细菌的培养与分离技术（通用9篇）
篇1：细菌的培养与分离技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术
一、实验目的与要求：
（1）掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能
（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法。
（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等。
二、实验原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
三、实验器材
1、牛肉膏蛋白胨培养基
2、盛9ml无菌水的试管，盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，1ml和5ml无菌 吸管，无菌培养皿；
3、接种环，土样，酒精灯等。
四、操作步骤
1、倒平板 将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，并标明培养基的名称。
2、贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。
3、点燃酒精灯。
4、接种
取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。
环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触边壁，使其冷却。
取菌种 待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环，然后将接种环移出菌种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。
接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：
⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。
⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
环灭菌 将接种环烧红灭菌。
5、挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置25℃和28℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
四、注意事项
1、实验操作过程中无菌操作。
篇2：细菌的培养与分离技术
通过外加砷源驯化肇庆市鼎湖山自然保护区土壤中细菌,采用富集、稀释平板、硝酸盐漫过方法从土壤中分离出2株砷氧化细菌.氧化砷实验表明:As-I、As-Q能高效将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ),其氧化率可达99%.培养条件研究表明,2菌株最适生长温度为30℃,As-I、As-Q最适生长pH分别为8和7.
作 者：莫于婷 宋卫锋 孙国萍 宾丽英 张倍维 作者单位：莫于婷,宋卫锋,张倍维(广东工业大学环境科学与工程学院,广东,广州,510006)
孙国萍(广东省微生物研究所,广东,广州,510070)
宾丽英(广东工业大学环境科学与工程学院,广东,广州,510006;广东省微生物研究所,广东,广州,510070)
刊 名：广西轻工业英文刊名：GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY年，卷(期)：2009“”(2)分类号：Q939.96关键词：土壤 砷 硝酸银 砷氧化菌
★ 脱硫细菌的培育及最佳生长条件的研究
★ 常见肠杆菌属细菌的耐药性研究
★ 高效溶磷菌株Bmp5筛选及活力和培养条件的研究
★ 生防细菌LM-3的鉴定及其抗菌蛋白的研究
★ 活的非可培养状态细菌生物学特性研究进展
★ 人文素养培养研究的论文
★ 论文：研究生创新思维培养研究
★ 学生体育能力培养研究论文
★ 学生语言表达能力培养研究论文
篇3：细菌的纯种分离与培养
通常情况下, 微生物是以群体的方式“杂居”在环境中。为了方便进行研究与应用, 一般需要先把目标微生物从微生物群体中分离出来, 进行纯化, 得到其纯种。在环境微生物学实验课程中, 细菌的纯种分离与培养实验, 其目的是教会学生将细菌从微生物群体中分离纯化出来, 最终得到细菌纯种[1,2]。
1 细菌纯种分离方法
在微生物实验中, 一般通过单菌落分离的方法获得细菌纯种。所谓单菌落分离, 就是让微生物群体在培养基上生长, 形成单菌落, 然后将目标细菌的单菌落纯化, 最终得到目标细菌纯种。由于分离专性厌氧细菌需要专门的厌氧操作箱或者其他类似的仪器设备, 其数量有限, 短时间内无法满足实验课的需求。因此, 在环境专业本科生的实验课中, 通常学生分离的是好氧细菌或兼性好氧细菌。针对这两大类细菌, 可以通过平板划线法、平板表面涂布法或浇注平板法获得细菌单菌落。
2 实验材料
