神经细胞因子（精选十篇）
神经细胞因子 篇1
关键词：BDNF,NSCs,脑源性神经生长因子,神经干细胞,增殖,分化
1 神经干细胞与脑源性神经生长因子的历史发展
干细胞可细化为胚胎干细胞、胎儿组织干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体组织干细胞等,神经干细胞属于成体组织干细胞的一种。
神经干细胞可以再分为内源性和外源性两大类,内源性没有外源性带来的免疫排斥、伦理学道德问题,适用于临床研究,是今后的热点研究方向。内源性干细胞来源于动物自身,非外界导入的神经干细胞都可以称为内源性神经干细胞。
1982年,脑源性神经生长因子(BDNF)被从猪脑中分离出来。1992年,Reynolds等在其研究中,通过细胞诱导从成年小鼠脑纹状体中分离的表皮生长因子,并在体外增殖,发现增殖细胞最初表达nestin(神经上皮干细胞中间丝蛋白,nestin是神经干细胞的特异性表达产物),最终确定成年小鼠纹状体的细胞具有分化成神经元和星形胶质细胞的能力。随后正式提出了神经干细胞的概念,从而打破了认为神经细胞不能再生的传统理论[1]。近年研究表明,BDNF可以维持神经元的存活,提高其活性,减少损伤后感觉神经元的死亡,并促进神经干细胞向神经元的分化[2]。1998年埃里克森等[3]首先用免疫银光标记法,发现成人大脑海马及侧脑室区具有产生神经元的能力。2000年Gage将神经干细胞的特性总结为:可生成神经组织,具有自我更新能力,可通过细胞分裂产生新细胞[4]。近年来大量实验结果已经证明,成年哺乳动物(包括人类)的脑室下带、海马、嗅球、纹状体、大脑皮质等区域都存在神经干细胞,其中侧脑室下带(SVZ)和海马颗粒细胞下层(SGZ)是内源性神经干细胞存在的主要部位。2012年诺贝尔生理学奖授予在细胞核重新编程研究领域有杰出贡献的两位专家,他们的研究表明成年体细胞在诱导下也可形成其他各种细胞。
2 神经干细胞的调控机制
目前发现,神经干细胞的增殖分化主要受基因及各种生长因子、神经营养因子等的调控,并与其所处的微环境密切相关。2006年Givogfi等研究发现Notch基因是在中枢神经系统发育过程中确定神经元数量的重要调控基因,并主要作用于侧脑室下带(SVZ)[5]。2008年有学者研究发现多种细胞因子都参与到了神经干细胞的增殖和分化的过程中,这些细胞因子包括各种生长因子、促红细胞生成素、神经营养因子等[6]。目前研究热门有表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)。Tarasenko等实验结果提示人类胎儿神经干细胞有很高的可塑性,其增殖和分化依赖不同的生长因子[7]。神经干细胞还受到特定磁环境的影响,如有学者研究发现,局灶性脑缺血大鼠海马增殖的内源性神经干细胞,可分化为神经元或神经胶质细胞,而重复经颅磁刺激可促进海马内源性神经干细胞向神经元的分化[8]。
3 脑损伤对于神经干细胞的影响
脑组织受到各种损伤后,神经干细胞发挥了重要作用。于春泳等所作的研究表明,成熟大鼠脑损伤后可诱导脑室室管膜下区的神经干细胞增殖,进而表达为伤口周围的神经干细胞梯度递减反应模式,提示神经干细胞对于脑组织损伤后的修复起着重要作用[9]。Kinlin等研究认为阿尔兹海默病本身可能激活内源性神经干细胞,这种增加的神经干细胞可能会取代因为疾病本身丧失的神经元[10]。赵某等实验研究发现,局灶性脑缺血再灌注损伤后亚低温能促进内源性神经干细胞增殖,并更多地向神经细胞分化[11]。
有关脑出血后内源性神经干细胞的研究开展较少。Masuda等用胶原酶法制作大鼠基底节出血模型,发现侧脑室下带明显的神经干细胞增生,血肿周围出现神经元前体细胞。实验说明脑出血激发了内源性的神经细胞再生[12]。还有研究表明,人类脑出血可导致血肿周围组织神经细胞再生[13]。
4 脑源性神经生长因子对于神经干细胞的作用
脑源性神经营养因子(BDNF),1982年首次从猪脑中提取,是神经营养因子家族中代表性的成员之一,在中枢神经系统中,BDNF主要在神经元内合成,两个主要受体为Trk B和P75,其中以Trk B的研究最多。
脑源性神经生长因子对中枢及周围神经元的作用,一直是研究的热点,国内外学者做了很多研究。概括来说BDNF对神经元细胞有促进其增殖、分化、代谢以及支持保护营养的作用。且研究显示,脑源性神经营养因子能够促进神经干细胞向神经元方向分化[14,15],可能与内源性b HLH基因MASH—1的表达升高有关[15]。另有一项研究表明,可以通过改变Va166等位基因,从而增强BDNF的表达,进而有利于蛛网膜下腔出血的恢复[16]。杨某等研究认为,BDNF可能是通过降低损伤后NO的形成从而有利于移植的神经干细胞向神经元分化,BDNF和神经干细胞联合移植较单独神经干细胞移植对神经系统损伤有更好的治疗效果[17]。王某的实验研究证实BDNF与NSCs联合移植较单独NSCs移植对缺血缺氧性脑损失有更好的疗效[18]。
