纳米载体

关键词： 化学修饰 分散性 载体 具有

纳米载体（精选七篇）

纳米载体 篇1

目前对碳纳米管的化学修饰和表面改性的方法很多, 但许多处理方法繁琐、操作装置昂贵等诸多缺点, 如用电弧放电法对碳纳米管填充需要很高的温度[7], 用物理方法对碳纳米管进行预处理[8], 很难得到纯净的碳纳米管等, 限制了一些方法的使用。作者从碳纳米管的预处理、碳纳米管的填充, 增大比表面积3个方面, 综述了对碳纳米管载体的化学修饰和表面改性主要的简便优化方法。

1 碳纳米管预处理

一般来说, 制备的原始碳纳米管在不同程度上含有一些杂质, 如残留的催化剂颗粒、无定形碳等[5], 可能影响活性组分的担载量, 因此在制备碳纳米管载体催化剂之前, 需对碳纳米管进行纯化除去这些杂质。同时, 由于原始制备的碳纳米管具有惰性和疏水性, 不利于活性组分的沉积, 因此需要近一步官能化生成羧基、羰基和羟基等。这些官能团可以改变碳纳米管的疏水性和惰性特性, 因此具有这些官能团更适合作为催化材料[9]。目前最常用的纯化方法是化学氧化法, 如HNO3、HNO3-H2SO4混酸法、H2O2[10]等。针对不同的反应纯化条件及官能化条件也各不同。原理示意图见图1。

1.1 HNO3预处理

采用铂金属负载单层纳米管, 作为选择加氢催化剂时, 纯化处理条件为70%HNO3加热回流4h, 然后用HNO3处理已纯化的碳纳米管6h进行官能化, 同时采用K2PtCl4做前驱体及溶剂乙二醇对已经官能化的碳纳米管进行还原反应, 处理过程不需要过滤, 大大简便了操作过程, 节省预处理时间, 预处理所得结构对液相反应起着重要作用[11]。制备铂多层纳米管载体应用甲醇燃料电池中, 用70%HNO3在120℃加热回流4h进行纯化处理, 之后在回流条件下用HNO3-H2SO4混酸进行官能化处理, 经过纯化和官能化处理的碳纳米管的比表面积增加了将近20%[12];利用二氧化硅碳纳米管载体应用于液相反应中[13], 将二氧化硅和碳纳米管在HNO3溶液中在80℃加热静置12h, 结果发现酸处理和超声没有大量碳纳米管损失, 最终形成了大量的羰基和羧基有利于活性组分的沉积。在研究铁和四氧化铁在碳纳米管中的还原性质中[14], 将碳纳米管与150mL的68%HNO3混合后, 在油浴中140℃加热, 考察了不同加热时间 (3~20h) 对碳纳米管结构的影响, 结果发现加热14h对碳纳米管官能化较理想。

1.2 HNO3-H2SO4混酸法

在质子交换膜燃料电池以Pt负载碳纳米管为载体中[15], Pt碳纳米管载体在HNO3-H2SO4混酸体积比1∶1在140℃加热5h, 保持加热时间到24h, 结果发现碳纳米管损失比较严重, 但在60℃的K2CrO7-H2SO4混合液中加热后却得到了高产量的官能化碳纳米管。研究纳米金粒子负载含有氮原子碳纳米管[16], 将纳米金碳纳米管放入HNO3-H2SO4混酸体积比3∶1溶液中超声2h, 经过过滤和去离子水完全洗涤, 结果表明处理的碳纳米管很容易溶解在水中。碳纳米管负载铂-二氧化钌纳米颗粒[17], 利用混酸浸泡方式进行纯化和官能化, 碳纳米管置于60℃回流5h, 过滤干燥室温下放置24h, 抽滤干燥用30%的双氧水浸泡24h, 洗涤pH至中性为止, 最后在80℃真空箱中干燥8h。Yu等[18]通过化学改性铂碳纳米管载体对比了用HNO3预处理和HNO3-H2SO4混酸法对结果的影响, 用HNO3-H2SO4总体积为40mL混酸体积比1∶1, 加热5h后用200mL去离子水洗涤过滤后在真空箱中干燥8h, 结果发现HNO3-H2SO4混酸法处理得到碳纳米管的官能团要比用HNO3处理的密度高。

1.3 其他处理方法

铂负载碳纳米管选择性加氧[10], 采用了HNO3、H2O2、NH2-CH2-CH2-SH 3种方法对碳纳米管进行预处理。HNO3处理法是用80mL 65%~68%HNO3处理10g碳纳米管, 在75℃保持回流11h, 过滤洗涤至pH为6.5, 最后在真空干燥箱中, 80℃干燥10h;H2O2处理法将10g碳纳米管浸泡在50℃200mL 30%H2O2中, 搅拌24h, 过滤用去离子水洗涤, 在真空箱中80℃干燥10h;NH2-CH2-CH2-SH处理是将经过HNO3处理的碳纳米管在70℃40mL SOCl2溶液中保持回流12h, 之后在脱水甲苯中使碳纳米管与NH2 (CH2) 2进一步反应。对比结果发现用NH2 (CH2) 2预处理的铂微粒对于选择性加氧要比HNO3和H2O2更具有活性。有研究报道, 采用96%H2SO4∶36%H2O2体积比为4∶1混合溶液处理单层碳纳米管[19], 可大大减少预处理过程中质量损失, 减少实验成本。Shuba[20]等利用硫酸和硝酸混酸在低温度下超声处理, 处理后碳纳米管的产率几乎达到了100%。一种新颖的蒸气纯化法[21], 是利用酸溶液的蒸气预处理碳纳米管, 相比其他传统方法, 此方法不需要回流、过滤等繁琐操作, 具有更加简便、效率高和能够精确控制等优点。

2 碳纳米管的填充

碳纳米管是卷曲的纳米级管腔结构石墨晶体, 这种管腔结构在几何结构上就形成了纳米尺度独特的限域体系[22]。因此, 填充在碳纳米管内部的催化剂活性组分可以调变了对催化反应和反应物的选择性, 对催化反应具有重要作用。

大量研究表明, 将活性组分填充在碳纳米管内部对催化性能有显著的影响。如费托反应是通过合成气将煤、天然气、甚至生物转为液体燃料和其他化学燃料, 是一种很有前景的途径。费托反应中是金属铁作为活性组分, 铁活性组分在载体上的分布和元素铁的存在形式有关[23]。通过Fe3O4与碳纳米管还原形成金属铁的方法[24], 将铁作为活性组分填充在碳纳米管内部, 比较金属铁在碳纳米管内部和在碳纳米管外部对费托反应的选择性和活性的影响, 结果表明虽两者都具有很高的活性, 但活性组分铁在碳纳米管内的CO转化率是铁在外部的1.4倍, 可见活性组分分布在碳纳米管载体内部要比分布在载体外部高很多。又如金属铑-锰填充在碳纳米管内[25], 催化剂表征结果显示80%金属微粒填充在碳纳米管内部, 进一步将催化剂用于合成气乙醇反应中进行催化活性测试, 测试结果表明填充在碳纳米管内部的催化剂制乙醇的收率是碳纳米管外部催化剂的16倍, 相比活性组分负载碳纳米管外部其催化活性有所提高。合成气制轻烯烃[26], 填充在碳纳米管内部的金属铁催化剂, 催化剂活性测试结果得出:填充在碳纳米管内部铁催化剂CO转化率约是填充在外部铁催化剂1.5倍。另有, 在费托合成反应中将金属铁填充碳纳米管内部[27], 比较填充碳纳米管内部铁催化剂和填充在碳纳米管外部铁催化剂催化活性, 两者CO转化率很相似大约都在90%, 但填充碳纳米管内部催化剂要比填充外部催化剂稳定 (催化剂活性测试125h后, 填充内部的催化剂从89%减少到85%, 而填充的外部催化剂从91%降到79%) 。以上研究表明, 将活性组分负载在碳纳米管载体对催化反应尤为重要, 因此对碳纳米管的填充方法也成为一个重要课题。

