酪氨酸激酶抑制剂

关键词： 激酶 多发病 癌症 疾病

酪氨酸激酶抑制剂（精选四篇）

酪氨酸激酶抑制剂 篇1

21世纪, 随着科学技术的不断发展, 人类已经战胜了一些以往难以治愈的疾病。但是, 被称为“世纪之魔”的癌症, 已经成为全球范围内的常见病和多发病[1], 其死亡率之高, 使其成为继心脑血管疾病之后的又一类杀手。癌症 (Cancer) , 亦称恶性肿瘤 (malignant neoplasm) , 为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控之外, 还会局部侵入周遭正常组织, 甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。

卫生部《中国卫生统计提要》的数字显示, 2003年以来, 癌症连续在城市居民死因中位居首位, 是严重危害居民健康和生命的疾病。自2006年6月起, 卫生部和科技部联合组织了第三次全国死因回顾抽样调查。20世纪70年代, 我国每年死于癌症的人口约70万。20世纪90年代, 我国每年死于癌症的人口约为117万。21世纪初, 我国每年死于癌症的人口约为150万。如不加以控制, 中国癌症死亡人数在今后20年中就将超过400万, 而癌症患者总数将达660万。

随着癌症在全球范围内的肆虐, 治疗方法也在不断更新, 其中包括外科肿瘤学的治疗、放射肿瘤学的治疗、癌症化疗、癌症的化学预防、大剂量化疗、癌症免疫治疗和综合治疗等。其中, 癌症的治疗方法一直是以外科手术、放射治疗、化学疗法为主的。药物治疗因其治疗范围有限——大部分癌症是无法用药物来治疗的, 只有有限的几种可以使用, 效果没有一线疗法好, 所以一直处于辅助的治疗地位。但是, 从癌症产生的那一天起, 人类就没有放弃过使用药物治愈癌症的希望, 但因为科学传统技术的制约问题, 一直没有长足的进步。随着近代生命科学和合成化学的发展, 出现了一批有代表性的常用抗肿瘤药, 其中包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物来源的抗肿瘤药物等, 多数是现今临床正在被使用的品种。传统的抗癌药也多是细胞毒药物, 不仅对癌细胞有杀伤作用, 而且对正常的人体组织细胞有极大的破坏作用, 产生很大的副作用, 患者生活质量明显下降, 人类对靶向给药的抗癌药有着急切的需求。

酪氨酸激酶抑制剂为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷 (ATP) 与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂, 也可作为酪氨酸的类似物, 阻断酪氨酸激酶的活性, 抑制细胞增殖, 已经开发为数种抗肿瘤药物。

二、文献综述

(一) 酪氨酸激酶抑制剂

现在研究较多的蛋白激酶抑制剂包括表皮生长因子受体酪氨酸激酶、血管内皮生长因子受体抑制剂等。下面我们以表皮生长因子受体酪氨酸激酶 (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 为例进行综述。

EGFR是原癌基因c-erb B1的表达产物, 是表皮生长因子受体 (HER) 的家族成员之一。该家族包括HER1 (erb B1, EGFR) , HER2 (erb B2, NEU) , HER3 (erb B3) 及HER4 (erb B4) 。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。

EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面, EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失、其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常, 均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。

EGFR是上皮生长因子 (EGF) 细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于Erb B受体家族的一种, 该家族包括EGFR (Erb B-1) , HER2/c-neu (Erb B-2) , Her3 (Erb B-3) 和Her 4 (Erb B-4) 。EGFR也被称作HER1, Erb B1, 突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白, 属于酪氨酸激酶型受体, 细胞膜贯通, 分子量170Da。

EGFR位于细胞膜表面, 靠与配体结合来激活, 包括EGF和TGFα。激活后, EGFR由单体转化为二聚体, 尽管也有证据表明, 但激活前存在二聚体。EGFR还可能和Erb B受体家族的其他成员聚合来激活, 例如Erb B2/Her2/neu。

EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路, 包括Y992, Y1045, Y1068, Y1148 and Y1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化, 包括MPAK, Akt和JNK通路, 诱导细胞增殖, 受体激活对于皮肤的免疫来说很重要。

研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关, 其可能机制有:EGFR的高表达引起下游信号传导的增强;突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化;自分泌环的作用增强;受体下调机制的破坏;异常信号传导通路的激活, 等等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用, 胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关, 一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在, 现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括:具有配体非依赖型受体的细胞持续活化;由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖, 它们的共表达往往预示肿瘤预后不良。例如, 在乳腺浸润性导管癌的研究中发现, TGFα与EGFR共表达, 且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。

此外, 对EGFR与肿瘤的血管生成、高侵袭性及转移关系的研究发现EGFR可以通过Ang-1及VEGF等因子水平的调节而影响肿瘤血管生成。

在配体与表皮生长因子受体 (EGFR) 结合后, 受体发生了二聚作用, 二聚作用既包括两个同种受体分子的结合 (同源性二聚作用) , 又包括人类EGF相关性受体 (HER) 酪氨酸激酶家族中的不同成员的结合 (异源性二聚作用) 。二聚作用后是酪氨酸残基的自磷酸化作用。这些磷酸化的残基是募集适配蛋白和额外的酪氨酸激酶底物的结合位点。蛋白质在激活的受体复合物中相互作用刺激ras蛋白, 引起磷酸化级联反应的发生和丝裂原激活蛋白 (MAP) 激酶的激活, 或者转录信号传导和激活、磷脂酰肌醇激酶-3 (PI3K) -Akt和应激活化蛋白激酶 (SAPK) 信号传导通路将被激活。这些信号通路依次触发基因转录, 同时控制细胞增生、分化和生存的通路被激活。EGFR介导信号通路的特异性和强度取决于激活蛋白的性质和四种EGFR家族成员的水平。与HER2结合的配体不详, 但当HER2和EGFR共表达时, 前者经常与配体激活的后者结合形成二聚体。这种异源性二聚体与EGFR同源性二聚体相比, 往往具有更高的再利用率、稳定性和传导信号的能力。EGFR也能与HER3和HER4发生二聚作用, 其产物具有更高的持久性和更强的PI3K活性。EGFR信号传导通路一旦配体结合的EGFR被内吞入细胞, 信号就将终止, 受体将被降解或再循环到细胞膜表面, 这取决于配体的性质。例如, EGF结合的受体将被降解, 而TGF-α结合的受体则进入再循环。不同的生长因子会影响EGFR信号通路的数量和持续时间。EGFR信号通路有多重的生物学作用。例如, Ras-MAPK信号转导通路刺激细胞的分裂和迁徙。EGFR也是多种受体通路的重要介体, 起到信号会聚点的作用, 能够将信号整合和多样化。例如, 在应激、膜解聚作用和一些非生理性刺激物 (包括氧化剂、放射线和烷化剂) 的反应中, 反向激活能诱导EGFR酪氨酸激酶的磷酸化并随后发生信号的转导。EGFR家族的成员在正常发育中起了重要的作用, 但在人类肿瘤中经常过度表达并失去控制。

