凋亡相关基因

关键词： 脑损伤 缺血性 凋亡 细胞

凋亡相关基因（精选八篇）

凋亡相关基因 篇1

1 细胞凋亡通路

1.1 Caspase依赖性凋亡通路

1.1.1 内源性线粒体通路

缺血性脑损伤后, 由于线粒体通透性转位孔 (mitochondrial permeability transition pore, MPTP) 在各种凋亡诱导因素刺激下不可逆地过度开放, 导致细胞色素C、丝氨酸蛋白酶 (high temperature requirement protein A2, Htr A2) 、第二线粒体衍生的天冬氨酸蛋白水解酶激活剂 (second mitochondria-derived activator of caspase, Smac) 等从线粒体膜间隙释放至胞浆内[1]。细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子-1 (apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1) 结合形成凋亡小体, 活化Procaspase-9, 导致Caspase-3激活, 介导细胞凋亡[2];此外, 当神经细胞发生凋亡时, SmacDIABLO能通过和凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein, IAP) 结合抑制活化的Caspase-9, 促进Caspase-3的激活, 引起细胞凋亡[3]。

1.1.2 外源性死亡受体通路

死亡受体 (death receptor, DR) 属于肿瘤坏死因子受体超家族中的一个亚家族。Fas、TNFR1、DR3、DR4是目前研究比较清楚的死亡受体。由Fas-Fas-L和TNFR为代表介导的细胞凋亡通路研究最多。

脑缺血后神经细胞受到缺血等一系列刺激后, 细胞表面的Fas配体 (Fas ligand, Fas L) 、TNF配体 (tumor necrosis factorα, TNFα) 分别与相应的受体 (FasR, TNFR1) 结合, 使受体相互交联形成三聚体并激活, 通过死亡效应域 (death effect domain, DED) 结合Fas相关死亡域蛋白 (Fas-associated protein with death domain, FADD) 和Procaspase-8形成死亡诱导信号复合物 (death-inducing signaling complex, DISC) , 该死亡诱导信号复合物导致Caspase-8被活化, 激活的Caspase-8启动蛋白酶级联反应, 从而活化下游的效应酶Caspase, 诱导Fas介导的细胞凋亡[4]。

1.2 Caspase非依赖性凋亡通路

脑缺血后, DNA发生损伤, 大量表达多聚ADP核糖聚合酶-1 (poly ADP-ribose polymerase-1, PARP-1) , PARP-1催化生成多聚ADP核糖 (Poly ADP-ribose, PAR) , PAR进入线粒体使线粒体释放凋亡诱导因子 (apoptosis inducing factor, AIF) 并转位进入核内, 导致染色质浓缩和DNA降解, 形成PARP-1过度表达的恶性循环;当细胞接受凋亡信号刺激后, Bcl 2/腺病毒E1B 19k Da相互作用蛋白3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19 k Da-interacting protein 3, BNIP 3) 同源二聚体和线粒体外膜结合, 使MPTP开放, 导致线粒体内的核酸内切酶G (endonuclease G, Endo G) 被释放并转移至核内。同时, 在细胞核内AIF和Endo G相互作用, 导致DNA断裂和染色质凝聚, 从而导致不依赖Caspase的细胞凋亡[5]。总之, 这3条信号转导通路都是通过caspase-3完成最终的激活。其中线粒体介导的细胞凋亡通路作为经典的凋亡通路, 近年来受到人们的广泛关注。

2 细胞凋亡相关基因的表达

细胞凋亡受多种基因调控, 包括Bcl-2家族基因、Caspase-3基因、p53基因、Fas基因、热休克蛋白 (heat stock protein, HSP) 基因、即早基因 (immediate-early genes, IEGs) 等[6]。

2.1 Bcl-2基因家族在缺血性脑损伤中的表达

2.1.1 Bcl-2在缺血性脑损伤中的表达

B细胞淋巴瘤/白血病-2 (B-cell lymphoma/leukemia 2, Bcl-2) 是从滤泡性淋巴瘤中分离出来的细胞凋亡信号转导通路中最重要的凋亡抑制基因。凋亡抑制基因Bcl-2高表达能抑制MPTP的开放, 阻止细胞色素C及促凋亡相关蛋白释放到线粒体膜外, 从而抑制caspase-3的激活, 导致各种因素诱导的细胞凋亡。Bcl-2还能通过抑制氧自由基结合Bax蛋白, 从而抑制细胞凋亡。

崔芳琴等[7]通过建立脑缺血再灌注模型, 观察不同缺血时间的小鼠脑组织免疫组织化学染色切片, 证实了在脑缺血早期受损神经元内, Bcl-2表达上调。但是随着缺血时间进一步延长, Bcl-2表达进一步减少, 为临床上使用Bcl-2激动剂治疗脑缺血提供依据。

2.1.2 Bax在缺血性脑损伤中的表达

Bax是最早发现的促凋亡基因, 正常情况下, 胞质中的Bax以单体形式存在。在凋亡信号诱导下, 胞质中的Bax以无活性的单体形式转移至线粒体, 与线粒体膜结合使其构型发生改变, 形成异源二聚体复合物, 使线粒体通透性发生改变, 开放线粒体通透转换孔, 释放凋亡因子如细胞色素C等, 细胞色素C与AIF及procaspase-9结合形成“凋亡小体”, 从而启动细胞凋亡级联反应[8]。

高红莉等[9]通过建立大鼠脑缺血再灌注模型, 研究血府逐瘀汤对脑缺血再灌注大鼠皮质神经细胞凋亡的影响。结果显示, 模型组与假手术组比较, 大鼠脑组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达显著增加, 血府逐瘀汤大、中、小剂量给药组大鼠脑组织中Bax、Caspase-3mRNA的表达量较模型组明显降低, 而Bcl-2 mRNA表达较模型组明显升高。提示血府逐瘀汤可能通过下调神经细胞Bax、Caspase-3 mRNA的表达, 上调Bcl-2 mR-NA的表达, 抑制细胞凋亡。

2.2 Caspase在缺血性脑损伤中的表达

Caspase-3是细胞凋亡信号通路中最关键的效应酶, 在神经细胞凋亡级联反应中处于核心位置。各种因素引起的细胞凋亡都是通过caspase-3完成最终激活的。在正常细胞中Caspase-3合成后以酶原和无活性的形式存在, 当细胞发生凋亡时, 激活的Caspase-3可以使一系列NF-κB、结构蛋白及多聚ADP核糖聚合酶活化, 形成凋亡小体和DNA片段化, 从而介导细胞凋亡。

有研究发现, 在脑缺血再灌注模型组Caspase-3mRNA表达明显高于假手术组, 凋亡细胞显著增多;与模型组比较, 天麻素大、中、小剂量组和尼莫地平组Caspase-3 mRNA表达明显降低, 提示天麻素可通过下调Caspase-3 mRNA的表达, 抑制神经细胞凋亡, 从而有效地保护脑缺血。张曼等[10]研究结果显示, 缺血再灌注模型组Caspase-3蛋白表达较假手术组显著增加;菟丝子黄酮50mg/kg、l00mg/kg剂量组和尼莫地平组Caspase-3蛋白的表达较缺血再灌注模型组显著减少。提示菟丝子黄酮可以通过下调Caspase-3蛋白的表达, 从而抑制神经细胞凋亡。

2.3 p53在缺血性脑损伤中的表达

p53是一种与肿瘤密切相关的抑癌基因, 包括野生型p53和突变型p53。野生型p53是促凋亡基因, 它可以直接导致细胞凋亡, 也可以通过激活一系列下游基因间接导致细胞凋亡。当细胞发生凋亡时, p53能通过上调促凋亡基因, 下调抗凋亡基因, 在缺血性脑损伤中发挥重要作用。

许妍妍等[11]发现在缺血再灌注后2 h, p53表达的阳性细胞数微量增多, 3 h后略有增多, 6 h后显著增多, 并持续增多至12 h。RT-PCR结果显示, 假手术组中p53mRNA仅有微量表达, 在缺血2~3 h大鼠脑组织中p53mRNA仅有微量表达, 6 h表达显著增多, 并持续增多至12 h。

