环氧合酶抑制剂

环氧合酶抑制剂（精选五篇）

环氧合酶抑制剂篇1

关键词：结直肠腺瘤,塞来昔布,阿司匹林,预防,治疗

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 病例选择

研究对象为2007年3月-2010年8月在我院行结肠镜检查并经病理确诊为结直肠多发性腺瘤患者。纳入标准:① 病理确诊为结直肠管状腺瘤、绒毛状腺瘤或绒毛管状腺瘤, 数量≥3个;② 年龄16～70岁;③ 自愿加入本研究, 并能遵医嘱按时服药、随访、接受肠镜复查和问卷调查, 签订同意书.排除标准:① 有活动性消化性溃疡、感染性疾病、炎症性肠病或近期消化道出血史者;② 息肉已有癌变者或家族性腺瘤性息肉病患者;③ 有中度以上高血压、糖尿病、甲状腺疾病、中枢神经系统病变、肝肾功能损害和妇科器质性疾病者;④ 孕妇和哺乳期妇女;⑤ 因其他疾病近期已服用非甾体类抗炎药 (NSAID) 或糖皮质激素等药物者;⑥ 对相关药物过敏或有禁忌症者。

1.1.2 病例分组及治疗

共有96例患者纳入研究, 分为A、B、C三组, 每组32例。各组患者均先在内镜下行高频电凝电切息肉圈套切除术或氩气刀治疗, 2周后A组患者给予塞来昔布200mg每天2次, B组患者给予肠溶阿司匹林50mg每天2次, C组患者暂不给予任何药物。疗程1年。治疗开始前和疗程第1、3、6、9及12个月复查1次血常规、粪常规、粪隐血和肝肾功能;疗程中每6个月复查结肠镜1次, 以后每12个月复查肠镜1次, 评价腺瘤复发情况, 随访2年。治疗中如出现消化道出血、腹痛或过敏等反应, 应及时停药并予以相应治疗。

1.2 疗效评估和判断

疗程中或疗程结束时复查肠镜, 如在原位出现息肉, 则认为是息肉复发;如在异位出现息肉, 则为息肉再发;在随访过程中发现息肉则均认为是再发。一旦发现息肉, 不论是复发或再发, 均认为是随访终点。疗程结束时各组息肉治愈率= (每组患者例数-复发例数-再生例数) ÷每组患者例数×100﹪ 。各组息肉再发率=再发例数÷随访例数×100﹪。

1.3 统计学分析

运用SAS 6.12统计软件进行数据分析。各治疗组的息肉根除率按意图治疗分析 (ITT) 和试验方案分析 (PP) 表示。息肉治愈率、再发率和不良反应发生率均用ⅹ2检验或Fisher确切概率法进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者的一般资料

各组患者的基本资料见表1。A、B、C三组中分别有2、1和4例失访。失访的主要原因为拒绝接受肠镜复查。A组中1例因肝功能异常、2例因原有高血压病史, 服药后血压控制不佳而中途退出;B组中3例因胃部不适、2例因溃疡出血而中途退出;C组中有1例切缘疑有癌变被剔除;其余患者均服完所有药物并完成随访和复查。

2.2 治疗结束时各组息肉治愈率

疗程6个月时复查结肠镜, C组有1例息肉复发, 于内镜下再次行息肉电凝圈套切除术。疗程结束时复查, B组1例出现结肠息肉, 单发, 病理为绒毛管状腺瘤;C组2例患者出现结肠息肉, 1例单发, 1例多发 (3个) , 病理分别为管状腺瘤和绒毛管状腺瘤;A 组未发现息肉。基于ITT和PP分析, A 组肠息肉治愈率为84.4﹪ 和100﹪, B组为78.1﹪ 和96.2﹪, C组为75.0﹪和88.9﹪。各组间息肉治愈率差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

2.3 治疗结束后随访2年各组息肉再发率

疗程结束后第1年复查结肠镜, A、B、C三组中分别有1、1和6例患者出现结肠腺瘤, A组和B组患者肠腺瘤再发率 (分别为3.7﹪和4.0﹪) 均显著低于C组 (25.0﹪) (P<0.05) ;第2年末, A、B、C三组中各检出3、3和4例息肉。所有息肉病理活检均为腺瘤。随访2年, A 组和B组患者息肉总再发率 (分别为14.8﹪和19.2﹪) 均显著低于C组 (46.2﹪) (P值均<0.05) , A组息肉再发率略低于B组, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 。

