细胞分离与提纯（精选六篇）
细胞分离与提纯 篇1
1 试验部分
1.1 原料及设备
1) 原料组成
试验所用原料 (混合油) 主要是本公司异丙醇装置脱醚塔顶和脱重塔顶等馏分的混合物, 其主要组成见表1。
2) 主要试验设备
①萃取塔:根据试验要求组装, 包括搅拌器、恒温水浴、分液漏斗等;
②闪蒸设备:根据试验要求组装, 包括加热套、真空泵、三口瓶等;
③精馏塔:天津优展科技有限公司生产, 塔高约2 m, 直径35 mm, 内装不锈钢三角填料, 理论塔板数约为50块, 通过控制回流比来控制采出速度。
1.2 工艺流程
称取一定量的混合油, 加入到三口瓶中, 然后按一定比例加入萃取剂。连接好萃取塔, 打开搅拌机, 边搅拌边加热升温。在设定温度下, 抽提一定时间后, 将剂料混合均匀, 然后静置分层。取抽提液加入到闪蒸釜中进行闪蒸, 得到粗醇。用粗醇作原料, 经过精馏塔精馏, 收集一定温度范围内的组分进行分析, 直到得到合格产品。
2 结果与讨论
2.1 萃取剂的选择
在原料混合油中除了含有目的组分异丙醇外, 还含有大量的异丙醚, 所以, 很难用简单的精馏工艺从混合油中分离得到高纯度的异丙醇。因此, 根据试验要求, 应首先选取对醇易溶而对醚难溶的溶剂作为萃取剂将混合油中的异丙醇萃取出来, 再进一步精馏得到合格的产品。经查阅资料[4], 比较合适的萃取剂有甘油、乙二醇、三乙醇胺。选择萃取温度为45℃, 剂料质量比为1∶1, 萃取时间为2 h, 分别用甘油、乙二醇、三乙醇胺3种溶剂进行萃取试验。对萃取液进行闪蒸, 得到粗醇, 对粗醇分析结果见表2。
从表2看出, 在相同的操作条件下, 甘油对异丙醇的萃取效果明显好于乙二醇和三乙醇胺, 并且甘油无毒, 无味, 性质稳定, 所以选择甘油为该试验的萃取剂。
2.2 萃取正交试验
为了准确地找出萃取过程的较佳工艺条件, 设计了一组三因素三水平的正交试验, 分别考察了不同剂料质量比、萃取温度、萃取时间对萃取结果的影响。萃取结束后取甘油层进行闪蒸, 其闪蒸条件为:真空度660 mmHg, 顶温小于60℃, 釜温小于120℃, 闪蒸后得粗醇, 进行分析。正交试验结果见表3。
注:表中的剂料质量比是指萃取剂甘油与原料投入量的质量比。
从表3看出, 在萃取过程中, 剂料质量比为试验的主要影响因素, 其次是萃取温度。综合各试验结果及试验目的, 初步确定试验的较佳工艺条件为:剂料质量比为1∶2, 萃取温度为30℃, 萃取时间为2 h。
2.3 验证试验
为了证实正交试验所得到的较佳工艺条件的准确性和重复性, 利用以上较佳工艺条件做了3次重复试验, 试验结果见表4。
由表4看出, 试验的重复性良好, 所得样品中异丙醇质量分数大于90%, 可以作为进一步精馏试验的原料。
2.4 粗醇精馏试验
利用正交试验所得的较佳工艺条件对混合油进行萃取、闪蒸, 收集粗醇。经分析, 其组成为:丙酮质量分数为3.05%, 异丙醇质量分数为93.28%, 异丙醚质量分数为3.15%, 其它组分质量分数为0.52%。用收集到的粗醇为原料进行常压精馏, 通过调节回流比来控制采出速度, 精馏试验结果见表5。
注:表中投料量指原料粗醇的投入量;样品质量指精馏过程中采集的目的产品 (异丙醇) 的质量;收率指异丙醇在精馏过程中的精馏收率, 其计算方法为:收率= (样品质量×样品中异丙醇的质量分数) / (投料量×原料中异丙醇的质量分数) 。
从表5看出, 回流比越大, 精馏效果越好, 精馏收率越高。如果回流比太小, 会造成前馏分中的丙酮和异丙醚分离不彻底, 所得目的产品不但量少, 而且纯度相对较低, 从而导致精馏收率随之降低。综合各相关因素及试验结果可知, 将回流比控制在5∶1、采出温度控制在82℃即可满足试验要求, 即所得样品中异丙醇质量分数大于99.5%。
3 结论
1) 用混合油作原料, 通过萃取、闪蒸、精馏的工艺过程可以得到高纯度 (纯度大于99.5%) 的异丙醇产品;
2 ) 通过试验确定了萃取过程中较适合的萃取剂是甘油;
3) 通过正交试验确定了萃取试验的较佳工艺条件为:剂料质量比为1∶2;萃取温度为30℃;萃取时间为2 h。在此较佳工艺条件下做了3次重复试验, 结果显示, 试验的重复性良好, 所得较佳工艺条件适用性较好;
4 ) 用试验所得的粗醇为原料进行精馏试验, 试验结果比较理想, 所得样品纯度大于99.5%, 精馏收率大于80%, 并确定了精馏试验的较佳工艺条件:回流比为5∶1;采出温度为82℃。
摘要：介绍了用混合油作原料, 通过萃取、闪蒸、精馏等工艺过程, 从混合油中分离出高纯度 (纯度大于99.5%) 的异丙醇产品。试验分别考察了不同萃取剂、温度、时间、剂料质量比对萃取试验的影响, 结果表明, 以甘油作为萃取剂效果最好;剂料质量比对异丙醇的纯度影响最大, 其次是萃取时的温度, 而萃取时间对异丙醇的纯度影响最小。通过试验确定了较佳工艺条件, 萃取试验的较佳工艺条件为:剂料质量比为1∶2;萃取温度为30℃;萃取时间为2 h。精馏试验的较佳工艺条件:回流比为5∶1;采出温度为82℃。
关键词：异丙醇,混合油,萃取,精馏
参考文献