化学湿法填充是一种简单有效, 也是目前最常用的一种方法[28]。化学湿法填充最主要的方法是通过HNO3化学改性, 将长链的碳纳米管裁剪成短链, 经过裁剪过程后, 碳纳米管开口变多有利于活性组分填充到碳纳米管内, 填充原理示意图见图2。

Kyotani等[29]采用20%HNO3回流6h, 用去离子水洗涤后在100℃下干燥, 然后在150℃用10M NaOH溶解, XPS和THD表征结果表明, 成功的选择性将活性组分负载在碳纳米管的内部。用合成气制乙醇[25], 同时制备了金属催化剂在碳纳米管内部和碳纳米管外部。制备铑-锰碳纳米管内部催化剂时, 将碳纳米管浸泡在68%HNO3溶液中, 在140℃油浴中回流14h, 过滤洗涤用去离子水洗涤, 在真空箱中60℃干燥12h。用浸渍法在超声和搅拌的条件下制备铑-锰碳纳米管内部催化剂。用6 M37%HNO3在110℃回流5h对碳纳米管进行预处理, 制备了铑-锰碳纳米管外部催化剂。值得注意是在催化剂制备过程中加入不同溶剂[30], 可以选择性的将金属活性组分填充到碳纳米管内或外, 将经酸化的碳纳米管浸泡在含有乙醇溶液的金属前躯体溶液中, 用去离子水洗涤, 在室温下放置12h, 同时在50℃下干燥10h除去残留的乙醇, 最后在250℃干燥2h, 在300℃氢气气氛中还原2h。表征结果显示, 几乎所有的金属微粒都沉积在碳纳米管内部。金属微粒负载碳纳米管外部是在浸渍法制备催化剂前加入有机溶剂苯, 其他步骤与上述相同, 结果表明加入苯有机溶剂对金属负载在碳纳米管外部具有较高的选择性。

3 增大比表面积

比表面积对催化剂活性和选择性有着重要的影响, 但通常制备的碳纳米管的比表面积较小[31], 不利于金属活性组分沉积在碳纳米管表面。目前, 最常用活化碳纳米管是KOH高温活化[32], 将KOH和碳纳米管以7∶1混合在一块[33], 在900℃下活化1h, BET测试结果得出活化后的碳纳米的比表面积是未经活化碳纳米管的将近15倍 (活化后的比表面积是360.1m2/g, 未经活化的是24.5m2/g) 。通过活化温度 (650~800℃) 对碳纳米管产量影响的研究, 结果发现750℃最有利于碳纳米管的活化。另一种方法是合成有孔金属合金增加碳纳米管的边缘层[34], 从而达到增加碳纳米管的比表面积目的。因此, 合金的碳纳米管具有高比表面积的活性组分, 成为具有潜力的高活性催化剂。

4 结论

纳米载体 篇2

二十世纪纳米技术兴起并迅速发展，由于纳米材料的独特性质使它在科学技术领域占据重要地位。纳米二氧化钛(TiO2)具有许多的特殊性能比如表面效应、体积效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应等，从而使其与普通二氧化钛相比具有许多特殊性能。纳米二氧化钛在水处理、催化剂载体、紫外线吸收剂、光敏性催化剂、防晒护肤化妆品、涂料填料、光电子器件等领域具有广泛的用途。

纳米TiO的制备方法有气相法、液相法。目前，研究的一个热点是纳米TiO2 作为半导体光催化剂用于废水、废气的净化。纳米TiO2 具有湿敏、气敏功能，如它对一氧化碳极为敏感，可用在传感器上，尽管我国对纳米二氧化钛的研究起步较晚，但是科技工作者们在其制备和应用上做了大量的工作和深入的研究，并取得了许多成果。

河北麦森钛白粉有限公司生产的纳米二氧化钛(光催化)(MS-GCA01)

产品性能：

本品光催化纳米二氧化钛外观为白色疏松粉末。在可见光或紫外光的作用下具有很强的氧化还原能力，化学性能稳定，能将甲醛，甲苯，二甲苯，氨，氡，TVOC等有害有机物，污染物，臭气，细菌，病毒，微生物等有害有机物彻底分解成无害的CO2和H2O，并具有去除污染物，亲水性，自洁性等特性，性能持久，不产生二次污染。

纳米载体 篇3

相关研究成果已分别刊载在国际著名期刊《诊断治疗学》和《大分子》。

据介绍, 确保药物分子能够顺利穿透肿瘤细胞细胞膜进入细胞核, 是利用高分子纳米药物体系实施肿瘤治疗的关键。但由于细胞膜的生物屏障作用, 很多高分子物质难以进入细胞内, 从而极大地限制高分子作为药物载体在临床治疗上的应用。目前有效介导载体高效进入细胞的“细胞穿膜肽”, 虽然可以实现对细胞膜的有效穿透, 但由于其结构固定, 进一步功能化修饰困难较大。

为解决这一难题, 合肥工业大学化学与化工学院科研团队, 通过人工合成的高分子材料模拟细胞穿膜肽的功能, 有效实现了纳米载体对细胞膜的快速、高效的穿透。

细胞水平实验结果证实, 这一新型纳米载体在20min内即可顺利跨膜, 穿透速度比常规无规高分子链提高近10倍。

同时, 该团队还将染料分子与抗癌药物包裹在纳米载体内部, 设计并制备了一系列多功能的能同时有效负载药物和造影剂的具有“诊疗一体化”功能的纳米载体。

“目前广泛采用的荧光手段无法精确反映肿瘤的位置、范围和细胞繁殖情况, 对肿瘤发展情况判定不够准确。而通过这一新型体系携载造影剂, 通过光声成像可以精确观察肿瘤部位, 甚至肿瘤毛细血管的扩张, 从而更加精准地判定肿瘤生长情况, 并提前做出预警。”团队负责人殷俊副教授介绍说。

纳米载体 篇4

目前所研究的光催化剂大都属于宽禁带型的半导体氧化物或硫化物,如TiO2、ZnO、CdS、WO3、SnO2、ZnS、Fe2O3等,其中纳米TiO2具有光催化性能高,化学稳定性强、廉价、无毒、耐酸碱、耐光化学腐蚀等优点[2,4],因此是当前最有发展潜力的一种光催化剂,已在诸如废水处理、空气净化、石油污染物的清除、抗菌、超级亲水抗雾等方面得到广泛应用。本研究以玻璃珠为基底制备了具有光催化性能的纳米TiO2膜,研究了制备纳米TiO2膜时影响光催化性能的因素,并对其应用进行了初步探讨。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂:钛酸丁酯(化学纯),无水乙醇(分析纯),三乙醇胺(分析纯),聚乙二醇(PEG)4000(分析纯),甲基橙,硝酸钠(优级纯)。