2.4 各组不良反应的发生率

A组中1例患者服药后出现血清丙氨酸转氨酶轻度升高, 停药后经保肝治疗12d后恢复;2例患者服药后血压控制不好, 停药2周后血压控制恢复正常。B组中7例出现胃部不适、上腹隐痛, 胃镜检查显示2例为糜烂性胃炎, 1例为胃多发溃疡, 1例为胃十二指肠复合溃疡伴出血, 1例为胃多发溃疡伴出血, 上述5例患者均在停药后经抑酸、止血及给予胃黏膜保护剂等对症治疗后恢复;另2例患者胃镜检查为浅表性胃炎伴轻度糜烂, 经加用胃黏膜保护剂后症状缓解, 未影响疗程。各组中其余患者不良反应均较轻微, 未有因药物不耐受而中断治疗者。B组消化道并发症发生率为22.5% (7/31) , 显著高于A 组3.3% (1/30) (ⅹ2=4.957, P=0.0268)

各组间比较, P>0.05。

3 讨论

结直肠癌是常见的严重危害人们身体健康的十大恶性肿瘤之一, 在发达国家中发生率居所有肿瘤的第2位。本研究结果显示, 结肠多发腺瘤患者在息肉切除术后服用肠溶阿司匹林和塞来昔布均可显著减低息肉的再发生率。服药1年, 停药2年后服用肠溶阿司匹林和塞来昔布组的息肉再发率分别为19.2%和14.8%, 均显著低于未服药组 (46.2%) 。塞来昔布组的息肉再发率虽然略低于肠溶阿司匹林组, 但差异无统计学意义。另外, 从随访结果可见, 停药后两组息肉再发率亦逐年增加, 但其增加的速度较未服药组慢。亦即停药后, 无论是肠溶阿司匹林或塞来昔布, 其保护作用均随时间延长而逐渐减弱。这提示, 对于结肠多发性腺瘤患者应长期服用NSAID或选择性COX-2抑制剂, 或者间歇服用, 方能有效预防息肉再发, 从而降低肠癌的发生率。

参考文献

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环氧合酶-2与乳腺癌的研究进展篇2

1乳腺癌中COX-2高表达

二十多年前, 人们发现前列腺素水平在乳腺癌中明显升高, 此后COX-2在乳腺癌中高表达逐渐受到关注。近年来研究者采用不同的检测方法对不同的乳腺标本中COX-2表达情况的研究表明COX-2过表达与乳腺癌相关。Ristimaki等[1]在大样本临床研究中测定了1576例浸润性乳腺癌患者中的表达, 结果显示COX-2蛋白在37.4%的乳腺癌中高表达, 54.2%的乳腺癌中低表达, 仅8.4%的病例无COX-2的表达。Spizzo等[2]检测212例乳腺癌标本、Denkert等[3]检测221例原发性乳腺癌发现COX-2表达分别为48.6%和36%。Wülfing等[4]分析200例乳腺癌中COX-2的表达, 结果显示78例 (40.6%) COX-2中到高表达。Boland等[5]检测187例原位导管癌、65例浸润性导管癌和60例正常乳腺组织中COX-2表达, 结果为67%的原位导管癌、63%的浸润性导管癌表达COX-2, 正常组织只有23%。Sucic等[6]分析9例乳腺癌、9例乳腺纤维腺瘤和8例乳腺纤维囊性变的细针抽吸物中COX-2的表达, 发现大部分乳腺癌COX-2的表达结果为强阳性, 纤维囊性变乳腺组织为弱阳性或阴性, 纤维腺瘤患者大部分为弱或中度阳性 (3例为强阳性) 。Watanabe等[7]报道40%浸润性导管癌高表达COX-2, 15%的临近正常乳腺上皮低表达COX-2;同时10例纤维腺瘤和10例导管内乳头状瘤均有COX-2高表达。Shim等[8]分析46例浸润性乳腺癌有85%的标本表达COX-2。在国内, 赵宪琪等[9]检测30例乳腺癌组织和临近正常组织及15例良性乳腺肿瘤组织中COX-2 mRNA的表达, 结果显示30例癌组织中28例 (93.3%) COX-2 mRNA的表达明显增高, 部分良性乳腺肿瘤中高表达, 正常腺体中无表达或表达弱。郭贵龙等[10]检测了30例乳腺癌患者的癌组织及配对的癌旁组织、6例远离肿瘤的正常乳腺组织中COX-2 mRNA的表达和COX-2蛋白的表达。结果COX-2 mRNA在86%的乳腺癌组织 (26/30) 中表达显著增高, 癌旁组织表达明显增高, 在正常乳腺组织中几乎不表达。80% (24/30) 的乳腺癌组织COX-2蛋白呈阳性表达, 58% (17/30) 癌旁组织COX-2蛋白呈不同程度阳性表达, 正常乳腺组织未见COX-2蛋白表达。王喜梅等[11]检测83例乳腺浸润癌和35例癌旁组织中COX-2的表达, 结果COX-2在乳腺浸润癌中的阳性表达率为73.5% (61/83) , 显著高于癌旁组织。王西京等[12]检测了80例乳腺癌、27例乳腺不典型增生以及20例正常乳腺组织中COX-2表达, 结果乳腺癌组织中COX-2阳性表达率为57.5% (46/80) , 明显高于乳腺不典型增生11.1% (3/27) 和正常乳腺组织10.0% (2/20) 。李莉等[13]分析48例乳腺癌中COX-2的表达, 显示29例 (60.4%) COX-2中到高表达。左文述等[14]研究结果表明, 乳腺癌组织中COX-2表达显著高于相应癌旁组织。邸军等[15]研究发现大部分乳腺癌标本中COX-2呈不同程度的阳性表达, 而12例正常乳腺组织中COX-2无阳性表达。