细菌的纯种分离实验以环境样品作为实验材料, 这些环境样品包括从上海曲阳污水处理厂二沉池取来的剩余活性污泥、崇明岛滩涂的土壤以及校园河水等。污水处理厂生化反应池中利用微生物组成的活性污泥具有处理污水的功能, 而从崇明岛采集的土壤样品和从校园采集的河水水样都具有一定的代表意义。以这些环境样品作为实验材料, 对其进行细菌纯种的分离、纯化, 将实验教学与环境问题有机结合, 有助于加深环境专业本科生对污水生物处理及土壤、河水微生物的认识与理解, 拓宽学生的专业视野, 激发学生的好奇心, 促进学生创新思维的培养[2]。
3 细菌的纯种分离与培养实验
平板划线法、平板表面涂布法和浇注平板法都是以培养皿作为培养微生物的容器, 将适于微生物生长的培养基灭菌、倒平板、冷却凝固后, 通过将样品在培养基上划线、涂布样品稀释液或者直接将样品稀释液和培养基混合均匀的方式, 使样品中微生物的浓度得到稀释, 然后在培养基上生长形成单菌落。虽然这3种实验方法的具体操作有所不同, 但是其本质都是将样品进行稀释, 使样品中的细菌最终在培养基上形成单菌落, 从而得到纯菌。本实验主要学习用浇注平板法分离纯化剩余活性污泥中的细菌[3]。
3.1 实验准备工作
实验开始以前, 需要做好实验准备工作。由于实验中学生需要用培养皿、培养基并稀释环境样品, 所以准备工作中最重要的是培养皿以及稀释环境样品所用的物品的准备, 此外还有培养基的配制。
根据实验需要, 每组学生准备若干套培养皿。每套培养皿包括一个培养皿盖和一个培养皿底, 这些培养皿都是事先清洗干净并在室温自然晾干的。学生将若干套培养皿按一定的排列顺序放入专门的培养皿罐中, 然后放入电热干燥箱中, 160℃干热灭菌2小时后取出, 放在室温下冷却待用。此外, 还需要准备1 mL和10 mL的移液管, 放入专门的移液管筒中, 和培养皿罐一样进行干热灭菌。
由于剩余活性污泥需要被梯度稀释到10-4和10-5浓度, 然后再作为实验材料进行细菌分离, 所以学生需要先准备一定量的无菌水, 以用于活性污泥的梯度稀释。准备无菌水时, 需要1个锥形瓶和4支同样大小的试管, 锥形瓶中提前加入一些玻璃珠, 学生用量筒分别量取90 mL和9 mL的蒸馏水倒入锥形瓶和试管中, 塞好棉花塞, 包好包装纸, 送入高压蒸汽灭菌器121℃, 0.103 MPa灭菌20 min[4]。
3.2 细菌分离纯化
进行细菌分离纯化时, 学生要点燃煤气灯, 在火焰旁进行实验操作, 尽量达到无菌要求。在取来剩余活性污泥样品后, 要首先对其进行梯度稀释。学生用移液管量取10 mL活性污泥样品, 将其加入锥形瓶90 mL的无菌水中, 塞好棉花塞, 摇晃锥形瓶, 通过玻璃珠的作用将活性污泥打碎, 形成浓度为10-1的均匀混合液, 然后用移液管量取浓度为10-1的1 mL混合液, 加入到试管9 mL的无菌水中, 形成浓度为10-2的混合液, 按照相同的方法依次稀释, 最终将活性污泥稀释到10-4和10-5浓度, 最后用移液管分别取1 mL活性污泥稀释液加入到空的培养皿中, 在培养皿盖上写上编号。
在准备好实验样品以后, 学生在小铁锅内放入自来水, 将已经灭菌并冷却凝固的培养基放进铁锅中, 水浴加热, 等培养基完全融化以后, 将其放到实验台上, 室温冷却, 等到学生用手触摸盛培养基的锥形瓶不烫手时, 就可以倒平板。此时, 培养皿中已经分别加入了浓度为10-4和10-5的活性污泥样品, 学生左手拿培养皿, 用大拇指和食指略微打开培养皿的盖, 其余3个手指托住培养皿的底, 同时右手拿培养基, 在培养皿内倒入少量培养基, 使培养基能铺满培养皿底即可, 然后将培养皿放在实验台上, 轻轻来回转动培养皿, 使培养基和活性污泥样品充分混合均匀。待培养基彻底冷却、凝固成平板以后, 将其倒置放入37℃恒温培养箱内培养24~48小时, 就能在平板上观察到若干圆形、颜色均匀、边缘清晰的细菌单菌落。
4 实验效果
通过实验, 学生学会使用浇注平板法分离纯化剩余活性污泥中的细菌。实验需要准备培养皿、无菌水、移液管和培养基等物品, 并涉及干热、湿热灭菌, 锻炼了学生的动手操作能力。在实验过程中, 需要先稀释实验样品、将样品加入培养皿, 然后加热融化培养基、倒平板。整个实验过程需要无菌操作, 并且操作要求的注意事项比较多, 需要各组学生互相配合, 充分沟通, 共同努力, 才能顺利完成实验。绝大多数小组的学生观察到了细菌的单菌落, 本实验获得了非常好的教学效果[5,6]。
摘要：以污水处理厂的剩余活性污泥作为实验材料, 在环境专业本科生中开展细菌的纯种分离与培养实验, 巩固了学生专业基础理论知识, 锻炼了学生实验操作技能, 激发了学生学习的热情, 促进了学生创新能力的培养。
关键词：细菌,分离,培养
参考文献
[1]洪庆华, 徐正, 秦璐璐.环境微生物学实验教学的改革[J].实验室研究与探索, 2011, 30 (5) :101-103.
[2]邓百万, 陈文强, 彭浩.基于能力培养的微生物实验教学手段与方法的改革研究[J].实验技术与管理, 2011, 28 (2) :7-10.
[3]周群英, 王士芬.环境工程微生物学[M].第三版.北京:高等教育出版社, 2008.
[4]王云创, 秦丹, 刘俊杰.在实验教学中培养创造性思维能力[J].实验室研究与探索, 2010, 29 (5) :140-142.
[5]梁璐怡, 胡宝兰, 朱亮.环境微生物学实验教学改革[J].实验技术与管理, 2012, 29 (9) :126-128, 131.
