Scaffold蛋白介导细胞信号转导专一性的定量分析

关键词： 介导 信号转导 组分 细胞

Scaffold蛋白介导细胞信号转导专一性的定量分析（共3篇）

篇1：Scaffold蛋白介导细胞信号转导专一性的定量分析

Scaffold蛋白介导细胞信号转导专一性的定量分析

细胞使用相对有限的蛋白质组分传递大量的信号,因此不同的信号通常由相同的蛋白质组分传递.这些蛋白质组分是如何选择性地参与不同的信号通路,“高保真”地传递不同的刺激,从而产生特定的细胞应答,是目前细胞生物学领域中的研究热点和难点之一.鉴于Scaffold蛋白在确保信号转导专一性和保真性中的关键作用,作者基于酵母S. cerevisiae的`生物学实验数据,建立了由Scaffold介导的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联信号转导网络的数学模型.并对已报道的工作进行扩展,给出了多条信号级联网络的“专一性(specificity)”和“保真性(fidelity)”的精确数学定义,计算了MAPK信号网络的专一性和保真性的解析解.用这些解定量分析细胞信号转导的专一性和保真性与信号通路各种动力学参数(输入信号的强度和时间、反应率、磷酸化和去磷酸化系数、降解系数等)之间的关系,从理论上阐述Scaffold蛋白通过隔离(sequestration)和选择性激活(selective activation)等机制增强信号转导网络的专一性和保真性.从而有助于加佑深对细胞信号转导及其调控过程的系统理解,为揭示某些因细胞信号转导异常所致疾病的发生机理,寻找治疗药物提供新的思路.

作 者：邹秀芬 许志强 潘兹书 ZOU Xiu-fen XU Zhi-qiang PAN Zi-shu 作者单位：邹秀芬,许志强,ZOU Xiu-fen,XU Zhi-qiang(武汉大学数学与统计学院,武汉,430072)

潘兹书,PAN Zi-shu(武汉大学生命科学学院,武汉,430072)

刊 名：生物物理学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA BIOPHYSICA SINICA年，卷(期)：22(4)分类号：Q6关键词：信号转导 数学模型 专一性 保真性 Scaffold蛋白

篇2：Scaffold蛋白介导细胞信号转导专一性的定量分析

关键词：小窝蛋白1,TGF-β,细胞外基质,信号传导,肺纤维化

急性肺损伤 (acute lung injury, ALI) /急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 是ICU常见的且死亡率高的一种急症状态, 近年来随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用, 其存活率已显著提高。然而, 长时间吸入高浓度氧, 幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前, 高氧肺损伤及肺纤维化已成为ICU最为棘手的问题之一和慢性肺疾病的最常见形式, 但目前高氧肺损伤及肺纤维化的确切机制尚未完全阐明。已知细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 的重塑参与了高氧肺损伤的整个病理过程, 若ECM重塑正常, 则损伤完全修复, 肺结构正常;若ECM重塑紊乱, 将导致肺纤维化。因此, ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。

目前已知在Ⅰ型肺泡上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞质膜上存在约50~100 nm大小的囊性凹陷结构——小窝 (caveolae) , 而小窝蛋白 (caveolin, cav) 1是小窝胞浆面包被的一种21~24 k D的膜蛋白, 是许多信号分子如TGF-β活性状态的重要调节者。TGF-β是一种多效生长因子, 可以调控细胞生长、分化、程序性死亡及ECM产生。研究发现, cav1可以通过调节TGF-β受体表达从而调控TGF-β信号转导[1,2]。在变异原诱发的急性肺损伤小鼠模型中, cav1对肺间质纤维化、肺泡支气管化及气道重塑有重要作用, 并且发现TGF-β信号增强, 胶原分泌增加[3,4,5]。有研究报道, cav1基因敲除小鼠出现肺泡腔狭窄、肺泡壁增厚及细胞过多现象[6]。故推测cav1可以通过介导TGF-β信号转导以此调控ALI/ARDS时的ECM重塑水平。本研究应用cav1-/-小鼠模型探讨Cav1对ECM重塑作用及其具体信号机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型、主要试剂及分组

