组织表达

关键词： 超微结构 列齿 组织化学 毛蚶

组织表达（精选十篇）

组织表达 篇1

1 材料与方法

1.1 材料与样品制备

实验所需样品群体采自江苏连云港海州湾海区，群体个体数量为30个，样品采集后活体运回实验室暂养。样品制备时分别取肝胰脏、斧足、外套膜、闭壳肌、鳃组织5种组织，按质量体积比1∶3(g/mL)比例加入0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)，冰浴研磨，4℃下15 000 r/min离心30 min(消化腺组织需二次离心30 min)，取上清液，部分装入0.5 mL的Eppendorf管中4℃保存待用，一部分装入1.5mL的Eppendorf管中保存于-20℃冰箱中备用。

1.2 实验方法

1.2.1 电泳

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法，电泳槽为北京六一仪器厂的DYCZ-24D型电泳槽，胶的制备参照何忠效的方法略作改动[6]。电极缓冲液为Tris-Gly溶液(pH 8.3)，指示剂为溴酚蓝，4℃条件下，浓缩胶电压为120 V，进入分离胶电压升至150 V，电泳时间4～5 h。

1.2.2 染色

染色方法参照卢龙斗和何忠效的方法并略加改进，染色完毕后用数码相机拍照、绘图，电泳酶谱谱带的命名方法及其酶谱分析参照王中仁方法[7]。

1.2.3 保存

用7%的冰醋酸+30%的乙醇+单蒸水保存。

1.3 同工酶的命名

同工酶的命名根据各种酶谱的相对迁移率(Rf=d/l,d为酶带迁移距离;l为指示剂迁移距离)从小到大依次命名，各位点从阴极到阳极的迁移顺序命名(1,2,3…)，若该位点有一个以上等位基因，各等位基因按英文字母顺序命名(a,b,c…)。

2 结果

本实验共检测了6种同工酶类，其中过氧化氢酶未显示任何酶带，α-淀粉酶和过氧化物酶仅在肝胰脏中表达，而酯酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶在5种组织中均有活性。

2.1 酯酶（EST,E.C.3.1.1.1)

EST是催化酯类化合物水解并进入中间代谢的重要酶类。贝类酯酶的酶谱表型与鱼类存在相似性，酶谱表型均较为复杂，一般认为是单体，由多个位点编码。毛蚶酯酶的各组织共检测出4～10条酶带，明显分为5个区域，与其他几种双壳类相似[5,8];各组织间EST酶谱表型存在不同程度上的差异，其中EST-3仅存在肝胰脏和鳃组织中。从图1可见EST-2,EST-5位点编码的酶活性在各组织中均最强，其中消化腺组织的酶带最复杂，而且表现出的酶活性也最强。

2.2 苹果酸脱氢酶（MDH..E.C.1.1.1.37)

MDH是细胞三羧酸循环中重要的脱氢酶之一。在硬骨鱼类中，MDH分为上清液型(s-MDH)和线粒体型(m-MDH);为二聚体;在双壳类贝类中，MDH谱带分为2个区，由2个位点各编码一个二聚体。毛蚶的MDH分布较广，在各组织中均有表达，根据酶带的深浅判断，MDH在斧足和肝胰脏组织中活性最强，闭壳肌和外套膜中较低。

2.3 乳酸脱氢酶（LDH..E.C.1.1.1.27)

LDH是参与糖酵解的关键性酶。现已知道大多数脊椎动物的LDH是由3个基因位点(LDH-a，-b，-c)编码，C位点仅在特异组织中如肝中存在。而对于大多数无脊椎的双壳贝类来说，LDH一般由两个单独位点所编码。毛蚶的乳酸脱氢酶的活性较弱，明显的分为2个区域，其中LDH-2仅在内脏团中表达，且个体之间有差异。在酶的表达活性上，肝胰脏和斧足两个组织的表达较强(图2)。

2.4 α-淀粉酶（α-AMY,E.C.3.1.1.1)

α-AMY是可以水解可溶性淀粉的重要酶类，广泛分布于动物的肝胰脏和唾液中。Morizot[9]认为鱼类的α-AMY是由一个位点所编码的单体酶。而在双壳类中关于α-AMY报道的较少，毛蚶的α-AMY仅在肝胰脏中表达，在其他组织中均无表达活性，呈3条白色带，与泥蚶的α-淀粉酶酶谱表型相近。

2.5 过氧化物酶（POD.E.C.1.1.1.7)

POD是机体抗氧化体系中的重要酶类，与SOD保护生物组织免受过氧化物的氧化。有关动物的POD研究报道较少，双壳贝类的POD研究也仅见泥蚶[5]和紫贻贝[10]。实验表明毛蚶的过氧化物酶有5～8条酶带，分为3个区域，其中POD-3仅存在肝胰脏、鳃中表达。在酶的表达活性上肝胰脏表达略强。

3 讨论

3.1 毛蚶不同组织同工酶特异性分析

结果显示，毛蚶具有比较完整的同工酶系统，并且同工酶系统有着广泛的组织分布。酯酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶3种在各组织中稳定表达的同工酶类也是一些脊椎动物体内所存在的常见酶类，所涉及的代谢途径也与其相类似[5]。同时，毛蚶同工酶的分布和活性强弱具有明显的组织特异性。如α-淀粉酶仅在肝胰脏中表达，而EST-3仅在肝胰脏和鳃组织中有活性，EST-5虽然在各组织中均有表达，但酶活性存在显著差异。不同组织同工酶活性的差异是同工酶组织特异性的表现，反映了不同组织不同的生理功能[11]。

3.2 酯酶在毛蚶不同组织中的表达差异

酯酶是催化酯类化合物水解并进入中间代谢的重要水解酶类。其遗传基础和亚基组成尚无定论。许学积等[12]报道钉螺的EST是由羟基酯酶等组成，有7个位点参与遗传。王梅芳等[13]在二色裂江珧不同组织中，共检测出15条酯酶酶带，且在消化盲囊中活性最高。本实验毛蚶的酯酶酶谱共检测出10条酶带，明显分成5个区域，这与其他几种双壳贝类[5,8]相类似。

酯酶除了维持细胞正常的能量代谢外，还能水解大量非生理存在的酯类化合物，被认为可能与机体的解毒作用密切相关[14]。肝胰脏是生物体营养消化、吸收的重要场所，同时也是机体最重要的解毒器官，这可能与EST-3在肝胰脏中活性最强相关。

3.3 苹果酸脱氢酶在毛蚶不同组织中的表达差异

MDH在三羧酸循环中催化草酰乙酸的形成，在整个循环过程中是一个关键性酶，已知动物的MDH有两种类型，即迁移较慢得到线粒体型(mMDH)和迁移较快的细胞质型或称上清液型(sMDH)，均以由两个位点控制的二聚体酶形式存在。动物有机体中的m-MDH和s-MDH的催化功能是不同的，m-MDH属三羧酸循环酶系，与葡萄糖异生过程有关，而s-MDH催化草酰乙酸和苹果酸-丙酮酸循环，与乙酰CoA的脂肪形成过程密切联系。

组织表达 篇2

MYOD基因家族在鸭小肠组织发育中的表达研究

为研究生肌调节因子MYOD家族对鸭小肠发育的影响,利用QRT-PCR法检测了MYOD家族各成员mKNA在鸭胚第10、14、18、22、27天及出生后1周小肠平滑肌发育过程中的相对表达量.结果表明,4个基因在鸭小肠发育过程中均有表达,且各自的表达量呈现一定的规律性变化.其中MYF5在第10天的表达量最高,之后总体呈下降趋势,到第27天时又达到一个高峰;MYOD1在第10天时表达量最高,之后急剧下降;MYOG的表达量从第10天开始曲折上升,到第22天时达到高峰,之后逐步下降;MYF6在第10天时表达量最高,之后急剧下降.初步推测,MYOD基因家族可能参与了小肠的.发育或功能的调控.