篇4：细菌的培养与分离技术
材料与方法
标本来源：2005年7月～2007年7月经临床确诊为肺结核的住院病人，同时伴有呼吸系统感染患者。晨起第1次咳出的痰液，置于无菌瓶中，立即送检。
药敏纸片：选用青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、羧苄青霉素、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、丁胺卡那霉素等（北京生物制品研究所）。
细菌分离培养与鉴定方法：按《全国临床检验操作规程》操作。
药敏试验方法：挑取分离鉴定的菌落，用无菌生理盐水制成菌悬液，用无菌棉签均匀涂布于培养基中，15分钟之内贴药敏纸片，35℃培养箱中孵育18小时，测量抑菌环直径，并根据NCCLS标准判断敏感(S)、中介度(I)、耐药(R)。同时定期用标准金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、铜绿假单胞菌（ATCD27853）、大肠埃希菌（ATCC25922）菌株做药敏质控。
结 果
痰液中分离的菌株分布情況［株数/百分率（%）］：大肠埃希菌（471/49.1），志贺菌属（8/0.8），铜绿假单胞菌（79/8.2），恶臭假单胞菌（12/1.3），产碱假单胞菌（9/0.9），肠杆菌属（37/3.9），类产碱假单胞菌（4/0.4），醋酸钙不动杆菌（13/1.4），肺炎克雷伯菌（42/4.3），变形杆菌（11/1.1），黏质沙雷菌（9/0.9），液化沙雷菌（8/0.8），枸橼酸杆菌（15/1.5），布兰汉菌属（30/3.1），金黄色葡萄球菌（104/10.8），表皮葡萄球菌（37/3.9），乙型链球菌（10/1.0），肺炎链球菌（61/6.4）。在这18种菌属中共960株细菌，其中革兰阳性菌212株，革兰阴性菌748株。
药敏试验结果统计：对分离菌株做药敏试验，经统计学处理，对16种抗生素的耐药率见表1，较常见菌株耐5种及5种以上常用抗生素的情况见表2。
讨 论
细菌耐药性迅速增长已成为当今全球关注的热点［1］。本组资料表明，引起肺结核合并呼吸系统感染的常见菌中，革兰阴性杆菌占绝对优势，其中感染率最高的是大肠埃希菌，而排在第3、5、6位的依次为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属。革兰阳性球菌中的金黄色葡萄球虽然排在第2，但只占感染总数的10.8%，排在第4位的肺炎链球菌占6.4%。总之，肺结核合并呼吸系统感染常见菌依次为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌，以革兰阴性杆菌为主。
从表1中可以看出，肠杆菌属出现多重耐药株比例最高，其次是大肠埃希菌。通常喹诺酮类抗生素有较强抗菌活性，但现在已产生耐药菌株，铜绿假单胞菌对氨苄青霉素和阿莫西林的耐药率已达100%，对先锋类和喹诺酮类抗生素也产生了一定的耐药性。因此临床上在治疗呼吸系统感染时，应谨慎使用抗生素。肺炎链球菌对青霉素的耐药率为54.4%。我们的耐药率明显高于国际细菌耐药监测研究组Jacobs等报道［2］。近年来金黄色葡萄球菌耐药性有逐年上升的趋势，尤其是MRSA常呈多重耐药性［3］，因此可以考虑与其他抗菌药物联合应用治疗低度耐药的MRSA感染。
从表2中可以看出，多重耐药菌株已相当严重，应当引起高度重视。建议在应用抗生素治疗呼吸系统感染性疾病之前，先留取患者晨痰并及时送到细菌室，做细菌分离培养鉴定及药敏试验，将其结果作为临床选择用药的重要参考。
2年内，从肺结核病合并呼吸系统细菌感染性疾病的痰液中分离出各种细菌960株，对了解引起肺结核合并呼吸系统感染的细菌及细菌谱，对于肺结核合并呼吸系统细菌感染性疾病的诊断及合理使用抗生素均具有一定的参考意义。
参考文献
1 陈民钧.当前我国抗生素耐药的发展现状及趋势.中华检验医学杂志，2003，26(12)：744-747.
2 Jacobs MR，Appelbaum PC，Felmingham D.The Alexander projectgroup.Penicillin resistance in S.pneumoniae.Clin Microbiol Infect，2000，6(Suppl1)：28.
篇5：细菌的培养与分离技术
从产自四川彭州的华重楼(Paris polyphylla var.chinensis Franch)地下块茎中分离得到16株菌.经以薯蓣皂甙元为标准对照的.薄层层析分析,表明其中编号为SNUS-1(AY842149)的菌株能分泌重楼皂甙或其类似化合物.16S rDNA序列(约1,500bp)系统发育分析表明:菌株SNUS-1与Pseudomonas tolassii (AF255336)和Pseudomonas tolassii(D84028)的遗传距离分别为0和0.003,在系统进化树上三者又严格聚为一族,结合形态及生理特征确定其为托氏假单孢菌(Pseudomonas tolassii).