[1]徐克勋.精细有机化工原料及中间体手册[M].北京:化学工业出版社, 1998.
[2]时钧.化学工程手册:上卷[M].第二版.北京:化学工业出版社, 1994.
[3]郭生鲁.化学工程师技术全书:上册[M].北京:化学工业出版社, 1996.
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量 篇2
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
12级临本二班 吕梦月 许力飞
王雅琦 王明华 马翔 张宇 王帅
实验目的：乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量 实验原理：
分离：加蛋白质抑制剂：竞争性或非竞争性抑制蛋白酶活性；防止蛋白酶分解；除核酸：利用核酸和蛋白质在链霉素磷酸酶中溶解度不同除去核酸；去盐 ：超滤液筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过度介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤液膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。等电点测定法的原理：在等电点时蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子静电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互作用之间的作用减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
提纯：醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
鉴定：乙醇脱氢酶可将乙醇分解生成乙醛
定量：SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：1.在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS(阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。3.蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验试剂与器材：
器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐 缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
实验步骤：
分离：1.细胞破碎：将10g肝组织用剪刀剪碎，放入研钵中,加入0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液4ml研磨成糊状，再加2ml0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液,搅匀，然后将所得的物质过滤，取滤液。2.添加蛋白质抑制剂：在盛有研磨液的试管中加入5ml磷酰胺素，震荡40度水浴中保温30min。3.除核酸：逐滴加入1%~2%的链霉素硫酸盐，直至沉淀不再产生。进行过滤除去沉淀。4.盐析：逐滴加入硫酸铵溶液直至蛋白质不再沉淀。进行过滤取其沉淀部分，并加入适量磷酸盐缓冲液直至蛋白形成6ml糊状物。5.去盐：将上述溶液放入超滤装置中，使蛋白质和小分子物质分离开，将大分子物质分离开并加入一定量磷酸盐缓冲液直至糊状物形成6ml。6.等电点沉淀法：在上述溶液中加入一定量0.02mol/L盐酸边加入边搅拌，一边用PH剂测量使其PH值调至5.4，然后倒置离心机中6000r/min离心15分钟，倒掉上清液，再在此溶液中加入6ml去离子水，震荡使下部的沉淀重新溶解，并以0.1mol/mL的氢氧化钠将其PH值调至8.6.重复进行两次。
提纯：醋酸纤维膜电泳：1电泳槽与薄膜的制备（1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择：用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s—30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。（2）电泳槽的准备：根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。
2、点样用钝头镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液，无光泽面向上平放在点样板上，点样时用点样器沾少许经分离的肝脏研磨液，再将点样器轻轻印在点样区内，样品线长度一般为1.5cm，宽度一般不超过3mm.使经分离的肝脏研磨液完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线，用同样的方法对标准乙醇脱氢酶溶液进行点样。