作 者：陈禧 刘贺贺 李亮 司建民 王继文 作者单位：四川农业大学畜禽品种资源发掘与利用重点实验室,四川雅安,625014刊 名：中国家禽 PKU英文刊名：CHINA POULTRY年，卷(期)：32(8)分类号：关键词：MYOD 平滑肌 发育表达 QRT-PCR

组织表达 篇3

关键词：毛果杨；拟南芥；GDSL酯酶；载体构建；转基因

中图分类号： S792.110.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0016-03

GDSL酯酶是脂肪水解酶超家族的一个亚家族，它具有广泛的底物特异性和专一性，能够水解多种酯类物质[1]。它因具有GDS（L）保守区域（pfam，PF00657）简称GDSL，其中G、D和S分别代表甘氨酸、天冬氨酸和丝氨酸等氨基酸残基[2]。近年来，人们从水稻、向日葵、拟南芥和玉米等多种植物体内分离出GDSL酯酶，并鉴定出它具有脂肪酰酯水解酶活性[3]。植物GDSL酯酶是一个多基因家族，在12个不同的植物物种内发现GDSL酯酶成员超过1 100个，如苔藓、葡萄、高粱、水稻、拟南芥和杨树基因组各存在57、96、130、144、108、126个GDSL家族成员[4-5]。GDSL酯酶参与植物发育、形态发生、次级代谢合成及多种防御反应[6-8]。最近，Dharmawardhana等报道了杨树茎由初级到次级生长转变中转录组变化模式[9]，一个GDSL基因Potri.002G253400是逐渐降低转录组聚类成员之一，这一信息初步暗示它可能参与了杨树茎的初级生长。本研究通过半定量RT-PCR手段鉴定Potri.002G253400在不同木质化程度茎节中转录表达模式，构建Potri.002G253400融合绿色荧光蛋白基因GFP的植物表达载体，在拟南芥中过量表达Potri.002G253400-GFP并分析该蛋白细胞内的定位情况。这为今后解析GDSL酯酶在杨树茎初级生长中的作用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以温室生长至3个月的毛果杨为试验材料，从顶端向基部分别取其第1至第6茎节、第9茎节、成熟叶、老叶各组织，用于基因表达分析。用于外源基因遗传转化的植物材料为野生型拟南芥（col-0）。

1.1.2 载体、菌株和培养基 pENTR/SD/D-TOPO（Invitrogen公司）和pGWB5用于转基因植物表达载体构建，转化菌株为大肠杆菌TOP10和DH5α，大肠杆菌和GV3101农杆菌分别用LB和 YEP培养基培养，转基因拟南芥在含50 mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选。

1.1.3 试剂 NA提取试剂pBIOZOL Reagent购自Bioflux公司，DNA Marker、dNTP、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser 试剂盒购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购于Promega公司，LR Clonase购自Invitrogen公司，卡那霉素、庆大霉素等药品购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA的合成 材料经过液氮速冻后研碎至粉末，用pBIOZOL悬浮粉末后装入1.5 mL离心管中，0.1 g样品加入0.5 mL的pBIOZOL，具体操作步骤参照pBIOZOL plant total RNA Extraction Reagent说明书。提取的RNA用不含核糖核酸酶的水溶解，测定其浓度和纯度。总cDNA合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser试剂盒，操作步骤参照其说明书。

1.2.2 Potri.002G253400基因引物 用Primer 5.0设计Potri.002G253400半定量PCR引物，序列为UP：5′-GATTATCCAACCCACAGACCAAC-3′和 DN：5′-GGCTAACTCCGCAGGAACACAAC-3′，片段扩增长度为333 bp。Potri.002G253400基因CDS全长片段扩增引物为cds-UP：5′-CACCATGTCAATTCCTAGGATTTTTC-3′和cds-DN：5′-GAGCTTGGCATCCAGGGCCA-3′，扩增片段长度为1 110 bp。

1.2.3 PCR扩增 以所用毛果杨样品的cDNA为模板，半定量和全长CDS的PCR扩增体系均为20 μL，上下游引物各 0.5 μL，1.0 μL模板，1.0 μL Taq DNA聚合酶，2.0 μL dNTP，2.0 μL 10×Buffer，13 μL水。PCR反应程序：95 ℃ 预变性 5 min，95 ℃变性30 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸（半定量和CDS PCR延伸分别为30、90 s），半定量和全长CDS的PCR扩增循环分别为25、33次。

1.2.4 植物表达载体构建 采用Gateway技术构建载体，取25 ng pENTR/SD/D-TOPO载体和15～30 ng Potri.002G253400基因片段相连接，反应体系为5 μL，反应时间 2 h。取 1 μL 连接产物转化TOPO10感受态细胞，操作参见说明书。用cds-UP和cds-DN基因引物PCR扩增鉴定含Potri.002G253400融合质粒菌落，并进行DNA测序确认。取30 ng pENTR/SD/D-TOPO-Potri.002G253400和120 ng pGWB5载体进行LR反应，反应体系2.5 μL、反应时间8～12 h。取 1 μL 反应产物转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定含 pGWB5-Potri.002G253400 菌落，重组质粒转化GV3101农杆菌。

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1.2.5 拟南芥遗传转化 拟南芥遗传转化沾染法参见文献[10]。

1.2.6 基因组DNA提取 拟南芥基因组DNA提取方法参见文献[11]。

1.2.7 绿色荧光蛋白GFP检测 绿色荧光蛋白GFP的激光共聚焦观察方法参见文献[12]。

2 结果与分析

2.1 杨树Potri.002G253400基因表达特性

以毛果杨第1至第6茎节、第9茎节各cDNA为模板，进行半定量RT-PCR，结果显示，Potri.002G253400基因转录水平在第1茎节处最高，其次为第2、第3茎节，第4至第6、第9茎节中观察不到。此外，使用内参基因Actin作为半定量 RT-PCR 内标，Actin基因扩增数据显示第1至第6、第9茎节各样品cDNA模板浓度基本相等（图1-A）。这个结果表明 Potri.002G253400 基因在顶端组织中大量转录表达。笔者进一步在幼茎、老茎、成熟叶和老叶中检测Potri.002G253400基因转录表达水平，结果显示，在成熟叶中该基因的转录表达水平很低（图1-B）。说明Potri.002G253400基因高丰度表达在毛果杨的顶端分生组织。

2.2 融合Potri.002G253400-GFP植物表达载体构建

以毛果杨幼茎cDNA为模板，用cds-UP和cds-DN引物RT-PCR扩增得到约1.1 kb的片段（图2-A），该片段长度与Potri.002G253400基因理论长度基本吻合。将该DNA片段连接到pENTR/SD/D-TOPO载体上，融合质粒pENTR/SD/D-TOPO-Potri.002G253400约为3.7 kb（图2-A），初步表明目的DNA片段已连接到pENTR/SD/D-TOPO载体上。将该质粒进行DNA测序，结果表明pENTR/SD/D-TOPO载体上DNA片段为Potri.002G253400全长cds片段。

通过LR反应将pENTR/SD/D-TOPO载体上的Potri.002G253400片段同源重组到pGWB5植物表达载体上，融合质粒pGWB5-Potri.002G253400电泳检测结果如图2所示。以该质粒DNA为模板，用Potri.002G253400引物进行PCR扩增，得到的1.1 kb特异条带与目标基因片段大小相符（图2-B）。由于pGWB5载体上融合报告基因GFP，这样构建了C端融合GFP的Potri.002G253400-GFP基因。把 pGWB5-Potri.002G253400 质粒转化GV3101农杆菌，用于 Potri.002G253400 基因遗传转化拟南芥试验。

2.3 Potri.002G253400-GFP转基因拟南芥分析

将上述农杆菌转化拟南芥，筛选获得7株抗卡那霉素的抗性植株。提取各株系基因组DNA作为模板，用Potri.002G253400基因引物扩增，得到Potri.002G253400目的DNA片段（图3），结果表明Potri.002G253400基因已转入拟南芥基因组，然后笔者分析了拟南芥基因组转入的Potri.002G253400基因转录表达。RT-PCR分析结果如图3所示，未转入Potri.002G253400基因的野生型拟南芥中没有扩增出特异条带，而转基因植株中扩增出很亮的特异条带，且大小与Potri.002G253400片段大小吻合。这表明转入到拟南芥基因组的Potri.002G253400呈现出高丰度的转录表达。

由于转入基因是Potri.002G253400-GFP，所以笔者通过激光共聚焦显微镜检测转基因拟南芥中GFP蛋白荧光信号，荧光信号集中在转基因拟南芥根组织的细胞膜或细胞壁区域（图4）。通过蛋白定位预测生物学软件PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）分析可知，Potri.002G253400蛋白最可能定位于细胞壁（0.820）上。

3 结论与讨论

GDSL酯酶基因家族成员广泛存在于植物界，其功能为参与生长发育、形态发生和防御反应等。例如，拟南芥GDSL酯酶GLIP1作为植物免疫力调节因子在植物抗病上起重要作用，GLIP2转录表达被水杨酸、茉莉酸和乙烯信号所诱导[3，13]。本研究结果表明，Potri.002G253400基因转录表达水平随毛果杨茎从初级到次级生长转变而逐渐降低，且在成熟叶中转录水平也很低，这种特异的组织表达模式暗示其功能可能与杨树茎的初级生长相关。植物GDSL酯酶家族成员组织表达模式存在冗余性与特异性，如拟南芥EXL1只在花蕾中表达[14]，油菜GDSL基因BnLIP2只在根中表达[15]，而番茄GDSL1只在果皮表达强烈[16]。此外，笔者运用GFP荧光蛋白分子检测技术发现，Potri.002G253400蛋白很可能定位在杨树的细胞壁上。细胞壁是由木聚糖、纤维素、半纤维素以及果胶构成的复杂糖类物质，这些成分物质中存在大量的酯键。尽管还没有鉴定出Potri.002G253400 GDSL酯酶水解底物，然而可基于其细胞壁定位推测它很可能参与细胞壁合成或作用细胞壁成分物质的水解修饰。笔者将利用Potri.002G253400过量表达遗传材料进一步探讨该GDSL酯酶在杨树茎初级生长中的作用以及其作用与细胞壁的关系。

参考文献：

[1]Akoh C C，Lee G C，Liaw Y C，et al. GDSL family of serine esterases/lipases[J]. Progress in Lipid Research，2004，43（6）：534-552.