作 者：张晓洁 查岭生 陈小静 冯定胜 王一丁 ZHANG Xiao-Jie ZHA Ling-Sheng CHEN Xiao-Jing FENG Ding-Sheng WANG Yi-Ding 作者单位：张晓洁,ZHANG Xiao-Jie(四川师范大学生命科学学院,成都,610068;蚌埠医学院医学检验系,蚌埠,233000)
查岭生,ZHA Ling-Sheng(淮北煤碳师范学院生物系,淮北,235000)
陈小静,冯定胜,王一丁,CHEN Xiao-Jing,FENG Ding-Sheng,WANG Yi-Ding(四川师范大学生命科学学院,成都,610068)
篇6：细菌的培养与分离技术
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计
一、教学目标
1.掌握筛选微生物的实验原理，对分离不同微生物能熟练配制不同的选择培养基
2.分析研究思路的形成过程，为本节课的细菌筛选提供思路启迪
3.掌握微生物培养过程的无菌操作
二、教学重点
1.对土样的选取和选择培养基的配制
2.实验流程的设计
三、教学难点
对分解尿素的细菌的计数
四、教学方法
启发式教学
五、教学工具
多媒体课件
六、教学过程
（一）新课引入
1.尿素是一种重要的氮肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为
氨和CO2，这是因为细菌能合成脲酶。
2.在体外将DNA大量复制的扩增技术被称为DNA多聚酶链式反应，该技术的自动化需要用到一种酶———耐高温的DNA聚合酶，我们应该从哪去寻找这种酶呢？到高温环境中去找，聪明的科学家从热泉中找到了一种耐热细菌Taq，从中筛选出了耐高温的TaqDNA聚合酶，是因为：热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，那么这个过程是否可以给我们一种思路，这种分解尿素的细菌应该如何分离出来？
（二）内容讲解
1.实验基础知识点讲解
1.1实验室中微生物得筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
1.2据教材22页左上角的培养基配方回答下列问题：
〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是
葡萄糖，提供氮源的的是
尿素，琼脂的作用是
凝固剂。
〖思考2〗该培养基对微生物
具有
选择作用。其选择机制是
只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。
1.3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是
稀释涂布平板法
。除此之外，显微镜直接计数法
也是测定微生物数量的常用方法。
1.4采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌
。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是
（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数。
〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是
正确的选择稀释度。
〖思考5〗教材22页案例一，哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？
第二
位同学的结果接近真实值。这两位同学的实验都需要改进：第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。
1.5统计的菌落数比活菌的实际数目
低
。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用
菌落数
来表示。
1.6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
1.7对照实验是指除了
被测试的条件外，其他条件都
相同的实验。满足该条件的称为
对照组，未满足该条件的称为
实验组。
〖思考6〗教材22页案例二，你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？：
方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。
方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。
2．实验设计
2．1
实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。
2．2
土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～90％为细菌。
2．3
分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。
2．4
培养不同微生物往往需要不同的培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。
2．5
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。
2．6菌落的特征包括
形状、大小、隆起程度、颜色
等方面。
〖思考8〗土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。
2．7
实验过程
1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2）应在火焰旁称取土壤
g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。
3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。
4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。
〖思考9〗在研究未知微生物时务必规范操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。
3．结果分析与评价
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶
将尿素分解成了
氨
。氨会使培养基的碱性
增强，PH
升高
。因此，在以
尿素
为唯一氮源的培养基中加入
酚红
指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变
红，说明该细菌能够
分解尿素。
七、板书设计
1、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
2、实验室中微生物的筛选原理
3、菌落数目的统计方法：稀释涂布平板法和显微镜直接计数法
4、设置对照实验应注意的问题和原则
5、实验设计流程
6、对尿素分解菌得进一步鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂进行培养，若指示剂变红，则该细菌能分解尿素。
八、作业布置：
同步解析与测评学考练上相应章节习题
九、教学反思：
篇7：细菌的培养与分离技术
活性污泥中细菌的分离及其生理生化特性研究
从乳品废水活性污泥中分离纯化细菌,并进行生理生化特性、药敏试验研究.结果表明,H-1菌株分解葡萄糖产酸,利用乳糖、蔗糖、甘露醇等碳源;H-1菌株对头孢菌素类、氨基苷类、大环内酯类药物敏感;而对青霉素类、磺胺类等具有不同程度的`耐药性.该研究对改善乳品废水活性污泥微生态、环境污染治理等具有科学指导意义.