BDNF通过什么样的通路起到神经保护的作用?有研究表明,c a s p a s e-3(一种半胱氨酸蛋白)的活性对于B D N F是否起到治疗作用起到决定作用,当caspase-3的活性被抑制时,BDNF将无法起到保护治疗作用[19]。BDNF还可以通过抑制铜锌超氧化物歧化酶(Cu Zn SOD),从而起到保护神经元的作用[20]。
5 现有问题及展望
综上所述,我们可以看到神经干细胞对于损伤后的脑组织的修复、再生起着关键作用,脑源性神经生长因子对于干细胞的增殖分化起着重要作用,脑损伤时BDNF与NSC可能具有协同修复受损组织的作用[17,18]。
神经细胞因子 篇2
目的.研究恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)在体外向神经细胞诱导分化过程中神经递质分泌和神经细胞抗原表型表达情况.方法无菌条件下密度梯度法分离猴BMSCs,在体外应用神经干细胞培养液进行体外培养和诱导分化,分阶段用高效液相色谱法检测培养基中单胺类生物活性物质的含量,免疫细胞化学方法检测神经细胞抗原表型.结果高效液相检测神经干细胞培养基未测到单胺类生物活性物质,而经体外培养增殖10 d、14 d、30 d的细胞培养基可检测到去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA).Asp方差分析显示:随着BMSCs培养天数的增加,培养基中所含的NE和DA无显著性差异(P>0.05).同期细胞免疫组化检测出酪氨酸羟化酶(TH)、巢蛋白抗体(nestin)、β-微管蛋白(β-tublin)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异烯醇化酶(NSE)抗原表达.结论恒河猴BMSCs能在体外增殖,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并合成、分泌NE和DA;部分细胞表达神经干细胞、成熟神经元、胶质细胞和DA能神经元的抗原表型,提示在一定条件下,诱导分化的BMSCs经过神经干细胞阶段可向成熟神经组织细胞分化.
作 者：徐强 徐如祥 姜晓丹 潘力 陈剑荣 蔡颖谦 张世忠 XU Qiang XU Ru-xiang JIANG Xiao-dan PAN Li CHEN Jian-rong CAI Ying-qian ZHANG Shi-zhong 作者单位：徐强,潘力,XU Qiang,PAN Li(200040,上海,复旦大学华山医院神经外科)
徐如祥,姜晓丹,陈剑荣,蔡颖谦,张世忠,XU Ru-xiang,JIANG Xiao-dan,CHEN Jian-rong,CAI Ying-qian,ZHANG Shi-zhong(510282,广州,南方医科大学珠江医院神经外科)
神经细胞因子 篇3
【关键词】鼠神经生长因子；四肢神经损伤；临床疗效
【中图分类号】R714.46 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0320-02
在临床中，四肢神经损伤往往是因为交通事故与外伤等原因导致的，其临床表现为指甲粗糙，关节囊、肌肉、皮肤萎缩变性，运动、感觉、反射运动功能丧失，关节强直，肌肉逐渐萎縮以及受累肢体肌张力下降等。若四肢神经没有完全损伤，其受累肢体则会保存部分功能，且发生感觉过敏的情况。其中，四肢神经功能往往需要显微外科手术实施治疗，但是具备着时限性。本研究中主要探讨分析了应用鼠神经生长因子对四肢神经损伤患者进行治疗的临床效果，现总结如下：
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2012年11月～2014年11月收治治疗的102例四肢神经损伤患者作为研究对象，采用随机数字法把其分成治疗组与对照组，每组有51例患者，其中治疗组中，男性患者为28例，女性患者为23例，其年龄为20～60岁，平均为（31.9±3.6）岁；而对照组中，男性患者为26例，女性患者为25例，其年龄为22～62岁，平均为（32.8±4.1）岁。全部患者的基本临床资料进行比较，均不存在明显的差异，具备可比性（P>0.05）。
1.2 方法
全部患者都接受手术治疗，依照受损部位实施神经探查切口，对于伴有骨折或者开放性神经创伤患者，应该先采取彻底清创处理，再实施骨折复位内固定，同时实施神经探查；对于新鲜神经断裂患者，应该及时的进行神经外膜缝合，而神经挫伤患者应该选择神经外膜松解减压术。其中，对照组患者采用常规方法实施治疗，提供营养神经药物、改善血液循环与抗感染等治疗，且指导患者进行运动，避免发生肌肉萎缩与关节僵硬等情况；而治疗组患者在对照组的前提下，采用鼠神经生长因子实施治疗，选取18微克的鼠神经生长因子溶解在2毫升的氯化钠溶液中实施静脉肌注，每天1次，每个疗程为4个星期。
1.3 统计学方法