3、电泳 用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。如图1-2-9所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。通电10min—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50min—60min。电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。
4、染色与漂洗用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5％氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。凝胶层析法：1.凝胶准备 称取5g交联葡聚糖G-25,倾入锥形瓶中,加蒸馏水约60ml溶胀,搅动后静置.待凝胶沉积后,用倾注法除去浮于表面的细粒,重复3次.将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜,以达平衡.2.装柱 取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支,垂直装好.加入缓冲液,打开出口,将气泡赶出,关闭出口.然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高,将 2
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内,再打开出口,使液体流出,继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液,柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止.床面上覆盖3ml缓冲液,关闭出口,在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸,使层析柱稳定5～10min后,接储液瓶,打开出口,用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡,最后关闭出口.3..上样,洗脱 打开平衡好的层析柱出口,使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口.吸混合物样品0.5ml左右,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品,切勿搅动床面.然后打开出口,使样品进入床内,直至床面重新露出.同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小,而样品又完全进入床内),当少量洗脱液将流入床面时,加入多量的洗脱液,但注意切勿搅动床面凝胶,连接储液瓶进行洗脱.4.分部收集 根据电泳方法进行的结果可得乙醇脱氢酶为第N条带，用自动部分收集器,以5滴/min,5min/管的速度进行收集.并且观察柱上的色带,待第N柱液体流下时,再继续收集两管透明的洗脱液作为空白,关闭出口.即可收集到提纯后的乙醇脱氢酶。再进行醋酸纤维膜电泳进行一遍看看是否纯净，若不纯净则重复进行凝胶交换柱层析法进行提纯。
鉴定：将提纯后的乙醇脱氢酶中放入一定量酒精，并加入氧化亚铜并加热，观察是否有砖红色沉淀。
定量：1.安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意事项：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
2.配胶：根据待测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶和浓缩胶浓度，按下表配制：
3.制备凝胶板： ①分离胶制备： 按表配制12%分离胶。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液。混匀后用注射器抽取3.2~3.5ml凝胶液，加至长、短玻璃板间的缝隙内(立即清洗注射器及针头)。再用滴管取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入约3~4mm高，以进行水封。30~60min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。②浓缩胶的制备：按表配制3%浓缩胶(待分离胶聚合后再加AP/TEMED)，混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合。