[2]Brick D J，Brumlik M J，Buckley J T，et al. A new family of lipolytic plant enzymes with members in rice，arabidopsis and maize[J]. FEBS Letters，1995，377（3）：475-480.

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[3]Lee D S，Kim B K，Kwon S J，et al. Arabidopsis GDSL lipase 2 plays a role in pathogen defense via negative regulation of auxin signaling[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，379（4）：1038-1042.

[4]Beisson F，Gardies A M，Teissere M，et al. An esterase neosynthesized in post-germinated sun flower seeds is related to a new family of lipolytic enzymes[J]. Plant Physiology and Biochemistry，1997，35（10）：761-775.

[5]Ling H. Sequence analysis of GDSL lipase gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，2008，11（5）：763-767.

[6]Volokita M，Rosilio-Brami T，Rivkin N，et al. Combining comparative sequence and genomic data to ascertain phylogenetic relationships and explore the evolution of the large GDSL-lipase family in land plants[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（1）：551-565.

[7]Zhang Z Y，Ober J A，Kliebenstein D J. The gene controlling the quantitative trait locus EPITHIOSPECIFIER MODIFIER1 alters glucosinolate hydrolysis and insect resistance in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2006，18（6）：1524-1536.

[8]Agee A E，Surpin M，Sohn E J，et al. MODIFIED VACUOLE PHENOTYPE1 is an Arabidopsis myrosinase associated protein involved in endomembrane protein trafficking[J]. Plant Physiology，2010，152（1）：120-132.

[9]Dharmawardhana P，Brunner A M，Strauss S H. Genome-wide transcriptome analysis of the transition from primary to secondary stem development in Populus trichocarpa[J]. BMC Genomics，2010，11：150.

[10]Clough S J，Bent A F.Floral Dip：a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

[11]徐平丽，赵晋平，孟静静，等. 一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法[J]. 农业科学与技术：英文版，2010，11（3）：41-42，155.

[12]Endo S，Pesquet E，Yamaguchi M，et al. Identifying new components participating in the secondary cell wall formation of vessel elements in zinnia and Arabidopsis[J]. Plant Cell，2009，21（4）：1155-1165.

[13]Kwon S J，Jin H C，Lee S，et al. GDSL lipase-like 1 regulates systemic resistance associated with ethylene signaling in Arabidopsis[J]. Plant J，2009，58（2）：235-245.

[14]Schrder F，Lisso J，Müssig C. Expression pattern and putative function of EXL1 and homologous genes in Arabidopsis[J]. Plant Signaling & Behavior，2012，7（1）：22-27.

[15]Ling H，Zhao J Y，Zuo K J，et al. Isolation and expression analysis of a GDSL-like lipase gene from Brassica napus L.[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2006，39（3）：297-303.

[16]Girard A L，Mounet F，Lemaire-Chamley M，et al. Tomato GDSL1 is required for cutin deposition in the fruit cuticle[J]. Plant Cell，2012，24（7）：3119-3134.

几种经济贝类性腺组织同工酶表达 篇4

1 材料和方法

1.1 材料

性腺成熟的成体皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)、家虫戚(Cellana toreuma Reeve)、泥螺(Bullacta exarata Philippi)、泥蚶(Tegillarca granosa Linnaeus)、紫贻贝(Mytilus edulis Linnaeus)、虾夷扇贝(Patinopecten yesoensis Jay)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、青蛤(Cyclina sinensis Gmelin)、文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)、硬壳蛤(Mercenaria mercenaria Ria)、缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck),共11种,分别取于宁波市水产品交易市场和浙江省海洋水产研究所。通过观察性腺颜色或镜检辨别雌、雄,-70℃低温冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

分别准确称取性腺组织,蒸馏水漂洗,以1∶3的比例[体重(g)∶体积(mL)]加入0.05%巯基乙醇,冰浴下匀浆,4℃冷冻离心机中12 000 r/min离心30 min,取上清(对于一些富含脂肪的贝类性腺组织需经2次以上离心,直至酶液清纯),加入适量溴酚兰后分装,-70℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2 电泳

采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶(ME)、超氧化物岐化酶(SOD)、乙醇脱氢酶酯酶(ADH)、腺苷-5'-三磷酸酶(ATPase)、酯酶(EST)进行图谱测定。分离胶浓度为8.2%(pH 8.9),浓缩胶浓度为3.6%(pH值6.7),电泳在4℃冰箱中进行。TG系统恒压230 V,电泳时间为4～5 h;EBT系统恒压140V,电泳时间6～7 h。缓冲系统Tris为甘氨酸电极缓冲系统(pH 8.3)。同工酶的显色方法参考喻子牛[3],并略作改动。染色完毕后用7.5%冰醋酸溶液固定,生物电泳图像系统进行摄影记录。

2 结果

2.1 苹果酸脱氢酶(MDH)

见图1。

MDH是细胞中三羧酸循环中重要的脱氢酶之一[4],各种贝类雌、雄性腺的MDH均表现出两个相似的酶带区,但虾夷扇贝和海湾扇贝的MDH未表现出任何活性。精巢中的1处泥蚶、青蛤、文蛤、硬壳蛤、缢蛏等有表达,2处除文蛤表现为弱带外,其他几种贝类均较强的酶谱。卵巢的酶谱表达很强,各种贝类在2处表现出多于2条或2条以上的酶带,但1处仅缢蛏有明显条带,其他贝类在此处出现拖尾现象。

注1:a鲍;b嫁虫戚;c泥螺;d泥蚶;e贻贝;f虾夷扇贝;g海湾扇贝;h青蛤;i文蛤;g硬壳蛤;k缢蛏。注2:上图左为各种贝类精巢,右为各种贝类卵巢(注1,2下同)。

2.2 苹果酸酶(ME)

见图2。

ME同工酶也是参与能量代谢的一种重要的酶类,贝类性腺的ME图谱表达与MDH具有相似的强度,但比MDH的酶谱复杂,精巢中可发现6处具有相同迁移率的酶带区,表现为1的家虫戚、泥螺、泥蚶、文蛤、缢蛏以及弱表达的虾夷扇贝,2处的贻贝、青蛤、文蛤,3处的鲍、家虫戚、文蛤和缢蛏,4处的泥螺、泥蚶、贻贝、硬壳蛤,5处的家虫戚、泥蚶、贻贝、青蛤、文蛤、缢蛏,6处的鲍和家虫戚。卵巢的酶谱较精巢简单,表现出4处相同酶带,1处的家虫戚、泥螺、泥蚶和缢蛏,2处的贻贝、青蛤、文蛤,3处的泥螺、泥蚶、贻贝、文蛤,4处的家虫戚、青蛤、缢蛏以及泥蚶的弱带。

2.3 超氧化物岐化酶(SOD)

见图3。

SOD是生物体防御氧化损伤的重要酶类[4],在各种贝类的性腺组织中SOD的表达比较复杂,但仍能够看出贝类之间的相似条带:贝类精巢的1处文蛤和缢蛏有表达,2处所在位置左近鲍、家虫戚、泥蚶、贻贝、文蛤等有表达,在3出表达的有家虫戚、泥螺、泥蚶、贻贝、虾夷扇贝、海湾扇贝、青蛤、文蛤等,泥螺、虾夷扇贝、青蛤、文蛤、缢蛏等在4处也有表达。在贝类的卵巢中,1处出现贻贝和缢蛏的表达,2处有鲍、家虫戚、泥蚶、海湾扇贝、文蛤的表达,家虫戚、泥螺、泥蚶、贻贝、海湾扇贝、文蛤、硬壳蛤等在3处有表达,4处则出现泥螺、泥蚶、虾夷扇贝、青蛤、缢蛏的表达,5处只有海湾扇贝和缢蛏表现出条带。

2.4 醇脱氢酶(ADH)

见图4。

ADH是参与糖酵解的重要酶类[5],从各贝类精子ADH电泳图谱可以看出,在标号1处,鲍、贻贝、硬壳蛤有迁移率相同的条带,且在硬壳蛤中表现最为明显,位于标号1处的稍下方,泥蚶、青蛤、缢蛏有1条弱带。在标号2处家虫戚、泥蚶、贻贝、虾夷扇贝、青蛤、文蛤均具有该条带。而在标号3处,鲍和虾夷扇贝具有该条带,且于扇贝中表达明显。在各贝类的卵巢的电泳图谱中,只有两处表现出一定的相似性,在1处泥蚶、贻贝、青蛤均表现为迁移率相近的2条带,而家虫戚和文蛤则在迁移率较大条带处表现出1条带。在2处,只有青蛤和缢蛏表现出条带的相似性。

2.5 腺苷-5'-三磷酸酶(ATPase,E.C.3.6.1.8)