仪器:AFM(NanoscopeIIIa),美国;XRD(D8 Advance),德国;紫外分光光度计(UV-2100),尤尼柯(上海)仪器有限公司;紫外灯管(25W),大连奥林匹克电子城;玻璃珠(d=5～8mm),紫外光源(CH F2XM150W),北京畅拓科技有限公司;电化学测试系统(CS300UA),郑州杜甫仪器厂。

1.2 纳米TiO2膜的制备、负载及其表征

量取20mL的无水乙醇,注入洁净的试剂瓶中,加入3mL三乙醇胺,搅拌成均匀透明溶液。缓慢滴加10mL钛酸丁酯,搅拌1h后,加入少量聚乙二醇4000,继续搅拌2h,得到均匀透明黄色溶胶,陈化一定时间后备用。将清洗干净的玻璃珠在陈化后的纳米TiO2溶胶中浸渍一定时间后取出,于100℃预烧结5min,再于550℃高温煅烧3h,即得到涂膜一层的玻璃珠滤料。采用AFM表征纳米TiO2膜表面的形貌及估算纳米TiO2颗粒大小,用XRD测定纳米TiO2的晶型和晶相分布。

1.3 纳米TiO2膜的光电催化性能测试

参考相关文献[5]中的方法制备纳米TiO2膜电极并进行光电催化性能测试。在光强为6.6mW/cm2、波长为365nm的紫外光照射下,以100mV/s的速度在-0.6V～+1.5V(vs.Ag/AgCl,以下同)的范围内进行循环伏安曲线测试。在相同的介质、光强、波长下,于+0.3V恒电位进行暂态电流测试。

进行暂态电流测试时,吸附质在电极表面预吸附一定时间后,打开紫外光源,光电流瞬间达到一个极大值,后逐渐衰减至一稳定值(图略)。根据法拉第电解定律,光电催化产生的电量与被降解物质的量成正比,因而在光强、电极有效光照面积、电解质温度等条件一定时,通过积分电量可以定量地反映TiO2薄膜电极的光电催化降解能力[6]。

1.4 纳米TiO2膜的应用及使用寿命研究

将制备好的负载有纳米TiO2膜的玻璃珠放入自制的光催化滤池装置中,滤池为一直径50mm,高300mm的圆柱形玻璃筒,紫外灯管位于装置中央,一定质量的玻璃珠载体围绕在紫外灯管周围,实验采用升流式进水方式,通过恒流泵调节进水流速。实验流程如图1所示。

1,6.集水箱;2.恒流泵;3.光催化滤池;4.紫外灯管;5.玻璃珠滤料

采用甲基橙模拟废水运行光催化滤池。在波长为464nm下用分光光度计测定甲基橙溶液原水样和处理后水样的吸光度,分别记为A0、A1。在一定浓度范围内甲基橙溶液的吸光度与浓度成正比,可以用吸光度代替浓度计算降解率,其计算公式如下[7]:

甲基橙的降解率Q=[(A0一A1)/A0]×100% (1)

2 结果与讨论

2.1 纳米TiO2粒子的微观结构分析

由纳米TiO2的XRD图2可看出,纳米TiO2的结晶度较好,主要为锐钛矿型(2θ=25.4°),有少量的金红石矿,为混晶。Bickley等[8]认为:由于混晶效应,锐钛矿型和金红石型的混合物比单一晶型具有更高的光催化活性。另外,由纳米TiO2膜的AFM图(图略)可知,制备出的TiO2膜颗粒粒径约为30nm,分布较为均匀,且TiO2薄膜表面粗糙不平(表面粗糙度Rms=0.870nm),极大地提高了薄膜的有效表面积,不但增大反应物在薄膜表面的吸附量,且光线在这样的表面可以经过多重反射光吸收及利用率得到提高,有利于催化反应的进行[9]。

2.2 纳米TiO2膜光催化性能的影响因素

2.2.1 陈化时间对TiO2膜光催化性能的影响

将按1.2所述制备的溶胶分别陈化1d、3d、7d和10d后,按1.3制备TiO2薄膜电极并测定其循环伏安曲线和暂态电流响应曲线,如图3。从图3(a)可看出,陈化时间为3d时制得的TiO2薄膜的稳态电流明显高于陈化时间为1d、7d及10d制得的。从图3(b)中也可以看出,陈化时间为3d时制备的膜电极的暂态稳定电流最大。造成这种现象的原因可能是:陈化时间太短,钛酸丁酯的水解和缩聚反应不完全,TiO2颗粒较少,产生的电子-空穴对少,光电流小;随着陈化时间延长至3d时,TiO2聚合完全,光电流值增大;陈化时间过长,TiO2颗粒团聚增大,分散性较差,TiO2颗粒表面能产生的电子-空穴对减少,光电流值反而减小[10]。

(a)不同陈化时间制备的TiO2薄膜电极的伏安曲线 (b)不同陈化时间制备的TiO2薄膜电极的暂态电流图

由此可知,陈化时间为3d制得的TiO2薄膜电极的阳极光电流最大,光催化性能最好,因此在以后的实验中我们选用陈化时间为3d的TiO2溶胶涂膜。

2.2.2 涂膜层数对纳米TiO2膜光催化性能的影响

按1.2所述的负载方法,分别在玻璃珠上负载1、2、3、4、5层膜,将涂好膜的玻璃珠分别装入光催化滤池中。配置5mg/L浓度的甲基橙水溶液,开启恒流泵和紫外光管,调节恒流泵流量为3mL/min,测定原水和运行后水样的吸光度,并计算降解率。

由图4可以看出,当涂膜层数为1～3时,随TiO2膜层数增加,光催化活性随之增加,膜的层数为3层是光催化活性最高,当膜层数大于3层时,膜催化活性略有降低。这是由于随涂膜层数增加,由紫外灯激发产生的光生电子和光生空穴对数量逐渐增加,薄膜的表面积逐渐增大,膜光催化活性提高[11]。但如果涂膜层数过多,TiO2颗粒在载体表面堆积严重,紫外光不能到达所有附着在载体上的TiO2颗粒表面,相当于反应活性中心减少[12] ,膜催化活性反而有降低趋势;另外,涂膜层数太多则导致薄膜膜层过厚,光生电子和空穴向表面迁移的时间延长,致使光生电子和空穴在迁移过程中复合的几率增大,导致其光催化活性降低[11]。

2.3 纳米TiO2膜吸附性能的研究

吸附是光催化反应发生的先决条件,吸附质只有预先吸附在催化剂的表面上,才能发生光催化反应,因此研究纳米TiO2膜的吸附性能对研究光催化反应的机理,从而提高光催化效率有极为重要的意义。