待凝胶凝固后，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将Tris-Gly电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。4.样品处理及加样 蛋白质标样及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/ml，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用(处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合)。一般加样体积为10~15l。如样品较稀可适量增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部(双手操作，避免伤及凝胶)，待所有样品槽内都加完样品后即可开始电泳。5.电泳将直流稳压电泳仪开关打开，将电流调至10~20mA(稳流)开始电泳。待蓝色染料(溴
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
酚蓝)迁移至距凝胶底部约1cm时关闭电源。6.染色及脱色取出玻璃板，先用注射器取水从两侧小心冲洗使之松动，再用取胶板轻轻将短玻璃板撬开移去(必要时同时用水冲洗)，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。7.相对分子量计算用直尺分别量取各蛋白质条带中心以及溴酚蓝条带中心距分离胶顶端的距离，按下式计算：相对迁移率 = 样品迁移距离(cm)/ 染料迁移距离(cm)以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
实验结果：
由此次实验可推理的，将乙醇脱氢酶提纯纯净，则可得其可乙醇进行脱氢生成醛，且可得此物质的相对分子质量为141000.实验讨论：
1.并非所有蛋白质都能用此法测定其分子量。已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的，包括电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1本身带有大量正电荷，尽管结合有正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响：其分子量是21,000，但用本法测定的结果却是35,000。因此有必要至少用两种方法来测定未知样品的分子量，以便互相验证。2.有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，本法测定的只是其亚基或单条肽链的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，以便与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。3.此次实验为推理实验，则不知是否纯正，所以要进行检测，而检测的方法是醋酸纤维蛋白膜进行检测即可知道含有几种蛋白质，用标准液进行对比就可知道乙醇脱氢酶的排列顺序是什么，则就知道在凝胶交换柱层析法的分离顺序，如若分离不彻底即要反复进行。就可分离出较纯正的乙醇脱氢酶。然后进行检测其活性和相对分子质量。
注意事项：
1进行研磨操作时，研钵应放在不易滑动的物体上，研杵应保持垂直。研钵中盛放固体的量不得超过其容积的1／3。洗涤研钵时，应先用水冲洗，耐酸腐蚀的研钵可用稀盐酸洗涤。研钵上附着难洗涤的物质时，可向其中放入少量食盐，研磨后再进行洗涤。2.加入链霉素磷酸盐时要适量，不要大量一次加入。3.装柱后要检查柱床是否均匀,若有气泡或分层的界面时,需要重新装柱.4.流速不可太快,否则分子小的物质来不及扩散,随分子大的物质一起被洗脱下来,达不到分离目的.附：本次实验思路
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
原料选取：饥饿24小时后的肝脏
↓
分离：细胞破碎（捣碎）→添加蛋白质抑制剂（丝氨酸蛋白质抑制剂）→除核酸（沉淀法
1％-2％的链霉素硫酸盐）→盐析（硫酸铵）→去盐（超滤）→等电点沉淀法（PI=5.4-5.8）↓
提纯：检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净看乙醇脱氢酶的带的顺序、凝胶交换柱层析法提纯、检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净再进行提纯
↓
鉴定：加入乙醇分解鉴定
↓
定量：SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
实验清单
实验试剂与器材：器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐 缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
细胞分离与提纯 篇3