本实验分为两组: (1) 实验组:实验动物为1周龄C57BL/6J cav1-/-小鼠, 购自美国Jackson实验室; (2) 对照组:实验动物为1周龄野生型C57BL/6J小鼠, 购自南京医科大学实验动物中心。每组均为15只小鼠。主要试剂:Sircol胶原测定盒购自北京友谊中联生物科技有限公司。RNeasy RNA试剂盒购自美国QIAGEN试剂公司。细胞裂解液购自美国Sigma试剂公司 (含1 m M DTT、1×蛋白酶抑制剂混合物、5 m M EDTA) 。

1.2 肺机械性测量

动态顺应性及弹性回缩力参数通过强迫振荡法flexi Vent呼吸功能研究系统获得。小鼠按体重予以氯胺酮 (100 mg/kg) 及甲苯噻嗪 (10 mg/kg) 静脉麻醉后插气管套管后连接flexi Vent仪器通畅, 参数设定如下:PEEP设定为2 cm H2O, 呼吸频率为150次/min, 潮气量为7.5 m L/kg。气道阻力、顺应性及弹性回缩力测定15次, 应用单室腔模式进行数据分析。数据测定后处死小鼠, 支气管肺泡灌洗后取肺组织标本, 以进行RNA及蛋白提取。

1.3 组织学检查及胶原沉着测定

肺组织标本固定于4%多聚甲醛, 包埋切片后予以天狼星红染色, 在光镜下观察组织标本, 利用Image Pro图像分析仪测定肺实质及气道周围的胶原含量。

取肺组织冰冻后应用Sircol胶原测定试剂盒测定胶原沉着水平。50 mg肺组织均匀搅碎于500μL的提取液并4℃搅拌过夜, 组织匀浆在4℃高速离心 (15 000 g) 1 h, 按照试剂盒说明操作, 用分光光度仪在540 nm波长测定光密度, 对比标准胶原含量曲线图得出胶原含量。

1.4 肺血管渗出测定

对小鼠行支气管灌洗术后取灌洗液, 在20℃时1000 g低速离心10 min后取上清液储存于-80℃环境, 测定肺组织渗出总蛋白及白蛋白含量。总蛋白含量采用Bradford法测定, 白蛋白测定应用小鼠白蛋白ELISA试剂盒方法测定。

应用伊文思蓝注射后计算伊文思蓝含量来评价肺血管通透性。取3月龄小鼠麻醉后按20 mg/kg剂量尾静脉注射伊文思蓝, 注射1 h后处死小鼠, 开胸后左心室灌注5 m L PBS。取出肺组织, 搅碎成组织匀浆固定于10%甲酰胺60℃孵育12~18 h, 5000 g离心30 min后收集上清液, 测定620 nm和720 nm吸收率。伊文思蓝含量 (每克肺组织中伊文思蓝毫克含量) 按下列公式计算:A620- (1.426×A720+0.030) , 结果对比伊文思蓝标准曲线得出伊文思蓝含量。

1.5 支气管灌洗液 (BAL) 中细胞含量及细胞因子水平

两组BAL在20℃1000 g离心10 min后收集细胞沉积, 在100μL的PBS中打匀, 使用标准血细胞计数板来计算总细胞数。分别应用小鼠Th1/Th2细胞因子ELISA试剂盒测定BAL中细胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ。

1.6 弹性纤维沉着测定

利用免疫组化方法检测弹性纤维, 切片用5%山羊血清封闭1 h, 用弹力蛋白一抗4℃孵育过夜, 在PBS及0.05%Tween-20清洗3次, 再与Alexa Fluor 568标记的二抗孵育过夜, 细胞核用DAPI复染。切片包被后在荧光显微镜下观测。

1.7 RNA及蛋白表达分析

应用RNeasy RNA试剂盒从肺组织标本中提取RNA, 按试剂盒说明操作。RNA标本在20℃与0.05 U/m L DNaseⅠ孵育15 min, 应用定量RT-PCR法测定Ⅰ型胶原α2链 (col1α2) 及弹性蛋白原 (eln) m RNA水平。