见图5。

ATP酶的主要功能是水解ATP高能磷酸键,释放出大量能量供机体的需要[6]。从上图的电泳条带可以看出,各贝类性腺组织ATP活性很强,其中迁移率相同的条带也比较多。在各贝类精巢的同工酶谱上可以看出,在点样孔较近处家虫戚、贻贝、虾夷扇贝、缢蛏等均有强的酶带。在1处,鲍、泥螺、泥蚶、虾夷扇贝、缢蛏等具有迁移率相同谱带;家虫戚、青蛤、缢蛏在2处均有表达;家虫戚、泥螺、文蛤、缢蛏等均有3处谱带;在4处,泥蚶、虾夷扇贝、硬壳蛤等表现出明显的2个条带,而泥螺中的该处活性很强,看不出是否具有相似的2条带。卵巢的电泳图谱可发现其中的3处不同的贝类表现出相同的条带,在1处家虫戚、泥蚶、虾夷扇贝表现出酶带,2处酶带表现在家虫戚、泥螺、虾夷扇贝、海湾扇贝中,3处仅硬壳蛤和缢蛏有此迁移率的酶带。

2.6 酯酶(EST,E.C.3.1.1.1)

见图6。

酯酶广泛分布在生物体的各个组织器官中,特别是在消化器官中的含量异常丰富,在各性腺组织中EST表达也很强[7]。在精子图版的1处,泥蚶、文蛤、缢蛏表达出条带;2处及离此处较近的位点泥螺、贻贝、海湾扇贝、文蛤、缢蛏等均有表达,且在缢蛏中表达最强;在3处,家虫戚、泥螺、青蛤、文蛤、缢蛏有表达,但强弱有明显差别,4处泥螺、泥蚶、虾夷扇贝、文蛤、硬壳蛤等很相似,缢蛏在箭头所指的稍下位置也表现出明显的酶带,大致与泥螺4处的稍下一点的酶带处于同一水平线上;位置5处表现出酶带的贝类有海湾扇贝、青蛤、硬壳蛤,文蛤和缢蛏也在该处表现出弱条带;各种贝类在6处表现出的酶带较多,皱纹盘鲍、泥螺、贻贝、虾夷扇贝等均表现出多余2条的酶带。在卵巢的同工酶谱中可以看到有4个表现出共同酶带的位置,分别是1处的家虫戚、泥蚶、海湾扇贝、文蛤,2处的家虫戚、泥螺、文蛤、缢蛏,3处的泥螺、泥蚶、贻贝以及文蛤的弱条带,4处的泥螺、贻贝、虾夷扇贝、海湾扇贝。

3 讨论

通过上述几种同工酶在各种贝类性腺组织中的表达比较可以发现,尽管试验贝类分属于不同的种或属,其酶谱仍显示出很多迁移率相同的条带。试验贝类性腺的MDH和ME酶带所表现的共有性很明显,虽然MDH只表现出两条共有条带,但这两条带基本在每个试验的贝类性腺中都含有,而ME的酶谱可大致看出2个表达明显区,并出现在几乎所有的贝类性腺中。作为机体中起到重要防御作用的SOD,在各贝类性腺中的表达明显,其中为不同贝类所共有的条带数在精巢及卵巢中分别为4条和5条。另外ADH、ATPase、EST亦表现出同样的相似性特征。由此我们可以看出,贝类虽然在漫长的进化中发生分化,但仍存在某些共同的特征,表现了它们的同源性。

地球上最初的生命是从非生命物质发展来[8],现代生存的各种生物有着共同的祖先,在漫长的进化过程中,由于环境及其他因素的作用,生物沿着不同的方向向前发展,从而造成生物种类和数量由少到多,生物的结构和功能有低级到高级,由简单到复杂。在众多的影响生物进化的因素中,环境起到了主导作用。生物生存的环境具有变化性和异质性,环境随时间的变化导致生物的适应性进化,环境在空间上的异质性导致生物的分异(性状分歧),分异的结果是物种形成[9]。试验中的各种贝类均生活于海水环境中,在生殖季节它们都是将配子释放外界环境中,受精和胚胎发育均在体外进行,这就决定了它们必然存在着某些共同基因来保持这种共同的生殖方式。通过它们的几种同工酶图谱我们可以看出,虽然这些贝类的形态特征千差万别,但其生理机能仍保持了某些相似性的特征,这主要表现在酶谱中各种贝类具有迁移率相同的酶带。

结果分析发现,同种或同属的贝类性腺所表现出共有的酶带数多于种间或属间,即亲缘关系越近,共有酶谱表达越相近,原因可能是贝类的亲缘关系越近,它们的生存环境和生活特征也就越相似,在漫长的进化史中越是沿着相同的方向向前发展,因而它们具有生理特征的相似性也就越明显。

种群及种群间的基因分化通常是一个缓慢的过程,这不仅直接与物种的遗传特性有密切的关系,而且与生物所处的生态环境有直接的关系。亲缘关系高度相近的物种之间常常具有许多共同的基因,而亲缘关系越远,则基因之间的差异就越大。同时,生态环境的相同或近似则能有效地维护生物基因的相对一致性,生态环境的多样性必然诱使生物基因的多样性。生物进化过程中必然有高频率的物种分化,而蛋白质又是物种分化变异中最为直观的表达产物,酶作为蛋白质中的一个特殊种类,也必然能够代表物种的分化程度。因此,同工酶技术作为生物化学和分子生物学研究深入发展的产物,可以用来间接了解DNA的变异情况,分析生物种群的遗传特性和遗传结构,了解种群内外乃至种间的遗传多样性,在重建生物的系统发生上也有着重要的意义;若结合种群的生态条件进行分析,则有助于了解生物适应环境的遗传学基础。

同工酶谱显示,各种贝类性腺的很多酶带迁移率明显不同,表达强弱也有差别,这种现象是在贝类漫长的进化历史中逐渐形成的。其进化过程可能是这样的:原始的一个广布的贝种,在其分布区内,因地理的或其他环境(如滩涂、海水、岩石)隔离因素而被分隔为若干相互隔离的群体,又由于这些被隔离的种群之间基因交流的大大减少或完全隔断,从而使各隔离种群之间的遗传差异随时间推移而逐渐增大,通过若干中间阶段(如族、地理亚种的形成)而最后达到种群间的生殖隔离[10]。这样,原先因环境隔离因素而分隔的两个或多个初始种群就演变为因遗传差异而相互间生殖隔离的新种。由于初始种群在分化过程中(生殖隔离获得之前)起分布区是不重叠的,故名异地种形成。一旦生殖隔离完成,新种的分布即使再重叠(环境隔离因素消失),也不会再融合为一种。此时,作为基因载体的DNA、RNA分子和蛋白质均会随生态环境而变化,使生物遗传特性在质量上发生变异,从而构成了生物遗传多样性和基因多样性以及种类的多样性。而生活在广阔海水环境中的贝类也因为各种因素造成了贝类物种的多样性,表现在酶谱表达的多态性。

摘要：用聚丙烯酰胺电泳法对皱纹盘鲍、家虫戚、泥螺、泥蚶、紫贻贝、虾夷扇贝、海湾扇贝、青蛤、文蛤、硬壳蛤、缢蛏11种经济贝类性腺组织的6种同工酶(MDH、ME、SOD、ADH、ATP、EST)进行检测分析。结果发现,各贝类性腺组织的各种同工酶谱的表达存在很多迁移率相同的条带,说明了它们的同源性;并且亲缘关系越近的贝类之间的酶谱表达越相似,表明环境对贝类进化具有重要作用;但由于不同贝类的所在的微环境的差异造成了同工酶谱表达的多态性。

关键词：经济贝类,进化生物学,物种形成,同工酶

参考文献

[1]张庆朝.同工酶的种类与生理功能[J].生命的化学,1993,13(6):18-20

[2]龚大洁,周开亚.同工酶及其在爬行动物系统学中的应用[J].西北师范大学学报(自然科学版),1999,35(1):111-116

[3]喻子牛,孔晓瑜,杨锐,等.泥蚶等位基因酶遗传变异研究[J].中国水产科学,1997,4(5):15-21

[4]王梅芳,余祥勇,杨荣权,等.二色裂江珧EST和SOD同工酶组织特异性研究[J].湛江海洋大学学报,2000,20(1):5-8

[5]李广丽,叶富良.马氏珠母贝不同组织同工酶的比较[J].水产学报,2000,24(5):418-421

[6]胡能书,万贤国.同工酶技术及其应用[M].长沙:湖南科学技术出版社,1985.70-85

[7]蒋晓华,昝瑞光.滇池高背鲫同工酶发育遗传学研究[J].云南大学学报(自然科学版),1996,18(2):114-117

[8]李难主编.生物进化论[M].北京:高等教育出版社,1985.1-5

[9]陈辉.生态遗传学与物种形成和进化[J].陕西林业科技,1999,76-81

组织表达 篇5

目的:研究脑缺血再灌注(CIR)后脑组织中蛋白酶激活受体-1(PAR-1)的表达及其与炎症反应的关系. 方法:40只雄性SD大鼠线栓法建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,再灌注后于3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d取脑,免疫组化法和脑组织匀浆法检测PAR-1、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的.含量. 结果:缺血再灌注后脑组织PAR-1表达增加(P＜0.01),MDA含量增多(P＜0.01),SOD活性降低(P＜0.01);PAR-1表达与MDA含量正相关(r1=0.844,P＜0.05),与SOD含量负相关(r2=-0.901,P＜0.01). 结论:CIR后PAR-1表达增多可加重脑组织炎性反应.