关键词：活动单；分离提纯；教学设计；中学化学教学
文章编号：1005－6629(2012)2－0032－02 中图分类号：G633.8 文献标识码：B
1、学情分析
很多老师都认为“硝酸钾与氯化钠的分离提纯”在初中化学教学中已解决，其实，根据考试说明，结合近几年江苏高考试题，会发现学生初中已掌握的内容，不论是广度还是深度，均不能满足高考的需要。同时，时间跨度大，学生已遗忘。
在江苏省不论是采用人教版的教学区，还是采用苏教版的教学区，在高三年级几乎都放弃《实验化学》而改选《物质结构与性质》，因为后者虽难教但易考。就是把《实验化学》中的相关内容进行讲解，能真正领悟除杂原理的学生也较少，大部分学生流于形式，只是“照方抓药”把实验重复了一遍，效果甚微。
4、教学反思
4.1 从教学设计看教学效果
我们把硝酸钾与氯化钠的分离提纯问题设计成两道计算题，让学生根据定量计算的结果，经过理性思考，设计出定性实验方案，从而感悟其除杂方法。这不是偏重于知识结论的记忆，而是重视对知识产生过程的研究，显然符合新课程所倡导的三维目标之一“过程与方法”的要求。
从学生角度看，气氛热烈，思维活跃，甚至有人还提出了诸如以下的问题：在两实验的洗涤步骤后，是否可加入“检验”步骤，以确认杂质是否除尽；在KNO3的提纯实验中，是否可把“加水溶解、加热浓缩”合并为“只用适量热水直接配成100℃KNO3饱和溶液”。
从课堂反馈看，几乎每个学生都已体会到结晶的原理，就是根据固体混合物中各组分溶解度随温度变化的不同，先配成溶液，再通过加热、浓缩、降温，使溶解度变小或大量蒸发溶剂这两个途径，让溶质从溶液中析出晶体。
4.2 从教学模式看教师、学生角色的转变
学生活动单模式，有着简约的操作程序，清晰的教学流程。教师课前精心准备活动单。课上，教师不再仅仅是知识的传授者，更是学生学习的组织者、引导者、评价者。教师不再需要慷慨陈词的讲述、井井有条的总结。轻松驾驭课堂的目标得以实现。学生不再是被动接受知识的容器，不再需要机械记忆应付提问，痛苦回忆应付考试。而是各项活动的参与者、合作者、竞争者。
“物质的分离与提纯”教学策略设计 篇4
“物质的分离与提纯”是苏教版必修1第二单元“研究物质的实验方法”中的一节内容, 主要是让学生掌握物质分离、提纯的常见方法和选择分离、提纯方法的依据, 教学的关键在于如何能够让学生运用所学方法去解决实际的问题。同时, 本节课教学内容的实践性较强, 所以, 创设激发学生思维的学习情境, 提供学生自我实践的机会就显得十分重要。
具体设计时应注重以下几方面。
一、从学生的学习经验出发, 创设问题情境
提出问题:实验室中用KClO3在MnO2催化下受热分解制取O2。从反应后的KCl和MnO2的混合物中分离回收这两种物质, 需要哪些分离方法?请简述实验方案。
从学生学习经验中选取相关素材创设问题情境, 更有利于激发学生对知识的探索, 推动学生去积极思维。
二、设计系列问题, 循序渐进, 引导学生深入理解所学知识
在学生已初步掌握课时内容后, 设计一组问题, 纵向深入, 让学生在讨论交流中加深对所学知识的理解。所预设的问题不宜过细, 问题的关节不宜过于显露, 这样不利于暴露学生的思维轨迹, 不利于学生的探究, 也就没有好的课堂生成。问题组如下:
(1) 实验室中用KClO3在MnO2催化下受热分解制取O2。从反应后的KCl和MnO2的混合物中分离回收这两种物质, 需要哪些分离方法?请简述实验方案。
(2) 现有KCl和KNO3的固体混合物50g, 其中KCl的质量分数为10%, 请设计实验方案提纯KNO3。
(3) 混合物的性质与分离方法之间有什么关系?
(4) 如何分离溴水中的溴和水?
(5) 已知Mg (OH) 2难溶于水, BaSO4既难溶于水又难溶于酸, BaCO3难溶于水, 但可溶于盐酸。现有含Na2SO4、MgCl2和泥沙的粗食盐, 请设计实验方案, 由粗食盐提纯NaCl。
三、渗透“总结—归纳—应用”等重要学习方法
先从问题 (1) 出发, 帮助学生复习过滤和蒸发的实验操作, 同时让学生理解方法选择的依据。再通过问题 (2) 让学生分析当MnO2换成KNO3时能否再使用过滤的方法, 如果不行又用什么方法呢?在前面知识的铺垫下, 通过问题 (3) 来引导学生总结解决问题的思路。而问题 (4) 则让学生利用总结的思路来解决问题, 探究新的分离方法。问题 (5) 是让学生综合运用所学知识解决问题。
四、教师适度介入, 培养学生不断进取、乐于协作的科学精神
细胞分离与提纯 篇5
产酸克雷伯氏菌氢酶分离提纯与特性的初步研究
采用硫酸铵沉淀和柱层析 (DEAE-Sepharose F.F., Sephacryl S-200, TSK-DEAE)初步分离纯化了产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HP1可溶性氢酶,研究了温度、pH值、电子载体等对氢酶催化放氢活性的`影响.研究表明,可溶性氢酶催化放氢的最适温度为30℃,催化放氢的最适pH值为7.5,甲基紫晶(MV)是氢酶催化放氢的最适人工电子载体,氧对氢酶催化活性有较大的抑制作用.