肺冰冻标本用冰PBS液冲洗3次后, 组织匀浆加入0.5 m L细胞裂解液直接煮沸5 min, 冰上冷却后, 12 000 rpm离心15 min, 取上清液, 按照Western blot试剂盒的说明操作, 分别加入小鼠anti-Smad2抗体及小鼠anti-ERK1/2抗体后, 4℃摇摆过夜。漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠Ig G多克隆抗体避光室温孵育2 h, 按照发光试剂盒的说明操作, X线曝光后应用NIH Image凝胶图像处理系统分析净光密度值。

1.8 统计学处理

采用SPSS 11.5软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示, 组间比较用t检验或ANOVA分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肺机械性变化测定结果的比较

实验显示, 实验组小鼠的肺顺应性较对照组明显降低, 与此相反实验组小鼠的肺弹性回缩力及气道阻力较对照组均明显增加 (P<0.05) 。结果表明, 实验组小鼠肺的僵硬度明显增加, 见表1。

*与对照组比较, P<0.05

2.2 肺组织胶原纤维沉着检测

实验组小鼠的气道周围及肺实质胶原纤维沉着较对照组均明显增加 (P<0.05) , 见图1。并且在应用Sircol法对组织匀浆测定胶原纤维含量结果显示, 实验组的胶原纤维含量为 (41.2±5.4) μg/mg, 而对照组小鼠为 (27.7±3.1) μg/mg, 表明实验组较对照组明显增加 (P<0.05) 。说明实验组小鼠肺的胶原纤维沉着明显增加, 也是肺僵硬度增加的病因之一。

2.3 肺血管蛋白渗出及伊文思蓝含量测定

肺血管渗出过多也是肺僵硬度增加的病因之一, 故检测BAL中蛋白渗出水平及肺实质伊文思蓝积聚可以反映肺血管渗出状况。实验组小鼠BAL中总蛋白及白蛋白水平较对照组均明显增加 (P<0.05) , 且静脉注射伊文思蓝在肺组织含量也较对照组明显增加 (P<0.05) , 见图2。

注:A表示实验组, B表示对照组 (×400) , 箭头所指为胶原纤维染色

注:A图中浅色柱形图代表总蛋白含量, 深色柱形图代表白蛋白含量, B图肺组织中伊文思蓝含量为注射后1 h进行检测

2.4 两组BAL中细胞含量及细胞因子水平测定结果的比较

在对BAL中细胞含量检测显示两组无明显差异 (P>0.05) , 并且两组中细胞因子如IL-2、TNF-α及IFN-γ也无明显差异 (P>0.05) , 见表2。结果表明, cav1-/-小鼠与野生型小鼠肺组织无明显炎症差别。

2.5 col1α2及eln的m RNA水平与弹性纤维沉着测定

实验组小鼠肺组织中I型胶原α2链 (col1α2) 及弹性蛋白原 (eln) m RNA水平均明显高于对照组标本水平 (P<0.05) , 见图3。荧光显微镜下观测显示, 实验组的肺实质及肺泡壁的弹性纤维分布较对照组均明显增加。结果表明实验组小鼠的肺组织弹性纤维沉着明显增加。

2.6 TGF-β信号转导系统表达水平测定

已知cav1-/-小鼠缺乏cav1会上调TGF-β信号转导, 而TGF-β是ECM基因转录活性主要的调节因子。TGF-β下游的信号通路主要为Smad2和ERK1/2, 故本研究应用Western blot法检测肺组织中Smad2和ERK1/2水平。结果显示, 实验组中Smad2和ERK1/2水平较对照组均明显升高 (P<0.05) , 见图4。结果说明TGF-β信号转导系统Smad2和ERK1/2在cav1-/-小鼠上调。