作 者：周青珍 王华梅 吴家幂 ZHOU Qing-zhen WANG Hua-mei WU Jia-mi  作者单位：周青珍,ZHOU Qing-zhen(郧阳医学院附属东风医院神经内科,湖北,十堰,442000)

王华梅,WANG Hua-mei(江宁医院神经内科,江苏,南京,211100)

吴家幂,WU Jia-mi(弋矶山医院神经内科,安徽,芜湖,241001)

刊 名：郧阳医学院学报  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF YUNYANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 27(3) 分类号：Q26 关键词：大脑中动脉   栓塞   蛋白酶激活受体-1  

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组织表达 篇6

[关键词]大肠癌；多梳基因；Bmi-1蛋白；免疫组化

[中图分类号] R735.3+5   [文献标识码] B   [文章编号] 2095-0616（2011）22-62-02

目前大肠癌的预后仍不理想，约有50%的患者死于治疗后的复发或远处转移，患者预后差与其不能早期诊断密切相关[1]。多梳基因-1（Bmi-1）为多梳基因家族(PcG)成员之一，研究显示其在肿瘤的诊断和预后判断中具有广阔的前景[2-3]。因此，笔者采用免疫组化技术，检测了大肠癌患者组织中Bmi-1蛋白的表达情况，以探讨其与大肠癌的关系及相关的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2007年1月～2009年1月来笔者所在医院进行治疗的大肠癌癌患者32例，所有病例均经活检病理诊断证实为大肠癌。其中，男19例，女13例。年龄25～79岁，平均（60.2±11.8）岁。按照大肠癌的Dukes分期分为A、B、C、D四期。其中，A期6例，B期8例，C期11例，D期7例。另取活检的20例正常组织作为对照组。

1.2 主要试剂

Bmi-1蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司，浓缩型SP免疫组化超敏试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物公司。

1.3 Bmi-1蛋白的免疫组化染色

实验所取标本置于4%多聚甲醛固定，4～6 μm石蜡切片常规脱蜡后，分别用于常规HE染色和免疫组化染色。免疫组化染色按照试剂盒的说明操作。

结果判断：Bmi-1阳性表达定位于细胞核，呈黄色或棕黄色。阳性标准：高倍镜下计数100个细胞，阳性细胞数＜10%为阴性表达，＞10%为阳性表达。

1.4 统计学处理

应用SPSS12.0统计软件处理数据，计数资料使用x2 检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bmi-1蛋白在大肠癌组织中的表达

Bmi-1蛋白阳性染色定位于细胞核，Bmi-1蛋白在大肠癌组织中的表达率为56.3%（18/32），而在正常对照组织中仅有15.0%（3/20）的表达，两者差异有统计学意义（P ＜0.01）。见图1。

A 大肠癌组织的常规HE染色；B 大肠癌组织的Bmi-1蛋白免疫组化阳性染色；C 大肠癌组织的Bmi-1蛋白免疫组化阴性染色

图1  Bmi-1蛋白在大肠癌组织中的表达

2.2 Bmi-1蛋白的表达与大肠癌临床特征的关系 （表1）

表1  Bmi-1蛋白的表达与大肠癌临床特征的关系

临床特征nMCM-2蛋白

阴性阳性P

年龄（岁）

 ≤6014770.17

 ＞6018810

性别

 男198110.42

 女1367

Dukes 分期（期）

 A、B 141150.001

 C、D18013

3 讨论

近半个世纪以来世界各国肿瘤的发病率和死亡率逐渐上升，已超过心血管疾病成为新世纪人类的头号杀手，其中由大肠癌所导致的死亡占整个肿瘤死亡的9%[1]。大肠癌的发生、发展伴有多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，近年来的统计显示大肠癌的发病率逐年增高，且有年轻化的趋势，大多数患者死亡率高的原因主要是大部分患者明确诊断时已处于中晚期，错过了治疗的时机。有统计显示处于Dukes A期的患者5年生存率可以高达90％以上，说明早期诊断在大肠癌预后中的重要作用[4]。因此，寻找一种能早诊断并监测其复发和预后判断的生物学指标是目前研究的热点。Bmi-1基因是已被实验证实的癌基因，主要是负性下调抑癌基因p16和p14，使p16和p14丧失抑制细胞G1-S期过度的功能，从而导致细胞恶性克隆性增生[5]，大量研究显示Bmi-1蛋白在肺癌、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌等人类多种恶性肿瘤中表达升高，笔者的研究也显示Bmi-1蛋白在大肠癌组织中的表达率为56.3%，显著高于正常对照组织中的15.0%，说明Bmi-1蛋白可以作为大肠癌鉴别诊断的1个标志蛋白。

Dukes分期中A、B期无淋巴结转移，C、D期有淋巴结转移，笔者的结果显示分期之间Bmi-1蛋白的表达也存在统计学差异，提示其与肿瘤的转移有一定的相关性，可成为大肠癌患者预后不良的一个参考指标。

综上所述，Bmi-1蛋白在大肠癌的发生发展中起到一定的作用，可以用于肿瘤的良恶性鉴别诊断、临床分级以及判断预后等方面，具有显著的临床意义。

[参考文献]

[1] Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin, 2011, 60(5): 277-300.

[2] Haupt Y,Alexander WS，Barri G，et a1．Novel zinc finger gene implicated as myc collaborator by retrovirally accelerated lymphomagenesis in Emu-myc transgenic mice[J].Cell，1991，65(5):753-763．

[3] 阚方功，彭开桂.Bmi-1与实体瘤的关系研究进展[J].蚌埠医学院学报，2010，35（11）：1193-1196.

[4] 吕洋，刘博，吴靖芳.大肠癌相关生物标志物的病理学进展[J]．河北北方学院学报(医学版)，2007，24（1）：80-82．

[5] 胡中华，胡义德.BMI-1基因与肿瘤关系研究进展[J].中华肿瘤防止杂志，2006，13（23）：1824-1827.

人牙髓组织中TLR-2的表达研究 篇7

关键词：人牙髓组织,Toll样受体-2,表达,免疫组化,逆转录PCR

Toll样受体 (toll-like receptors, TLRs) 是存在于生物体内一大类非常重要的模式识别受体, 可识别多种病原体相关分子模式 (PAMPs) , 包括脂多糖、磷壁酸、肽聚糖等, 能够介导机体的天然免疫, 同时在机体适应性免疫中也发挥作用[1]。其中Toll样受体-2 (TLR-2) 具有相对广泛的配体特异性, 可识别多种PAMPs, 在非感染性组织损伤以及组织修复的过程中发挥着重要作用[2]。目前研究证实在人正常牙髓组织中未发现Toll样受体-4 (TLR-4) 阳性细胞, 而炎症牙髓中TLR-4表达为强阳性, 而关于TLR-2在牙髓组织中的表达及分布情况尚不清楚。本研究以人健康牙髓及炎症牙髓为研究对象, 通过免疫组化和逆转录实时荧光聚合酶链反应 (PCR) 检测研究TLR-2信使核糖核酸 (m RNA) 和TLR-2蛋白在人牙髓中的分布及表达情况, 从而了解TLR-2在牙髓组织中的天然免疫作用。

1 材料与方法

1.1 材料

收集泸州医学院附属口腔医院口腔门诊因临床诊断为慢性牙髓炎而拔除的第三磨牙10颗为炎症牙髓组;收集同期拔除的健康第三磨牙10颗为健康牙髓组。患者年龄20岁~30岁, 健康牙髓组纳入标准为牙体完整无龋病及牙周病, 牙髓炎症组纳入标准为临床表现为明显温度刺激痛或自发痛的慢性牙髓炎, 但近1个月未服用免疫制剂。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色

所有牙齿拔除后置于无菌Hanks液中保存, 在距釉牙骨质界根方约3 mm处将牙冠劈开, 用镊子和探针小心取出牙髓。牙髓组织用4%的甲醛溶液固定后进行石蜡包埋、切片、粘片、脱蜡, 一抗用亲和纯化的抗人TLR-2抗体, 二抗加酶标链亲和素复合物, 二氨基联苯胺 (DAB) 显色, 苏木素复染, 封片, 光学显微镜下观察。每次实验均以0.01 mmo L/L磷酸盐缓冲液 (PBS) 替代一抗作为空白对照。采用IPP6.0显微图像分析系统对免疫组化染色结果进行定量分析, 以视野中阳性染色面积占视野面积的百分比表示阳性表达率, 每个标本选5个视野, 取平均值。