2.3.1 纳米TiO2对水的吸附性能研究

按“1.3”的测试条件,做不同预吸附时间下TiO2 薄膜电极的暂态电流响应曲线。

从图5可看出,在无紫外光照射时,没有光电流响应。光路打开的瞬间,光电流瞬时达到一个极大值后逐渐衰减。光电流的暂态响应曲线是由光电催化分解吸附在膜电极表面上的水所形成的。随着光催化反应的进行,水分子不断被分解,光电流逐渐减小,直到水在TiO2薄膜表面上的吸附与分解达到平衡,光电流趋于稳定。同时,随着预吸附时间的延长,瞬时峰电流逐渐增大[13]。

2.3.2 纳米TiO2膜对甲基橙的吸附研究

用0.1mol/L的NaNO3电解质溶液分别配制0.95mg/L、1.90mg/L、2.85mg/L、3.80mg/L、4.75mg/L的甲基橙溶液,按1.3的测试条件做暂态测试并计算积分电量。

由图6可以看出,甲基橙吸附降解的电量Q总体上呈现比空白水样减小的趋势。这可能与甲基橙和水在TiO2薄膜表面上的竞争吸附有关系。水分子与TiO2的一个桥键O原子反应吸附在TiO2表面[14],甲基橙分子中的偶氮结构和-NR3结构决定1个甲基橙分子与TiO2的多个桥键O原子结合吸附在TiO2表面,当1个甲基橙分子吸附在TiO2表面时,占据了多个水分子可吸附的位置,抑制了水分子的吸附,使得电量减少。

随甲基橙浓度增加,甲基橙吸附降解的电量Q减少,纳米TiO2膜的光催化性能降低,这与光催化滤池处理不同浓度的甲基橙模拟废水(水力停留时间为60min)的结果一致,随甲基橙浓度增加,甲基橙的降解率降低,数据如表1所示。

2.4 光催化滤池处理甲基橙模拟废水

用陈化时间为3d的TiO2溶胶对玻璃珠涂膜3层,装入光催化滤池中。配置3mg/L的甲基橙水溶液,调节不同水力停留时间运行光催化滤池,测吸光度并计算降解率,其结果如表2所示。可以看出,水力停留时间大于30min,降解率在74%以上;水力停留时间为120min时,降解率可达到92.9%。光催化滤池在较短的水力停留时间内达到较好的处理效果,说明所制备的纳米TiO2膜光催化性能较好,可用于废水处理。

2.5 纳米TiO2膜的使用寿命

纳米TiO2膜的使用寿命主要由膜能维持较高催化效率的催化降解时间决定。设计光催化滤池实验的运行参数为:甲基橙浓度为5mg/L,pH值为中性,流速为3mL/min,室温运行。实验结果为:涂膜层数为3时的玻璃珠滤料首次运行的降解效率为83.0%,累计运行92.8h后,测得甲基橙的降解效率为82.6%,膜的光催化性能基本不变。这说明玻璃珠和TiO2膜结合力强,膜在玻璃珠表面不易脱落,使用寿命较长,可用于水处理等领域。

3 结论

纳米载体 篇5

在所有纳米材料中,Si O2具有良好的生物相容性,稳定的化学结构及无免疫原性等优点,因此其在生物医药领域的研究逐渐增多,在基因治疗中的研究也逐渐广泛。利用Si O2纳米材料作为基因药物载体,它能保护基因在体内不被内皮网状系统(reticuloendothelial-system,RES)破坏,还能透过组织间隙被组织细胞吸收,Si O2纳米材料能够被动靶向于肿瘤细胞。另外,无定形Si O2纳米材料进入人体后,直接以原形排出体外,因此Si O2纳米用于基因治疗安全性高[2,3]。

但是,Si O2纳米粒表面电位为负值,不能携带荷负电的DNA分子。阳离子表面活性剂虽然提高了与DNA的结合率,但是其具有较高的水溶性,在溶液中与DNA的结合不够紧密,容易使DNA在转染的过程中被核酸酶降解,同时,阳离子基团容易造成细胞膜的损伤产生细胞毒性。本实验利用CTAB修饰Si O2纳米粒,使Si O2纳米粒的Zeta电位变为正值,因此Si O2纳米粒可以通过静电作用结合DNA,表面的CTAB还能通过疏水键和静电作用与DNA结合。利用CTAB修饰Si O2纳米粒,不仅能弥补Si O2的缺点,还能改善CTAB在基因转染中的性能,使CTAB的细胞毒性显著减小,DNA降解率降低。因此,CTAB@Si O2纳米粒作为基因治疗的载体,不仅很好地克服Si O2纳米粒和CTAB的缺点,同时还能将各自所具有的独特优势充分发挥出来[4]。

1 材料和方法

1.1 仪器

粒径仪(zetasizer)(英国Malvern公司);冷冻干燥机(美国LABCONCO公司);红外检测仪(赛默飞世尔公司);电泳仪(北京六一仪器厂)PCR仪(广州三元科技有限公司);凝胶分析系统(广州三元科技有限公司)。

试剂:正硅酸乙酯(TEOS)(上海凌峰化学试剂有限公司);十六烷甲基溴化铵(CTAB)(国药集团化学试剂有限公司);DMEM培养基(北京索宝来科技有限公司);四甲基噻唑蓝(MTT)(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 Si O2纳米粒的制备与修饰

Si O2纳米粒的制备:采用微乳法[5,6]制备Si O2纳米粒。在一平底烧瓶中加水和环己烷,室温条件下搅拌15 min。加入Triton X-10和正己醇各2 m L,超声10 min。加入25%的氨水搅拌15 min后,逐滴加入正硅酸乙酯,搅拌4 h。加入适量的水破乳,12 000 r/min离心10min,去上清。适量无水乙醇洗涤所得沉淀,重悬离心10 min,去上清,洗涤。将所得沉淀冷冻干燥,室温下贮存备用。

Si O2纳米粒的修饰:将制得的Si O2纳米粒重悬于双蒸水中,混匀,超声。加入0.06 g CTAB,65℃搅拌1 h。12 000 r/min离心15 min,去上清。沉淀用双蒸水洗三次,重悬,离心,即得CTAB@Si O2纳米粒。所得沉淀冷冻干燥,室温下贮存备用。

1.2.2 粒径及电位的测定

取一定量未修饰的Si O2纳米粒及CTAB@Si O2纳米粒,超声分散,Zetasize测其粒径及电位。

1.2.3 红外光谱表征

干燥的CTAB、Si O2纳米粒和CTAB@Si O2均采用溴化钾制样,用红外光谱仪对上述材料结构进行表征。

1.2.4 CTAB@Si O2纳米复合物细胞毒性考察

收集对数生长期的U251细胞,每孔1×104的数量接种于96孔板,置于37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养过夜。设置空白对照组(细胞培养基)、阴性对照组(细胞悬液与培养基)、实验组(细胞悬液与不同浓度的复合物溶液)。置于细胞培养箱中培养48 h后,每孔加入20μL浓度为5 mg/m L的MTT,继续培养4 h。终止培养,每孔加入150μL的二甲亚砜,振荡10 min。用酶联免疫检测仪在490 nm处测量各孔的吸光值。细胞生长抑制率的计算公式:

细胞生长抑制率/%=1-(加药组OD490nm-空白组OD490nm)/(阴性对照组OD490nm-空白组OD490nm×100%)