本研究采用SPSS15.0统计学软件对观察组患者以及对照组患者的临床数据进行分析、统计、处理，其中计数资料采取卡方检验，计量资料采用t检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
2. 结果
两组患者经过临床治疗后，其中治疗组患者中，获得优的患者为25例（49.0%），获得良的患者为23例（45.1%），其优良率为94.1%；而对照组患者中，获得优的患者为21例（41.2%），获得良的患者为18例（35.3%），其优良率为76.5%；对两组患者临床治疗效果进行比较分析，治疗组患者的临治疗效果明显的比对照组好，差异具备统计学意义（P<0.05）。详情见下表：
3. 讨论
四肢神经损伤为神经外科与骨科必须面临的，且极富挑战的一个难题。若没有及时的采取有效措施对其进行治疗，患者则会发生永久性的运动功能丧失与感觉功能丧失的情况，严重的话，患者还会出现残疾[1] 。最近几年，随着医疗水平与神经修复技术的日趋发展进步，在显微外科技术的前提下通过基因工程、细胞移植、激光与组织工程等技术，有效的使四肢神经损伤的临床修复质量得到了提升，但是由于周围神经再生特点与周围神经结构等因素，则非常容易对神经再生产生一定的影响[2] 。其中，鼠神经生长因子是由小鼠颌下腺内提取纯化的一种神经生长因子，其具备着对神经损伤恢复进行促进的作用，有效的使患者的感觉功能与运动功能得到恢复。
本组研究结果表明，治疗组患者的优良率为94.1%；而对照组患者的优良率为76.5%，对两组患者临床治疗效果进行比较分析，治疗组患者的临治疗效果明显的比对照组好，差异具备统计学意义（P<0.05）。
结语：
综上所述，术后早期应用鼠神经生长因子对四肢神经损伤患者进行治疗，其具有较好的临床效果，可以有效的使患者的感觉功能与运动功能得到恢复。
参考文献
[1] 王德胜，黄烈天，杨兴桃，蓝国湖.鼠神经生长因子局部注射治疗周围神经缺损伤的实验研究[J].海南医学，2011，34（05）： 7-10.
神经细胞因子 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠、新生24h内Wistar乳鼠, 由佳木斯大学动物实验中心提供。随机法分为5组:分别为正常组、对照组 、NT-3组、NSCs组、NSCs+ NT-3组, 24只/组。
1.2 主要试剂
人重组EGF、bFGF及NT-3 购自北京晶美生物工程有限公司;兔抗-Nestin、兔抗-NSE、山羊抗兔FITC抗体、山羊抗兔TRITC抗体、5-BrdU 、兔抗大鼠BrdU 单克隆抗体 、DAB试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒 (山羊抗兔) 均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 神经干细胞的培养及鉴定
根据Vescovi等[1]报道方法进行细胞培养。传二代的NSCs克隆球转移至0.1%多聚赖氨酸 (P-L-L) 处理过的盖玻片上, 加入适量完全培养液, 置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24h后, 采用免疫组织化学方法进行Nestin染色鉴定。
1.4 脑出血模型制备
采用Hua等[2]方法进行定位和制作脑出血模型。
1.5 移植治疗方法
在脑出血模型制备后的第3天, 行NSCs移植及给予NT-3营养因子。具体操作如下: (1) 先处理标记有BrdU的NSCs, 使细胞悬液的密度为2×107个细胞/100μL。 (2) 对于移植组用微量注射器经原骨孔垂直进针, 分别在进入5mm, 6mm和7mm后缓慢注入5μL刚制成的细胞悬液。对于NSCs+NT-3组:给予5μL含0.4ng NT-3的NSCs悬液。NSCs移植组:给予5μL已标记Brdu的NSCs悬液。NT-3组:给予5μL含0.4ng NT-3的PBS液。对照组:不移植NSCs和NT-3, 只进行三点穿刺。正常组:不移植NSCs和NT-3, 不进行三点穿刺。 (3) 术后普通饲养, 不用抗生素和免疫抑制剂。
1.6 神经行为功能学评分
在制作ICH模型前和移植后第3天, 7天, 14天, 28天, 采用Menzies量表对大鼠进行神经功能缺损评估[3]。
1.7 脑标本取材及制片
用10%水合氯醛 (按100mg/kg) 对SD大鼠行腹腔注射麻醉, 左心室快速输入生理盐水及4%多聚甲醛磷酸缓冲液 (含有DEPC) , 取脑。标本按常规给予固定、浸泡、脱水、浸蜡、包埋, 制作石蜡切片, 厚度5μm。
1.8 免疫组织化学检查
在移植后第3d、7d、14d、28d, 通过脑片的BrdU免疫组化染色和BrdU/NSE免疫荧光双标染色, 在400×显微镜下计算此区域内的免疫组化染色为阳性细胞数, 每个时间点6只动物, 每只动物每个指标取切片6张, 每张切片选择5个视野, 数出每个视野的阳性细胞后计算平均阳性细胞数。
1.9 统计学分析