1.2.2 逆转录PCR检测

采用Trizol法提取牙髓组织和细胞中的总核糖核酸 (RNA) , 按RT-PCR扩增反应试剂盒说明操作, 逆转录获得互补脱氧核糖核酸 (c DNA) , 以β肌动蛋白 (β-actin) m RNA的表达水平作为内参照。TLR2及β-actin引物由大连Taka Ra公司提供。RT-PCR反应的引物序列如下:β-actin (F/R:CCTGTACGCCAACACAGTGC/ATACTCCTGCTTG CTGATCC) ;TLR (F/RCCCAAAGTCTTGATGATTGG/TTAAGTTC TCCAGCTCCTG) 。PCR反应条件:95℃变性40 s之后56℃退火40 s, 然后72℃延伸40 s, 共进行40个循环。反应结束后, 用2.0%琼脂糖凝胶电泳, 成像分析。

1.3 统计学方法

计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组织化学染色显示, TLR-2在健康牙髓组织中表达呈阴性, 在炎症牙髓TLR-2的表达呈阳性。对TLR-2在2组牙髓组织中的表达的免疫组化图像分析结果显示, 炎症牙髓组织中TLR-2阳性表达率显著高于健康牙髓组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。以正常牙髓组织及炎症牙髓组织标本总RNA进行RT-PCR扩增, 产物用琼脂糖凝胶电泳后成像发现, 炎症牙髓标本均在β-actin条带之上348bp位置出现条带, 与预期扩增产物一致, 而健康牙髓标本未见对应条带。

3 讨论

Toll样受体均为Ⅰ类跨膜蛋白, 分胞外区、跨膜区和胞内区, 胞外区结构域富含亮氨酸重复基序 (leucine-rich repeats, LRRs) , 称为LRR功能域, 跨膜区富含半胱氨酸, 胞内区结构域和哺乳类白介素-1受体 (IL-1R) 结构和组分非常相似, 称为Toll-IL-1R (TIR) 功能域。LRR的主要作用是识别病原体表面的PAMPs, 胞内Toll/IL-1受体同源区 (TIR) 主要负责机体相应反应的信号传导[3]。TIR在进化中是相当保守的, 而与病原相关分子模式 (PAMP) 识别相关的胞外结构则进化得较快。根据识别PAMPs的不同又将Toll样受体 (TLRs) 分为三类[4]:识别脂类PAMPs的TLR1, 2, 4, 6, 10, 其中尤以TLR-2识别的种类繁多;识别蛋白质类的TLR5、11, 如鞭毛蛋白以及识别核酸类 (源于病毒或细菌) 的TLRs, 主要包括TLR3, 7, 8, 9。TLRs表达于所有的淋巴组织中, 在外周血白细胞中的表达水平最高, 单核/巨噬细胞、B淋巴细胞、T细胞及树突状细胞都表达TLRs;此外, 在脂肪细胞、小肠上皮细胞、皮肤、内皮细胞均有表达, 这充分支持TLRs是防御微生物侵入的“哨兵”的理论[5]。文献报道[6,7], TLRs在牙髓、牙周组织和牙龈上皮细胞以及口腔黏膜上也均有表达。在TLRs与天然免疫应答关系的研究中, TLR-2具有相对广泛的配体特异性, 可识别多种PAMPs并可协助TLR-4参与人体内对脂多糖 (LPS) 的反应;另外, TLR-2在非感染性组织损伤以及组织修复的过程中也发挥着重要作用。因此, 深入了解TLR-2不仅有重要的理论意义, 而且具有非常重要的现实意义。

本研究以人健康牙髓及炎症牙髓为研究对象, 分别通过免疫组化及逆转录PCR方法研究TLR-2蛋白以及TLR-2 m RNA的分布与表达情况。结果显示, TLR-2在健康牙髓组织中表达呈阴性, 但是在炎症牙髓中呈阳性, 炎症牙髓组织中TLR-2阳性表达率显著高于健康牙髓组;而对所有标本总RNA的RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后发现, 炎症牙髓标本TLR-2 m RNA表达上调。此结果提示, 牙髓感染和牙髓组织TLR-2表达增多同时存在, TLR-2可能直接或间接地参与了牙髓局部炎症以及免疫反应。目前关于TLR-2在牙髓中的研究较少, 本文虽然发现了其在炎症牙髓中的阳性表达, 但是TLR-2在牙髓病变发生发展过程中的作用, 及其在牙髓炎症反应中的作用机制尚需进一步研究。

参考文献

[1]晏春根, 谢青.Toll样受体与炎性应答[J].国外医学·流行病学与传染病学分册, 2003, 30 (1) :159.

[2]杨芳芳, 陈成水.Toll样受体2的研究进展[J].医学综述, 2008, 144 (11) :1636.

[3]孙守勋.Toll样受体2的研究进展[J].重庆医学, 2008, 37 (5) :533.

[4]蒋宏伟, 凌均棨, 曾劲峰.Toll样受体4在人成牙本质细胞和牙髓组织中的表达[J/CD].中华口腔医学研究杂志 (电子版) , 2008, 2 (1) :4.

[5]Bahri R, Saidane-M osbahi D, R ouabhia M.Candida fam ata m odulates toll-likereceptor, beta-defensin, and proinflam m atorycytokineexpression by norm alhum an epithelialcells[J].JCellPhysiol, 2010, 222 (1) :209.

[6]段立立.内毒素对人牙周膜细胞Toll样受体2和Toll样受体4表达的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2012, 22 (2) :71.

卵形鲳鲹不同组织同工酶表达的差异 篇8

1 材料和方法

卵形鲳鲹为网箱养殖鱼类。取回实验室后马上进行解剖,取肌肉、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、脑等6种组织。各组织、器官先用0.8%生理盐水冲洗干净,取适量称重,放在小培养皿中,下面垫上冰袋,用消毒后的剪刀适当剪碎,小心拨入玻璃匀浆器的玻璃管中,然后把玻璃管竖直插入冰水混合物中以样品:缓冲液=1:3的比例混合匀浆。匀浆0.5 h后,4℃、13 000 r·min-1离心30 min,然后取上清液,按需分量装小管中置于-70℃冰箱中备用。此实验采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法。浓缩胶的浓度均使用4%,缓冲液是tris-HCl(pH 6.7)溶液。梯度胶的浓度和缓冲系统见表1。用移液枪进行点样,每个点样孔加25 μL样品。电泳是在4℃冰箱中进行,电泳缓冲液使用tris-Gly缓冲液,pH 8.3。染色方法参考《同工酶技术及其应用》[7]、《电泳》[8]和《蛋白质电泳实验技术》[9]。酶的命名参考SHAKLEE等[10]推荐的方法,以同工酶缩写名称的大写代表酶蛋白,小写代表编码基因。若该酶有1个以上座位编码,各座位按其编码酶从阴极到阳极的迁移顺序命名为1、2、3……。

注:TC . Tris-柠檬酸(pH 7.0);TVB. Tris-硼酸-EDTA(pH 8.4)

Note:TC. Tris-citric acid(pH 7.0);TVB. Tris-boric acid-EDTA(pH 8.4)

2 结果与分析

2.1酯酶(EST,EC 3.1.1.1)

卵形鲳鲹不同组织的EST电泳图谱见图1。卵形鲳鲹的EST同工酶由2个位点Est-1和Est-2控制,其在组织中的表达有明显的组织特异性,肌肉、脾脏、心脏和脑组织中记录1个位点,在肌肉和脾脏中表达微弱,在心脏和脑表达明显;肝脏和肾脏中2个位点都有表达,且表达明显。

2.2乳酸脱氢酶(LDH,EC 1.1.1.27)

不同组织的LDH酶谱见图2。记录到的LDH由3个基因座位编码,分别记为Ldh-1、Ldh-2、Ldh-3。组织差异性表现在脾脏没有记录到LDH,心脏和脑记录到Ldh-1的表达,肌肉记录到Ldh-3,肾脏记录到Ldh-1、Ldh-2和Ldh-3的表达。LDH的活性在各个组织中也存在差异,肌肉和心脏的活性最强,脑和肾脏次之,肝脏和脾脏最低。

2.3苹果酸脱氢酶(MDH,EC 1.1.1.37)

不同组织的MDH见图3。卵形鲳鲹的MDH分为2个区,由2个位点编码。Mdh-1表达为MDH1和MDH2 2条酶带,Mdh-2表达为MDH3 1条酶带。各组织的LDH具有一定的组织差异性,肝脏的活性最强,而且可以观察到3条酶带;心脏的活性次之,可以观察到MDH1和MDH3;脾脏可以检测到MDH2和MDH3;肌肉、脾脏和脑的活性较低,可以检测到MDH1和MDH3。

2.4苹果酸酶(ME,EC 1.1.1.40)