注:浅色条柱为col1α2m RNA, 深色条柱为eln m RNA

注:浅色条柱为Smad2含量, 深色条柱为ERK1/2含量

3 讨论

长期以来, 有关小窝蛋白1 (cav1) 的研究主要集中在胆固醇代谢、肿瘤转移、膜物质转运、信号转导等方面, 而在急性肺损伤 (acutelung injury, ALI) /急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 所致肺纤维发病机制的研究较为少见。研究发现, cav1广泛存在于肺泡Ⅰ型上皮细胞膜, 对于形成囊性凹陷结构——小窝 (caveolae) 至关重要, 而小窝内含有多种信号受体, 其中TGF-β信号通路对于ECM沉着、肺内皮细胞分化及相关病理状态至关重要[3]。为了解cav1对肺的生理功能及结构影响, 本研究探讨了肺功能、TGF-β信号通路及ECM重塑间关系。已有研究显示, cav1缺乏或降低可以上调TGF-β水平, 而体外培养肺成纤维细胞时予以外源性TGF-β则可以上调数个ECM基因转录[3,7,8,10]。cav1-/-小鼠的肺功能出现有害改变, 因而了解TGF-β信号系统改变是否也会造成ECM重塑成了需要解决的问题。Ⅰ型胶原纤维和弹性纤维是ECM重要成员, 也是决定肺顺应性重要因素[11], 因而本研究选取I型胶原纤维和弹性纤维作为研究ECM重塑对象。研究中发现, cav1-/-小鼠相比与野生型小鼠, 其肺顺应性下降, 而肺弹性回缩力及气道阻力增加, 表明肺的僵硬度增加, 这与肺的ECM增加及肺血管渗出增加相关[12,13]。实验中分别对肺组织的Ⅰ型胶原纤维和弹性纤维含量检测, 显示cav1-/-小鼠产生ECM是明显升高, 这一点不论从组织切片还是转录水平都得到了证实。

同时研究中显示, cav1-/-小鼠的支气管灌洗液蛋白渗出也明显增加, 并且在应用伊文思蓝静脉注射后渗透至肺组织含量明显增加也证实cav1-/-小鼠的肺血管通透性增加。在毛细血管内皮细胞中, 30%细胞表面存在小窝, 因而cav1缺陷会增加肺血管通透性, 促进渗出[14]。已知在正常人的血管内皮细胞内TGF-β可以上调NO合成酶的活性, 而NO合成酶产生的NO会增加血管通透性, 故TGF-β被认为是直接导致肺水肿的关键调节物[15,16]。而cav1可以下调TGF-β信号水平, 因而可以推测cav1-/-小鼠肺组织中血管渗出增加是因TGF-β过度激活而致使NO合酶活性过强所致。

本研究从以上两方面证实cav1可以调控肺组织ECM重塑水平, 进而影响肺的顺应性变化。已知cav1可以调节TGF-β表达水平, 但为进一步了解cav1是否通过TGF-β信号系统来调控ECM重塑, 研究选取了TGF-β的两个重要下游信号因子Smad2和ERK1/2作为研究对象。有研究表明, 各种的TGF-β下游信号途径如Smads、ERK1/2及p38 MAPK等对调控弹性纤维m RNA及转录后稳定有重要作用, 比如Smad3缺乏则会导致肺弹性纤维表达抑制进而出现肺气肿[17,18]。研究结果显示, cav1-/-小鼠的Smad2和ERK1/2表达明显增加, 证实cav1介导TGF-β信号系统调控肺ECM重塑。

篇3：受体细胞信号转导运动与规律分析

关键词：受体,细胞,信号转导,运动,规律

一、受体及细胞信号转导的概念

关于受体的研究已经有百余年的历史, 有研究人员认为在细胞上存在若干个侧链, 如果在细胞结构上的侧链基团与毒素分子集团相结合, 于是将这些侧链称作受体。随着受体研究的不断深入, 现今对受体的定义为:存在于细胞表面的一种分子集团, 能够对一些具有生物活性的信号配体进行识别, 并与之结合, 激发生物化学反应的发生, 从而产生具有一定的生物效应的具有特殊性的糖脂或者蛋白质。受体概念的产生是生物学界研究发展道路上的一座里程碑。如今, 在信号在细胞中的传递, 受体对信号的识别、信号在通路中的传导以及细胞内效应三个环节相互依存, 相辅相成。毒素集团以及药物都选择自身适合的受体产生作用, 达到细胞间信息传递的目的。

细胞信号转导是一个生物学效应的过程, 受体位于细胞内或者细胞的胞膜内, 当其受到来自细胞外部信息分子的刺激后, 受体细胞利用信号转导系统对刺激信号进行调控和转换同时进行信息传递。细胞信号转导系统具有组织性、严密性、网络化的特点, 外界刺激对细胞产生刺激作用, 通过信号传递途径向细胞内进行信息传递, 对各种转录因子进行激活刺激, 从而对细胞的生长、发育以及其功能进行活性调节, 进而产生各种生物学效应。通过对细胞信号转导系统的结构和机理的研究和探讨, 来对细胞的全部生命过程进行细致的研究, 对其在多个方面的具体表现以及其各项机能的调控方法加以认识。