利用SPSS13.0软件统计学分析, 各组数据以均数±标准差undefined表示, 两组间比较用t检验, 多组比较用方差分析。P<0.05差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠脑出血移植后神经功能缺损评估
正常组和术前各组的大鼠神经功能缺损评分均为0分。对照组在移植28d时的评分比移植3fd时明显减低 (P<0.05) ;而NT-3组、NSCs组及NSCs+NT-3组在移植14d时的评分即比移植3d时明显减低 (P<0.05) 。NT-3组和NSCs组在移植28d时的评分明显低于对照组 (P<0.05) ;而NSCs+NT-3组在移植14d时的评分即比对照组明显减低 (P<0.05) 。NSCs+NT-3组在移植28d时的评分明显低于NT-3组或NSCs组 (P<0.05) 。NT-3组与NSCs组各时间段的评分比较差异不大无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。
2.3 大鼠脑出血造模移植后免疫组化染色结果
见表2, 3。
(±s, n=6)
*与同组第3天比较P<0.05;#与对照组比较P<0.05;○与NSCS组比较P<0.05。
(±s, n=6)
*与对照组比较P<0.05;# NSCs组比较P<0. 05。
(±s, n=6)
*与对照组比较P<0.05;#与NSCS组比较P<0.05。
3 讨论
ICH是严重危害人类健康、致死致残率较高的疾病。寻找有效的治疗途径, 最大限度的改善神经功能恢复成为神经科领域关注的热点。
NSCs的发现为疾病治疗带来了光明的应用前景, 由于大脑的功能主要依赖神经元, 通过神经元分泌神经递质, 发出并传导神经信号来实现其功能, 因此研究神经干细胞定向分化调控机制, 使其向特定神经元分化, 是将NSCs应用于神经系统移植和替代治疗的关键[4]。本实验研究表明, NT-3可以促进NSCs向神经元分化, 目前对分化机制尚不清楚。
目前关于NSCs移植在大鼠体内存活、分化、迁移的机制, 可能有如下几个方面:① 在脑出血后, 有学者研究发现在脑出血早期BDNF和EGFmRNA的含量是增加的, 可能是对脑出血损伤的细胞起保护作用。② 脑出血后病灶区产生的某些细胞因子对神经干细胞的分化可能有促进作用。③ 脑出血后局部的血脑屏障发生破坏, 细胞之间的连接也受到破坏, 以及脑出血后产生的某些细胞因子对神经干细胞具有趋化作用。本试验研究中发现, 在NSCs和NT-3联合移植组、单纯NSCs移植组中可以观察到大量的NSCs及分化的神经元和胶质细胞主要存活在出血灶周围而远隔部位较少, 尤其是NSCs和NT-3联合移植组更加明显。在NSCs和NT-3联合移植组中存活的NSCs数量明显增多, 并且促进NSCs向神经元分化。这正是说明了以上的观点。
NSCs移植改善功能缺损的机制可能是移植的NSCs替代或强化了神经环路[5]。近年来试验研究发现, 向发育中或成年中枢神经系统内移植胚胎神经组织能够部分重建神经环路和改善功能[6]。学者将人神经营养素神经元立即或于2周后移植于完全性脊髓损伤后丧失运动诱发电位的大鼠后, 运动诱发电位恢复, 运动功能部分恢复, 从而说明了移植细胞可以整合神经环路[7]。移植NSCs促进大鼠运动功能恢复可能的原因有:①由于移植的NSCs分化为神经元后与宿主体内的神经元建立了新的突触联系而使得中断的纤维联系重新建立;② 移植的NSCs本身及其分化后分泌的多种神经营养因子的作用[8]。③ NSCs可能改善脑出血后脑水肿的作用。在本实验中发现, 在移植2周后的神经功能评价中NSCs和NT-3联合移植组的功能评分明显优于单纯NSCs移植组, 这可能是与神经环路重新整合和神经营养因子缺乏有关。在脑出血早期脑组织切片中还观察到移植NSCs组及NSCs和NT-3联合移植组的脑水肿明显比对照组减轻。
以上研究表明NT-3对NSCs具有促进其分化的神经元存活作用, 详细的机制尚不清楚, 有待于进一步研究。
关键词：NSCS,NT-3,移植,脑出血
参考文献
[1]Vescovi AL, Snyder EY.Establishment and properties of neuralstem cell clones:plasticity in vitro[J].Brain Pathol, 1999, 9 (3) :569-598
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神经细胞因子 篇5
研究了一类带有离散和分布时间滞后的不确定时滞细胞神经网络(DCNN)的全局渐进稳定性.应用李亚普诺夫稳定性理论,构造李亚普诺夫泛函,结合Leibniz-Newton公式,给出一个关于时滞细胞神经网络的新颖的全局渐进稳定性判据,所得出的结论依赖于时间滞后的最大值并且以线性矩阵不等式的形式给出.最后给出一个数值例子来说明所提判据的.有效性和可行性.
