛素的种类繁多，价格适中，能够充分满足绝大多数糖尿病患者的治疗，尤其是胰岛素注射泵以及吸入胰岛素技术的出现，大大地方便了1型糖尿病患者。结合目前胰岛移植的现实情况及我国医疗状况和人民生活水平，现阶段1型糖尿病患者的常规治疗方案应当还是胰岛素治疗。胰岛移植仍为研究阶段的实验治疗，仅适用于那些需要同时进行肾移植或其他器官移植的糖尿病患者，或者因为糖尿病脆性(血糖波动十分大)而可能会危及生命的患者。另外，为加快胰岛移植治疗技术的研究，也建议提高政府研究基金投入、建立民间研究基金、提高人们捐献器官的认识程度，建立全国移植协作组织，以提高胰腺器官的利用率及胰岛移植的成功率。
作者简介
苏本利 大连医科大学附属第二医院内分泌科主任、教授、医学博士。从事糖尿病临床工作17年，现任中华医学会糖尿病学专业委员会第四届青年委员、中华糖尿病杂志通讯编委，辽宁省医学会糖尿病专业委员会副主任委员。
胰岛移植 篇5
1 材料和方法
1.1 材料
新生3d 内清洁级SD 大鼠乳鼠,体重10 ±2g ,雌雄不限;5 周龄雄性SD 大鼠,体重200 ±15g。均由辽宁医学院实验动物中心提供[合格证号:SCXK(辽)]。Ⅱ型分散酶(dispaseⅡ);0.125%胰蛋白酶( Tryp2sin) (美国Hyclone 公司);Ⅱ型胶原酶、D2Hank's 液;10 %胎牛血清(FBS ,杭州四季青公司) ; 兔抗磷酸化AKT抗体 (SantCruz公司);兔抗大鼠β-actin单克隆抗体( Sigma公司)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠
MDSCs的分离、培养取新生3d的SD乳鼠6只;浸入75%的医用酒精中,5min×3次,处死并消毒;无菌条件下取前肢肱三头肌,后肢腓肠肌,尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织;用PBS液漂洗2次,将肌组织移入一小平皿,用眼科剪剪成乳糜状;加入1%的Ⅰ型胶原酶3mL,37℃消化30 min;加入0.25%的胰酶3mL,37℃消化45 min;加入5倍体积的胎牛血清中止消化,反复吹打后滤过200目的筛网,收集滤液,1000 r/ min离心7min,室温静置5min弃上层液,细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬,移入培养瓶中,该培养瓶称为PP1。PP1于37℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜,随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养,此为PP2。此后连续4d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中,分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用,PP6用于进一步的鉴定实验,细胞在达到约70%汇合时必须传代。37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2细胞培养孵箱中培养。
1.2.2 大鼠MDSCs的免疫荧光鉴定
取PP4中的MDSCs培养到第3代时,把细胞培养在6孔板中的盖玻片上,第5天细胞生长达70%～80%汇合,用75%乙醇固定30 min,PBS洗5 min,2次;加入5%BSA封闭液,常温下静置1h,封闭非特异性结合,不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗(1:100),37℃孵育2 h;PBS洗5 min,3次;滴加羊抗小鼠FITC(1:200),避光孵育30 min;PBS洗5 min,3次;50%缓冲甘油封片,置于荧光显微镜下观察,选取不同视野照相。
1.2.3 糖尿病模型的建立
用0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.4)将链脲佐菌素配制成2%注射液,取32只大鼠,空腹12 h后通过尾静脉注射45 mg/kg体质量的链脲佐菌素,分别于注射前、注射后48 h,4 d,8 d空腹断尾采血,血糖仪测定全血血糖浓度,连续3次血糖浓度高于16.7 mmol/L的大鼠视为糖尿病模型鼠。余8只大鼠作为正常对照组,同法注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
1.2.4 细胞移植
糖尿病模型鼠随机分为3组:实验a组8只,胰腺被膜下移植肌源性干细胞约2×106个;实验b组8只,胰腺被膜下移植DMSCs+ LY294002 (MDSCs2×106,10umol/L),模型对照组注射不含细胞的培养液。