虽然不同研究显示乳腺癌中COX-2的表达程度不相同, 但越来越多的研究显示:COX-2在乳腺癌中高表达[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12], 在良性肿瘤中表达不一致[6,7,9,12], 正常组织中无或低表达[5,7,9,10,12,15]。这些研究说明COX-2高表达可能与乳腺癌相关。但是我们可以看出COX-2在乳腺癌中表达分布并不均衡, COX-2在乳腺癌中表达的规律需继续深入研究。

2 COX-2表达在乳腺癌中的作用机制

COX-2高表达促进乳腺癌发生发展的具体机制并不清楚, 可能是通过以下途径发挥作用。①促血管形成:Chang等[16]在COX-2转基因小鼠中研究发现PGE2刺激转基因小鼠中乳腺癌细胞血管生成调节基因的表达, 基因的上调可被吲哚美辛抑制。用吲哚美辛抑制前列腺素类合成能显著减低微血管密度, 抑制肿瘤进展。这些结果表明PGE2是乳腺癌进展过程中血管生成的强诱导剂;②抑制免疫调节作用:Pockaj等[17]在研究中发现乳腺癌患者COX-2高表达组织中PGE2合成增加, PGE2可抑制T细胞和B细胞的增殖及NK细胞的细胞毒反应。由此可见COX-2高表达可以阻碍抗肿瘤免疫而促进肿瘤生长;③影响细胞周期的过程:Kundu等[18]研究发现由COX-2抑制剂引起的乳腺肿瘤细胞株生长抑制与细胞形态的改变相关, 细胞形态改变在撤药后恢复, 而与对照组相比G0/G1期细胞数明显增加而S期明显减少;④增加细胞侵袭力:肿瘤细胞中COX-2稳定高表达时, 细胞变得更具侵袭性。COX-2过表达可引起P-糖蛋白的表达和功能活性增加, 降低P-糖蛋白功能的COX-2抑制剂可以增加化疗药在肿瘤细胞的聚积、减少耐药[19]。

3 COX-2表达与乳腺癌预后及预后因子的关系

乳腺癌的预后因子使人们对乳腺癌的临床病程及生物学行为有了更充分的估计, 从而指导合理的临床治疗。淋巴结转移情况、肿瘤大小、组织病理学性质是目前公认的有价值的乳腺癌预后因子。激素受体状态能预测患者对内分泌治疗的反应。大量研究表明COX-2高表达与乳腺癌的发生发展和转移相关。

3.1 COX-2高表达与生存率的关系

Ristimaki等[1]发现COX-2低表达的乳腺癌患者5年无病生存率为83%, 而高表达者为73%。Spizzo等[2]发现高度表达的COX-2对总生存率有预测作用。Denkert等[3]研究显示COX-2高表达与无病生存率和总生存率明显相关。王西京等[12]的研究亦表明, COX-2高表达的乳腺癌术后5年无病生存率明显高于COX-2低表达者。但Wülfing等[4]却认为COX-2高表达与总生存率和无病生存率无明显相关性。

3.2 COX-2高表达与一些病理参数的关系

Ristimaki等[1]研究结果显示COX-2高表达同肿瘤的大小、高组织学分级有关, 在腋淋巴结转移和导管型癌中常见。Denkert等[3]、Wülfing等[4]也认为COX-2高表达与淋巴结转移、大肿瘤、分化差等临床病理参数明显相关。Shim等[8]研究结果为COX-2高表达只与肿瘤大小、临床分期相关, 与组织学分级无明显相关性。王喜梅等[11]发现乳腺浸润癌组织COX-2的表达与临床分期、周围组织浸润和淋巴结转移密切相关, 与患者年龄和肿瘤大小无明显相关性。但Watanabe等[7]研究显示, COX-2表达与腋淋巴结转移和血管侵袭等均无关。

3.3 COX-2高表达与激素受体状态的关系

Ristimaki等[1]认为COX-2高表达与阴性激素受体状态有关。Wülfing等[4]研究结果为COX-2高表达与肿瘤中ER、PR含量呈反比例关系。Shim等[8]研究发现COX-2 mRNA表达与PR阳性相关。李莉等[13]的研究结果也表明COX-2高表达与ER、PR阴性显著相关。