作 者：郗多明 何海阔 仇计清 高志峰 XI Duo-ming HE Hai-kuo QIU Ji-qing GAO Zhi-feng 作者单位：郗多明,XI Duo-ming(河北工程大学理学院,河北邯郸,056001)
何海阔,仇计清,HE Hai-kuo,QIU Ji-qing(河北科技大学理学院,河北石家庄,050018)
高志峰,GAO Zhi-feng(南京航空航天大学自动化学院,江苏南京,210016)
环境决定大脑神经细胞的质量等 篇6
有研究者特意研究了这种情况，他们将一群小老鼠分别放在三个不同的环境下饲养，一是单独将老鼠养在标准的实验室笼子里：二是将多只老鼠养在标准的实验室笼子里：最后是将多只老鼠养在装有各种玩具设备的笼子里。结果发现这三群老鼠的脑部有不同的发展结果。养在装有玩具设备的笼子里的老鼠(运动量比较多)比其他两组的老鼠具有优势：1、学习能力较佳或学习速度较快，如走迷宫；2、脑部的总质量比较重；3、脑部加速学习的激素总量增加：4、神经细胞的细胞体积较大：5、树状突的连接比较多。
原来真的是环境越丰富，神经细胞越多，神经网络越复杂。这样的话，对于儿童早期教育的环境，教育者们可就要好好下一番功夫啦。
大脑也有清洁工
银川
众所周知，人体内有一个免疫系统。这个免疫系统就是我们身体的清洁工，它能像杀毒软件一样，毫不留情地消灭身体内部一切有害物质。但是免疫系统仅限于对大脑外的身体部分起作用，对于大脑，一般认为免疫系统是不起作用的。
可是，近年来科學家们渐渐发现，这种看法是错误的。美国斯坦福大学的本·巴里斯博士发现，神经细胞也会分泌一种蛋白质。这种小分子蛋白质是免疫系统的一个重要的“补体”，它的作用就是发现入侵之敌，然后把自己附着在外来病菌的细胞表面，为免疫系统的正规军(比如巨噬细胞)竖立一个靶子。正规军一旦发现了这种蛋白，就会对目标发起进攻，直到把病菌消灭。
血液细胞变神经细胞有了新方法 篇7
这一科学突破由麦克马斯特大学干细胞和癌症研究所所长米克·巴蒂亚领衔完成。巴蒂亚小组研究发现, 可直接将成人血液细胞转变成中枢神经系统 (脑和脊髓) 的神经元, 以及外周神经系统负责疼痛、温度和瘙痒感知的神经元。这意味着, 一个人的神经系统细胞如何对刺激作出反应和响应, 将可通过他的血液来测定。
目前, 医学研究人员对疼痛形成的复杂病理及其治疗的了解还十分有限。外周神经系统由不同类型的神经组成, 如感觉压力、检测温度等。在极端情况下, 疼痛或麻木是由这些外周神经发出信号通过大脑来感知。
巴蒂亚表示, 与血液不同的是, 在使用皮肤样本或组织活检过程中, 人们无法取走患者的部分神经系统。神经系统密布全身, 无法取样开展研究。现在, 科学家们只需简单地采集血液样本, 然后就可为患者定制各种神经系统的主要细胞类型———中枢神经系统细胞以及外周神经系统细胞。
由于在临床试验中常常需要收集血样进行冷藏, 该项突破可让研究小组“坐着时光机”回溯过去一段时间的研究, 对先前调查过并已将数据存档的患者具有的疼痛或神经通路问题进行探索。
神经细胞因子 篇8
为了进一步验证NGF的促生殖作用并探索其机制, 同时建立一种更有效的卵巢GC体外培养的标记方法, 本研究采用分离和培养原代小鼠卵巢腔前颗粒细胞 (preantral granulosa cells, Pre GC) , 应用CCK-8分析和Brd U体外标记检测细胞增殖, 以探讨NGF是如何影响GC的增殖。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
NGF, RD systems公司;DMEM-F12培养液, Tryple, 胎牛血清, 双抗, GIBCO公司;BSA, Biotech BASIC INC公司;抗体, Promega公司;CCK-8, Dojindo laboratories公司;Brd U, Brd U in situ defection kitⅡ, BD Biosciences公司。
1.2 实验动物
10 d龄的健康雌性ICR小白鼠, 中国科学技术大学生命科学学院实验动物中心[许可证号:SCXK (皖) 2005-0008]。
1.3 Pre GC的原代培养
小鼠断颈处死后无菌取出双侧卵巢, 去除周围脂肪组织及卵巢被膜, 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution, PBS) 洗净卵巢上血污, 体视显微镜下用尖头镊子分离腔前卵泡, 消化膜细胞5~10 min后吸取单个腔前卵泡, 2 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 加入胰酶消化15 min, 期间吹打数次, 终止消化后离心5 min, 1 500 r/min, 去上清, 加入完全培养基制成颗粒细胞悬液, 调整细胞密度为2×105个/ml, 预接种到培养板中。