2.4 IEGs在缺血性脑损伤中的表达

即早基因 (immediate-early genes, IEGs) 是一类对外界刺激信号传入数分钟内即刻作出反应进行表达的基因。在正常情况下, c-fos低水平表达。当细胞发生凋亡时, Fos蛋白由胞质转入细胞核内, 通过和Jun蛋白相互作用形成异源二聚体转录因子复合物 (activator protein 1, AP-l) , 使其与DNA结合位点特异性结合, 从而调控靶基因快速而短暂的表达[12]。

陈江君等[13]通过观察不同缺血时间的大鼠脑组织免疫组织化学染色切片发现, 假手术组阳性细胞数仅有微量表达;模型组海马CA1区c-fos阳性细胞数在缺血灌注3 h表达显著增加, 48 h达高峰, 72 h仍有表达;红景天干预组c-fos阳性细胞数较同时相模型组比较明显降低。

2.5 Fas在缺血性脑损伤中的表达

Fas是重要的促调亡基因。一方面, Fas L与Fas两者结合, 使Fas死亡区交联, 产生神经酰胺, 通过某种途径, 激活内源性核酸内切酶, 引起凋亡。另一方面, Fas L与FasR结合, 使受体相互交联形成三聚体并激活, 通过DED结合Fas相关死亡域蛋白 (Fas-associated protein with death domain, FADD) 和Procaspase-8形成死亡诱导信号复合物, 该死亡诱导信号复合物导致Caspase-8被活化, 从而活化下游的效应酶Caspase, 诱导Fas介导细胞凋亡。

实验发现川芎嗪可通过下调脑缺血再灌注诱导的Fas-L蛋白表达, 从而抑制神经细胞凋亡。通过观察不同缺血时相大鼠脑组织免疫组织化学染色切片发现, 缺血再灌注组大鼠脑组织神经细胞凋亡数目及Fas蛋白阳性细胞数目较假手术组显著增多;Fas蛋白阳性细胞数目在缺血再灌注后6 h达高峰, 24 h开始下降, 细胞凋亡数目在缺血再灌注6 h显著增加, 24 h达高峰, 36 h略有下降[14]。

2.6 HSP在缺血性脑损伤中的表达

热休克蛋白 (heat stock protein, HSP) 是一组进化上高度保守的细胞内可溶性蛋白。HSP70在脑缺血损伤研究中备受关注。正常情况下, HSP70 mRNA在脑内表达稳定, 但很快被降解;应激状态下, 其他蛋白合成受到抑制, HSP70表达反而增强, 敲除HSP基因后, HSP表达下降, 细胞凋亡增多。

研究发现, 模型组与假手术组比较, 大鼠脑组织中HSP70 mRNA及其蛋白表达明显增多, 通心络治疗组HSP70 mRNA表达较模型组显著增多。提示通心络可以促进应激保护性蛋白HSP70表达, 从而抑制细胞凋亡[15]。

细胞凋亡相关研究进展 篇2

关键词：细胞凋亡；特征；检测方法；生物学意义

细胞凋亡（apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，最早是1972年由Kerr教授根据形态学特征首先提出的。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程[1]。

一、细胞凋亡的特征

形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的， 细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的[1-2]。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素 C 到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA 降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整.

二、细胞凋亡的检测方法

1、电镜形态学观察。虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体，但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构，因此用光镜观察难以令人满意。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法，被认为是确定细胞凋亡的标准[3]。

但仍有缺点：（1）只能定性，不能定量；（2）标本处理过程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求较高，不适于大批标本检测；（3）在组织切片上进行电镜观察时，有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别，因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色，可弥补电镜检查的不足.

2、生化检测。生化检测最常见的方法是 ：（1）电泳 ：琼脂糖凝胶电泳，可以检测细胞凋亡时细胞内 DNA 出现特征性的 “梯子状”带纹；聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以原位检测核酸内切酶的活性 。（2）流式细胞术：可以检测细胞凋亡在生化代谢及分子水平的表现 ，同时阐明凋亡细胞与细胞周期的关系，有较高的灵敏性[4]。

（3）原位缺口翻译法：用来检测凋亡细胞中DNA的断裂情况，这种方法耗时短，具有安全、快速、特异性强 、灵敏度高的特点。（4）末端脱氧核苷酸转移酶法：可以早期检出未发生形态改变的细胞凋亡。

三、细胞凋亡的生物学意义

细胞凋亡机制的研究在发育和衰老 、肿瘤细胞发生、神经系统发生，免疫系统发展中发挥重要作用，从而指导临床实践。

1、发育和衰老方面。哺乳动物的胚胎发生、发育和成熟过程中，构成组织的细胞生死交、细胞凋亡是保证个体发育成熟所必需。从生物学意义上讲，在胚胎发育过程中，通过细胞凋亡可清除对机体没有用处的细胞，如雄性动物的米勒氏管；尚可清除多余的发育不正常的结构细胞，如大脑中没有形成正确连接的神经元[5]。在成年机体中，通过细胞凋亡可清除衰老的细胞并代之新生的细胞，从而维持器官中细胞数量的稳定 ，如皮肤、粘膜细胞的更新；女性月经周期进行子宫内膜的脱落与更新[6-7]。

2、肿瘤学方面。组织自身稳定来源于细胞增殖和死亡之间的平衡，过量增殖和过少死亡都将导致细胞过度堆积，而各种引起凋亡和制止调亡的因素，特别是病毒因素是形成肿瘤的一个重要因素。众多病毒感染不只是转化细胞，而且还阻止细胞的凋亡 。例如 ； Bukitt’S淋巴瘤时凋亡障碍延长了细胞的半衰期 ，增加基因突变的机会，也与肿瘤细胞抗药性形成有关 ，因而 ，考虑治疗这类肿瘤时 ，需要涉及细胞凋亡 。另一方面 ，肿瘤细胞也存在凋亡现象 ，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗的一条途径[8-9] 。

四、细胞凋亡的应用

实验证明p53基因失活可促使人类多种肿瘤的发生，P53 蛋白有潜在的抗细胞增殖作用，可以使细胞增殖停滞在G期。p 5 3在细胞生长过程中可能作为一种分子感受器，以一 种分子警察的身份监视细胞内D N A的状态，如果细胞D N A受损，p 5 3蛋白水平升高，以終止增殖，使受损细胞获得修复时间，如果受损D N A无法修复，则p 5 3蛋白持升高，引起细胞凋亡.当 P53 发生突变时，突变的p53蛋白不能引起细胞增殖的停止或细凋亡，细胞内受损或错配的D N A 就不能修复或清除，从而导致体内突变细胞增多，成 为长失控的癌细 胞前身。因 此将正常p53基因导入肿瘤细胞或拮抗异常p53基因的表达，恢复其正常功能己成为肿瘤基因治疗的新策略。

五、结语

细胞凋亡作为细胞死亡的概念，已不再是最初意义上的生物学概念。从它的整个演化过程不难看出，无论在生物学还是医学领域，细胞凋亡越来越受到重视，尤其是2002年度的诺贝尔生理或医學奖的颁发和第二届国际细胞凋亡学术研讨会的召开，更是细胞凋亡方面的研究给予了高度的评价和肯定。今后，随着细胞凋亡机制及其概念研究的深入、扩展与明确，必将在生物学与医学等领域产生更大的影响。

参考文献

[1] 彭黎明，江虹.细胞凋亡的检测.见：彭黎明，王曾礼，主编.细胞凋亡的基础与临床.北京：人民卫生出版社，2000.153 -218.

[2] 彭黎明.细胞凋亡检测的研究进展.中华医学检验杂志，2006，19：336-338.

[3] 彭黎明.六种细胞凋亡检测方法的比较.中华病理学杂志，2010，28： 55 -57.

[4] Peng L， Liu JJ. A novel method for quantitative analysis of apoptosis.Lab Invest， 1997， 77： 547-555.