不同组织的ME见图4。卵形鲳鲹的ME同工酶只检测到1条酶带,由1个基因座位编码。肝脏的活性最强,脾脏、肾脏和心脏次之,肌肉和脑组织没有检测到ME。

M.肌肉;L.肝脏;S.脾脏;K.肾脏;H.心脏;B.脑M.muscle;L.liver;S.spleen;K.kidney;H.heart;B.brain

2.5天门冬氨酸氨基转移酶(AST,EC 2.6.1.1)

不同组织的AST同工酶见图5。卵形鲳鲹的AST记录到3条酶带,由2个基因座位编码。在肝脏中的活性最强,肾脏次之,其它的几种组织没有检测到AST。

3 讨论

3.1卵形鲳鲹同工酶的表达具有明显的组织特异性

5种同工酶在卵形鲳鲹不同组织中表达的座位数、异聚体形成的能力及活性的强弱都有差异。EST同工酶在肝脏和肾脏表达了2个座位,其它的4种组织只表达了1个座位。LDH同工酶在肾脏表达了3个座位,在肌肉、肝脏、心脏和脑都只表达了1个座位,而在脾脏中没有表达。MDH同工酶在6种组织中都检测到2个座位,但每个座位的表达产物并不一样,酶活性强弱也不一样。ME同工酶在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中都检测到1个座位,在肌肉和脑中没有发现ME。AST在肝脏和肾脏检测到2个基因座位,其它4种组织没有发现。

上述结果分析表明,卵形鲳鲹不同组织同工酶表达有明显的组织特异性,其酶谱特征在不同组织中均有差异,尤其是肝脏、肾脏中的EST、MDH和肾脏中LDH的表达式样明显不同于其它组织。鱼类同工酶组织特异性的存在是机体在特定环境下适应生存条件及组织分化并特异性执行各自功能的结果。例如EST属于水解酶类,能催化酯键水解,对于酯类代谢和生物膜的结构与功能具有一定的作用,因此,卵形鲳鲹的EST在肝、肾中表达较明显。LDH是参与糖酵解的关键性酶,LDH3催化乳酸形成,在卵形鲳鲹肌肉等厌氧代谢组织中活性强,是对嫌气组织无氧酵解特性的适应;LDH1与乳酸利用有关,在卵形鲳鲹心、肾、脑等的好气组织中占优势。MDH是糖代谢三羧酸循环过程中最重要的酶,在细胞中的功能主要是使苹果酸脱氢酶参与糖酵解的有氧代谢,因此,在卵形鲳鲹的肝脏、肌肉和心脏表达强烈。

卵形鲳鲹同工酶组织特异性,表现在以下几个方面:

(1)位点的表达。某些位点的同工酶仅限于某种组织特有,在其它组织中,该同工酶不表达或活性太低而检测不出。如Est-2仅在肝脏和肾脏中表达,Ldh-2仅在肾脏中表达。

(2)位点表达的程度即酶活性的强弱。一方面,同一位点在不同组织中的相对含量或表达的数量差别很大,如Est-1在肝脏和肾脏中的表达很强,Ldh-3在肌肉中的表达很强,而这些位点在其它组织中表达较弱;另一方面,不同位点在不同组织中相对活性不同,如肌肉中Mdh-1较Mdh-2编码的酶活性强,而在脑组织中恰好相反。这些差异也是和所在组织和器官的功能密切相关的。酯酶除了维持细胞正常的能量代谢外,还能水解大量非生理存在的酯类化合物,认为可能与机体的解毒作用密切相关,EST2只在肝脏和肾脏中出现且活性较强,因而有可能参与解毒功能,而肝脏是机体的重要解毒器官。Mdh-1是线粒体型,Mdh-2是上清液型,卵形鲳鲹脑组织中Mdh-1活性较弱可能说明脑细胞线粒体有氧代谢不发达。

(3)等位基因表达上的差异。由于复等位基因的存在,不同的组织中会有不同的等位基因表达,结果同一位点上的酶谱表型在不同组织中有明显差异,或有时等位基因编码的亚基不一定完全表达或不能通过电泳鉴定其产物,即存在“哑等位基因”或“无效基因”。结果也导致不同组织中同一位点的酶谱表型出现差异,如Mdh-1在肝脏中表达为MDH1和MDH2,在肾脏中表达为MDH2,在其它的4种组织中表达为MDH1,MDH是二聚体酶,在肝脏有2条酶带,其它5种组织只有1条酶带,可能存在哑等位基因。

3.2卵形鲳鲹同工酶组织特异性与功能的相关性

不同组织同工酶活性的差异是同工酶组织特异性的一种表现,这种差异与其组织的生理功能相关。

EST属于水解酶类,能催化酯键水解,对于酯类代谢和生物膜的结构与功能具有一定作用。在硬骨鱼类中EST一般认为是单体或二聚体,由多个位点编码,多态现象非常普遍,EST酶谱非常复杂[11,12,13]。对卵形鲳鲹各组织的EST电泳分析可知,它的酶谱比较简单,总共只有3条酶带,其中在肝脏的活性高于其它组织,这可能与肝脏的解毒等作用有关[14]。

LDH是参与糖酵解的关键性酶,催化丙酮酸与乳酸间的相互转化,在肌肉和心脏组织中活性高,可在有氧状态下,催化乳酸转化为丙酮酸而进入三羧酸循环,通过有氧氧化呼吸从而获得较多的生物能量来保证其收缩功能的正常进行[15]。卵形鲳鲹LDH3催化乳酸形成,在肌肉等厌氧代谢组织中活性强,是对嫌气组织无氧酵解特性的适应;LDH1与乳酸利用有关,在心、肾、脑等的好气组织中占优势[16]。

MDH、ME是生物氧化的重要酶类,主要催化苹果酸与丙酮酸、草酰乙酸之间的相互转化,这些酶的大量存在,利于将物质经三羧酸循环转化为能量以供肌肉收缩所需。在细胞中的功能主要是使苹果酸脱氢参与糖酵解后的有氧代谢[17]。因此,MDH在心脏、肝脏和肾脏等有氧代谢旺盛的组织中染色较深。卵形鲳鲹的MDH含量非常丰富,特别是在肝脏中,这说明肝脏的有氧代谢很旺盛。

组织表达 篇9

1 材料和方法

1.1 标本

所有标本均来自北京肿瘤医院2000年2月～2007年2月间手术切除标本,收集乳腺癌标本65例及其癌旁正常组织(距肿瘤缘≥3cm) 65例,全部为女性,年龄为35～80岁,平均年龄为52.35岁,其中有淋巴结转移的35例,无淋巴结转移的30例,所有乳腺癌患者术前均未接受放化疗。全部标本均经组织病理学证实为浸润性导管癌。

1.2 试剂

抗体一抗来自美国Santa Cruz公司,二抗、三抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

石蜡标本4μm厚连续切片,免疫组化采用SP法,DAB显色,苏木素复染、脱水、透明、封片。以0.01M PBS液(pH7.5)替代一抗作为每次染色的阴性对照,已知表达MMP12非小细胞肺癌组织作阳性对照。

1.4 判断标准

依照Kapitanovic的标准稍有改动。以细胞浆呈黄色反应为阳性信号,以阳性细胞数≥10%作为阳性判断标准。阳性染色强度按着色深浅分三度:+、++、+++。+++为强阳性表达。

1.5 统计学处理

所有数据均采用SPSS13.0统计软件包处理,率的比较采用χ2检验,P值<0.05为差异有显著性。

2 结果

65例乳腺癌中MMP12表达率为81.57%(53/65);而在癌旁正常组织中表达率为18.46%(12/65),MMP12在乳腺癌组织中的表达率明显高于癌旁组,两组之间表达具有显著性差异(P<0.01)。在有淋巴结转移组强阳性表达率为68.57%(24/35),在无淋巴结转移组强阳性表达率为13.33%(4/30),两者差异有统计学意义(P<0.01),见表1。

3 讨论

浸润和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征,也是恶性肿瘤患者的主要死亡原因。ECM的降解是肿瘤浸润和转移的重要途径。基底膜是ECM的主要成分之一,是肿瘤细胞浸润和转移的屏障。基底膜的完整性是判定肿瘤细胞有无浸润和转移的标志。ECM由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白等成分组成,这些成分均为MMPs的作用底物,均能被MMPs降解。MMPs通过对ECM的降解来促进癌细胞对周围组织的浸润。MMPs代表着一个大家族在细胞的增殖、血管发生、肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用[1]。根据底物专一性,MMPs可分为胶原酶、明胶酶、基质降解素和模型MMPs4大类。MMP12是MMPs家庭中的新成员,MMP12能有效地降解弹性蛋白和ECM包括Ⅳ型胶原、弹性板、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、硫酸软骨素等[2]。

近年研究发现MMP12在正常组织中少量或不表达,在多种肿瘤细胞中呈现高表达,潘虹等[3]从转录及蛋白质水平研究发现MMP12在非小细胞肺癌组织中高表达,并与淋巴结的转移存在显著相关性。董燕等[4]报道MMP12在子宫内膜癌中的表达随着病理分级的升高、肌层浸润程度的加深以及手术病理分期的升高而增强。刘伟松等[5]研究发现MMP12与喉鳞状细胞癌的发生和转移有关。MMP12高表达与临床预后密切相关。MMP12在不同的组织中预示着不同的预后。研究报道,MMP12高表达在胃癌中预示着良好的预后[6],其原因与抑制血管生成有关,Guelaguetza[7]等发现MMP12在子宫颈癌中可能与浸润和癌细胞早期转移有关,提示不良预后。