1.4 CCK-8检测细胞的增殖
将细胞悬液接种到96孔培养板, 每孔100μl, 设定NGF分别作用时间为12、24、48、72和96 h的实验组, 每个时间段都设定各自的对照组, 对照组加入普通培养基, 每组设定6个复孔。5%二氧化碳CO2, 37℃孵箱培养24 h, 细胞贴壁率达到90%, 更换含0.1%BSA的DMEM/F12培养基饥饿24 h, 加入NGF使终浓度为50 ng/ml, 继续培养各个时间段后终止培养, PBS清洗后每孔再加入10μl CCK-8溶液孵育12 h, 酶标仪检测450 nm波长的吸光值, 计算平均值。
1.5 Brd U体外标记GC增殖
将盖玻片 (1.5 cm×1.5 cm) 在酒精灯上迅速过火后小心放入24孔培养板中, 然后将单细胞悬液滴到玻片上, 40μl/滴, 然后加培养基到500μl, 设定对照组和NGF组 (50 ng/ml) , 每组3个复孔。培养24 h, 饥饿后加入NGF使终浓度为50 ng/ml继续培养。
根据细胞生长状况, 培养36 h左右适时取出爬片, 按照Brd U免疫荧光技术的步骤操作, Hoechst染核, 封片后荧光显微镜拍照, 随即计数10个高倍视野中细胞总数及Brd U阳性细胞数, 计算标记指数 (labeling index, LI, 百分数表示) 。
1.6 统计方法
所有的检测数据以均数±标准差 (±s) 表示, 使用SPSS 16.0统计分析软件进行单因素方差分析后进行组间LSD分析。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NGF对小鼠卵巢Pre GC促增殖作用
50 ng/ml的NGF作用Pre GC不同时间段后, 采用CCK-8法检测NGF对细胞增殖的作用。结果显示, 在波长450 nm时, OD值随作用时间的延长 (12~96 h) 而增加, 当NGF作用48 h时, 促增殖作用明显表现出来, 同对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 随着NGF作用时间进一步延长, 促增殖作用持续存在, 同对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图1。
2.2 Brd U的免疫荧光技术检测及LI (%)
Brd U免疫荧光技术检测显示, 经50 ng/ml NGF处理36 h后, NGF对小鼠卵巢Pre GC已经有促增殖作用, 见图2。随机计数10个高倍视野中细胞总数及Brd U阳性细胞数, 计算LI (%) , NGF组的Brd U的LI为45.03%, 明显高于对照组20.65% (P<0.01) , 见图3。
1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05
A:对照组, 只有少数细胞表达Brd U;B:NGF (50 ng/ml) 组, 表达Brd U的细胞数增多
覮与对照组比较, P<0.01;1:对照组;2:NGF 50 ng/ml组
3 讨论
颗粒细胞是卵巢的主要组成细胞, 为卵母细胞的发育提供其所需要的营养物质以及生存的微环境[4]。卵母细胞通过缝隙连接从周围的颗粒细胞中摄取各种营养因子, 使卵母细胞的代谢需要得以满足。因此, 颗粒细胞在卵母细胞生长中起着重要的营养作用[5]。而且, 颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙连接是卵母细胞生长、分裂和成熟能够正常进行的必需因素;同时, 卵母细胞对卵泡细胞功能起着中心调节作用[6]。卵母细胞分泌的生长因子对颗粒细胞和卵丘细胞的分化、增生、凋亡和泛素化起着广泛的调节作用, 说明颗粒细胞和卵母细胞之间的关系是相互依赖的[7]。颗粒细胞的增殖和分化在原始卵泡形成启动以及以后的卵泡正常发育起着至关重要的作用。因此, 颗粒细胞是否能够正常的增殖分化可作为卵泡发育成熟的标志[8]。
最开始的研究显示:NGF的生物学功能仅仅限于神经系统, 但越来越多的证据表明NGF也可以作用于其他非神经系统的组织细胞。研究表明, NGF及其受体Trk A和p75在动物的生殖系统中有表达[9]。在猪卵巢中, NGF及其受体在膜细胞和颗粒细胞中都有表达, 从而证明NGF及其受体在卵泡发育、排卵等方面都有重要的作用[10]。在金仓鼠的子宫组织中, NGF及其受体Trk A在子宫内膜上皮细胞、腺细胞及基质细胞中都有表达, 而p75只在子宫内膜上皮细胞、腺细胞中有表达[11]。对山羊的研究显示NGF及其受体Trk A与p75在输卵管壶腹部与峡部的上皮细胞与肌细胞中有表达[12]。对小鼠和人的卵巢研究也表明, NGF的过表达会导致卵巢中初级卵泡与次级卵泡数量的大幅增加, 而裸露的卵母细胞数量相对减少, 表明不正常的NGF及其受体水平的增加会造成卵巢囊状疾病[13]。