(二) 吲哚衍生物

吲哚环化合物是重要的有机原料和化工产品, 近年来吸引了越来越多的化学家的关注。吲哚环化合物不仅可以合成染料、制备香料, 还可以用作植物生长素、饲料添加剂, 而且可以治疗心血管病、糖尿病及肺癌等多种疾病, 因此它在工业、农业及医药等领域中有着十分广泛的重要用途。随着人们对吲哚环化合物用途认识的深入, 对吲哚环化合物合成方法的研究也越来越多, 现在每年都有不少关于这方面的报道。褪黑素是典型的吲哚生物碱药物。褪黑激素 (Melatonin) 主要是由哺乳动物和人类的松果体产生的一种胺类激素, 化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。

N-乙酰基-5-甲氧基色胺

褪黑激素的生物合成:松果体在光神经的控制下, 由色氨酸转化成5-羟色氨酸, 进一步转化成5-羟色胺, 在N-乙酰基转移酶的作用下, 再转化成N-乙酰基-5-羟色胺, 最后合成褪黑激素, 从而使体内的含量呈昼夜性的节律改变。褪黑素每日分泌量极少, 但在昼夜调节、性成熟、生殖、免疫反应、肿瘤、衰老过程中起着重要的作用。

褪黑素的抗肿瘤作用:Vijayalaxmi等 (1995) 体外研究发现, 褪黑激素对137Cs的γ射线 (150c Gy) 所造成的人体外周淋巴细胞染色体损伤有明显的保护作用, 且呈剂量—效应关系;对自由基产生的物理和化学致突变性和致癌性有拮抗作用。体外试验表明, 褪黑激素对自力霉素C引起的致突变性也有保护作用。褪黑激素能降低化学致癌物 (黄樟素) 诱发的DNA加成物的形成, 防止DNA损伤。

(三) 吲哚药效团在酪氨酸激酶抑制剂中的应用

舒尼替尼是一种经典的酪氨酸激酶受体抑制剂, 其母核中就含有吲哚结构的重要药效团。

舒尼替尼

实验证明, 舒尼替尼能够抑制80多种酪氨酸激酶和多种生长因子受体, 如血小板源性生长因子受体 (platelet derived growth factor receptors, PDGFR) 、血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptors, VEGFR) ﹑I-型集落刺激因子受体 (colony stimulating factor receptor type 1, CSF-1) 、干细胞因子受体 (stem cell factor receptor, KIT) 等。

在酪氨酸激酶的肿瘤表达体系中, 舒尼替尼能够抑制多种酪氨酸激酶的磷酸化过程。通过实验性肿瘤模型证实, 舒尼替尼有抑制肿瘤细胞生长、退化、转移的作用。对于酪氨酸激酶调控失灵的肿瘤细胞, 舒尼替尼能够抑制其生长。

舒尼替尼的靶点, 如VEGF、PDGFR、raf、HIF等很多在肾癌细胞中都是高表达的。Ⅱ和Ⅲ期临床试验表明, 舒尼替尼可使肿瘤稳定, 受益率为70%—75%, 在相当多患者中延长PFS, 控制力、反应率比干扰素治疗显著提高, 生存率提高, 一线治疗有很好效果, 二线治疗效果也很好, 有非常好的应用前景。

舒尼替尼与索拉非尼治疗转移性肾癌都有很好的疗效, 都是抑制血管生成和细胞增殖, 靶位可能有所不同。

(四) 酪氨酸激酶抑制剂——贝雷文尼

随着分子生物学技术的发展和提高, 和从细胞受体及增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制的进一步了解和认识, 人类开始了以关键基因、细胞受体和调控分子为靶点的治疗方法的研究, 称其为“靶向治疗”。贝雷文尼正是在这样的趋势下, 研究和发展起来的新一代靶向抗癌药物。

贝雷文尼Brivanib alaninate

贝雷文尼一种分子靶向新药, 是由百时美施贵宝公司 (BMS) 开发的。它通过抑制血管生成和诱导细胞凋亡起到抗肿瘤作用。前期临床研究表明贝雷文尼对肝细胞癌有较好的抗肿瘤效果。

贝雷文尼是一种选择性血管内皮生长因子 (VEGFR) 酪氨酸激酶抑制剂, 该酶通常表达于上皮来源的实体瘤。酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶, 能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化, 在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数属于致癌RNA病毒的癌基因产物, 也可由脊椎动物的原癌基因产生。

酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷 (ATP) 与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂, 也可作为酪氨酸的类似物, 阻断酪氨酸激酶的活性, 抑制细胞增殖, 已经开发为数种抗肿瘤药物。

贝雷文尼对索拉非尼和沙利度胺治疗失败的患者有效且耐受性良好。研究还发现血清Ⅳ型胶原下降与较长的PFS、OS相关, 可能是贝雷文尼治疗有效的一个生物标志物。

贝雷文尼与索拉非尼“头对头”比较一线治疗晚期HCC和贝雷文尼对照安慰剂治疗索拉非尼治疗失败或不能耐受的肝癌的两项Ⅲ期国际研究刚开展。贝雷文尼有望成为肝癌分子靶向治疗另一个可供选择的药物。