凋亡相关基因 篇3

关键词：老年妇女,外阴营养不良,细胞凋亡,基因表达

慢性外阴营养不良是女性常见的一种良性病变, 其恶变率高达8%, 严重影响着妇女的身体健康。且近些年来, 该病的发病年龄逐渐趋于年轻化, 然而现阶段临床上尚未明确该病的根治方法。临床上通常将原位末端标记及免疫组织化学S-P法作为检测外应营养不良及恶变组织中细胞凋亡及相关基因表达的常用方式。我院为探讨老年妇女外阴营养不良组织中细胞凋亡及相关基因的表达情况特进行了以下研究, 报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料:

选取我院自2013年1月至2014年1月期间接收的80例外阴活检患者为研究对象, 以其中70例外阴营养不良患者为观察1组其中增生型营养不良25例, 硬化型营养不良25例, 混合型营养不良20例;10例营养不良恶变患者为观察2组, 本组10例患者均恶变为鳞癌;同时选取10例正常外阴患者为对照组。本组所有标本均采用10%福尔马林溶液进行固定, 并行常规石蜡包埋, 切片厚度应控制为4µm。

1.2 方法

1.2.1 原位末端标记检测法:

本次研究选用由Boehringer Mannheim公司生产的试剂盒, 并严格以说明书为依据进行操作, 结果判定:阳性细胞:细胞核中含有棕黄色颗粒, 且背景清晰。在400倍显微镜下, 于标记良好区域选择10个视野计数, 每个视野计数100个。凋亡指数=阳性细胞数总和/1000×100%。

1.2.2 免疫组织化学S-P法检测bcl-2、bax蛋白:

选用由Snta Cruz公司生产的第一抗体鼠抗人bcl-2、兔抗人Bax单克隆抗体, 同时选用由北京中山技术有限公司生产的S-P试剂进行检测。工作浓度应设置为1∶50及1∶75, 严格按照说明术进行操作。结果判定:阳性细胞:以细胞质着棕黄色为阳性细胞;阳性:细胞质着色程度>20%;阴性:细胞质着色程度<20%。

1.3 统计学分析:

采用SAS9.0软件进行t检验及χ2检验, 并对其相关性进行分析, P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 细胞凋亡的检测结果:

对照组患者细胞凋亡指数为 (2 3.2±4.6) %, 观察1组患者细胞凋亡指数为 (19.6±4.2) %, 其中增生型营养不良患者的细胞凋亡指数为 (18.9±5.7) %, 硬化型营养不良患者的细胞凋亡指数为 (20.5±3.1) %, 混合型营养不良患者细胞凋亡指数为 (19.9±4.4) %;观察2组患者细胞凋亡指数为 (5.1±2.2) %, 三组患者均存在有细胞凋亡现象, 其观察组及研究组患者的细胞凋亡指数均明显高于对照组 (P<0.05) , 但两组间及观察组中三种病理类型组间比较细胞凋亡指数比较均无明显统计学意义 (P>0.05) 。

2.2 bcl-2、bax检测结果:

对照组10例患者中bcl-2表达9例, 占90%, b a x表达1 0例, 占1 0 0%;观察1组7 0例患者中b c l-2表达6 5例, 占92.9%, bax表达63例, 占90%;其中增生型营养不良25例中bcl-2表达23例, 占92%, bax表达23例, 占92%;硬化型营养不良25例中bcl-2表达24例, 占96%, bax表达23例, 占92%;混合型营养不良20例中bcl-2表达17例, 占85%, bax表达18例, 占90%;观察2组10例患者中bcl-2表达2例, 占20%, bax表达2例, 占20%;对照组患者及观察1组患者中bcl-2、bax均有较高表达, 但观察2组患者中bcl-2、bax均显著减弱 (P<0.05) 。

2.3 细胞凋亡指数、bcl-2、bax三者间的关系:

观察1组和对照组患者凋亡细胞的分布区域及表达bcl-2、bax蛋白的细胞分布区域则保持一致, 且bcl-2、bax二者间的表发呈正相关 (P<0.05) , 在恶变部分凋亡细胞的分布区域及bcl-2、bax的表达方面则无明显相关性。

3 讨论

细胞凋亡也叫程序化细胞死亡, 其主要是指细胞核在特定条件下通过启动自身内部机制, 同时通过一系列连续性变化所引发的主动性死亡的过程[1]。细胞凋亡不同于细胞坏死, 细胞凋亡是一种主动过程, 而非被动过程, 细胞凋亡往往需涉及一系列的基因激活、表达及调控作用, 其并非病理条件下的自体损伤现象, 是为适应环境而主动争取的一种死亡过程[2]。细胞凋亡不仅可有效的维持个体自身的稳定性, 同时在控制细胞增殖、分化及疾病的发生发展中同样发挥着难以取代的作用[3]。本次研究结果显示正常外阴皮肤及外应营养不良患者与外阴营养不良恶变患者相比其细胞凋亡指数均明显升高。这就表明外应营养不良的发生发展在一定程度上受细胞凋亡的影响, 因而在细胞凋亡现象受到抑制时便极易引起外阴营养不良组织恶现象。所以, 临床上通常将细胞凋亡指数作为判断生物学活性的有效依据。

bcl-2及bax属于正负凋亡调节基因, 其中bcl-2可有效的对细胞凋亡现象进行抑制, 且可有效的延长细胞生存周期, 有助于增加细胞的积累率[4]。而bax本身即可诱导细胞凋亡, 同时还可与bcl-2联合对细胞凋亡现象进行调控。临床研究表明bcl-2与bax间存在有较大的化学剂量关系, 其比值在一定程度上决定了细胞接受信号后是否存活;通常在bcl-2含量较大时可对细胞凋亡现象进行抑制, 而在bax含量较大时则可对细胞凋亡现象进行促进, 而在两组计量相当时则不会抑制细胞凋亡[5]。本次研究结果显示组患者均在细胞凋亡及bcl-2、bax的表达现象, 且观察1组患者的细胞凋亡指数及bcl-2、bax的表达方面均明显高于观察2组 (P<0.05) ;bcl-2、bax二者间的表达呈正相关 (P<0.05) , 在恶变部分凋亡细胞的分布区域及bcl-2、bax的表达方面则无明显相关性。这就表明外阴营养不良的发生发展与恶变及细胞凋亡间有较大的关系, 且bcl-2、bax发挥着一定的作用。

参考文献

[1]方志启, 吴刚, 王贺彬, 等.凋亡相关基因p53、bcl-2、ba X在前列腺组织中的相关性[J].中国临床解剖学杂志, 2013, 31 (5) :560-563.

[2]周兰英, 孙圣华, 高健, 等.吲哚美辛对COPD大鼠TNF-α与Bcl-2和Bax表达的影响[J].现代生物医学进展, 2012, 12 (6) :1044-1047.

[3]郭巍, 陈美霓, 王爱红, 等.P53、Bcl-2和Bax在膀胱癌的表达及意义[J].山西医科大学学报, 2014, 45 (3) :180-183.

[4]余姚凤, 何爱文, 李章平, 等.凋亡相关性micro RNA及其靶基因蛋白在心肺复苏后大鼠心肌中的表达变化[J].温州医学院学报, 2013, 43 (6) :367-370.