CCK-8试剂中含有WST-8, 它是一种类似于MTT的化合物, 在电子载体的作用下被细胞线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 (Formazan) 。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比, 细胞增殖越多越快, 则颜色越深;细胞毒性越大, 则颜色越浅。用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值, 可间接反映活细胞数量。与传统的MTT检测法比较, CCK-8具有使用方便, 不需要放射性同位素和有机溶剂, 检测快速, 灵敏度高, 甚至可以测定较低的细胞密度, 重复性优于MTT, 对细胞毒性小等各种优点[14]。
本实验采用CCK-8试剂盒比较了不同作用时间的NGF对体外培养的小鼠Pre GC增殖的影响, 选取10 d龄的小鼠, 获取Pre GC, 避免分化的颗粒细胞自身因素对NGF促增殖作用的影响, 并且在加入NGF前用无血清培养基饥饿培养, 减少其他因素干扰细胞增殖。实验结果证实50 ng/ml的NGF作用颗粒细胞48 h的时候, 促增殖作用非常明显地表现出来, 随着作用时间延长, 呈现一定的时效关系。虽然NGF对细胞的促增殖作用持续存在, 但过长的作用时间可能会使细胞的密度太大。因此, 判定50 ng/ml的NGF对颗粒细胞的促增殖作用最理想反应时间不能超过48 h。
Brd U作为胸腺嘧啶的类似物, 能取代胸腺嘧啶被增殖细胞利用。当细胞处于DNA合成期, 即细胞处于增殖期, Brd U被细胞特异性地摄入细胞核掺入到细胞新合成的DNA中, 只要细胞存活, 这种存留是永久的, 用抗Brd U单克隆抗体经免疫荧光技术染色后, 可特异性显示Brd U阳性标记细胞, 即可直接观察其在细胞内的掺入情况[15]。
本研究采用Brd U体外标记方法, 50 ng/ml的NGF作用颗粒细胞36 h后, 进行免疫荧光技术检测, 结果显示荧光显微镜下可见Brd U阳性标记的颗粒细胞, NGF组的阳性细胞数量明显多于对照组, 提示细胞处于增殖期。同时计算Brd U阳性标记指数LI (%) , 数据显示NGF组的Brd U标记指数明显高于对照组, 差异具有统计学意义, 这更加直观的表明NGF能够促进颗粒细胞的增殖。
可见, 在研究NGF促颗粒细胞增殖及影响因素实验中, 采用CCK-8检测和Brd U体外标记的方法是可取的, 它们是高效、便捷地标记Pre GC增殖的方法, 而且本实验结果也证实了NGF促进颗粒细胞增殖是与时间呈时效关系的。
摘要：目的 为了解神经生长因子 (NGF) 对小鼠卵巢腔前颗粒细胞促增殖情况并探索其机制, 同时建立方便灵敏、无污染和毒性小的细胞增殖检测方法。方法 用NGF刺激培养的小鼠卵巢腔前颗粒细胞, 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 实验分析, 溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brd U) 掺入标记, 免疫荧光技术检测颗粒细胞在体外培养中的增殖情况和Brd U标记指数。结果 NGF明显促进颗粒细胞增殖, 并且具有一定的时效关系。荧光显微镜下可见Brd U阳性标记的颗粒细胞, 提示细胞处于增殖期。NGF组的Brd U标记指数为45.03%, 明显高于对照组20.65% (P<0.01) 。NGF使增殖期的细胞显著增多及增殖指数明显升高。结论 该研究证实NGF能够促进颗粒细胞增殖, CCK-8分析和Brd U标记是高效、灵敏的标记腔前颗粒细胞增殖的方法, NGF促进颗粒细胞增殖与促进颗粒细胞DNA的合成有关系。
神经细胞因子 篇9
由亥姆霍兹慕尼黑中心干细胞研究所所长玛格达莱娜·格茨领导的这个研究小组在最新一期美国《公共科学图书馆·生物学》杂志上报告说, 通过研究证实, 在大脑皮层的星形胶质细胞中植入Neurogenin2转录因子可使星形胶质细胞转变为兴奋性神经元, 在同样的星形胶质细胞中植入“Dlx2”转录因子则可使其转变为抑制性神经元。
星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞, 其胞体发出的许多长而分支的突起伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间, 起支持和分隔神经细胞的作用。德国研究人员指出, 星形胶质细胞与放射状胶质细胞密切相关, 而后者则是胎胚发育过程中大多数神经元的前驱细胞。
神经细胞因子 篇10