二、细胞信号转导的途径

近几年众多专家学者和研究人员将研究的重心放在细胞信号转导的途径方面, 并对信号转导途径制定了相应的标准:第一, 细胞信号的转导途径手肌肉活动的影响, 肌肉的收缩能够造成信号转导途径的变化;第二, 与运动有关的细胞组织中的基因表达受细胞信号转导途径的调控。第三, 运动信号途径属于关联组织基因的效应, 是局部效应的表现, 与生理活动无关。据此标准, 本文对受体细胞转导运动进行深入的研究和分析。

细胞丝裂原激活的蛋白激酶 (简称MAPK) 信号转导途径在细胞功能的维持和实现中起着非常重要的作用。在真核细胞中有四条蛋白激酶的信号转导途径已经确定, 这些对细胞的生长、代谢、基因转录以及细胞凋亡都具有重要的调控作用。

1. ERK1/2途径

ERK1/2途径即调节细胞外信号蛋白激酶途径, 这一途径是首个已经在哺乳动物中经过严格确认的途径。细胞信号无论是生长信号还是分化信号都利用这一途径进行信号的传导。信号传导以细胞中的生长因子和酪氨酸激酶为传导介质, 对激酶按照一定的顺序逐个进行激活。ERK1/2激活转录因子在对其进行活化以后结合到SRE对转录进行启动;同时ERK1/2在活化后也能够对转录因子Stat3进行激活作用, 从而启动转录。ERK1/2可以对转录因子产生磷酸化的作用, 从而对转录因子产生激活的作用同时对细胞的胞浆底物产生磷酸化的作用。

2. JNK途径

对细胞内的JNK途径激活, 可通过氧化应激、照射紫外线等方式进行激活作用。细胞在应激的状态下, 激酶按照一定的次序被逐个激活。转录因子受到活化的作用与元件相结合启动转录。JNK途径可对诱导型的生物合成进行调控, 在应激状态下, 随着诱导型NO数量的增加, 可以起到舒张血管的作用, 对激素的产生进行调理。

3. p38途径

p38信号转导途径的激活可通过紫外线、渗透压应激等产生激活作用。细胞因子按照一定的顺序进行逐个激活, 活化的p38MAPK对MAPKAP激酶2具有进一步的激活作用, 同时还对转录因子有激活作用。

三、AMPK信号分子在运动中的作用

运动会改变骨骼原有的肌能量代谢能力, 这是AMPK酶调节的直接结果, AMPK酶能够对骨骼肌能量在产能和耗能方面都具有调节的作用。人体在进行较大强度的运动以后, 骨骼肌的AMPK酶的活性大大增强, 同时对转录银子的磷酸化作用也大大增强。运动对AMPK的激活作用能够使骨骼肌葡萄糖的利用率大大提高, 同时受转运载体的调节作用促进了其在肌体内的转运。AMPK对于运动有关的基因转录也同样起到调节的作用。当AMPK被激活后, 可促进骨骼肌和基因表达。AMPK的激活过程与细胞核呼吸因子增加有关。

四、运动诱导细胞凋亡的信号机制

特异性蛋白水解酶在细胞凋亡的信号转导中起着非常重要的作用。人体骨骼肌细胞的凋亡很可能是因为运动的过程中将一系列的蛋白酶产生了激活和活化的作用, 从而使骨骼肌细胞发生凋亡。研究结果表明, 细胞凋亡信号的转导的过程是多条不同的通路相互交织, 多种信号相互产生作用, 共同构成一个复杂的信号网络系统。运动诱导细胞调往信号机制的研究还有待日后更加深入的开展研究工作

参考文献

[1]贺师朋.受体研究技术[M].北京:北京大学医学出版社, 2013.

[2]李琳燕, 侯丕宇.瘦素及其受体与运动[J].沈阳体育学院学报, 2012, 20 (1) .