三、目标化合物设计

合成路线与条件: (1) 乙酰乙酸乙酯, 钠氢, 浓硫酸, 室温, 12小时; (2) 氯化苄, 四氢呋喃, 室温, 12小时; (3) 钯碳, 氯化铵, 四氢呋喃, 甲醇, 室温, 12小时。

路线一是本小组设计的第一条路线, 因为其在实验过程中收率较低, 产物在反应环境中不稳定, 故最后放弃。

旧路线从表面上看来比新路线步骤少而且操作简单, 但实验证明在氢气钯碳环境下吲哚产物不稳定, 最后一步关环反应产率很低, 所以在综合考虑已有文献和前期实验结果后, 我们最终确定了一条四步的新反应路线 (路线二) 。

合成路线与条件: (1) 乙酰乙酸乙酯, 钠氢, 浓硫酸, 室温, 12小时; (2) 碳酸钾, 甲醇, 回流, 2小时; (3) 吡啶盐酸盐, 180度, 5小时; (4) 保险粉, 室温, 19小时。

四、化学合成

(一) 合成路线

合成路线与条件: (1) 乙酰乙酸乙酯, 钠氢, 浓硫酸, 室温, 12小时; (2) 碳酸钾, 甲醇, 回流, 2小时; (3) 吡啶盐酸盐, 180度, 5小时; (4) 保险粉, 室温, 19小时。

(二) 实验讨论

在反应步骤a中要注意原料加入的顺序, 应当先加入乙酰乙酸乙酯和氢化钠拔氢, 再加入原料三氟硝基苯。同时, 在此步中要控制反应系统的温度不能过高。

在反应步骤b中要注意加入碳酸钾的作用是中和生成的HF, 使反应不断向右进行, 使反应产率变高。同时要注意加热的温度, 使甲醇充分回流。

在反应步骤c中要注意吡啶盐酸盐的脱甲基作用, 可用软硬酸碱理论解释。同时注意此步的后处理过程较为困难繁琐, 可用优化萃取的方式, 获得较高的产率。

在反应步骤d中要注意加入保险粉时需分批加入, 防止强还原性的低亚硫酸钠和水大量放热, 此处可用用冰水浴控温。

五、实验操作

MS用HP1100LC/MSD质谱仪测定。薄层层析 (TLC) 板采用硅胶GF254 (烟台江民硅胶开发有限公司生产) 与浓度为0.8%的CMC-Na蒸馏水溶液搅拌均匀后铺板, 经100-110℃活化一小时后放置于干燥器内保存备用, 于紫外灯下 (波长254nm) 显色;柱层析采用200-300目硅胶 (烟台江民硅胶开发有限公司生产) , 干法装柱。试剂均为市售化学纯或分析纯产品, 除特别说明外, 不经处理直接使用。

(一) 2-丙酮基-3, 4-二氟硝基苯2-acetone and 3, 4-fluorine nitrobenzene

将钠氢 (10.1g) 混溶 (混悬) 于四氢呋喃 (480m L) 中, 加入2L的四颈瓶, 室温搅拌, 随后缓慢滴加乙酰乙酸乙酯 (47g, 0.36mol, 至反应液, 内温上升至27℃后下降, 此时置于冰水浴中降温, 温度维持在22℃左右。溶液变为淡黄色澄清溶液。滴加三氟硝基苯 (32g, 0.18mol, 约105滴/分钟) , 撤去冰浴, 恢复室温, 溶液呈现澄清酒红色, 内温22℃, 继续搅拌3小时, 内温在20℃至22℃之间波动。反应结束后加氯化铵溶液调节p H值至4, 溶液的红色逐渐变淡直至消失。反应液用乙酸乙酯萃取三次, 有机层用饱和食盐水洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 滤液浓缩得油状物66.3g, 随后加入浓硫酸50m L和乙酸62m L, 70℃下反应过夜。反应结束后, 加水稀释反应液, 用乙酸乙酯萃取三次, 有机层用饱和食盐水洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 滤液浓缩得油状物, 快速硅胶柱层析得红色油状物Briva-1共27.2g, 收率70.24%。

(二) 2-丙酮基-3-氟-4-甲氧基硝基苯2-acetone-3-fluorine-4-hydroxy nitrobenzene

将Briva-1 (5g, 23.24mmol) , K2CO3 (2.73g, 19.75mmol) 溶于甲醇溶液 (3m L) , 加热至70℃。回流速度大约40滴/分钟, 溶液深红色。2小时后回流变慢, 约10滴/分钟, 点板观察发现未完全反应完, 将外温上调至73℃。共反应5小时, 将反应液用乙酸乙酯水萃取, 取乙酸乙酯层旋蒸, 得棕黄色固体3.6g。收率72.67%。

(三) 2-丙酮基-3-氟-4-羟基硝基苯2-acetone-3-fluorine-4-oxhydryl nitrobenzene

将Briva-2 (3g, 13.2mmol) 和吡啶盐酸盐 (6.1g, 52.82mmol) 放入三颈瓶中, 180℃加热, 固体融化为黑色液体。5小时后, 溶液用乙酸乙酯和水萃取, 取乙酸乙酯层旋干得棕黑色固体1.81g。用洗脱剂 (石油醚:乙酸乙酯=6:1) 柱层析得黄色的纯品1.50g, 收率56.86%。

(四) 2-甲基-4-氟-5-羟基-吲哚2-methyl-4-fluorine-5-hydroxyl-indoles

取Briva-3 (1.524g, 7.15mmol) 和水 (33.48ml) 加入50ml三颈瓶, 黄色固体不溶, 室温搅拌。分配加入Na2S2O4 (保险粉6.9g, 39.6mmol) , 温度逐渐上升至36℃, 冰浴降温至17℃, 溶液内有黄色絮状物, 20min内保险粉加完, 溶液逐渐由黄色变为乳白色, 内温8℃。反应过夜 (19h) 。溶液最终呈乳黄色, 乙酸乙酯和水萃取, 最终得固体 (1.054g) 。产率89.25%。

参考文献

[1]彭涛, 周家驹.酪氨酸激酶抑制剂的研究新进展[J].化学进展, 2010, VOL14, (5) :355-359.

[2]郑友广, 李铭东, 吉民.酪氨酸激酶及其小分子抑制剂研究进展[J].药品评价, 2006, VOL3, (2) :137-140.