凋亡相关基因 篇4

1 材料

1.1 临床资料

全部158例均为2007-09～2008-09就诊于余杭区第五人民医院消化内科并接受胃镜和病理活检的病例,经结合临床、内镜及病理组织学检查确诊为慢性胃炎,排除兼有其它器质性疾病的患者,其中肝胃不和型40例、脾胃湿热型36例、脾胃虚弱型28例、脾虚气滞型34例、胃络瘀阻型8例、胃阴不足型12例。

1.2 诊断标准

中医证型辨证标准参照2003年中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会在重庆召开的全国慢性胃炎专题讨论会制订的《慢性胃炎中西医结合诊治方案(草案)》[1]。慢性胃炎诊断标准参照2003年9月中华医学会消化内镜学会在大连召开的全国慢性胃炎专题讨论会制订的标准[2]和1990年在澳大利亚悉尼召开的第九届世界胃肠病学术大会制定的“悉尼系统-新的胃炎分类法”[3]。

1.3 病例排除标准

①同时伴有消化性溃疡的胃炎患者;②胃大部切除术后的患者;③同时患有其他器质性疾病患者;④住院患者:⑤年龄在18岁以下或70岁以上;⑥妊娠或哺乳期妇女;⑦中医辨证分型有兼证者。

1.4 主要试剂

鼠抗Bax、鼠抗Bcl-2、兔抗P53:Santa Cruz进口分装,由中杉金桥生物技术有限公司提供,规格0.1ml/支;鼠两步法试剂盒(PV-6002):中杉金桥生物技术有限公司产,规格:18ml/支;DAB显色试剂盒(ZLT9032,20×):中杉金桥生物技术有限公司生产,规格:3ml/支×3支。

2方法

2.1 免疫组化法测定

胃黏膜切片置60℃烤箱烘烤2小时;切片脱蜡至水;蒸馏水洗2分种;高压热修复:高压锅内放适量自来水,将修复液倒入烧杯内(体积视切片多少定),将烧杯置于高压锅内煮沸(高压锅不需盖紧),将切片放入装有修复液的烧杯内,盖紧高压锅,加热至设定压力冒气后持续2分钟,自来水冷却;3%H2O2溶液阻断过氧化物酶,10分钟;PBS洗3min×3次;滴加一抗,37℃孵育60分钟,稀释倍数均为1:100;PBS洗3分钟×3次;滴加二抗,37℃孵育45分钟;PBS洗3分钟×3次;DAB显色2分钟;复染、透明后封片。

2.2 图象分析

每张切片所要分析的部位显微镜下拍摄3～5张照片,进行图象分析。阳性面积:照片内被染成棕黄色的物质的面积总和,反映阳性表达的多少;平均光密度:阳性表达区域的光密度平均值,光密度值越大,阳性显色颜色越深,反映表达部位的阳性强度;总光密度:又称积分光密度,总光密度=∑(阳性表达部位面积×该部位的平均光密度),反映阳性表达的总量。

2.3 统计方法

统计分析采用SPSS13.0软件包。采用Kolmogorov-Smirnov的方法进行正态性检验。采用t检验或χ2检验对正态分布数据的均值或构成比进行比较。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK(q)检验。样本数据分布采用非参数χ2检验。P<0.05为差异有显著性意义。

3结果

各证型胃黏膜Bax、Bcl-2和P53表达结果,见表1。

与肝胃不和型比较*P<0.05,**P<0.01;与脾胃湿热型比较△P<0.05,△△P<0.01;与脾胃虚弱型比较#P<0.05,##P<0.01;与脾虚气滞型比较○P<0.05,○○P<0.01;与胃络瘀阻型比较☆P<0.05,☆☆P<0.01

4讨论

细胞增殖和凋亡的平衡维持着组织中细胞总数的相对恒定,此过程的异常与肿瘤的发生与发展关系密切[4]。Bcl-2家族基因包括Bcl-2、Bax和BH3 3个亚族。Bcl-2是一种抑制凋亡基因,Bax与Bcl-2在体内的表达呈部分互补形式,Bax通过抑制Bcl-2的功能从而促进凋亡[5],Bcl-2与Bax的比值将影响细胞的凋亡[5]。慢性萎缩性胃炎与胃癌的发生有密切的联系,Correa提出的“慢性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌”,已被公认为人类胃癌发生的典型模式,提示萎缩性胃炎在向胃癌的发生发展过程中,存在着细胞增殖调控基因蛋白Bcl-2的变化,Bcl-2基因的异常表达对胃癌及癌前病变的形成发挥一定作用。本研究发现胃黏膜Bcl-2表达阳性面积胃络瘀阻型显著高于其他各证型(P<0.01),平均光密度脾胃虚弱型显著高于肝胃不和型(P<0.05),总光密度胃络瘀阻显著高于其他各证型。在慢性胃炎各中医证型中以胃络瘀阻型和脾胃虚弱型的Bcl-2表达最强,揭示其与萎缩性胃炎的发生密切相关[6]。Bax蛋白的表达在各种中医证型间差异无显著性意义,与文献[7]报道有所不同,有待进一步研究。

P53基因定位于17号染色体,分为野生型和突变型两种。野生型P53基因的作用主要是抑制细胞过度增殖、启动DNA损伤修复机制,诱导凋亡,协调细胞凋亡与增殖速度,修复损伤的DNA或通过凋亡清除DNA异常的细胞,以防止细胞的异常蓄积和恶性转化[8]。P53基因突变后的突变型P53则失去抑制细胞增殖、启动DNA修复及诱导细胞凋亡的作用,导致细胞增殖过度、凋亡减少及异常细胞蓄积和转化。野生型P53蛋白在正常组织中表达量低、半衰期极短、易水解、难以检测。而突变后P53蛋白半衰期明显延长,因而P53蛋白水平明显升高。用免疫组化检测出的P53蛋白一般为突变型P53蛋白[9]。本研究结果显示:慢性胃炎胃黏膜组织中的突变型P53蛋白的阳性面积和总光密度,从低到高依次为肝胃不和→脾胃虚弱→脾虚气滞→脾胃湿热→胃阴不足→胃络瘀阻;平均光密度脾胃湿热型和胃阴不足型显著高于肝胃不和型。本研究发现胃络瘀阻型、胃阴不足型、脾胃湿热型有P53基因的较强表达,揭示慢性胃炎的发展变化表现为由实证到虚证,或因虚致瘀、虚实夹杂的病机演变规律,胃黏膜良性病变的加重与中医证型演变规律基本相符,从而证实了慢性胃炎辨证中胃络瘀阻型、胃阴不足型、脾胃湿热型是胃黏膜癌前病变的主要相关证型。

参考文献

[1]中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.慢性胃炎的中西医结合诊治方案(草案).中国中西医结合杂志,2005,25(2):172.

[2]中华医学会消化内镜学分会.慢性胃炎的内镜分型分级标准及治疗的试行意见.中华消化内镜杂志,2004,21(2):77.

[3]Misiewici JJ,Tytgat GNJ,Godwin CS,et al.The sydney system:a new classification of gastritis.J Gastroenterol Hepatol(working party re-port),1990:1.

[4]孟华,刘丽娜,吕申.胃癌及癌前病变中胃黏膜上皮细胞增生及凋亡相关蛋白表达.世界华人消化杂志,2004,12(2):494.

[5]贾海霞,屈伸.舌黏膜上皮bax、bcl-2基因表达与舌苔厚薄关系的研究.中国中医药科技,2005,12(3):176.

[6]胡敏,纪云西.慢性萎缩性胃炎病理改变与气虚血瘀相关性探讨.江西中医药,2004,35(11):17.

[7]徐珊,石君杰,杨季国,等.基因蛋白质在不同证型慢性胃炎胃黏膜中表达的研究思路.浙江中医学院学报,2006,26(1):3.

[8]Lakin ND,Jackson SP.Regulation of P53in respose to DNA damage.Oncogene,1999,18(53):7644.