本研究发现,乳腺癌组织中MMP12阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P<0.01),表明MMP12在乳腺癌中高表达,同时淋巴结转移组强阳性表达率高于阴性组(P<0.01),表明MMP12与乳腺癌浸润、转移有关。MMP12在乳腺癌发生机制中的具体作用及其与预后之间的关系仍需进一步研究。

参考文献

[1] Nabeshima K,Inoue T,Shimao Y,et al. Matrixmetalloproteinases in tumor invasion: role for cellmigration[J]. Pathol Int,2002;52(4) :255～264

[2] GRONSKI T J J r,MARTIN R L,KOBAYASH ID K,et al. Hydrolysis of a broad spectrum of extracellular matrixproteins by human macrophage elastase[J]. J Biol Chem,1997;272: 12189-12194

[3] 潘虹,刘铭,张晓莉,等.非小细胞肺癌组织中MMP12的表达及临床意义.第三军医大学学报,2010;32(2) :142～145

[4] 董燕,沙建华.基质金属蛋白质酶12在子宫内膜癌中的表达及其意义.中国微生态学杂志,2006;18(3) :212～214

[5] 刘伟松,项丞,贾深汕,等.基质金属蛋白酶-12及其编码基因NM-002426在喉鳞状细胞癌中表达的研究.临床耳鼻咽喉科杂志,20006;20(24) :1120～1123

[6] 章宏,历有名,许国强.人巨噬细胞弹性蛋白酶在胃癌细胞和组织中的表达及临床意义.中华肿瘤杂志,2007;34(8) :564～566

组织表达 篇10

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 在我国其发病率居各类肿瘤首位, 占全部恶性肿瘤死亡人数1/4。因此, 寻找新的胃癌防治方法有重要的临床意义。研究表明, 胃癌的发生、发展与凋亡细胞数目减少有密切联系。细胞凋亡失控会引起细胞过度增殖和凋亡减少, 从而导致肿瘤发生、发展。生存素 (Survivin) 属于凋亡抑制蛋白 (IAP) 家族, 通过抑制Caspase-3表达, 抑制肿瘤细胞凋亡而促进肿瘤的发生、发展。Bcl-2是凋亡调控基因, 广泛抑制各种刺激因素诱导的细胞凋亡, 延长细胞活力而发挥生物学作用。Survivin与Bcl-2在胃癌发生、发展中的关系尚不明确。因此, 本研究通过检测胃癌组织中Survivin和Bcl-2表达, 探讨Survivin和Bcl-2与胃癌发生、发展的关系及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本及来源

收集黑龙江省大庆油田总医院2008—01～2009—06手术切除胃癌标本40例, 取癌组织同时取癌旁正常胃黏膜组织。 其中男26例, 女14例, 年龄40～75 (平均65.12) 岁, 其中未/低分化癌22例, 中/高分化癌18例;胃癌的分期采用1997年U ICC分期标准进行TNM分期, Ⅰ～Ⅱ期28例, Ⅲ～Ⅳ期12例;无淋巴结转移21例, 有淋巴结转移19例;未侵及浆膜者20例, 侵及浆膜者20例。

1.2 试剂及方法

兔抗人Survivin和Bcl-2单克隆抗体购于Sigma生物技术公司。SP试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公司。按试剂盒说明书操作。

1.3 免疫组化染色结果判断标准

常规制备石蜡切片及HE染色, 组织标本均经40g/L甲醛固定, 石蜡包埋, 4μm厚连续切片, 行病理组织学检查。采用SP试剂盒免疫组化方法染色, 用PBS替代一抗作阴性对照, 癌旁正常组织作为正常对照。Survivin和Bcl-2阳性染色位于细胞浆内, 呈棕黄色颗粒状。按阳性细胞数占细胞总数的比例判定:高倍镜下选取10个视野, 计数阳性细胞数, 阳性细胞数<10% (-) , ≥10% (+) 。

1.4 统计学分析

采用SPSS11.0统计包, 数据用χ2检验及Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 Survivin阳性表达

Survivin阳性产物位于细胞浆中, 呈棕黄色颗粒状。在胃癌组织中Survivin蛋白阳性率60.00%, 在癌旁正常胃黏膜组织中Survivin蛋白阳性率22.50%, 两者比较有显著性差异 (χ2 =11.605, P<0.01) , 见表1。

注:*与癌旁正常组织比较有显著性差异。

胃癌组织中Survivin蛋白表达阳性率在男性患者中高于女性, 但两者比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;胃癌组织中Survivin蛋白表达阳性率在高/中分化癌组织中低于未/低分化癌组织, 两者比较有显著性差异 (χ2=4.713, P<0.05) ;胃癌组织中Survivin蛋白表达阳性率在Ⅰ～Ⅱ期癌组织中低于Ⅲ～Ⅳ期癌组织, 两者比较有显著性差异 (χ2=4.682, P<0.05) ;胃癌组织中Survivin蛋白表达阳性率在无淋巴结转移癌组织中低于有淋巴结转移癌组织, 但两者比较差异无统计学意义 (χ2 =3.480, P>0.05) ;胃癌组织中Survivin蛋白表达阳性率在无浆膜侵润癌组织中低于有浆膜侵润癌组织, 两者比较有显著性差异 (χ2 =4.286, P<0.05) ;Survivin与胃癌各临床病理因素间的关系, 见表2。

注:*两组比较有显著性差异。

2.2 Bcl-2在胃癌组织中的表达

40例胃癌组织中有30例Bcl-2呈阳性表达, 其阳性率为75.00%;30例Bcl-2 阳性表达中Survivin 阳性表达占22例, 阳性率为73.33%;Survivin的表达与Bcl-2的表达呈正相关 (r=0.471, P<0.01) , 见表3。

3 讨论

本实验结果显示, 在胃癌组织中Survivin阳性表达率为60.00%, 且随胃癌分化程度、TNM分期增加及浆膜侵润程度, 其阳性表达率亦随之增高。研究结果提示Survivin在胃癌发生、发展过程中可能起重要作用。在Bcl-2阳性表达胃癌组织中Survivin阳性率为73.33%, 提示Bcl-2与Survivin可能在胃癌发生、发展过程中起协同作用, 这些结果也进一步证实胃癌的发生、发展是多种基因和多种因子共同作用的结果。Survivin是IAP家族中一个新成员, 属凋亡抑制因子, 通过直接或间接抑制凋亡效应蛋白酶Caspase-3和Caspase-7活化来阻断细胞凋亡过程, 促进细胞增殖[1,2]。因此, Survivin参与肿瘤的发生、发展过程。Survivin基因在正常组织中不表达或低表达, 而在肿瘤组织中呈高表达, 这一特点使其可能成为判断肿瘤病人发生、发展及预后的一项重要指标[3,4]。本实验结果表明, 在胃癌组织中Survivin阳性表达较癌旁正常组织显著增高, 且随胃癌分化程度、TNM分期增加及浆膜侵润, 其阳性表达率亦随之增高。故推测Survivin阳性表达可能是胃癌发生、发展的标志之一。检测胃癌组织中Survivin表达可能对判断肿瘤的发生和临床进展有一定作用。有关胃癌组织中Survivin与Bcl-2蛋白表达的关系尚不明确。本研究结果显示, 在Bcl-2阳性和阴性的胃癌组织中, Survivin阳性表达率分别为73.33%和20.00%, Survivin表达与Bcl-2表达呈正相关, 这与研究报道一致[5]。提示两者表达可能在胃癌发生、发展过程中具有协同作用。这为进一步探索胃癌治疗方案提供有价值的线索。胃癌的发生、发展是多因素、多阶段、多基因变异的病理过程。其发生机制尚未完全阐明, 但和多种基因表达异常密切相关。Survivin与Bcl-2两种生物因子的检测, 可作为胃癌发生与发展的重要参考指标, 有望成为胃癌基因诊断性标志物和胃癌治疗的新靶点。

参考文献

[1]王滋宗, 魏煜程, 沈毅.非小细胞肺癌组织Survivin和Caspase基因表达及其关系[J].青岛大学医学院学报, 2008, 44 (4) :319-321

[2]许兰涛, 崔煜.Survivin反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长的抑制[J].中国肿瘤生物治疗杂志, 2008, 15 (1) :31-34

[3]李凤朝, 孔庆兖, 杨雪梅.Survivin在胃癌中的表达及其与细胞凋亡、p53的关系[J].实用肿瘤学杂志, 2004, 4 (6) :214-217

[4]Wang TT, Qian XP, Liu BR.Survivin:potential role in diagnosis, prognosis and targeted therapy of gastric cancer[J].World JGastroenterol, 2007, 13 (20) :2784-2790