1.2.5 CTAB@Si O2纳米复合物保护基因实验

将CTAB@Si O2纳米复合物与DNA按30∶1质量比混合,37℃孵育15 min,加入1 m U DNase I,37℃孵育1h,加入EDTA,12 000 r/min离心15 min,所得沉淀用p H为10的TE缓冲液重新分散,室温放置15min,12 000 r/min离心15 min,取上清于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,裸DNA基因组和CTAB@DNA组作为对照组。

1.3 统计学分析

实验数据均以均值±标准差表示,应用SPSS 17.0分析软件,利用单向方差分析(one-way analysis variance,ANOVA)法进行比较,以P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 粒径及电位测定结果

CTAB@Si O2纳米粒粒径为101.7 nm(d Si O2=93.54 nm),zeta电位为+27.9 m V(ZSi O2=-38.4 m V),因此,修饰前后Si O2纳米粒的粒径变化不大,但zeta电位则由负值变为正值。如图1。

2.2 CTAB对Si O2纳米粒重分散性的影响

不同批次测得的修饰的和未修饰的Si O2纳米粒的粒径如附表所示,根据SPSS 17.0进行LSD-t检验,发现Si O2纳米粒重新分散后,粒径明显大于CTAB@Si O2纳米粒,说明CTAB@Si O2纳米粒重分散性提高。

注:覮与未修饰组相比,P<0.05,两者存在着显著性差异。

2.3 红外光谱分析结果

CTAB@Si O2纳米复合物红外图谱中(图2),研究人员既可以在960 cm-1和1 007.71 cm-1处发现Si O2纳米粒中的Si-O-Si的特征峰,也可以在2 860cm-1和2 918 cm-1处发现CTAB中的-CH2和-CH3特征峰,因此可以确定,CTAB已经成功地吸附在Si O2纳米粒表面。

2.4 CTAB@Si O2纳米复合物细胞毒性的研究

MTT实验结果表明,Si O2纳米粒对U251细胞的IC50是442.94μg/m L,而CTAB@Si O2纳米复合物对U251细胞的IC50是264.62μg/m L。由此可知,当Si O2纳米表面包覆CTAB后,其IC50明显减小,毒性增加。包覆在Si O2纳米粒表面的CTAB相对于同等质量的游离CTAB,其细胞抑制率比游离CTAB低,说明当CTAB包覆在Si O2纳米表面后,其细胞毒性能够降低。

2.5 CTAB@Si O2纳米复合物对基因保护的实验

如图4所示,当裸DNA和CTAB@DNA复合物经核酶处理后,未发现DNA条带,说明裸DNA组和CTAB@DNA组中的DNA已被核酶降解。当CTAB@Si O2与DNA结合后,在电泳图中发现清晰明亮的DNA条带。说明经过DNase I处理后,结合在复合物上的DNA并没有被降解,并且CTAB@Si O2与DNA质量比为30∶1时,条带最清楚,说明CTAB@Si O2纳米复合物对DNA具有保护作用。

3 讨论

Si O2纳米粒由于其表面具有大量的羟基(-OH),因而具有强烈的吸湿性,同时由于氢键的相互作用,很容易导致Si O2纳米粒的聚集,从而影响Si O2纳米粒的分散性[7]。同时,Si O2表面大量的硅醇基是Si O2纳米粒产生细胞毒性的重要原因之一[8,9]。研究表明,限制基因转染的重要原因是细胞表面的DNA浓度太低,而用硅纳米做基因转染载体,能有效的提高细胞表面的基因浓度,从而提高基因转染效率。如Si O2纳米粒与脂质体结合后,能使基因转染效率提高7~8倍[2]。研究认为,阳离子表面活性剂与DNA结合一般分为两个阶段[10,11],第一阶段静电吸引作用,表面活性剂的阳离子与DNA中富含电子的磷酸基团键合,但DNA链中的净电荷不发生变化。第二阶段是表面活性剂中的脂肪链以协同方式与DNA分子发生疏水键合作用。

CTAB能够包覆Si O2纳米粒的机理如下:首先,由于Si O2纳米粒的粒径为100 nm左右,因而具有较大的比表面积,保证了二者能够充分接触。其次,反应溶液的p H值约为8时,Si O2表面含有大量的羟基保证Si O2纳米的电位为负值,为带正电的CTAB静电结合奠定了基础[12]。最后,当CTAB和Si O2纳米粒表面的羟基结合后能够降低Si O2纳米粒的表面能。CTAB能增加纳米粒的重分散性,主要是由于CTAB具有较长的有机碳链,使得Si O2纳米粒之间的空间距离增大[13]。

纳米载体 篇6

我们课题组前期研究制备成功醛基化海藻酸钠改性的磁性纳米,并将制备的PEG-PEI吸附带负电的该磁流体作为基因载体转染基因,发现纳米粒子在肿瘤部位不能达到足够的浓度,缺乏高效分子靶向性,故我们希望制备偶联FA和PEG的PEI共聚物(PEG-PEI-FA),并将其作为表面改性剂,与磁流体静电吸附,得到具有磁靶向及FA分子靶向的基因载体,更易被肿瘤细胞吞噬,提高转染效率,为下一步转基因治疗恶性肿瘤提供必要的条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

聚乙二醇单甲醚(MPEG),分子量5 000,Sigma公司。叶酸(FA)、聚乙烯亚胺(PEI,分子量25 000)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),分析纯,阿拉丁试剂公司。一氯乙酸,分析纯,国药集团。食品级海藻酸钠,其余制备纳米试剂均为国产分析纯。大肠杆菌DH5α、绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2质粒由本实验室保存,限制性内切酶购自Ta KaRa公司、质粒大量抽提纯化试剂盒购自Qiagen公司。

1.2 仪器与设备

QL-861型旋涡混合器,上海江仪仪器有限公司;JEM-100CXⅡ型透射电子显微镜,日本电子株式会社;MPMS XL-7振动样品磁强计,美国Quantum Design公司;Brookhaven Zeta Plus激光粒度仪,美国Brookhaven公司;UVIKON923紫外-可见光分光光度计,美国BIO-TEK公司。

1.3 试验方法

1.3.1 FA靶向磁性纳米基因载体的制备

参照有关文献高碘酸钠氧化法制备醛基化海藻酸钠[3,4],按照化学共沉淀法制备醛基化海藻酸钠改性的磁性纳米粒(Alg-Fe3O4)[5]。再制备PEG-PEI-FA共聚物,先合成羧基化聚乙二醇MPEG-COOH,将5.0 g MPEG溶解于50 m L水溶液中,然后向其中加入2.0 g氢氧化钠和0.567 g一氯乙酸,40℃条件下反应12 h。反应结束后将产物透析(截留分子量1 000),每12h换水,透析3 d。样品冷冻干燥,即得羧基化聚乙二醇MPEG-COOH。将5.0 g PEI和2.0 g MPEG-COOH溶解于30 m L干燥的二甲基亚砜中,然后再加入1.0g FA。待样品完全溶解后,向体系中加入DCC和NHS,室温条件下反应24 h。反应结束后将样品透析(截留分子量14 000),每12 h换水,透析3 d。样品冷冻干燥,即得MPEG-PEI-FA共聚物,将其与Alg-Fe3O4纳米按照4∶1的质量比混合均匀漩涡20 min后形成FA靶向磁性纳米载体[PEG-PEI(-FA)-Alg-Fe3O4]。该纳米载体与质粒按4∶1的体积比混合均匀漩涡20 min制备载基因的叶酸靶向磁性纳米复合物。