[3]鄢明, 蒋耀忠, 宓爱巧.甲基醚脱甲基反应[J].化学试剂, 1996, VOL18, (3) :151-156.

[4]丁震宇.舒尼替尼治疗肾细胞癌的新进展[J].临床肿瘤学杂志, 2010, VOL15, (5) :461-464.

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酪氨酸激酶抑制剂 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组20例, 男15例, 女5例;年龄17～82岁, 平均59岁。依据血液病诊断及疗效标准[1], 确诊为慢性粒细胞白血病且BCR-ABL融合基因阳性、Ph染色体阳性。其中慢性期12例, 加速期6例, 急性变期2例。

1.2 方法

患者口服甲磺酸伊马替尼治疗, 其中慢性期患者剂量为300～400 mg/d, 急变期和加速期患者为600 mg/d。餐中顿服。6例加速期和急性变期患者经甲磺酸伊马替尼600 mg/d治疗90d后5例无效者改用尼洛替尼400mg、每天2次, 饭后口服, 服药后嘱饮水500 mL以上。

1.3 不良反应的观察

采用电话随访或患者来院复诊时, 请家属或患者详细记录每次服药后的不良反应, 观察患者服药后1 w、1个月以及以后1～3个月的症状、体征、体重等情况。8例加速期和急性变期患者为住院病人。

2 结果

患者服药情况服药时间3～50个月, 平均9.3个月, 中位18个月, 超过1年者11例。6例加速期和急性变期患者经甲磺酸伊马替尼600 mg/d治疗90天后无效者改用尼洛替尼。本组治疗后, 完全缓解12例, 白血病症状消失6例。治疗期间患者均有出现白细胞下降。服药14d后, 5例发生WBC下降<2.0×109/L, 均为急变期和加速期患者。服药14 d, 全组WBC均下降, 4例血小板下降。服药21 d, 10例均出现WBC下降, 5例血小板下降<50×109/L, 1例血红蛋白下降。发生恶心、呕吐4例, 颜面部浮肿、体重增加6例, 肝功异常3例。服药2周后出现皮炎3例, 其中剥脱性皮炎1例, 停药1个月后, 伊马替尼又从小剂量200 mg/d开始口服治疗逐渐加量至400 mg/d, 皮炎未继续出现。蛛网膜下腔出血1例, 查血小板30×109/L, 予输注血小板, 并给予甘露醇降颅压治疗, 蛛网膜下腔出血治愈。1例心动过速, 2例肌肉痛, 2例脱发。

3 护理

3.1 观察记录病情

服药期间观察病情, 建立不良反应记录表, 每周监测血常规2次, 每3周查肝、肾功能1次, 每3个月查骨髓象1次, 记录服药后不良反应发生情况。

3.2 胃肠道反应的护理

本组有4例发生恶心、腹胀、呕吐, 嘱患者:①进食易消化、高蛋白食物和补充足够液体。②减少进食对消化道有刺激的食物。③早餐中顿服格列卫化疗药物, 多饮水, 促进毒素排出体外。

3.3 出血的预防及护理

当血小板、白细胞下降到参考值以下时, 要嘱患者卧床休息, 减少活动。应指导患者避免外伤引起出血, 防摔碰损伤。禁用抑制血小板功能的药物, 密切观察血象的变化。血小板<10·0 g/L需停药。:本组出现蛛网膜下腔出血1例。观察患者头昏头痛、恶心呕吐症状, 随时观察神志、瞳孔变化, 监测血压、脉搏变化, 遵医嘱给予甘露醇降颅压治疗, 嘱患者绝对卧床休息, 一切生活护理均由护理工作者完成。

4 讨论

甲磺酸伊马替尼可在细胞水平上抑制酪氨酸激酶, 治疗慢性粒细胞白血病有较好的疗效, 总有效率可达95%[2]。在治疗CML时, 常见的不良反应有骨髓抑制、水肿、恶心呕吐、腹泻、纳差、口腔溃疡、肝功异常、肌痛、肌痉挛等。本组最常见的不良反应有轻恶心、呕吐, 腹泻、皮疹、肌痛及肌痉挛, 这些不良反应经处理均有效控制。不良反应中的骨髓抑制, 以粒细胞减少、血小板减少常见。本组浮肿和水、钠潴留, 发生率为30.0%。大多数患者的浮肿表现为下肢浮肿和眶周, 午后明显、体重迅速增加;治疗期间应作详细观察, 必要时用利尿剂治疗能很快控制。本组有3例在服药2周后出现皮炎, 予小剂量强的松15mg/d, 口服, 2例消失, 1例患者逐渐出现剥脱性皮炎, 该不良反应罕见, 需引起临床护理工作者重视。CML患者采取规范治疗时, 罕见出血报道。本组发现1例蛛网膜下腔出血, 这与患者治疗期间血小板减少有关。慢性粒细胞白血病患者治疗期间, 一旦血小板减少在20×109/L以下时, 就应高度警惕患者内脏出血危险, 要严密观察病情, 及时治疗处理, 必要时停药。尼洛替尼是一种新型的、高选择性的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂, 作用强于伊马替尼。现已应用在伊马替尼耐药或者不耐受的加速期和急变期患者中。本组患者结果证实了尼洛替尼在治疗伊马替尼耐药或者不能耐受的患者时, 可以更快速起效并能获得更持久的缓解。其不良反应与伊马替尼类似, 以骨髓抑制, 水潴留为主。非血液学副作用不很常见且多为1～2级, 如皮疹、乏力、瘙痒、头疼、恶心、肌肉痉挛和胃肠功能紊乱。尼洛替尼较少出现伊马替尼常见的体液潴留、水肿等不良反应。文献有心电图Q-T延长的报导, 本组病例未发现, 有待积累病例观察。

参考文献

[1]张之南, 沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].天津:天津科学出版社, 1991:193-195.