作 者：徐云玲 龙传南 徐惠娟 邬小兵 张凤章 XU Yun-ling LONG Chuan-nan XU Hui-juan WU Xiao-bing ZHANG Feng-zhang 作者单位：厦门大学生命科学学院,厦门大学生物能源中心,福建,厦门,361005刊 名：厦门大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：45(5)分类号：Q936关键词：产酸克雷伯氏菌 可溶性氢酶 分离纯化 催化放氢
细胞分离与提纯 篇6
“物质的分离与提纯”是高中化学教学体系中的重要内容, 对于培养学生的实验意识、科学态度、动手能力、学习习惯和让学生初步领会科学研究方法等方面均具有重要意义.就教学目标而言, 其显性目标是使学生初步学会物质的分离和提纯的实验技能, 但更重要的是要完成体验科学探究过程、学习运用以实验为基础的实证研究方法、初步认识实验方案设计在化学学习和科学研究中的应用等隐性目标.在实际教学过程中, “物质的分离与提纯”贯穿整个高中化学教学体系, 在教材编排上, 主要依据学生的基本经验和知识水平发展, 兼顾教学模块特点和学生学习心理特点, 有侧重的依次有序的呈现.从具体表现形式看, 针对教学要求, 主要有“活动与探究”、“问题解决”、“拓展视野”、“交流与讨论”、“整理与归纳”等.这些特点反映在认知过程中, 往往会给学生带来以下的认知障碍:学生原有的生活和实践操作经验的缺乏导致概念模糊, 进而导致不能有效辨析, 出现判断错误;物质的分离与提纯方法的多样性与学生知识体系逻辑组织方法及能力的不足之间的矛盾, 造成解决问题时思路混乱;教学过程中只关注阶段性结果, 忽视整体的系统的评价习惯的培养, 阻碍学科思想的形成.因此, 尽管“物质的分离与提纯”中的基本原理容易理解, 但在较高层次的综合应用中, 学生往往缺乏头绪, 无法快速准确地作出判断.避免这些问题的出现需要在教学过程中系统地关注学生的知识经验的迁移和重组, 培养学生的认知策略.在现代学习理论中, 认知策略是一种“控制过程”, 是学生赖以选择和调整他们的注意、学习、记忆和思维的内部过程[1].加涅 (R.Gagne, 1985) 认为有两种基本的认知策略, 即学习的策略和思考的策略.学习的认知策略是一种集中注意、组织信息、细化内容、熟悉使用和检索知识的智慧策略;思考的认知策略是一种导致发现、发明或创造性的理智技能.[2]伴随着高中化学教学中“物质的分离与提纯”基本方法的逐渐完善, 教师有必要指导学生循序渐进由低层次到中层次, 最后到高层次形成认知策略, 关注学生方法和能力螺旋上升的学习过程, 帮助学生形成化学学科思想.
二、基于认知策略的教学实践
1.概念的辨析——内涵与外延
从概念的内涵看, 物质的分离和提纯有不同的侧重.物质的分离是指将几种物质经过处理、分开后, 再恢复到各自原来的纯净状态, 强调的是几种物质的完整性和纯净性.物质的提纯是指将某物质中混有的杂质除去, 强调的是主体物质纯净性.原则上, 在分离和提纯时, 不能引入新的杂质, 即排他性.从概念的外延看, 只要依据物质性质 (特别是物理性质) 的差异进行有效分离和提纯即可.高中化学中常用的分离、提纯方法有:过滤、 (减压/常压) 抽滤、蒸发、结晶、分液、萃取、液化、蒸 (分) 馏、洗气、升华、加热、渗析、盐析、 (纸) 层析、交换吸附以及一些特殊方法, 必要时也可以利用化学方法, 包括吸收法、转化法、离子交换法、电解法、再生法等.