凋亡相关基因 篇5

1 材料和方法

1.1 载体与试剂

含人HIF-1α基因质粒pBSKh HIF1αT7由瑞士苏伊士大学Gassmann教授惠赠(GenBank:U22431),通用型腺相关病毒(AVV)载体pSNAV2.0、AVV载体包装系统、rAAV2/lacZ及具有AVV复制和包装功能的重组I型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2由本元正阳基因技术有限公司提供。DMEM购自美国Invitrogen公司;胎牛血清、马血清购自美国HyClone公司;阿糖胞昔、抗人HIF-1α单克隆抗体及多聚赖氨酸购自美国Sigma公司。

1.2 rAAv-HIF-1α载体的构建

限制性内切酶双酶切pBSKhHIF1αT7质粒获取人HIF-1α的基因片段,构建含人HIF-1α基因的载体质粒pSNAV-HIF-1α。按GibcoBRL产品说明书提供的方法,用LipofectAmine2000将质粒转染6孔板中的BHK-21细胞,24 h后用0.8 mg/ml G418选择培养。待抗性克隆生长至孔底面积的1/2左右时,用胰酶消化,继续用G418选择培养直至细胞长满,传代后换用不含G418的培养液。将此混合细胞株命名为BHK/pSNAV-HIF-1α,即AVV载体细胞株。将AVV载体细胞株用转瓶培养,细胞长满后用HSV1-rc/△UL2感染(MOI为0.1)该细胞株。待48h细胞完全病变、容易脱落时,盖紧瓶盖剧烈振摇,将瓶壁上的细胞全部洗脱至培养液中,然后采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提技术粗纯化AVV病毒,透析袋浓缩法进一步浓缩AVV病毒,即得到用于细胞实验的rAAV-HIF-1α。进行酶切及PCR鉴定,PCR引物由本元正阳基因有限公司设计(上游引物5′-TAA GAA ACC TAT GAC CT-3′,下游引物:5′-TGA GTT TCA ACC CAG ACA TAC-3′)。

1.3 rAAV-HIF-1a滴度的测定

以pSNAV质粒为模板,PCR法标记探针。用地高辛标记的CMV探针点杂交方法对经梯度稀释的病毒原液和标准品进行检测,依据检测到的杂交信号判断病毒滴度。

1.4 rAA-HIF-1a纯度的测定

采用凝胶扫描图像分析系统,分析rAAV-HIF-1a。样品经10%的SDS-PAGE后所得蛋白条带测定病毒纯度,加样孔加rAAV-HIF-1 a。样品15 μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色,脱色液脱色至显出低背景的、清晰的条带。

1.5 海马神经元培养及转染

取新生1 d内的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min后,在超净工作台中取脑,仔细剥除脑膜及血管,分离出海马并剪碎,加入0.125%胰蛋白酶溶液37 ℃消化20 min,用含10%胎牛血清、5%马血清DMEM培养基终止消化,200×g离心5 min,弃上清,用上述血清培养基重新悬浮细胞沉淀,吹打均匀,用200目不锈钢网过滤制成单细胞悬液,以5×105 cell/ml接种于预先用多聚赖氨酸包被的6孔培养板中,每孔1 ml,每隔二三天换液1次,于培养第4天时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞昔作用一二天,以抑制非神经细胞的繁殖。于培养第6天时吸去培养液,每孔加入无血清培养基500 μl,按1×105/cell滴度加入rAAV-HIF-1a及rAAV2/lacZ,37 ℃、5%CO2孵育1 h后,吸去每孔液体,加入1 ml/孔含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM培养基,37 ℃、5%CO2培养72 h后,检测海马神经元表达产物。

1.6 HIF-1a蛋白表达的检测

采用Westen印迹技术收集转染rAAV-HIF-1a的海马神经元(简称rAAV-HIF-1a组)、转染载体对照的rAAV2/lacZ的海马神经元(简称载体组)以及未转染的海马神经细胞(简称正常组),提取细胞总蛋白,考马斯亮蓝蛋白定量。按100 μg/孔加样量计算应加细胞总蛋白的体积。SDS-PAGE分离蛋白后,100V电转移至膜上,5%脱脂奶粉封闭过夜,PBS清洗PVDF膜。加入小鼠抗人HIF-1a(1∶1000)单克隆抗体,4 ℃孵育过夜,PBS清洗。加入二抗(1∶2000)HRP兔抗小鼠抗体,37 ℃孵育1 h,PBS清洗,DAB法显色,采用Labworks4.0图象分析系统扫描测定积分光密度。

1.7 细胞凋亡百分率的检测

采用流式细胞术转染3 d后将rAAV-HIF-1a组细胞、载体组细胞以及正常组细胞分别与10 μmol/L的Aβ25-35作用24 h(分别简称rAAV-HIF-1a+Aβ组、载体+Aβ组、正常+Aβ组),以0.25%胰酶消化处理细胞,离心收集细胞,以pH7.4的PBS制成单细胞悬液,浓度为1×106 /ml。加入2倍体积在-20 ℃预冷的70%乙醇固定细胞1 h,PBS洗涤1次。加入含有50 mg/ml的碘化吡啶和100 mg/ml的无DNA酶污染的RNA酶,PBS染色液,置4 ℃避光染色1 h,上机检测。

1.8 激光共聚焦技术检测细胞内游离Ca2+荧光强度

吸去塑料培养皿中的培养基,将细胞用D-Hanks液清洗3次,用终浓度为5 μmol/L的Fluo-3/AM在37 ℃恒温避光条件下负载30 min,然后吸出染液,再以D-Hanks液清洗3次后在激光共聚焦显微镜下检测细胞荧光强度,激发光选用488 nm,发射光为530 nm。随机选取结构清楚、胞突完整的神经细胞,每组扫描20个以上细胞,所得图像和数据由计算机收集分析,即得每个细胞内Ca2+的荧光强度值,荧光强度值越大,则细胞内游离Ca2+浓度越高。

1.9 统计学处理

应用SPSS 10.0统计分析软件进行统计处理,数据用了undefined表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两样本比较采用t检验,以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pSNAV-HIF-1α及rAVV-HIF-1a鉴定结果

利用KpnⅠ、BamHⅠ双切酶pSNAV-HIF-1α后琼脂糖电泳鉴定,可以产生3800和7000 bp两条片段,其中3800 bp片段包含HIF-1αcDNA全长(图1)。PCR扩增产物为324 bp(图3)。表明pSNAV-HIF-1α及rAAV-HIF-1a构建成功。

1:KpnⅠ、BamHⅠ双切酶pSNAV-HIF-1α;2:DNA marker DL 15000

1: pSNAV-HIF-1α;2:rAVV-HIF-1a;3:阴性对照;4:DL 2000 marker

2.2 病毒滴度的测定

病毒滴度测定如图3所示,样品与标准品对照得出结论,可知样品原液与标准品中2号相当,即浓度为1×1012/ml。

1-7:2.0×1012,1.0×1012,0.5×1012,0.25×1012,0.125×1012,0.0625×1012,0.0375×1012/ml;a:样品原液;b:4倍稀释的样品原液;c:8倍稀释的样品原液。

2.3 病毒纯度的测定

AAV的外壳由VP1、VP2、VP33种蛋白质组成,相对分子质量依次为82 000、72 000、62 000,在AAV病毒颗粒中VP1、VP2、VP3蛋白的比例约为1∶1∶10。纯化后的rAAV-HIF-1α经10%SDS-PAGE电泳分离后,VP1、VP2、VP3 3条特征性条带清晰,无其他杂带,大约符号1∶1∶10的比例,经凝胶扫描图像分析后认为rAAV-HIF-1α纯度大于98%(图4)。

1:低分子质量蛋白质标准;2:样品原液

2.4 HIF-1a蛋白的表达

Western印迹检测结果表明,各组细胞中均表达相对分子质量为120 000的HIF-1a蛋白,但表达量不同。rAAV-HIF-1a组细胞HIF-1a蛋白的表达(727.57±36.08)较载体组(335.94±20.19)、正常组(328.57±23.71)明显增强(P<0.05,n=6),而载体组、正常组细胞相比HIF-1a蛋白的表达无明显差异(图5)。

1:正常组;2:载体组:3:rAAV-HIF-1α组

2.5 HIF-1α基因转染对Aβ25-35诱导细胞凋亡的影响

流式细胞分析结果表明,正常+Aβ组、载体+Aβ组细胞凋亡百分率较正常组、载体组显著升高(P<0.05),而rAAV-HIF-1α+Aβ组细胞凋亡百分率较正常组+Aβ组、载体+Aβ组显著降低(P<0.05),正常+Aβ组、载体+Aβ组细胞凋亡百分率相比,差异无统计学意义(P>0.05)(表1),这说明HIF-1α能够抑制Aβ25-35诱导海马细胞发生凋亡。