1.3.2 电镜观察

将制成的磁性纳米载体悬液去离子水稀释至合适浓度超声振荡(200 W,3 min)后滴至专用覆膜铜网上,常温干燥在透射电镜下观察。

1.3.3 核磁氢谱

取3~5 mg MPEG-PEI-FA装入核磁管中,加入0.6 m L氘代水,封口。待样品完全溶解后室温条件下进行核磁表征。

1.3.4 粒径、Zeta电位检测

将制成的样本用去离子水稀释超声振荡,激光粒度检测仪测定其有效粒径及Zeta电位。

1.3.5 饱和磁性检测

将制成的纳米载体干燥成粉末,在MPMS XL-7磁学性质测量系统中进行磁化曲线测定,测试条件为常温,范围自-10~10 kOe。

1.3.6 紫外分光光谱分析

由于FA分子包含高度共轭的苯环结构,在363 nm处存在特征性的强吸收峰,利用这个特点可采用紫外分光光度计法分析物质中FA成分及测定含量[6],根据FA的不同浓度和相对应的紫外分光光度计363 nm波长下吸光度绘制标准曲线。以吸光度值为横坐标,FA浓度为纵坐标。在测得纳米载体稀释10倍后的吸光度值根据标准曲线来得出其FA浓度。

1.3.7 质粒DNA的制备

将转化有pEGFP-C2质粒DNA的大肠杆菌接种至LB培养基中培养收获细菌沉淀物,按照碱裂解法提取质粒DNA,经过酶切电泳鉴定后参照Qiagen公司操作手册进行质粒的大量抽提和纯化,用紫外分光光度计测量质粒浓度及纯度。

1.3.8 琼脂糖凝胶电泳分析纳米载体与DNA的结合能力

分以下3组:Ⅰ组:取10μL质粒,加入40μL高纯水,涡旋均匀后的混合物。Ⅱ组:叶酸靶向磁性纳米基因载体。Ⅲ组:载质粒的叶酸靶向磁性纳米复合物。3组各取6μL,分别加1μL含溴酚蓝的Loading Buffer,进行琼脂糖凝胶电泳实验:1%琼脂糖凝胶,60 V,电泳30 min,紫外灯下观察结果。

2 结果

本组将制备的磁性纳米复合物在常温下静置,肉眼观察呈棕褐色,外观流动性佳,连续观察3个月未发现纳米颗粒沉淀。

电镜观察纳米复合物颗粒呈球形,分散较均匀(见图1)。激光粒度检测仪检测MPEG-PEI-FA的粒径为67.7 nm,Zeta电位为+17.2 m V;混合后的PEG-PEI(-FA)-Alg-Fe3O4纳米微球的粒径为197.8nm,Zeta电位为+12.6 m V。MPEG-PEI-FA的Zeta电位图中,分别在+18.2和-2.61 m V处出现2个新号,说明FA位于MPEG-PEI-FA形成的胶束表面,对该胶束Zeta电位也起作用。因此可推断,在混合后的纳米微球中,FA仍在微球的表面,起分子靶向功能。结果见图2、3。

核磁氢谱图所示,MPEG-PEI-FA化学位移在2.5 ppm处的质子峰归属于PEI;化学位移在3.65ppm处的质子峰归属于PEG;化学位移4.67 ppm处的质子峰归属于水;其他化学位移处的质子峰归属于FA。从核磁氢谱可以看出,MPEG-PEI-FA化合物成功合成(见图4)。从紫外光谱图形可以看出,FA有个特征峰在363 nm处,MPEG-PEI-FA和PEG-PEI(-FA)-Alg-Fe3O4纳米都可检测处这处特征峰,可见均连上了FA,结果见图5。在0~100μg/m L范围内FA的含量与OD值有良好的线性关系,见图6,回归公式Y=112.08X-0.3832。PEG-PEI(-FA)-Alg-Fe3O4稀释10倍后的吸光度值平均为0.8719,按此方法测得该纳米载体FA的浓度平均为0.9734mg/m L。

A:FA;B:MPEG-PEI-FA;C:PEG-PEI(-FA)-Alg-Fe3O4

磁饱和强度结果如图7所示,该磁性纳米载体饱和磁化强度为15 emu/g,剩磁为0,具有超顺磁性。

质粒DNA的抽提和纯化,酶切和凝胶电泳鉴定成功提取了pEGFP-C2质粒。紫外分光光度计检测质粒稀释100倍的OD260=0.076,OD260/OD280=1.83,质粒浓度为0.38μg/μL。

琼脂糖凝胶电泳磁性纳米载体与基因的结合分析显示,该磁性纳米载体通过静电吸附与DNA有良好的结合能力,DNA条带留在点样孔(图8)。

1:DNA marker;2:质粒DNA;3:PEG-PEI(-FA)-Alg-Fe3O4;4:PEG-PEI(-FA)-Alg-Fe3O4载质粒复合物

3 讨论

作为基因载体的磁性纳米微粒除了具有一般纳米微粒的特性外,如粒径小、比表面积大、具有表面效应等;其对肿瘤细胞具有特殊的亲合力,应用时可自动聚集在肿瘤周围。并具有超顺磁性,具有磁场靶向,可定向移动[7],并通过结合表面修饰配体的主动分子靶向大大加强了靶细胞对目的基因的摄取。

研究发现在多种肿瘤细胞膜表面上的叶酸受体(FR)活性和数量显著增高,而在正常组织细胞很少表达[1,2]。FR已经成为一个具有广谱性的恶性肿瘤的靶点。当FA通过其结构中的γ-羧基部分连接到治疗药物或显像剂药物分子上,该FA复合物与肿瘤细胞表面受体的高亲和力保持不变[8]。利用FR介导靶向肿瘤基因转染,与非靶向用药相比,其靶向性和效能均明显的提高[9]。已有研究发现经FA分子修饰的纳米载体增强了肿瘤组织的靶向性,偶联FA的氧化铁纳米粒子可直接特异性地到达肿瘤靶组织,可用于诊断和治疗[10,11,12]。

在本课题小组前期研究中,已制备了醛基化海藻酸钠改性Fe3O4磁性纳米。该纳米稳定性、粒径和饱和磁性能十分理想,但该纳米为负电荷,难于吸附负电荷的DNA,且在体外,由于细胞膜带负电荷,影响了细胞对该颗粒的摄取,所以不经修饰难以有效被细胞摄取,就需要通过该纳米表面修饰。