作 者：卞阿虎 费平任璐 吕爱军 温洪宇 Bian Ahu Fei Ping Ren Lu Lv Aijun Wen Hongyu 作者单位：徐州师范大学,生命科学学院,江苏,徐州,221116 刊 名：环境科学与管理 英文刊名：ENVIRONMENTAL SCIENCE AND MANAGEMENT 年，卷(期)： 33(12) 分类号：X703.1 关键词：活性污泥 细菌 生理生化 药敏试验篇8：细菌的培养与分离技术
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验药物
庆大霉素、链霉素、林可霉素、头孢氨苄、菌必治等。
1.1.2 试验器材
生物显微镜、托盘天平、锥形瓶、电炉、载玻片、盖玻片、恒温培养箱、超净工作台、立式圆形压力蒸汽灭菌器、冰箱、接种环、酒精灯等。
1.1.3 试剂
乳糖、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂、胆盐、超纯水、中性红、结晶紫、95%乙醇、硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、拘橼酸盐、尿素、半固体琼脂、葡萄糖产气、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖等。
1.1.4 试验动物
试验犬均来自云南农业大学动物科学技术学院动物医院 (西站) 及康大妈流浪动物收容所。首先进行犬健康状况状况调查, 调查内容包括品种、年龄、性别、体重、临床症状, 引起犬腹泻的原因。根据犬的临床症状:出现呕吐, 慢性肠卡他, 厌食, 稀便, 血便, 渐进性消瘦, 营养不良, 精神不振, 体温升高, 脱水等有典型腹泻症状, 经诊断后排除病毒性腹泻及寄生虫腹泻可能的犬。
1.2 试验方法
1.2.1 粪样的采集
在动物医院里, 由于不可能随时都能采到新鲜粪便样品, 所以采用棉棒采集每只试验犬直肠深部少量粪便直接涂片观察, 并编号记录被检犬的年龄、营养状况、品种、性别等, 并保存待检。本次试验粪样采集时间为0d:2010年4月20日, 采到3个样品分别编号1、2、3。1d:2010年4月21日采到4个样品分别编号4、5、6、7。2d:2010年4月22日采到3个样品, 分别编号8、9、10。本次采样的犬品种不一, 有北京犬、雪橇犬、金毛、博美等。年龄从1月龄至8岁之间。各个体的粪样分别取2份。
1.2.2 培养基制备
麦康凯琼脂培养基制备, 麦康凯培养基用于肠道致病菌的选择性分离培养。配方如下蛋白胨20.0g, 乳糖10.0g, 胆盐5.0g, 氯化钠5.0g, 中性红0.03g, 琼脂14.0g, pH值7.1±0.2, 加热溶解于1000ml蒸馏水中, 121℃高压灭菌15min备用。本次试验使用的是由上海市医学化验所试剂厂生产的麦康凯琼脂培养基, 取样品52g加入1000ml蒸馏水中混合放置10min微火煮沸使之完全溶解, 115℃高压灭菌15min备用。鉴定原理为蛋白胨提供碳氮源、维生素和生长因子;牛胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长;氯化钠维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;乳糖为可发酵的糖类;中性红是pH指示剂, 细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。
1.2.3 粪样检测
每一个样品分别取少量的粪样经无菌纯水稀释后涂于载玻片上等干后用革兰氏染色法[5]染色之后进行镜检。
1.2.4 接种培养
将样品在超净工作台上分别接种到麦康凯琼脂培养基上, 并且标明接种的编号。接种时用采样的棉签轻轻涂抹于培养基的一头, 之后用接种环以“之”字型画开, 每涂过培养皿的一半时旋转90°, 接种环烧白灭菌后继续沿“之”字画开。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱培养24h。
1.2.5 生化鉴定
使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红实验、V-P试验、吲哚等分别配制生化鉴定管[5]。将培养皿中的典型菌种在超净工作台上接种至鉴定管中, 24h后观察结果。
1.2.6 药敏试验
使用药敏纸片呋喃妥因、链霉素、头孢氨苄、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、四环素、氯霉素、菌必治做两组药敏实验。以上药敏纸片均产自杭州天和生物试剂有限公司, 执行标准:WS/T125-1999。
1.2.7 注意事项
在操作中严格按照无菌操作, 使用明火、电时注意自身安全。实时记录试验数据。严格按照操作规程操作, 注意保护设备安全完整。
2 试验结果
2.1 粪样检测结果
在每一个便样的镜检中视野内大量存在革兰氏阴性、中等大小、两端钝圆的短杆菌, 呈单个或多个散在排列。从形态和革兰氏特性上判断在视野中的细菌为大肠杆菌[6] (图1) 。
2.2 接种培养结果
所有麦康凯培养基中均有均匀红色, 边缘整齐, 中心突起, 中等大小, 表面光滑湿润的散在菌落长出。其中1号培养皿有菌落200个, 2号有菌落185个, 3号有菌落50个, 4号有菌落130个, 5号又菌落70个, 6号有菌落150个, 7号有菌落134个, 8号有菌落124个, 9号有菌落125个, 10号有菌落113个 (图2) 。
2.3 生化实验结果
见表1。
注:“+”产酸;“—”阴性;“○+”产酸产气。
2.4 药敏试验结果
见表2。