酪氨酸激酶抑制剂 篇3

本研究旨在构建人蛋白酪氨酸激酶Lyn的真核表达载体,并转染至HEK 293T细胞进行表达纯化及其对HEK 293T细胞的增殖能力的具有明显抑制效果,为后续深入研究该蛋白在疾病发生中的生物学功能及作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验材料

人子宫颈癌Hela细胞株、pc DNA3. 1( - ) 质粒和人胚肾HEK293 T细胞由南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所保存; 大肠杆菌DH5α 购自Tiangen公司。

1. 1. 2 试剂

Super ScriptTMⅡ Reverse Transcriptase试剂盒购自Invitrogen公司; Prime Star Max DNA聚合酶、限制性核酸内切酶EcoRⅠ、Bam HⅠ酶切缓冲液10 × M buffer、高效连接液Solution Ⅰ、total RNA提取试剂盒、DNA Ladder Marker、10 × Loading Buffer试剂均购自Ta KaRa公司; DNA片段凝胶纯化回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自Omega公司; 引物合成、质粒测序分别由华大基因、上海英俊公司完成; 转染试剂X - treme GENE HP购自美国Roche公司; 蛋白质Marker购自Fermentas公司; PVDF膜购自Bio - Rad公司; 组氨酸标签镍离子螯合琼脂糖磁珠BeaverBeadsTMHis - tag试剂盒购自海狸生物科技有限公司; 抗His标签的鼠抗Ig G抗体、HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体均购自Bioworld公司; CCK - 8 试剂盒购自Dojin Do公司。

1. 1. 3 仪器

PCR扩增仪、核酸电泳仪、垂直电泳仪及转移装置均购自美国Biorad公司。

1. 1. 4 培养基

胎牛血清、MEM培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶均为Gibco公司产品。

1. 2 方法

1. 2. 1 Hela细胞培养及总RNA提取与逆转录

使用含有10% 胎牛血清的MEM培养基培养Hela细胞,按total RNA提取试剂盒的步骤提取人Hela细胞总RNA,进行1. 2% 琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的提取效果。根据Super ScriptTMⅡ Reverse Transcriptase试剂盒说明书逆转录合成c DNA,逆转录反应体系: total RNA 1 μl、Oligo( d T) 1 μl、d NTP Mix 1 μl、H2O 9 μl; 5 × First - Strand Buffer 4 μl、0. 1mol / L DTT 2 μl、RNase OUTTM1 μl、H2O 1 μl; 逆转录反应条件: 65℃ 5min; 42℃ 2min; 42℃ 50 min,70℃ 15min,4℃ 保温。

1. 2. 2 Lyn基因的引物设计、合成及PCR扩增

根据NCBI数据库中的Lyn基因序列( Genbank: NM_002350 ) ,设计并添加EcoR Ⅰ和Bam H Ⅰ酶切位点的引物扩增全长约为1 500 bp的Lyn基因,下划线处为酶切位点( 表1) 。并委托华大基因公司进行合成。PCR反应体系( 50 μl) : c DNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、Prime Star Max DNA聚合酶25 μl、H2O 22 μl。反应程序如下: 98℃ 预变性5 min,35 个循环( 98℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s) 进行扩增,72℃延伸10 min。将PCR产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳,出现1 500 bp大小条带时可进行凝胶纯化回收试剂盒操作回收产物。

1. 2. 3 真核表达质粒pc DNA3. 1( - ) - Lyn的构建

用EcoRⅠ和Bam HⅠ分别双酶切Lyn和真核表达载体,双酶切反应体系( 20 μl) : pc DNA3. 1( - ) 质粒或Lyn的PCR产物10 μl、EcoRⅠ1 μl、Bam HⅠ1 μl、10 × M缓冲液2 μl、H2O 6μl。37℃ 酶切反应4h后根据胶回收试剂盒说明书对酶切产物分别进行割胶回收。再按1∶ 6 的比例将酶切后纯化的pc DNA3. 1( - ) 和Lyn的PCR产物加Solution Ⅰ 高效连接液于16℃过夜进行连接,并将连接产物转化大肠杆菌DH5α。翌日挑单克隆菌接种至5 ml含Amp+的LB液体培养基中,摇菌12 h后,按Omega质粒小提试剂盒操作提取阳性单克隆的质粒DNA。

1. 2. 4 真核表达质粒pc DNA3. 1( - ) - Lyn的双酶切、PCR及测序鉴定

双酶切鉴定所构建的重组质粒,反应体系( 20μl) : pc DNA3. 1( - ) - Lyn质粒10 μl、EcoRⅠ1 μl、Bam HⅠ1 μl、10 × M缓冲液2 μl、H2O 6 μl; 37℃ 水浴酶切过夜。PCR反应体系( 50 μl) : pc DNA3. 1( - ) - Lyn 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、Prime Star Max DNA聚合酶25 μl、H2O 22 μl; 反应条件同1. 2. 2。产物进行1. 0% 琼脂糖凝胶电泳,出现1 500 bp大小的条带则送往上海英俊公司进行测序,结果与Pub Med数据库进行比对,若碱基无错配、移码等突变且含有起始密码子ATG可认为构建成功。

1. 2. 5 His / Myc - Lyn蛋白的表达及纯化

用含10% FBS的DMEM培养基培养HEK 293T细胞,转染前1 d将处于对数生长期的细胞以1 ×106细胞/孔接种于6 孔板培养。次日待细胞生长至70% ~ 90% ,即按照转染试剂X - treme GENE HP的说明书按1: 3 比例将空质粒、重组质粒pc DNA3. 1( - ) - Lyn各2 μg转染至293T细胞,继续培养48h收细胞进行蛋白水平鉴定。用同样方法将10 μg的pc DNA3. 1( - ) - Lyn重组质粒转染10 cm培养皿,共4 皿,转染48 h后用预冷的PBS洗涤2 次,每皿细胞用1 ml含1% ( V/V) Triton X - 100、1 mmol/L PMSF的Binding buffer重悬,冰上10 min裂解后14 000 r / min,4℃ 离心30 min,取50 μl上清制备样品进行电泳分析。取2 ml金属离子螯合磁珠用Binding buffer平衡3 次,再加入上述细胞裂解上清4℃ 孵育1 h,加入Washing buffer洗涤3 次,加入1m L Elution buffer洗脱,磁性分离后收集洗脱液为纯化的融合蛋白,于- 20℃保存。