1.2.5 统计学分析
数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析,各组数值以undefined表示,两样本均数比较选用t检验,方差不齐时采用t检验,P<0.05,P<0.01为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物数量分析32 只大鼠共24只成功建立糖尿病模型,成模率达75%,选取24只用于后续移植实验。正常对照组8只均进入结果分析,中途无脱落。
2.2 大鼠肌源性干细胞免疫荧光鉴定结果实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定,结果细胞desmin染色呈阳性,细胞胞质发出绿色荧光,观察500个细胞95%desmin阳性。
2.3 移植后一周和四周胰岛β细胞数的变化
A代表实验b组;B代表实验a组;C代表模型对照组;B与A、C比较差异有统计学意义P<0.05。
2.4 A代表实验a组:pAKT的表达显著增强;B代表实验b组即加入LY294002阻断剂后表达不上调C代表模型对照组pAKT表达也不上调。
2.5 见附表。
与实验b组,P<0.05;与模型对照组,P<0.01。
3 讨论
目前临床上糖尿病治疗的方法有口服药物和皮下注射胰岛素,但效果差强人意。2000年,SHAPIRO等[2]提出了“埃得蒙顿方案”,使得胰岛移植得到空前的发展,但供体的严重短缺、免疫排斥等难题使其仍不能广泛推广。
干细胞是体内存在的一类特殊细胞,具有自我更新和不断增值的能力,又有多向分化的潜能,己逐渐成为人们寻找替代胰岛细胞的新资源。干细胞的来源主要有胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有发育的全能性,可自分化[3]和诱导分化为胰岛细胞。LUMELSKY等[4]从鼠胚胎细胞中挑选Nestin阳性的细胞进行诱导分化,得到类似胰岛样结构并分泌内分泌激素的细胞团。有研究者从人胚胎细胞获得干细胞,并在体外特定的微环境培养后,得到能分泌胰岛素的类胰岛样结构[5]。虽然胚胎干细胞的定向分化研究取得了很多进展,但定向分化产生的细胞中仍然存在部分具有多向分化潜能的干细胞,当分化的细胞移植入动物体内,混杂的干细胞可能形成畸胎瘤。另外,目前部分胚胎干细胞是从体外受精的胚胎中获取的,因此人类胚胎干细胞研究还面临着许多伦理学和社会学的问题。
成体干细胞来源于成体组织,来源丰富且不存在伦理学和社会学的争议。目前已经有研究发现,肝脏细胞、胰腺外分泌细胞[6]、胰腺导管细胞等能够诱导分化为胰腺内分泌细胞。但这些组织来源的干细胞分离、纯化还不成熟,而且诱导分化条件和机理也不清楚,这就限制了其在临床上的应用。而DMSCs作为一种发现最早、研究最深入的成体干细胞,具有许多优点:(l)取材方便,人体取材时对个体无健康损害。(2)易于分离培养,扩增能力强,并能保持形态学和细胞生物学特性不变。(3)免疫原性低,与受体能很好的相容。因此,DMSCs是胰岛来源理想的种子细胞。
虽然,越来越多的证据表明DMSCs能分化为胰岛素分泌细胞,但也有不少研究者对其提出质疑:DMSCs不能分化为胰岛素分泌细胞。为此,不少研究者做了大量的实验,结果表明在体内外建立适合DMSCs分化的环境,DMSCs具有转分化为胰岛素分泌细胞的可能。但是建立这样的环境本身就不是一件容易的事情,况且分化的胰岛素分泌细胞不纯、数量又少达不到临床治疗的目的。所以这一研究在临床也不能广泛推广。
无论是1型糖尿病还是2型糖尿病它们一个共同的特点是胰岛β细胞的减少。所以促进内源性胰岛β细胞的再生又将是研究的热点。这种方法的最大优势在于不需外源性的供体,也不存在免疫排斥反应,有可能成为糖尿病治疗的理想方法。本实验初步证明了肌源性干细胞移植在糖尿病大鼠胰腺被膜下对胰岛细胞的修复作用及PI3K-AKT信号通路对这一作用的调控。
参考文献
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[2] ShaPiroJ,Lakey JRT,RyanEA,et al. Islet transPlantation in seven Patients with type 1 Diabetes mellitus using a glueoeortieoid free immunosuPPressive regimen[J].New England joumal of medieine,2000:343:230-238.
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