注:敏感度按《抗菌药物药敏试验判断标准》抑菌圈大于等于20mm为极敏, 大于等于15mm小于20mm为高敏, 大于等于10mm小于15mm为中敏, 小于10mm为耐药。
3 讨论
3.1 生化分析
生化试验结果与动物传染病书上大肠杆菌基本特性相符[8], 而且与王云峰等[9]、孙善发等[10]的试验结果相一致。该菌能够分解麦芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸, 产酸产气, 不能产生硫化氢。因此从生化结果来看此菌种为大肠杆菌。
3.2 药敏分析
从药敏试验的结果来看, 该菌对头孢类, 和喹诺酮类[12]抗生素高度敏感, 但是林可霉素、四环素、庆大霉素的治疗效果不佳。这与有关的报道相符[11]。药敏试验说明该菌种已经对常用的药物产生耐药性。当前在犬细菌性腹泻的治疗中常常出现乱用抗生素, 或者使用了合适的抗生素却达不到良好治疗效果的现象。
3.3 犬病治疗中的误区
误区一:一泻就用止泻药。过早的服用止泻药, 或者是止泻药服用不当, 反而会延误病情, 甚至可以导致严重的并发症。误区二:先镇痛缓解腹泻, 感染性腹泻时可能会出现腹痛的现象, 一些犬主则习惯给犬服用654-2、颠茄片等止痛剂, 而且不按犬的的月龄, 随意使用。这种做法非常不安全, 因为止痛后, 不让肠蠕动, 会导致肠道蠕动功能瘫痪, 肠音消失或减弱, 容易引起肠黏膜脱落, 便血。误区三:一泻就吃消炎药, 许多人一看到犬腹泻, 就使用复方新诺明或诺氟沙星等抗生素。其实这种做法是不合适的。因腹泻有感染性和非感染性两类, 非感染性腹泻可由饮食不当、食物过敏、生活地域的改变、气候突变等原因引起, 此类腹泻使用抗生素治疗是无效的, 而应当服用一些助消化药或采用饮食疗法等。即便是感染性腹泻, 在选用抗生素时, 最好先做大便细菌培养, 明确致病菌种类, 再选用对细菌最敏感的抗生素进行治疗。切不可滥用抗生素。误区四:泻止就停药, 有的人腹泻常依症状服药, 即腹泻重时多服药, 腹泻轻时少服药, 稍有好转就停药。这样做很容易造成治疗不彻底而使腹泻复发, 或转为慢性腹泻, 给治疗带来很多困难[7]。正确的使用抗生素后, 就不能随便停用, 否则就容易使细菌产生耐药性。
3.4 试验犬与健康犬肠道菌比较
通过对引起犬细菌性腹泻的细菌进行分离鉴定得出的结果与健康犬的常规肠道菌进行对比发现。在正常的犬肠道内存在着许多种类的细菌其中包括需氧、兼性厌氧、厌氧细菌、真菌在内的45个菌属的约164种菌。涉及菌种包括链球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、埃希菌、双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌与链格孢霉等[13], 通过对正常犬只的大便进行培养也证明了这点。而引起这次细菌性腹泻的细菌培养后主要得到的是大肠杆菌, 说明了这些犬的细菌性腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起的。
4 结论
篇9：细菌的培养与分离技术
关键词 依赖海水；细菌；分离培养
分类号 Q933
Isolation and Characterization of Seawater Required Bacteria
YU Zhonghua1，2） LIU Jiayang1） CHEN Fujia1） BAO Shixiang2）
（1 Huanghuai University， Zhengzhou， Henan 450000， China
2 Institute of Tropical Biosciences and Biotechnolog Key Laboratory of Ministry
of Agriculture for Tropical Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）
Abstract In order to increase the cultivability of seawater-required bacteria， 9 strains were isolated for their seawater requirements. strain HB10001（=CGMCC 1.10781T） had the highest sequence similarity with Spongiibacter tropicus DSM19543T（96.3%）. The G+C content is 66.7 mol%. Strain HB10303 had the highest sequence similarity with Paenibacillus agaridevorans DSM1355T（98.4%）. The G+C content is 45.5 mol%.
Keywords seawater required ； bacteria ； isolation
海洋微生物对海水中盐的组分和浓度有不同程度的依赖性，因此，在设计培养基时，需要考虑海盐对海洋微生物生长的影响[1]。有些海洋微生物的培养离不开海水，所以在培养基中添加海水是必不可少的。Mincer[2]发现的海孢菌Marinospora spp.和盐孢菌Salinispora spp.只能在海水配制的培养基上生长。Han等[3]从阿穆尔斯基海湾中分离到的Salinibacterium amurskyense gen. nov. sp. nov是Microbacteriaceae的一个新属。这类菌株能耐受浓度高达10%的NaCl，不过NaCl对其生长则并非必需，说明该菌株对海洋环境有良好的适应性。Tsueng等[4]对海水中的阳离子及离子强度对Salinispora的3个种S. pacifica，S. arenicola和S. tropica生长的影响进行了初步研究，结果表明，钙离子和二价镁离子及某些特定的离子强度对于Salinispora spp.的生长是必需的。Zhang等[5]采用5种不同培养基，分别对5种海绵中可培养放线菌进行分离，证明培养基对可培养微生物的数量有显著影响；其中，在无机盐成分最为丰富的M3培养基上分离到的菌群也具有最大的多样性。