1. 2. 6 Western Blot鉴定Lyn蛋白的表达及纯化

重组质粒转染HEK 293T细胞48 h后进行细胞收集,加细胞裂解液进行处理,再加等体积2 × Loading Buffer制备蛋白样品,用相同方法进行纯化蛋白及未结合蛋白样品的制备。再进行10% SDS -PAGE蛋白电泳,PVDF膜用甲醛浸泡后进行电转移,用TBST稀释的5% 脱脂奶粉室温振荡封闭4 h,分别加入1∶ 5 000 比例用封闭液稀释的抗His标签的鼠抗为一抗,4℃ 冰箱孵育过夜,TBST洗涤3 次,每次10 min,再加入1∶ 10 000 比例用TBST稀释的HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体室温孵育2 h,TBST洗涤3 次,每次10 min,加入发光液ECL法化学发光显影。

1. 2. 7 CCK8 法检测过表达Lyn细胞的增殖能力

细胞的转染及OD450值的测定均于96 孔板进行。采用1 × 104个/孔的密度制备单细胞悬液并接种细胞200 μl,每孔加入20 μl CCK8 溶液并混匀,于细胞培养箱常规培养4 h,再对培养液进行检测。酶标仪检测转染后第1 ~ 6 d,pc DNA3. 1( - ) 细胞组和pc DNA3. 1( - ) - Lyn细胞组的吸光度( OD) 值( λ= 450 nm ) ,每组计数6 孔,取平均值进行分析。

1. 2. 8 细胞增殖曲线的绘制及统计分析

用SPSS 20. 0 统计软件对检测数据进行统计学分析,实验数据均以x ± s表示,配对t检验进行组间比较分析实验数据,P < 0. 05 则认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2. 1 Hela细胞总RNA的鉴定

提取人Hela细胞的总RNA,紫外分光光度法的结果显示OD260 /280值约为2. 0,并进行1. 2% 琼脂糖凝胶电泳结果可见18 S和28 S的条带,提示提取的总RNA可用于逆转录合成c DNA( 图1) 。

2. 2 PCR扩増产物的鉴定

合成的c DNA经PCR扩增目的片段,产物进行1. 0% 琼脂糖凝胶电泳,结果显示约1 500 bp处可见特异性目的条带,与Lyn基因1 500 bp大小一致( 图2) 。

Note:M1,M2:DNA marker;1,2:Lyn products with PCR.

2. 3 重组质粒的PCR鉴定

提取质粒并进行重组质粒PCR,1. 0% 的琼脂糖凝胶电泳结果可见存在约为1 500 bp处Lyn的基因片段,说明重组质粒含有Lyn目的基因片段( 图3) 。

2. 4 重组质粒双酶切鉴定

重组质粒用EcoRⅠ和Bam HⅠ进行双酶切后进行1. 0% 的琼脂糖凝胶电泳,结果可见含约1 500 bp的目的基因Lyn片段和5 500 bp的空质粒pc DNA3. 1( - ) 片段,显示重组质粒构建成功( 图4) 。

2. 5 测序结果分析

重组质粒送上海英俊公司进行测序后与GenBank检索的Lyn的c DNA序列( Accession: NM _002350) 进行比对证实为100% 同源,红色为匹配区,无错配和移码突变,成功构建了含有人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的真核表达载体( 图5) 。

Note:1:pcD NA3.1(-)-Lyn with PCR;M1,M2:DNA marker.

Note:M:DNA marker;1:pcD NA3.1(-)-Lyn with endonuclease.

2. 6 Western Blot检测融合蛋白的表达及纯化

转染pc DNA3. 1 ( - ) - Lyn重组质粒于HEK293T细胞中,然后用组氨酸标签海狸磁珠纯化表达的融合蛋白。Western Blot结果中,重组质粒组可检测到59k Da大小条带,空质粒组未检测到目的条带且洗脱液成功检测到纯化蛋白( 图6) 。

注解:A、Lyn蛋白的表达:1.转染pcD NA3.1(-);2.转染pcD-NA3.1(-)-Lyn。B、Lyn蛋白的纯化:1.转染pcD NA3.1(-)-Lyn的细胞裂解上清;2.转染pcD NA3.1(-)-Lyn磁珠纯化后的细胞裂解上清;3.纯化的His/Myc-Lyn融合蛋白。Note:A,1:HEK-293T cell transfected by pcD NA3.1(-)vector,2:HEK-293T cell transfected by pcD NA3.1(-)-Lyn.B,1:Represents supernatant of pcD NA3.1(-)-Lyn transfected cells,2:Represents supernatant of His/Myc-Lyn transfected cells after purification;3:Represents purified His/Myc-Lyn fusion protein.

注解:对比pcD NA3.1(-)组,Lyn过表达对细胞增殖有显著的抑制作用(*P<0.01)。Note:The cell proliferation was inhibited by Lyn overexpression(*P<0.01),compared with pcD NA3.1(-)group.

2. 7 过表达Lyn对细胞增殖的影响

检测的吸光度( OD) 值与细胞的成活率成正比,据此原理以吸光度( OD) 值为纵坐标,细胞培养的天数( d) 为横坐标,进行细胞增殖曲线的绘制( 图7) 。增殖曲线结果显示,较对照组pc DNA3. 1( - ) 细胞,Lyn过表达组pc DNA3. 1 ( - ) - Lyn细胞在第5、6 d的生长速度明显降低,差异有统计学意义( P <0. 01) ,表明Lyn过表达对细胞增殖有显著的抑制作用。