结合学生的经验和知识水平, 在教学的初始阶段, 学习上宜采用低层次认知策略.除了需要明确各种方法的概念和适用对象的特性, 更重要的是通过实例操作, 体验各种方法的异同, 为知识积累和保持信息进行不同形式的有意义重复.将抽象的概念落实到有实验目的的实验操作中, 可以将基本概念和方法内化为长期记忆.实践证明, 尽管物质的分离与提纯知识内容相对分散, 时间跨度大, 但这种建立在学生亲身体验基础上的必要的低层次认知策略, 对于促进理解和记忆是持久有效的.因此, 除了有意识记、及时复习、分散复习等常规手段, 结合化学学科的特点, 实验落实程度和学生的参与程度决定了学生能否用低层次认知策略区分不同的分离和提纯方法.
2.评价与应用
不同于低层次认知策略, 中层次认知策略是一种精细加工策略.精细加工策略强调将新学材料与头脑中已有知识联系起来从而增加新信息的意义的深层加工策略.因此, 激发探究兴趣, 引导学生进行发散思维是非常必要的, 同时, 有意识有计划地设计开放性问题, 深入分析, 建立明确的评价体系, 适时收敛思维, 可以对“物质的分离与提纯”的方法达到精细加工的目的, 进而在不同的知识背景下增加新信息的深层意义, 巩固已有知识, 拓展新知识, 增强认知质量.
应用中层次认知策略解决“物质的分离与提纯”问题, 举隅如下:
问题1:你准备如何设计实验, 区分铜铁混合物中的两种金属?并说明设计理由.
问题设计思路:问题设计上预留一定的发散空间, 对“铜铁混合物”没有加以特别明确的描述, 学生必须联系实际进行分析.就实际教学情况而言, 针对“铜铁混合粉末”、“铜片和铁片混合物”、“铜铁合金”等可能出现的物质状态, 学生思维活跃, 思路清晰巧妙, 现摘录几例.
问题2:尝试通过不同途径, 获取相关知识, 并设计实验, 获取碘水中的碘.
问题设计思路:纵观不同版本的高中化学教材, 对萃取这一方法从原理到实验装置仪器再到具体操作均予以详细介绍.利用两种溶剂对被萃取物的溶解性质及两种溶剂互不相溶解的特点进行萃取, 但萃取仅是提纯物质必要的步骤——富集, 并非就是提纯物质的完整过程.所以, 作为一个有挑战性的探究小课题, “获取碘水中的碘”的最终目标是要求学生获得纯净的碘, 可以说是一个集文献查找整理、方案设计和实践操作相结合的合作学习型任务.学生最后通过网络搜索、查阅文献和咨询教师等途径获得了科学合理的解决方案.一般地, 在萃取后要进行“反萃取”——使被萃取的目标物I2从一种溶剂转入另一种溶剂.常用的方法是:将少量NaOH溶液加入CCl4—I2萃取液中, 振荡, 通过3I2+6OH- = 5I-+IO3-+3H2O, 碘以I-和IO3-的形式进入水层, 且含碘物质的浓度较原先大幅增加, 分离后, 再对水层进行酸化得晶体碘.需要注意的是, 不能用蒸馏的方法来分离CCl4层中的I2, 因受热时CCl4将挥发, 同时I2将升华.这个方案既有科学的理论和经验作先导, 又有实际操作来验证, 将教材未尽之意进行了完美的诠释, 真正利用中层次认知策略对教学内容深入浅出地进行了一次精细加工.