本研究针对海洋细菌的特殊生存进化环境，通过在R2A寡营养培养基中添加海水、纯水及NaCl溶液模拟海洋环境，提高海洋微生物的可培养性，最大程度地分离培养依赖海水的细菌，并分离出新的未培养细菌。同时，利用多相分类方法对分离出来的细菌进行系统分类和鉴定，探明它们的种属特性和系统发育学地位，进一步丰富海洋微生物资源库，以期为后期新基因、新化合物研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 海洋细菌分离培养基
R2A培养基（海水）：0.05 g细菌学蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g酸水解酪素，0.03 g丙酮酸钠，1.5 g琼脂粉，100 mL海水，pH 6.8。
R2A培养基（纯水）：0.05 g细菌学蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g 酸水解酪素，0.03 g丙酮酸钠，1.5 g琼脂粉，100 mL纯水，pH 6.8。
R2A培养基（NaCl）：0.05 g细菌学蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g 酸水解酪素，0.03 g丙酮酸钠，1.5 g琼脂粉，100 mL 2%NaCl溶液，pH 6.8。
1.1.2 待测菌株
HB10001，HB10303分离自海南省三亚市三亚湾海水和海南省昌江县海泥（表1）。
1.2 方法
1.2.1 海水、海绵、海泥样品采集
于2011年9～10月分别在海南省和广东省采集样品用于海洋微生物分离。样品信息详见表1。
1.2.2 依赖海水细菌的分离方法
将采回的海绵、海底沉积泥样品加入一定比例的无菌海水，匀浆后，备用。配制R2A海水和R2A纯水平板培养基。将处理好的样品稀释至10-3涂布在R2A海水平板上，培养7 d后，首先进行菌落形态和菌落个数统计，然后将R2A海水平板上长出的可见菌落挑出在新的R2A海水平板培养基上重新划线培养，以获得纯菌株。再将获得的纯菌株进行进一步的海水需求试验。
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1.2.3 海水需求试验
纯化后的细菌测定步骤：用灭菌接种环从R2A（海水）培养基上挑取一定量的菌落，分别接种于R2A（纯水），R2A（海水）以及R2A（NaCl）3种培养基中培养1～4周。采用显微镜观察其生长情况。如果只在海水R2A培养基中观察到菌落生长，则说明其需要海水才能正常生长。
统计R2A（纯水），R2A（海水）以及R2A（NaCl）平板培养基分离海水、海绵样品的菌落数；统计海水需求试验结果，记录严格依赖海水和不需要依赖海水的菌株数，并统计其在总体分离细菌中所占比例。将严格需求海水的细菌作为目标菌，进行下一步测序研究。
1.2.4 培养特征分析
采用R2A（海水）培养基，将纯化的于对数生长期的成熟菌株HB10001，重新接种在R2A（海水）培养基上，于25℃温箱中培养7～14 d，并观察记录菌落形态、大小、干湿情况、颜色特征和生长状况等。
1.2.5 显微形态特征分析
将接种纯化后的待测菌培养7～14 d后，选取生长较好的菌落，用灭菌接种环将菌落挑取到无菌离心管中，冷冻干燥。再将冻干呈粉状的待测菌贴于有导电胶带的电镜样品底座上，镀膜处理（纯金膜）。最后采用扫描电镜观察，并选取较好的待测菌密度以及清晰的视野进行拍照保存。
1.2.6 生理特征分析
均参考Smibert和Krieg[6]的方法，包括革兰氏染色，菌株运动性试验，耐盐范围，生长pH值范围，生长温度范围。
1.2.7 分子分类研究
总DNA提取、16S rDNA基因扩增与系统发育分析：采用Saito和Miura[7]报道的方法提取和纯化细菌DNA。PCR扩增条件：93℃、预变性2 min；再于93℃变性30 s，52℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35个循环：72℃ 延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶对PCR产物电泳检测。将PCR扩增产物交给上海生工工程有限公司测序后，获得的菌株16S rDNA序列，通过GenBank中的Blast程序与核酸数据进行对比，分析得出相似性（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）[8]。选取系统中比对结果相似性高的菌株及其序列，采用Clustal X2.0软件包进行多序列匹配排列，Mega3.1软件包中的Kimura-parameter 方法计算进化距离，neighbor-joining[9]方法构建系统发育树，100次随机抽样，以自引导值（Bootstrap）评估系统发育树的置信度[10]。
（G+C）mol%含量的测定：采用Mesbah报道的方法，用高效液相色谱分析基因组DNA（G+C）mol%[11]。
2 结果与分析
2.1 依赖海水细菌的分离培养
2.1.1 菌落计数
在稀释梯度为10-3的情况下，通过平板计数发现，R2A海水培养基，无论是在菌落形态多样性上，还是菌落个数的统计上，都较其他2种培养基更优（图1，表2）。结果表明，R2A海水培养基上的菌落直径在0.2～2 mm，形状以圆形为主，边缘规则，颜色以白色和透明无色为主，有黄色，蓝色和绿色的菌落。