3 讨论

酪氨酸激酶家族的信号转导在癌症的管制与肿瘤转化过程中发挥重要作用。近年来,已有研究表明Lyn激酶在免疫应答、炎症反应等过程中发挥着重要的生理病理作用。有研究发现,内皮细胞中Lyn具有加强内皮完整性和维护血管屏障的作用[12],并且Lyn可以磷酸化胰岛素受体底物- 1,从而引起葡萄糖的利用率的上升[13]; 其参加B细胞受体( BCR) 介导的信号传递[14],当Lyn缺乏通过活化B细胞与骨髓增生会导致狼疮样自身免疫疾病[15];Lyn激酶的缺乏亦可导致严重的哮喘症状[16]; Lyn的异常表达也与肝脏炎症程度显著相关[17,18]。此外,Lyn与一些疾病治疗的耐药性相关,如高表达Lyn的慢性髓性白血病患者对伊马替尼耐药[19,20];Lyn活化突变体在雌激素受体阳性的乳腺癌患者抗雌激素治疗耐药[21]。而对比上皮样癌细胞,Lyn在间充质乳腺癌细胞系中过表达,且其过表达促进肿瘤细胞的侵袭,提示Lyn有可能提供一个针对肿瘤细胞上皮- 间质转化( EMT) 治疗的机遇,然而其具体的作用机制有待进一步的研究[22]。

本实验提取人Hela细胞总RNA,并经逆转录PCR体外扩增出Lyn的基因,并以质粒pc DNA3. 1( - ) 为载体构建重组质粒转染人HEK 293T细胞表达蛋白。Western Blot分析重组质粒的细胞裂解液,可以检测到与人Lyn蛋白相对分子量大小—致的59k Da蛋白,并使用组氨酸标签海狸磁珠进行纯化得到融合蛋白His/Myc - Lyn,并且用CCK - 8 法检测发现细胞的增殖能力受到明显抑制( P < 0. 01) 。本研究中Lyn基因通过表达载体的作用转染HEK293T细胞,能成功进行外源性真核表达。此外,外源性真核表达特异性强,具有翻译后加工修饰功能,使其结构、糖基化方式更接近天然蛋白且生物活性稳定。本实验下一步拟筛选出Lyn稳定表达株,为进一步研究Lyn的生物学功能和作用机制提供实验基础。

摘要：[目的]构建含人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的载体并进行真核表达、纯化和研究其对细胞增殖的影响。[方法]提取人Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法获得Lyn基因并克隆至pcDNA3.1(-)载体。经双酶切、PCR和测序方法鉴定后,将重组质粒瞬时转染HEK 293T细胞表达目的蛋白,应用组氨酸标签镍离子螯合磁珠纯化融合蛋白,通过Western Blot检测蛋白的表达及纯化,并用CCK-8法检测过表达Lyn后细胞增殖能力的变化。[结果]成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Lyn并进行瞬时表达和蛋白纯化,CCK-8法检测过表达Lyn的HEK 293T细胞的增殖能力显著性下降(P<0.01)。[结论]Lyn在HEK 293T细胞中成功瞬时表达及纯化,并可以使细胞的增殖能力受到明显抑制,为稳定表达和深入研究其生物学功能及作用机制奠定基础。

酪氨酸酶抑制剂的研究进展 篇4

关键词：酪氨酸酶,抑制剂,植物来源,人工合成

酪氨酸酶 (Tyrosinase) , 又称多酚氧化酶, 是一种含铜金属酶, 广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中, 并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。一般认为, 羽毛, 毛发, 眼睛, 昆虫表皮, 种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素, 都是酪氨酸酶作用的结果。酪氨酸酶在不同的生物中具有各异但却都很重要的功能。酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能, 是生物体内参与黑色素 (melanin) 合成的关键酶。酪氨酸酶催化L-酪氨酸最终形成黑色素是一个非常复杂的过程。黑色素的合成途径一般被分为两个阶段:远端步骤和近端步骤。近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化, 由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌;远端步骤包括化学反应和酶反应, 最终合成黑色素。

酪氨酸酶抑制剂作为黑色素祛除剂可以在皮肤美白化妆品具有重要作用, 因此, 可以通过酪氨酸酶的活性抑制实验来确定这些美白剂。

酪氨酸酶抑制剂的来源非常广泛, 不仅有天然产物, 而且有很多是人工合成化合物。如表1和表2所列, 这些化合物在抑制酪氨酸酶单酚酶酶活的同时也抑制了二酚酶的酶活。

1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂

众多的具有生物活性、副作用小的化合物来源于植物。如表1所示, 很多植物源的天然产物对酪氨酸酶活性具有抑制作用, 并且这些化合物的抑制能力及其抑制类型不尽相同。

1.1 高等植物来源的酪氨酸酶抑制剂

多酚类化合物, 如单宁酸, 广泛的存在于自然界中, 与花的颜色有关。一些存在于植物中的树皮、根和叶子的多酚类化合物结构复杂, 另一些存在于新鲜水果、蔬菜和茶叶中多酚类化合物结构却相对简单。酪氨酸酶强抑制剂黄酮类化合物, 如4’, 5, 7-三羟基黄酮、槲皮素、苦参酮、苦参碱F均在植物中被分离出来。Kubo等人详细研究了天然产物对酪氨酸酶抑制的构效关系。研究发现, 文献中所有的黄酮类化合物之所以能够作用酶的活性中心来抑制酶的活性, 原因是3位上自由羟基的存在。但是, 进一步的研究发现, 对于另一些不含3位羟基的黄酮类衍生物, 如4’-O-葡萄糖甙取代的四羟黄酮和7-O-葡萄糖甙取代的四羟黄酮, 仍然对酪氨酸酶具有抑制性。Badria和el Gayyar发现含α-酮基的黄酮类衍生物对酪氨酸酶也具有抑制效果, 原因可能是L-DOPA和含α-酮基的黄酮类衍生物具有相同的二羟苯基。上述的结果揭示了天然产物中新的酪氨酸酶抑制剂, 这些化合物会被进一步研究以便将来用于治疗色素沉着。另一类重要的多酚类化合物是没食子酸及其衍生物, 以D-葡萄糖多酯的结构出现, 并且这类化合物在食品工业上作为添加剂应用非常广泛。各种没食子酸衍生物从绿茶和五倍子中被分离出来, 并且其中的一些对酪氨酸酶抑制作用很强。研究发现, 没食子酸在3位和黄酮成酯后对于酪氨酸酶活性具有很大影响。有趣的是从五倍子中分离而得的1, 2, 3, 4, 6-五-没食子酰-β-D-葡萄糖 (PGG) 抑制酪氨酸酶的活力并没有因为被苯环上酯化、羟基化、甲基化而下降。