3.学科思想的形成
如果说, 应用中层次认知策略进行“物质的分离与提纯”的精细加工是一项细致有序的小型的系统工程, 那么, 高层次认知策略——组织策略, 就是这项系统工程的整体设计思想.作为低层次认知策略和中层次认知策略的上层建筑, 高层次认知策略位于金字塔塔尖, 是解决“物质的分离与提纯”问题的核心所在.熟练运用高层次认知策略对于促成学科思想至关重要, 同时, 学科思想对于高层次认知策略的不断优化也有巨大的反作用.事实上, 学科思想的形成是一个循序渐进、螺旋上升的过程, 是一个通过知识不断积淀, 技能逐渐熟练, 思维不断推进的系统优化工程.不能指望短期内通过知识堆积的方法获得真正的掌握, 需要培养良好的认知习惯, 有意识地利用高层次认知策略解决实际问题, 使思维得到升华, 最终内化为个人化的学科思想.
问题3:自行设计资料卡片, 分类整理高中化学中常用的分离和提纯方法.
问题设计思路:分类整理是通过比较分析、细化内容, 重新审视和组织信息, 使习得知识螺旋式上升, 不断提高概括能力, 实现思维由具体到抽象的转化.自行设计资料卡片是利用知识的自组织性进行的一次有益的尝试, 以下内容摘自某学生的资料卡片 (部分) .
都是固—液分离方法, 利用分离对象在外界条件改变前后的存在形式的变化而进行分离 (主要利用溶质的物理性质) .
问题4:硫酸亚铁铵是一种重要的工业原料.请利用工业废铁屑和实验室中的药品及仪器, 结合教材提供的硫酸铵 、水合硫酸亚铁、硫酸亚铁铵的物理性质、相关数据和相应的化学反应, 设计实验并进行制备.
问题设计思路:物质制备与合成实验过程中要考虑的实际问题较多, 综合性强, 难度较大.实验过程中, 应引导学生注意控制反应条件, 以减少副产物的生成, 从而提高原料的利用率.教学的核心是学科思想必须渗透在过程方法的教育中, 使学生在真正明确实验目的的基础上, 统筹设计实验方案, 集思广益, 关注细节, 不断优化实验方案并付诸实践, 使学生体验合成过程中的艰辛和成功的喜悦[3], 增强学生对化学实验的认识和兴趣, 增进学生对化学科学的好感.以下为学生设计的实验思路, 非常接近于工业生产实际.
三、结论与反思
在不同层次的认知策略指导下, 通过对物质的分离和提纯及提纯物质的一般方法的实验探索、评价、总结、运用, 可以由浅入深地培养学生综合抽象的逻辑思维能力、语言表达能力、实验设计和评价能力, 逐步形成特殊到一般, 再到特殊的科学方法, 形成交互促进的教学模式.
新课程理念指导下的高中化学教学, 一改以往教学中单向的机械的知识传播方式, 在教材编制上也体现出问题中心和认知中心的特点, 因此, 同一知识内容也往往分散在不同的教学进程中.“物质的分离与提纯”很明显地体现了这一变化, 建立在不同层次认知策略上的教学模式, 关注个体的历史的经验迁移和重组, 促进认知策略的螺旋式上升, 最终能形成动态的、不断优化的学科知识体系.
摘要：作为课程实施的基本途径, 教学模式处于在教学理论和教学实践的中介地位.努力探索新课程实施中的学科教学模式是课程改革的重中之重.基于高中化学教学中不同层次的认知策略, 依托高中化学教学中的重要内容——物质的分离与提纯, 提出“关注经验的迁移和重组, 促进认知策略的螺旋式上升”的教学模式, 进行积极的探索与实践.
关键词：物质分离与提纯,认知策略,螺旋式上升,教学模式
参考文献
[1]R.M.加涅等.当代心理科学名著译丛教学设计原理[M].华东师范大学出版社, 1999.66.
[2]章伟民.教学设计基础[M].电子工业出版社, 1998.224.