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2006年1月至2010年12月于本院进行治疗的130例糖尿病神经病变患者为研究对象, 将其随机分为对照组 (常规治疗组) 65例和观察组 (鼠神经生长因子组) 65例。对照组的65例患者中, 男35例, 女30例, 年龄51～75岁, 平均 (56.9±4.3) 岁, 病程6.5～22.5年, 平均病程 (11.8±2.6) 年。观察组的65例患者中, 男36例, 女29例, 年龄50～75岁, 平均 (56.6±4.2) 岁, 病程6.5～23.2年, 平均 (12.0±2.4) 年。两组患者各项基本资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。
1.2 方法
对照组采用常规治疗方案进行治疗, 主要为给予患者弥可保500 μg, 维生素B1 100 mg肌内注射, 1次/d。观察组在对照组的基础上加用鼠神经生长因子进行治疗, 给予患者鼠神经生长因子20 μg肌内注射, 也为1次/d。两组患者均治疗30 d为1个疗程。后将两组患者的治疗总有效率、不良反应发生率及治疗前后运动、感觉神经传导速度进行统计及比较。
1.3 评价标准
显效:患者的自觉症状基本消失, 且肌电图传导速度恢复正常或幅度>5 m/s;有效:患者的自觉症状有较大幅度改善, 但是肌电图传导速度改善幅度<5 m/s;无效:患者的自觉症状及肌电图传导速度均无改善[1]。总有效=显效+有效。
1.4 统计学方法
将本文中统计及检测所得数据采用统计学软件包SPSS 14.0进行相应的统计学处理, 计量资料及计数资料分别采用t检验及χ2检验处理, P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者治疗总有效率、不良反应发生率比较
将两组患者的治疗总有效率及不良反应发生率进行统计及比较, 具体比较结果见表1。
由表1可见, 观察组的治疗总有效高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 而两组不良反应发生率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。
2.2 两组患者治疗前后运动、感觉神经传导速度比较
将两组患者治疗前后的正中神经运动、感觉神经传导速度进行检测统计及比较, 具体比较结果见表2。
由表2可见, 治疗前两组患者的正中神经运动、感觉神经传导速度比较, 均差异无统计学意义 (P>0.05) , 而治疗后观察组的正中神经运动、感觉神经传导速度均优于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
糖尿病神经病变是糖尿病在神经系统发生的多种病变的总称, 最常累及的有股神经、坐骨神经、正中神经、桡神经、尺神经、腓肠神经及股外侧皮神经等[2]。鼠神经生长因子可改善由己二酮和丙烯胺造成的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍, 缩短神经-肌肉动作电位潜伏期, 并提高神经-肌肉动作电位幅度[3,4]。本文中我们就鼠神经生长因子治疗糖尿病神经病变的疗效进行观察, 发现其在改善治疗总有效率的基础上并未见不良反应发生率的升高, 同时患者的运动、感觉神经传导速度也得到较大幅度的改善, 综合这些因素可以肯定其在本病治疗中的疗效及可取性。因此, 我们认为鼠神经生长因子治疗糖尿病神经病变的疗效好, 安全性高, 总体优势明显。
摘要：目的 探讨鼠神经生长因子治疗糖尿病神经病变的疗效。方法 选取2006年1月至2010年12月于本院进行治疗的130例糖尿病神经病变患者为研究对象, 将其随机分为对照组 (常规治疗组) 65例和观察组 (鼠神经生长因子组) 65例, 后将两组患者的治疗总有效率、不良反应发生率及治疗前后运动、感觉神经传导速度进行统计及比较。结果 观察组的治疗总有效高于对照组, 运动、感觉神经传导速度优于对照组, (P<0.05) , 差异有统计学意义, 而两组不良反应发生率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论 鼠神经生长因子治疗糖尿病神经病变的疗效好, 安全性高, 总体优势明显。
关键词：鼠神经生长因子,糖尿病神经病变,疗效
参考文献
[1]张玉春, 向光大, 乐岭.前列腺素E1对糖尿病周围神经病变的疗效观察.中国综合临床, 2000, 16:427-428.
[2]汤建军, 赵永波.糖尿病神经病变研究进展.中风与神经疾病杂志, 2003, 20 (6) :567.
[3]王笠, 李琳, 王达, 等.糖化血红蛋白的检测和临床应用.上海医学检验杂志, 2003, 18 (2) :119-121.