注:a:与正常组比较,P<0.05;b:与载体组比较,P<0.05;c:与rAAV-HIF-α+Aβ组比较,P<0.05。

2.6 HIF-1α基因转染对Aβ25-35诱导细胞内Ca2+荧光强度上调的影响

以Fluo-3/AM荧光染色,在激光共聚焦显微镜下检测结果表明,正常+Aβ组、载体+Aβ组细胞内Ca2+荧光强度上调[(196.42±22.38)、(209.27±19.63)]显著高于正常组、载体组[(81.93±15.36)、(69.52±12.71)](P<0.05),而rAAV- HIF-1α+Aβ组细胞内Ca2+荧光强度被抑制到(136.42±17.52)显著低于正常+Aβ组、载体+Aβ组(P<0.05),正常+Aβ组、载体+Aβ组细胞内Ca2+荧光强度相比差异无统计学意义(P>0.05),这说明rAAV- HIF-1α能够抑制Aβ25-35诱导细胞内Ca2+荧光强度(即游离Ca2+浓度)的上调。

3 讨论

近年来病毒载体介导的AD基因治疗迅速发展并取得初步成功[2],但仍有众多难题亟待解决,其中选择适当的基因载体以将具有治疗价值的基因导人靶细胞并使其有效表达是基因治疗研究的关键所在。AVV载体具有安全性好、免疫原性低、宿主细胞范围广、能介导外源基因在体内长期稳定表达、并且不表达任何病毒自身蛋白基因等优点,是目前基因治疗研究中应用最为广泛的载体之一。

缺氧诱导因子-1是在缺氧环境下存在于哺乳动物体内一种真核转录因子,由α,β亚基组成,α亚基在功能调控方面起主要作用,β亚基在细胞内稳定表达[3]。常氧情况下,HIF-1α通过泛素2蛋白酶体途径降解,其半衰期<5 min。HIF-1α最先由Semenza等[4]于1992年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现,广泛存在于人和动物的多种肿瘤细胞中,可调控一系列靶基因如促红细胞生成素、血管内皮生长因子、糖酵解酶和一些涉及细胞生存蛋白质等的转录,同能量代谢、肿瘤治疗、凋亡等密切相关[5]。

本研究成功构建了携带人类HIF-1α基因的腺病毒相关载体rAVV- HIF-1a,经磷酸钙共沉淀介导的质粒转染技术将外源性HIF-1α基因导入原代培养海马597神经元细胞3 d后,海马神经细胞表达HIF-1α蛋白明显增加,与转染载体rAAV2/lacZ空载体组及未转染组比较差异有统计学意义,说明细胞能够高效表达外源性HIF-1α基因。10μmol/L的Aβ25-35作用于rAAV- HIF-1α组海马神经细胞后诱导的细胞凋亡百分率显著低于载体+Aβ组及正常+Aβ组,而载体+Aβ组和正常+Aβ组凋亡百分率相比差异无统计学意义,表明导入了HIF-1α基因的海马神经细胞对Aβ25-35诱导凋亡的敏感性降低,即产生了抗凋亡效应。这提示通过转染HIF-1α基因使细胞高效表达HIF-1α蛋白,能够拮抗Aβ25-35的促凋亡作用。进一步研究证实Aβ25-35诱导海马神经细胞凋亡的同时,细胞内游离Ca2+浓度显著上调,预转染rAAV- HIF-1a后,细胞内游离Ca2+浓度上调被显著抑制,提示HIF-1α蛋白能够拮抗Aβ25-35诱导的细胞内游离钙离子浓度的升高,推测有机制可能与以下因素有关:即HIF-1α通过上调细胞质内质网钙泵SERCA2蛋白表达和增强线粒体的钙离子缓冲能力,促进细胞内Ca2+向内质网、线粒体转移,降低细胞内游离钙离子浓度[6];此外,HIF-1α尚能够下调细胞膜非典型L型钙通道表达,这可能引起Ca2+内流减少[7],从而发挥调节细胞内游离钙浓度的作用。

目前,普遍认为胞内游离Ca2+浓度升高是细胞凋亡的一个重要事件,其可以通过线粒体依赖的和非线粒体依赖的2种途径启动细胞凋亡。一方面,钙离子顺电化学势进入线粒体,促使线粒体膜上的渗透性转移孔开放,细胞色素C等释放出线粒体进入细胞质,并直接激活caspase凋亡级联,引发细胞凋亡;另一方面,游离Ca2+浓度上调也可直接激活内源性核酸内切酶,造成DNA的剪切损伤,加速凋亡的发生。因此本研究认为,HIF-1α抗Aβ25-35诱发原代培养海马神经细胞凋亡作用可能与降低细胞内游离Ca2+浓度,从而抑制细胞C释放及内源性核酸内切酶活力有关。并且资料证实在鳞癌细胞HIF-1α可以通过激活糖酵解酶,降低代谢耗氧,减少活性氧产生,抑制细胞色素C释放及caspase凋亡级联反应,发挥抗凋亡作用[8],与本实验结果一致。

近年来,国外学者纷纷证实HIF-1α能够减弱氧化应激等因素对皮层神经细胞、视网膜神经细胞以及C6神经胶质瘤细胞的损伤[9,10],并且本研究亦证实通过HIF-1α基因转染使海马神经细胞高效表达HIF-1α蛋白,降低了Aβ25-35诱导细胞凋亡的敏感性,揭示进一步研究HIF-1α功能,有望对AD等神经变性疾病防治提供新的方案。

参考文献

[1]Soucek T,Cumming R,Dargusch R,et al.The regulation of glucosemetabolism by HIF-1 mediates a neurop rotective response to amyloid be-ta peptide[J].Neuron,2003,39:43-56.

[2]Tuszynski MH,Thal L,Pay M,et al.A phase 1 clinical trial of nervegrowth factor gene gherapy for Alzheimer disease[J].Nat Med,2005,11:551-555.

[3]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratoryManual[M].2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:787-793.

[4]段东晓,张桂红,邢莹,等.低氧预处理大鼠缺血再灌注脑组织缺氧诱导因子-1α的表达[J].郑州大学学报:医学版,2004,39(6):974-976.

[5]Semenza GL,Wang GL.Anuclear factor induced by hypoxia via denovoprotein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at asite required for transcrip tional activation[J].Mol Cell Biol,1992,12:5447-5454.

[6]Neumann AK,Yang J,Biju MP,et al.Hypoxia inducible factor1 alpharegulates Tcell receptor signal transduction[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:17071-17076.

[7]Callinan L,McCarthy TV,Maulet Y,et al.Atyp ical L-type channelsare down-regulated in hypoxia[J].Biochem Soc Trans,2005,33:1137-1139.

[8]Sasabe E,Tatemoto Y,Li D,et al.Mechanism of HIF-1alpha-depend-ent supp ression of hypoxia-induced apoptosis in squamous cell carcinomacells[J].Cancer Sci,2005,97:394-402.

[9]Liu J,Narasimhan P,Yu F,et al.Neurop rotection by hypoxic precon-ditioning involves oxidative stress mediated expression of hypoxia-induc-ible factor and erythropoietin[J].Stroke,2005,36:1264-1269.

凋亡相关基因 篇6

1材料和方法

1.1实验动物及分组雌性SD大鼠60只,体重(200±20)g,随机分为正常组、模型组、SASP组、结肠康泰组,每组各15只,购自广州中医药大学实验动物中心。

1.2实验药物及试剂

结肠康泰:黄芪20g、党参20g、白术15g、茯苓12g、白头翁12g、秦皮6g、木香10g、地榆8g、元胡8g、白芍12g、甘草3g,由深圳市第二人民医院门诊部中药房提供,按比例将原方药物置于搪瓷药罐中,以1:10加入蒸馏水浸泡2小时,加热煮沸30分钟,滤出头煎,药渣加蒸馏水适量,再煮沸30分钟,滤出二煎,合并二次滤液,浓缩成200%置冰箱备用。SASP:上海三维制药有限公司提供,碾磨成粉,配成浓度为40mg/ml的混悬液。5%2,4,6-TNBs:Sigma公司。细胞凋亡原位末端标记(TUNEL)检测试剂盒:德国Roche Molecular Biochemicals公司。4%多聚甲醛、多聚赖氨酸(poly-lysine)、载玻片(防脱片剂处理)、即用型SABC免疫组化染色试剂盒等:均购于武汉博士得生物工程有限公司。

1.3造模方法[3]