多聚乙烯基亚胺(PEI)是人工合成的含有极高密度正电荷的有机大分子阳离子聚合物。PEI与DNA通过正负电荷的相互吸引形成复合物,可被细胞摄取。然而PEI有较大的细胞毒性,且PEI/DNA复合物溶解性较差限制其作为基因载体的应用。因此,许多学者研究将阳离子共聚物连接上非离子的亲水性基团,如聚乙二醇(PEG)[13]。PEG引入不仅可降低载体的毒性,还可延长载体在体内的循环时间、避免非特异性吸附等。已有实验合成PEG-PEI共聚物包裹四氧化三铁纳米颗粒作为基因载体转染基因[14],在本组前期实验中,将制备的PEG-PEI吸附带负电的醛基化海藻酸钠改性磁流体作为基因载体转染基因,发现纳米粒子在肿瘤部位不能达到足够的浓度,缺乏高效分子靶向性。故本组将连有FA和PEG的PEI(PEG-PEI-FA共聚物)作为表面改性剂,与磁流体静电作用复合,得到具有磁靶向及FA分子靶向的基因载体,更易被恶性肿瘤细胞吞噬,为下一步转基因治疗恶性肿瘤提供必要的条件。

主动靶向纳米药物通常要满足以下两个条件:粒径200 nm以内,含有亲水的改性表层,这样才能最大可能的逃避网状内皮系统的吞噬,获得更长的循环时间和更高的靶向能力[15],本组对该叶酸靶向磁性纳米进行的表征结果显示:透射电镜观察该纳米药物颗粒分散均匀,形态规则。平均水动力学粒径为197.8 nm,符合主动靶向纳米药物的应用要求。本组制备的该磁性纳米的Zeta电位为+12.6 m V,且常温下静置3个月未发现纳米沉淀,提示其稳定性好。磁化曲线表明其具有超顺磁性,可作为磁共振靶向对比剂,紫外光谱分析及琼脂糖凝胶电泳分析该纳米颗粒成功偶联上FA分子及与基因结合较好,该纳米基因复合物包含3个重要的功能部分:靶向分子叶酸、基因和Fe3O4磁核。

纳米载体 篇7

关键词：静电纺丝,固定化酶,葡萄糖淀粉酶,聚乙烯醇

固定化酶具有高稳定性、提高酶的利用率、利于产物的分离纯化等多种优点。因此固定化酶已广泛地应用于医药、食品、轻工、分析和科学研究等领域[1]。采用静电纺丝技术制备的纳米纤维膜具有比表面积大、空隙率高等诸多优点, 故静电纺丝纳米纤维膜固定化酶能有效提高酶的催化效率、稳定性和重复利用性, 是一种具有广阔的应用前景的酶固定化方法[2,3]。目前采用静电纺丝技术制备固定化酶多以包裹法为主, 即将高聚物载体溶液与酶溶液按一定比例混合, 在高压静电场中直接拉出包裹酶的纳米纤维。这种方法虽然具有工艺简单、制备成本低等优点[4], 但被包裹酶的活性中心很难暴露, 难以获得较高酶活力的固定化酶。本文采用已制备好的高压静电纺聚乙烯醇 (PVA) 纳米纤维膜为载体, 利用化学结合法固定葡萄糖淀粉酶 (GA) 。采用对甲苯基磺酰氟 (PMSF) 作为基团活化剂, 在非水溶性介质中与PVA纳米纤维膜表面所携带的大量羟基反应, 经过活化后的羟基易与酶的巯基或者氨基反应, 达到固定GA的目的, 故该法又称为活化酯法[5]。此法使酶分子固定在纳米纤维膜的表面, 可增加酶与底物的结合效率。最后, 通过比较固定化酶与游离酶水解淀粉的效率, 期望获得较高酶活力的固定化酶并完善化学结合法固定化酶的工艺。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

H-7500型扫描电子显微镜 (SEM) (Japan, Hitachi) ;傅立叶红外光谱仪 (FT-IR) 其扫描范围为4000-400cm-1 (USA, Nicolet-560) ;UV-2550分光光度计 (日本岛津公司) ;高压静电纺丝装置 (吉林大学化学学院自组装) ;振荡培养箱 (上海精密仪器仪表公司) 。聚乙烯醇 (PVA, 聚合度1750±50, 国药集团化学试剂有限公司) ;葡萄糖淀粉酶 (苏柯汉 (潍坊) 生物工程有限公司) ;对苯甲基磺酰氟 (PMSF, 北京精华耀邦医药科技有限公司) ;四氯化碳、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈、可溶性淀粉等均为分析纯试剂 (北京化工厂) 。

1.2 PVA纳米纤维膜的制备

准确称量PVA固体10g, 将其放置于100mL的去离子水中, 在80℃条件下搅拌5h, 配置成质量浓度为10%的PVA溶液, 接着将质量浓度为10%的PVA溶液倒入带有电极的塑料管中, 调节合适的静电纺丝参数, 进行纺丝。静电纺丝的指标参数为:工作电压为16kV, 喷口与接收板的距离为12cm, 溶液流速为1.6mL/h。

1.3 酶的固定化

为探索PVA与PMSF的最佳反应条件, 分别采用不同介电常数的有机试剂 (四氯化碳ε=2.23;丙酮ε=20.7;乙醇ε=24.5;甲醇ε=32.7;乙腈ε=38.8) 配制高浓度 (2倍摩尔比于纳米纤维膜上的羟基) 的PMSF, 使其作为羟基活化剂。将PVA纳米纤维膜浸泡于不同介质的羟基活化剂中, 在25℃震荡24h, 再用去离子水清洗纤维膜3次, 以除去附着在纳米纤维膜上多余的有机溶剂。将处理的纳米纤维膜在低温真空条件下进行干燥, 制成带有活化羟基的纳米纤维膜。为了确定获得的纤维膜含有活化的羟基, 本研究通过傅立叶红外光谱仪 (FT-IR) 进行测定和分析, 观察硫酸酯键的形成。再将活化后的纳米纤维膜浸泡于不同浓度 (0.1mol·L-1, 0.2mol·L-1, 0.5mol·L-1, 1mol·L-1) 的GA溶液中, 在58℃下震荡24h, 用去离子水清洗纤维膜3次, 除去其表面附着的GA, 进行真空低温干燥。化学结合法在PVA纳米纤维膜上固定GA的原理如图1所示。本文旨在通过PMSF与PVA在不同介质中的相互作用, 以获得通过酯键结合于PVA纳米纤维膜上的固定化葡萄糖淀粉酶 (immobilized glucoamylase, IGA) 。

1.4 酶活力测定

GA的活力单位定义:在pH=4.6、温度为58℃时, 1小时内GA水解淀粉释放出1mg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位 (U) 。酶比活力定义:单位质量的游离酶或载酶PVA纳米纤维膜所具有的酶活力单位数, 单位为U/g。反应液是由10mL的质量浓度为2%的淀粉溶液和5mL的pH=4.6的醋酸缓冲液混合而成。在58℃水浴条件下加热10min后, 加入0.5g载酶PVA纳米纤维膜, 在58℃恒温反应20min。反应结束后, 立刻将反应液置于沸水浴中10min, 终止酶反应。生成的葡萄糖量采用3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) 法测定[6], 以葡萄糖的质量 (mg) 为横坐标, 540nm处吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。分别取2mL待测样品、水 (空白对照) 和各浓度葡萄糖标准品, 加入1.5mL DNS, 沸水浴5min后迅速取出冷却, 加水定容至15mL, 测定吸光度值 (OD540) 。酶活力计算公式:酶活力 (U) =C×N×V1/V2, 其中:C表示标准曲线上查出的试剂中葡萄糖含量;Vl表示试液的体积;V2表示测定时吸取试液体积;N表示稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 静电纺丝法制备的PVA纳米纤维膜