1.2 醛类及其他类别化合物

大量的醛类及其他类别化合物在高等植物中被分离。这些化合物, 诸如肉桂醛、2-烯醛类、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、茴香醛、枯茗醛、3, 4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸等均是酪氨酸酶抑制剂。醛基和巯基、氨基、羟基一样, 是一种具有生物活性的亲核基团, 因此能够和酶的伯氨基形成席夫碱反应。比较各种醛类及其结构类似物, 如肉桂酸、茴香酸、枯茗醛、枯茗酸、安息香酸对酪氨酸酶的抑制能力, 其中枯茗醛最强, 因为枯茗醛的醛基受到异丙基和甲氧基这两种供电子基团的诱导效应的影响容易在酶的活性部位形成比较稳定的席夫碱。如2-烯醛类化合物, 亲油性烷基链的长短对抑制性会产生影响。因为酪氨酸酶的活性中心是疏水性的“口袋”, 随着碳链增长, 分子的亲酯性提高, 因此与酶的结合力增强。Kubo等人研究发现, 除了2-羟基-4-甲氧基苯甲醛之外, 芳香类的醛是酪氨酸酶的非竞争性抑制剂。大部分的抑制研究是通过衡量酶的半抑制浓度 (IC50) 来确定的, 当然, IC50是一个重要的指标, 但是不是唯一的指标, 它仅在于描述二酚酶活性抑制上比较准确。因此, 研究更多的酪氨酸酶单酚酶和二酚酶抑制动力学参数必要的。

1.3 真菌来源酪氨酸酶抑制剂

除了来自于高等植物, 从真菌中也发现了很多酪氨酸酶抑制剂。M a d h o s i n g h和Sundberg从圆生蘑菇分离、纯化得到了两种酪氨酸酶抑制剂, 通过Lineweaver-Burk双倒数方程发现, 抑制剂Ia为竞争性抑制剂, 而另个抑制剂Ib为非竞争性抑制剂。从黑曲霉中分离得到的金属硫蛋白对酪氨酸酶活性中心的铜原子具有很强的螯合性, 因此对酪氨酸酶的抑制性非常强。分析其抑制机理, 可能为蛋白所带的巯基能够和醌发生亲核反应, 生成无色的硫醚。经体外研究发现, 从圆蘑菇中分离的蘑菇氨酸不仅是酪氨酸酶二酚酶的非竞争性抑制剂, 而且是单酚酶的竞争性抑制剂。

2 人工合成酪氨酸酶抑制剂

表2列出了各种通过人工合成而来的酪氨酸酶抑制剂。有一些市售药物也是酪氨酸酶抑制剂, 尽管它们的结构比较简单。

2.1 药物

抗高血压药卡托普利通过不可逆的非竞争性抑制单酚酶和竞争性的抑制二酚酶活性, 从而阻止了黑色素生成, 机理为生产的醌受到亲核进攻形成无色的产物]。对单酚酶和二酚酶的抑制为正协同性。该药会和酶形成卡托普利-铜复合物以及能够与活性部位的半胱氨酸残基形成二硫键。抗甲状腺药物甲硫咪唑对单、二酚酶均有抑制作用。和卡托普利相比较, 和酶的作用机制类似, 但是抑制类型却不同。

2.2 合成化合物

很多文献报导了诸多化合物, 如过氧化氢、羟胺、钛铁试剂和芳香族羧酸均是酪氨酸酶抑制剂。另外一些文献报导了抑制剂与酶是慢结合型抑制机理。过氧化氢抑制酪氨酸酶可以分两个阶段, 并且第一阶段相对第二阶段迅速。酶的抑制程度大小取决于过氧化氢浓度及其环境的p H, 并且在限氧条件下抑制速度比供氧条件下要快。铜螯合剂 (如环庚三烯酚酮和叠氮钠) 和底物类似物 (如L-含羞草碱、L-苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸、苯甲酸钠) 均能够阻止过氧化氢对酪氨酸酶的失活, 表明酶活性中心的铜原子对于失活至关重要。另一种酪氨酸酶抑制剂羟胺在低浓度 (33mmol/L) 时会缩短单酚酶的延滞时间, 而当浓度大于20mmol/L时, 羟胺将会抑制二酚酶酶活, 减少了黑色素的生成, 并且在限氧条件下的失活速率会加快, 原因为羟胺会和醌形成具有颜色的肟。羟胺和二酚酶作用导致了酶的抑制是由于有色产物引起的光谱变化和羟胺对酶的失活。在N-取代亚硝基胍类化合物中抑制能力最大的是N-环戊基-N-亚硝基胍, 其IC50值为0.6μmol/L, 去掉亚硝基或者羟基, 化合物对酪氨酸酶没有抑制性, 说明这两个官能团是影响酪氨酸酶活性的必须官能团, 作用机理可能为化合物对活性中心的铜原子有影响。与L-DOPA相比, 钛铁试剂是一种弱的还原剂, 当酪氨酸在羟基化时, 少量还原剂的存在能够促进反应, 钛铁试剂只延长反应的延滞时间, 而几乎不会影响L-DOPA的生成。然而, 钛铁试剂在较高浓度下还原性增加, 而延滞时间会缩短。

半胱氨酸和大量的芳香族羧酸是酪氨酸酶的抑制剂。通过抑制剂的本身属性和酶的测活途径来判断是竞争性、非竞争性、混合型、还是反竞争性类型。但是, 半胱氨酸和谷胱甘肽这类含巯基的化合物在较高浓度时, 氧气变得无关紧要, 都能够使酶失活。研究发现二甲硫醚是蘑菇酪氨酸酶的竞争性慢结合抑制剂, 是研究的第一个挥发性的酪氨酸酶抑制剂。二甲硫醚在植物组织中有一定的生理作用, 高浓度的二甲硫醚会抑制酪氨酸酶的表达, 因此可以抑制植物的褐变。

参考文献

[1]陈清西, 宋康康.酪氨酸酶的研究进展[J], 厦门大学学报:自然科学版, 2006, 45 (5) :731-737.

[2]李韶勇, 孙命, 曲娜, 等.黑色素的合成及其常见抑制剂的作用机理, 天津师范大学学报[J], 2002, 22 (1) :17-21.