2.1.2 海水需求实验
结果表明，经过划线纯化后的267株细菌中，有9株严格依赖海水的细菌（图2），编号分别为：HB09009，HB09010，HB09012，HB10001，HB10301，HB10302，HB10303，HB10304，HB10305。观察菌株HB10001、HB10303在海水、纯水及NaCl 3种R2A培养基上的生长状况发现：HB10001、HB10303在最适温度25℃下，经过1～4周培养，HB10001在纯水及2% NaCl的R2A培养基上无生长，只在海水R2A培养基上生长，且生长状况良好；HB10303仅能在海水R2A培养基上生长，且生长状况不好，说明培养基有待进一步优化。
2.2 菌株HB10001和HB10303的鉴定
2.2.1 培养特征分析
菌株HB10001培养特征：生长缓慢，在R2A固体培养基平板上划线培养6 d左右可见菌落，培养10 d左右可见成熟、清晰的菌落形态为扁平的圆形小菌落，菌落直径为0.1～0.3 mm；菌落成乳黄色、半透明、表面光滑、边沿不规则，无基内菌丝。
菌株HB10303培养特征：生长缓慢，在R2A固体培养基划线培养10～15 d可见菌落，培养20 d以上可见成熟、清晰的菌落形态为扁平的圆形小菌落，直径为0.5 mm；菌落呈白色半透明状，表面光滑，边沿规则，无基内菌丝 。
2.2.2 显微形态特征分析
菌株HB10001显微形态特征：两头尖的长杆状，不产生孢子，无鞭毛。大小范围：长径为100～300 μm，短径为10 μm。
菌株HB10303显微形态特征：长杆状。大小范围：短径0.5～1.4 μm，长径2～8 μm（图3）。
2.3 生理特征
菌株HB10001为革兰氏阴性细菌，无运动性。在海水存在的情况下，能在0～4% NaCl范围内生长，最适为3%。能在pH值5.5～7.5的范围内生长，最适pH 6.8。能在温度为8～38℃的范围内生长，最适生长温度为25～38℃。
菌株HB10303为革兰氏阴性细菌，无运动性。在海水存在的情况下，能在0～3% NaCl范围内生长，最适为1%。能在pH值5.5～7.5的范围内生长，最适pH 7.2。能在温度为8～45℃的范围内生长，最适生长温度为15℃。
2.4 分子指征分析
2.4.1 基因组DNA（G+C）mol%含量
对2株新分离的菌落进行（G+C）mol%含量分析发现，菌株HB10001的（G+C）mol%为66.7%，菌株HB10303的（G+C）mol%为45.5%。
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2.4.2 16S rDNA序列测定及系统发育分析
菌株HB10001和菌株HB10303 16S rDNA序列全长分别为1 424 、1459 bp，将16S rDNA序列拼接后的结果与EzTaxon server（http：//www.eztaxon.org/）（Chun et al.，2007）中相关菌进行Blast比对，并将该结果在Genbank数据库中进行登陆注册，菌株HB10001的登录号为HM068370。参照序列比对后的结果，选取同源性高的标准菌株，利用ClustalX（Version1.8）软件进行排序，选用Mega 3.1软件中的neighbor-joining方法构建系统发育树（图4、5）
3 讨论与结论
现今有关真正的海洋微生物的定义仍有争论，普遍认为，分离自海洋环境，正常生长需要海水，并可在寡营养、低温条件下生长的微生物可视为严格的海洋微生物。然而，有些分离自海洋的微生物，其生长不一定需要海水，只需要加入适当的盐离子，就可产生不同于陆栖微生物的代谢产物，或者拥有某些特殊的生理性质，也被视为海洋微生物。与陆栖细菌相比，海洋细菌普遍耐盐，最适盐度在2%～4%，也可以利用海洋微生物的特殊耐盐度筛选真正的海洋细菌。本研究采用的分离依赖海水细菌的方法，是用于筛选出严格需求海水的细菌。此类细菌在普通的淡水寡营养培养基或者加入一定量Na+的情况下，都不能正常生长。本研究发现，在传统的寡营养培养基中，添加海水可提高海洋微生物的可培养性。所获得的9株菌则是常规传统培养基分离所忽略的类群。
细菌的多相分类研究经历了长期不断的发展和提高。早期主要以形态特征、培养特征及生理生化特征等分类学特征对其进行描述分类。但传统分类系统不能确切说明遗传进化地位和关系。现今分子生物学技术在现代分类学中已占主导地位。一般认为，16S rDNA 序列同源性大于95%的菌可归为同一属，大于97% 可视为同一种。因此，在菌株鉴定时，16S rDNA 序列同源性低于 95%的菌可考虑建立新属，低于 97% 的建立新种时必须测定DNA-DNA 杂交率。本实验得到的菌株HB10001，与其16S rDNA序列同源性最高的是Spongiibacter tropicus DSM19543T（96.3%），因此需要测定 DNA-DNA 杂交率来确定是否为新种。HB10303与Paenibacillus. agaridevorans DSM1355T（98.4%）的16S rDNA序列同源性最高，则需要通过进一步的多相分类来鉴定。
同时，菌株HB10001、HB10303分离自中国南海，都只能在海水培养基中形成正常的菌落，离开海水，均不能生长。此外，通过耐盐试验发现，HB10001耐盐范围为0～4%，HB10303耐盐范围为0～3%。综合菌株来源、低温适应性、菌株严格依赖海水生长、盐耐受性，认为菌株HB10001，HB10303为海洋细菌。
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