静电纺丝法制备的PVA纳米纤维膜如图2所示, 图2A显示了通过高压静电纺丝技术制备的PVA纳米纤维膜, 从数码照片中可以看出, 该材料在宏观上呈现纤维毯状结构, 具有良好的机械强度, 满足GA固定化技术所需要载体材料的需求。图2B显示了场发射环境扫描电子显微照片, 从图中可以看出:制备的PVA纳米纤维膜表面平滑, 材料内部呈现三维孔道结构, 且制备的纤维直径分布比较均匀, 其数值约为200nm, 符合酶固定化条件的需要。

2.2 葡萄糖淀粉酶在PVA纳米纤维膜上的固定

PVA、PVA-PMSF和PVA-Glucoamylase的红外光谱结果如图3和图4所示。静电纺丝PVA纳米纤维膜的红外光谱上, 3287cm-1的宽峰为O-H的伸缩振动峰, 也是PVA的特征吸收峰;2939cm-1左右为-CH2的伸缩振动峰;1417cm-1左右为O-H、C-H以及-CH2弯曲振动引起的吸收峰;1091cm-1左右是C-O (多缔和体) 单键伸缩和O-H弯曲振动吸收峰。在不同介电常数的有机溶剂中基团活化剂PMSF与PVA纳米纤维膜相互作用的结果, 如红外谱图所示 (PVA-PMSF) 。在出现PVA的特征吸收峰的同时, 在波数约为3300cm-1出现的特征吸收峰向右移动[7], 表明纳米纤维膜中存在分子间的氢键, 它可能来源于PVA分子与PMSF分子之间的的相互作用。在波数为813cm-1、1251cm-1出现了两处特征吸收峰, 分别归属于对称的C-O-S键伸缩振动、不对称的S=O键的伸缩振动[8], 该结果表明硫酸酯键已经形成, 并且存在于纳米纤维膜上, 由此说明PVA与PMSF连接获得成功。另外从红外谱图中还可以看出, 在用乙醇和乙腈作为反应介质所制备产物中, 二者的C-O-S键和S=O键伸缩振动强度明显较大, 表明在以乙醇和乙腈为反应介质的条件下, 所制备的载体材料化学结合效果比其他反应介质结合的效果要好。从不同介质条件所制备的IGA的红外光谱图中可以看出:在波数约为659cm-1、1170cm-1和1656cm-1处所出现的特征吸收峰, 它们分别归属于碳硫键 (C-S) 的伸缩振动、碳氮键 (C-N) 的伸缩振动和酰胺基团中碳氧双键 (C=O) 的伸缩振动吸收;而代表硫酸酯键的813cm-1、1251cm-1二处特征吸收峰, 已经变弱或者基本消失。由此说明:PVA纳米纤维膜上的基团活化剂PMSF经过处理后, 已经从纤维膜中除去, 取而代之的是GA被很好地固定在PVA纤维膜上。综上所述, 通过红外光谱图的比较和分析, 运用高压静电纺丝技术和化学结合方法法, GA已经被成功地固定在PVA纳米纤维膜上。

[ (a) 乙醇; (b) 乙腈; (c) 丙酮; (d) 四氯化碳; (e) 甲醇]

2.3 固定化葡萄糖淀粉酶的理化性质

2.3.1 酶活力

以光密度值为纵坐标, 葡萄糖浓度 (mg/mL) 为横坐标, 计算回归方程为y=1.9407x+0.0178。分别测定在不同介质中制备的IGA的比活力, 计算固化率, 见表1。

2.3.2 最适反应温度和最适反应pH

将固定化前后的GA进行比较, 在pH为4.6时分别改变催化反应温度对酶活性进行测定。图5表明了游离态的GA最适反应温度为59.17℃, 与产品说明一致。固定于PVA纳米纤维膜上的IGA最适反应温度提高到63.34℃, 并且适用温度范围有所变宽。图6为游离酶与固定化酶分别在60℃下于不同pH缓冲液中进行的酶活力测定。结果表明, 游离酶与固定化酶的最适pH范围基本相同, 分别为4.57和4.61。

2.3.3 热稳定性和贮存稳定性

将IGA和游离的GA分别置于pH=4.6的醋酸缓冲液中, 在恒温水浴中保持不同温度1h, 迅速取出并冷却至室温, 随后进行活性测试。图7所示, 固定化酶的热稳定性要优于游离酶, 但经高温处理后其活性明显下降, 此外, 另将一批处于湿态的IGA和游离酶溶液储存于4℃冰箱中, 每隔2d测定其酶活力。图8显示, IGA和游离GA的活力均随着储存时间的延长而降低。储存20d后, 固定化酶仍能保持初始酶活的58.51%, 而游离酶只能保留初始酶活力的18.13%。固定于PVA纳米纤维膜的IGA储存稳定性显著提高。这一结果与目前大多数固定化酶的试验结果相同, 原因是经固定化的酶分子活动自由度减少, 提高温度可以增加分子链的柔性即空间构型的改变要容易些, 故而固定化酶必须在比自由酶更高的温度下才表现出最佳的催化性能。

2.3.4 重复使用性

固定化酶的重复使用性是衡量固定化酶性质的重要指标之一。在pH值4.6, 60℃下, 取出IGA用蒸馏水冲洗3次, 以去除表面的底物和产物溶液, 然后重复使用, 测其酶活力。由连续重复使用10次的实验结果 (图略) 可知。第2次使用时酶活力即大幅下降, 但随后几次使用时能保持在一个较高的水平;从第6次使用开始酶活力又进一步逐渐下降。其原因可能是部分酶活性被底物或产物堵塞, 减少了酶与底物接触的机会。

3 结论

采用活化酯法, 以PMSF为基团活化剂在非水溶性介质中活化PVA纳米纤维膜, 然后放置于水溶液中进行固定GA, 对其理化性质进行研究。

(1) 红外光谱数据表明:GA成功固定在PVA纳米纤维膜的表面, 以乙醇为介质活化的PVA纳米纤维膜固定效果较好。

(2) 对固定于PVA纳米纤维膜上的IGA进行酶学性质检测, 结果表明IGA保持了较高原酶 (游离酶) 的活性。同时发现IGA相对游离态GA的最适反应温度升高了近5℃, 且在各温度点都表现出更高的酶活力。

(3) 酶被固定于某一介质内部或载体表面时, 由于载体的特性不同, pH值对酶活力的影响也不相同[9]。本法制备的IGA与游离态GA的最适pH相近, 但各pH值处都表现出更高的酶活力。

(4) 从酶学的热稳定性和储存稳定性方面看, 固定于PVA纳米纤维膜上的IGA均优于游离态GA, IGA经多次重复利用后发现, 第2次使用时酶活力大幅下降, 但此后有较好的重复利用性。

以PVA纳米纤维膜为载体, 经过PMSF活化, 而制备的IGA在最大程度上保留了酶活力, 减少了酶变的可能性, 增加了酶的稳定性, 并具有良好的重复使用性。该方法理论上适用于所有酶的固定化, 并且可以被其它高聚物制备的纳米纤维膜材料所替代。

参考文献

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