除正常组外,其余各组大鼠造模前禁食不禁水48小时,禁食24小时后提起鼠尾将其悬空,使挣扎以排出大肠远端的大便,共2次,每次相隔6小时以上,以氯氨酮(0.2ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠,用外径为2mm的硅胶管插入鼠肛内约8cm,经管内注入5%2、4、6-三硝基苯磺酸水溶液0.4ml(100mg/kg)+50%乙醇0.25ml,约10秒灌注完毕。

1.4动物给药正常及模型组:生理盐水2ml/只·d-1;SASP组:0.8g/kg·d-1;结肠康泰组:20g/kg·d-1;从造模后第1天开始,按以上剂量给大鼠每天灌胃1次,连续14天。

1.5标本采集和处理

至第15天,各组大鼠禁食8小时后,用颈椎脱臼法处死大鼠,剖腹,取肛门至回盲部的结肠,沿肠系膜边缘纵形剖开,每只动物在远端结肠、横结肠和升结肠处至少各取1块组织标本(2mm×10mm),另于有炎症或溃疡处至少取1块组织标本,常规石蜡包埋、切片。

1.6观察指标与方法

1.6.1 UC细胞凋亡的检测TUNEL法。

1.6.2 UC凋亡基因Bcl-2、c-Myc、P53蛋白表达的检测免疫组化法。

1.7统计学处理所有数据经SPSS10.0统计软件处理,各组资料用()表示,采用非参数统计方法Wilcoxon秩和检验比较各组资料间的差异,P<0.05为差异有显著性。

2实验结果

2.1细胞凋亡观察TUNEL阳性细胞在普通光镜下的特征:细胞收缩变小,呈圆形,与周围细胞分离,细胞核显棕色或棕褐色或核碎裂为棕黄色颗粒。光镜下,可见正常组基本未见TUNEL阳性细胞;模型组阳性细胞数目较多,呈棕黄色;而SASP、结肠康泰组仅见少量的阳性细胞散在分布。凋亡指数见表1。

2.2细胞凋亡调控基因Bcl-2、c-Myc、P53蛋白表达的检测结果见表2。

与正常组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P<0.05(下同)

3讨论细胞凋亡失调是当今许多重要疾病的发病机制之一,调控凋亡过程是人类防治这些病症的新途径。细胞凋亡受多种基因调控,大量的资料显示[4],许多癌基因、原癌基因和抑癌基因参与细胞凋亡。已发现的抑凋亡基因有bcl-2、c-abl、ras等;促进凋亡基因有c-myc、p53、bax、fas等。Bcl-2蛋白能与细胞中一种称作Bax的蛋白结合,而这种结合对Bcl-2的抗细胞凋亡功能起重要调控作用,Bcl-2蛋白过度表达而抑制细胞凋亡。c-myc基因是与细胞生长调节有关的原癌基因,c-myc基因编码的c-Myc蛋白具有引起细胞增殖和诱导细胞凋亡的双重作用。P53基因的生物学意义是监护细胞基因组的完整性,如DNA受损,尤其在G1期,则P53蛋白累积,复制停止,以利DNA修复,如修复失败则P53基因引导程序使细胞“自杀”。

Iwamoto等报告[5]正常结肠细胞凋亡主要发生在肠腔上皮细胞;活动期UC除此之外,病变处及临近的非病变处隐窝上皮细胞凋亡增加,从而使上皮细胞的黏膜屏障破坏,导致结肠黏膜的损伤和溃疡,细胞凋亡由参与凋亡调控的系列基因相对表达程度决定,并受细胞凋亡程度影响。本研究结果表明:SASP及结肠康泰组大鼠细胞凋亡指数(AI)明显降低、c-Myc、P53蛋白低表达,Bcl-2高表达,与模型组比较有显著性意义(均为P<0.05)。提示细胞凋亡是UC的病理机制之一,结肠康泰通过调控基因bcl-2、c-myc、p53对结肠炎大鼠结肠黏膜细胞凋亡有抑制作用。所以选择性地减少UC肠上皮细胞凋亡造成的组织损伤,或选择性地诱导UC炎症细胞凋亡,减少炎症反应,将可能成为治疗UC的有效方法。

参考文献

[1]陈如山，张永锋，邓联民，等．结肠康泰治疗慢性结肠炎的临床研究．内蒙古中医药，1998，21(3)：3．

[2]张永锋，陈如山，吴正治，等．结肠康泰Ⅱ号对结肠炎小鼠TGF-β_1、EGF及其mRNA表达的影响．中国中医药科技，2006，13(2)：75．

[3]张涛，谢建群．大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究．中国中西医结合消化杂志，2006，14(4)：240．

[4]汤新之．细胞凋亡的分子机制．中国中西医结合外科杂志，1998．4(1)：60．

凋亡相关基因 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

白血病K562细胞系来自天津血液病研究所;榄香烯乳注射液大连金港制药公司产品;鼠抗人PDCD5单克隆抗体, 购自北京宝赛生物技术有限公司;DMEM培养液购自海克隆生物化学制品 (北京) 有限公司;免疫组化SP检测试剂盒, 购自福州迈新生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 K562细胞培养及实验分组

将K562细胞培养于37℃含有5%CO2孵育箱中24 h后加入10μl不同浓度的榄香烯注射液。分组如下:榄香烯药物终浓度分别为40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml 3组以及榄香烯空白乳对照组、顺铂阳性对照组 (3μg/ml) 、培养液DMEM对照组共6组, 各组分别于加药12h、24h、48h后收集细胞, 每组设5个复孔。

1.2.2 免疫组化步骤

参照免疫组化SP试剂盒说明书进行操作。每次实验均以已知PDCD5蛋白阳性表达的渗透明细胞癌组织作阳性对照;以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 免疫组化结果判定

PDCD5蛋白免疫细胞化学染色阳性信号均在细胞浆, 呈棕黄色颗粒。在光镜下观察免疫细胞化学信号, 以信号强弱进行分级和评分, 进行统计学处理。具体分级和评分标准见表1[3]。

1.4 统计分析

采用SPSS 11.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示, 采用方差分析对实验数据进行统计学分析, 检验标准以α=0.05为显著性检验水准, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDCD5蛋白在白血病K562细胞中的表达

PDCD5蛋白免疫细胞化学染色阳性信号位于K562细胞胞质, 呈棕黄色颗粒。阳性对照有阳性信号显示;阴性对照组无阳性信号显示。

2.2 榄香烯对白血病K562细胞中PDCD5蛋白表达的影响

不同3种浓度榄香烯作用白血病K562细胞12h、24h、48h后, 对K562细胞中PDCD5蛋白表达均有上调作用, 以80mg/L榄香烯作用48h上调效应最明显。与空白乳对照组、培养液DMEM对照组两两相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) ;3个实验组间及与顺铂对照组两两相比, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) , 见表2。

注:①12h、24h、48h三个时间点a、b、c、d组两两相比, 无显著性差异, P均>0.05②a、b、c、d组与e、f组两两相比, 差异有显著性, P均<0.05

3 讨论

榄香烯 (elemene) 是我国首先从姜科植物温郁金 (温莪术) 的根茎中提取的抗癌有效成分, 由于其低毒、高效、和光谱等优点, 已被广泛用于治疗多种肿瘤。体外实验研究发现榄香烯可阻滞多种肿瘤从S期进入G2/M期, 抑制其增殖[4]。体内实验证实, 榄香烯对皮下接种的Lewis肺癌细胞有较好的抑瘤作用[5]。临床应用观察证明榄香烯除对多种浅表肿瘤有确切的疗效外, 还对乳腺癌等多种恶性肿瘤有较好的疗效[6]。另外研究表明榄香烯可通过激活Caspase-3促使细胞发生凋亡[7]。

细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下, 由基因控制的细胞自我毁灭过程。凋亡异常与许多疾病 (尤其是肿瘤) 的形成及发展进程密切相关。细胞凋亡调控机制研究证明, 多种基因 (如p53、c-myc、bcl-2、bax等) 参与了细胞凋亡的调控过程。PDCD5基因是由我国科研人员新发现的另一重要的凋亡相关基因[8], 国内外已有多家实验室利用不同技术研究发现PDCD5在疾病情况下, 特别是在肿瘤组织中表达明显下降[1,4], 同时还发现PDCD5在细胞凋亡过程中发挥重要的正调控效应, 它可能作为胱天蛋白酶-3的正调控分子参与细胞凋亡[9]。PDCD5蛋白在凋亡过程中不仅表达增加, 而且在凋亡的早期出现明显的核转位现象, 其出现的时间早于Annexin V检测的PS外翻现象, 因而有可能作为一种新的早期凋亡的标志[9]。

本研究发现榄香烯处理白血病K562细胞后, 对K562细胞中PDCD5蛋白表达具有上调作用, 以80mg/L榄香烯作用48h上调效应最明显。与空白乳对照组、培养液DMEM对照组两两相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。此研究结果为临床通过调控与白血病等肿瘤细胞凋亡相关基因的表达, 促进肿瘤细胞凋亡, 进而治疗恶性肿瘤奠定一定的理论基础。

参考文献

[1]LI CG, LI ML, SHU XH, et al.Effect of elemene on the phospholipids transformation rate and membrance fluidity of human BIU87cells[J].Nat Med J China, 2004, 84 (3) :416-417.

[2]Chen YY, Sun RH, Han WL, et al.Nuclear translocation of PDCD5 (TFAR19) :an early signal for apoptosis·[J].FEBS Letters, 2001, 509 (27) :191-196.

[3]孙淼淼, 张红, 曹学全, 等.肝素酶特异性RNAi对人食管癌移植瘤中HPA基因表达的影响[J].郑州大学学报, 2007, 42 (1) :12-14.

[4]Li X, Wang G, Zhao J, et al.Antiproliferative effect of beta-elemene in chemoresistant ovarian carcimoma cells is medi-ated through arrest of the cell cycle at the G2-M phase[J].Cell Mol Life, 2005, 62 (7-8) :894-904.

[5]Barr LF, Campbell SE, Diette GB, et al.c-Myc suppresses the tumorigenicity of lung cancer cells and down-regulates vascular endothelial growth factor expression[J].Cancer Res.2000;60 (1) :143-149.

[6]胡军, 金伟, 杨佩满.β-榄香烯逆转人乳腺癌MCF27/ADM细胞对阿霉素耐药性的研究[J].中华肿瘤杂志, 2004, 5 (26) :268.

[7]向彬, 张福胤, 吴佩春.β-榄香烯及顺铂对人涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞毒作用的研究[J].现代口腔医学杂志, 2005, 19 (4) :433-434.

[8]Liu H, Wang Y, Zhang Y, et al.TFAR19, a novel apoptosis-related gene cloned from human Leukemia cell line TF-1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced of growth factor withdrawal[J].Biochem Biophys Res Commun, 1999, 254 (1) :203-210.

凋亡相关基因 篇8

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2008年1月至2010年12月期间日照市人民医院确诊受控子宫内膜异位症患者并手术治疗者60例,年龄在30~55岁,平均为42岁,取盆腔异位内膜组织并刮取在位内膜分别60例。另取经期非子宫内膜异位症(并排除其他妇科疾病)的正常人刮取内膜组织40例为对照组(自愿),年龄30~55岁,平均为40岁。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂

Bcl-2、Bax并克隆抗体、p53并克隆抗体,及SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。

1.2.2 免疫组织化学SP法检测

标本均常规固定,包埋,过滤切片3张,分别作Bcl-2、Bax,p53免疫组织化学染色。Bcl-2阳性反应物为棕褐色颗粒,分布于细胞膜和(或)细胞质。Bax阳性反应物为桔黄色颗粒,分布于细胞核(或)细胞质。p53阳性反应物为棕黄色颗粒,分布于细胞核。

1.2.3 结果判定

根据细胞染色强度和染色细胞所占面积的得分之和进行评估:(1)染色强度评分标准;(2)不着色为0分,黄色为1分,棕黄色为2分,黄褐色为3分;染色细胞占整张面积评分标准;无阳性细胞染色为0分,≤25%为1分,26%~50%为2分,>50%为3分;(3)各种评分相加,0~1分为(-),2分为弱阳性(+),3~4分为阳性(++),5~6分为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法

应用SPSS11.5统计软件,秩和检验、χ2检验等统计学方法,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Bcl-2在异位内膜组表达强于在位内膜及对照组(P值均<0.05),Bax在异位内膜组的染色强度低于在位内膜组和对照组,有显著性差异(P值均<0.05)。见表1。

2.2 p53在正常子宫内膜及子宫内膜异位症患者在位内膜中均呈阴性表达。在子宫内膜异位症患者异位内膜中的阳性表达率为20%,有显著性差异(P<0.05)。见表2。

3 讨论

细胞凋亡是指有核细胞在一定条件下,通过启动内部机制,经过一连串的细胞变性,最终发生死亡的过程。它在有机体的发育、生殖、老化、免疫等生理过程中,病毒感染、增殖性疾病、肿瘤发生等病理过程中都起到十分重要的作用,对维持个体组织器官的正常形态和功能有重要意义[3]。

Bcl-2为凋亡抑制基因,Bax为促凋亡基因。Bcl-2与Bax比例决定细胞对某一凋亡刺激的敏感性。Bcl-2是目前发现的与凋亡关系密切的基因之一。多出现在寿命长的干细胞群里,如子宫内膜、结肠、皮肤、和前列腺等[4]。John等通过培养神经元有丝分裂状况也证实了Bcl-2在不引起细胞增殖的情况下,可以抑制细胞凋亡。Bax的主要作用是加速细胞死亡,并与Bcl-2一起调节细胞凋亡,子宫内膜的周期性增生与脱落是通过细胞增殖和凋亡的形式来实现的[5]。

此外,Bcl-2/Bax异二聚体的比值越低凋亡越明显。本研究结果显示,Bcl-2表达在异位内膜中最强,在正常内膜中最弱。Bax蛋白表达在异位内膜中最弱,正常内膜中最强。正常内膜中大量凋亡细胞的存在,使得正常月经期脱落的内膜细胞不再具有增殖分化的能力。在EMS异位内膜组Bcl-2表达增强,Bax表达减少,Bcl-2/Bax比值大于对照组。由此我们可以推测EMS异位内膜的抗凋亡性大大增强,使得月经期逆流至腹腔的子宫内膜的活性增高而具有继续生长的潜能。有利于子宫异位内膜细胞的种植、侵袭和发展。这也是本研究结果的重要意义。

肿瘤抑制因子p53蛋白是人体内一个关键的细胞凋亡调节因子,Gylfason等[6]研究结果提示,体细胞p53基因随机改变在发生重度子宫内膜异位症中起一定作用。本实验采用免疫组织化学SP法检测发现p53在异位子宫内膜的阳性表达,显著高于在位子宫内膜及正常子宫内膜中的表达。再次证明了异位的子宫内膜组织存在凋亡抑制,细胞周期调控机制发生了改变,从而使其存活种植,过度增生,促进了内膜异位症的发生发展。

通过以上研究,我们得出子宫内膜异位症中异位的子宫内膜组织抗凋亡性较内异症的在位内膜及正常子宫内膜明显增强的结论。为探讨子宫内膜异位症的发生发展机理及临床治疗提供理论依据。如果能用药物抑制异位内膜增殖,诱导其凋亡,可能对EMS保守治疗起积极作用。

参考文献

[1]朗景和.子宫内膜异位症的研究与设想[J].中华妇产科杂志,2003,38(8):478-480.

[2]任云青.子宫内膜异位症与细胞凋亡[J].医学综述,2005,11(8):689-691.

[3]Biscotti CV,Hart WR.Apoptotic bodies: a consistent morphologic feature of endocervical adenocarcinoma in situ [J].Am J Surg Pathol,2008,22(3):434-439.

[4]Watanbe H,Kanzaki H,Narukawa S,et al.Bcl-2 and Fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during the menstrual cycle in relation to endometrial cell apoptosis[J].Am J Obstet Gynecol,1997,176(2):360-368.

[5]王云霞.李亚里.细胞凋亡与子宫内膜异位症[J].解放军医学杂志,2000,25(6):161-163.