3.4 COX-2高表达与癌基因的关系

Ristimaki等[1]分析结果为COX-2表达与突变型p53高表达和HER-2癌基因的扩增有关。Wülfing等[4]也认为与HER-2/neu扩增有关。Subbaramaiah等[20]研究发现15例HER-2/neu高表达的乳腺癌标本中14例有COX-2蛋白高表达;相反14例HER-2/neu阴性的标本中只有4例表达COX-2蛋白。

一些较大样本的研究结果显示COX-2表达与乳腺癌的预后明显相关[1,3,4], 可以作为乳腺癌不良预后因子之一, 但也存在争议[8], COX-2与乳腺癌预后及一些预后因子的关系仍需进一步的探讨。

摘要：病因学研究证实, 乳腺癌的本质是一种基因病, 乳腺癌的发生发展是多基因共同作用的结果。最近研究显示, 环氧化酶-2在乳腺癌发生发展中起重要作用。本文主要就环氧合酶-2与乳腺癌的有关研究进展加以综述。

环氧合酶抑制剂篇3

1 材料与方法

1.1 材料

收集陕西省榆林市中医院 (以下简称“我院”) 病理科2013~2014年的胃镜活检及手术胃癌标本70例和30例癌旁正常胃组织。本实验经医院伦理委员会通过, 所有患者均知情同意并签署知情同意书。所有标本均经HE染色由我院病理科医师诊断。胃癌标本男42例, 女28例, 按WHO病理分级:高-中分化40例, 低分化30例;按UICC标准行TNM标准临床分期:Ⅰ+Ⅱ级41例, Ⅲ+Ⅳ级29例。

1.2 试剂及检测方法

浓缩型兔抗人COX-2及VEGF、VEGF-C即用型多克隆抗体和S-P试剂盒均购于北京中杉生物科技有限公司;DAB底物显色剂购于武汉博士德生物科技有限公司。采用免疫组织化学SP法, 染色步骤严格按试剂盒说明书进行。抗原修复采用枸橼酸钠缓冲液高压热修复。COX-2与VEGF多克隆抗体使用1∶100稀释, VEGF-C多克隆抗体使用1∶150稀释。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

COX-2及VEGF、VEGF-C 3种蛋白均以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达, 试剂公司提供的阳性切片作为阳性对照。免疫组化结果判定如下:阳性细胞占总细胞数0~10%为阴性;>10%~25%为弱阳性;>25%~75%为中等阳性;>75%为强阳性。

1.4 统计学方法

使用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析, COX-2及VEGF、VEGF-C在胃癌及正常黏膜中的表达和胃癌临床病理特征之间的关系采用χ2检验;COX-2与VEGF、VEGF-C之间的相关性采用Spearman等级相关分析;以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX-2 及 VEGF、VEGF-C 蛋白的表达情况

COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌中阳性表达率为71.4% (50/70) 、62.9% (44/70) 、55.7% (39/70) , 而在正常胃黏膜中阳性表达率为13.3% (4/30) 、6.7% (2/30) 、16.7% (5/30) 。经比较, 胃癌与正常胃黏膜之间COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白阳性表达率差异有高度统计学意义 (χ2=23.542、26.693、12.995, P < 0.01) 。胃癌组织COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白表达在年龄、性别、不同肿瘤发生部位、肿瘤大小分组上差异均无统计学意义 (P > 0.05) , 在胃癌淋巴结转移及临床分期分组之间差异均有统计学意义 (P < 0.05) , 在病理分级上COX-2表达差异无统计学意 (P > 0.05) , VEGF与VEGF-C表达差异有统计学意义 (P < 0.05) 。见图1 (封三) 、表1。

2.2 胃癌组织中 COX-2 及 VEGF、VEGF-C 蛋白表达间的相关性分析

对70例胃癌组织中COX-2及VEGF、VEGF-C三种蛋白进行Spearman等级相关分析显示, COX-2与VEGF-C蛋白表达之间存在正相关关系 (rs=0.747, P < 0.05) ;COX-2与VEGF蛋白表达之间存在正相关关系 (rs=0.539, P < 0.05) ;VEGF与VEGF-C蛋白表达之间存在正相关关系 (rs=0.082, P < 0.05) 。

3 讨论

胃癌的发生是一个多步骤、多因素进行性发展的过程。生理状态下, 胃黏膜上皮细胞的增殖和凋亡之间保持着动态平衡。这种平衡的维持有赖于癌基因、抑癌基因及一些生长因子类物质的共同调控[3]。研究发现, COX-2是花生四烯酸转化为前列腺素 (PGs) 和血栓烷的关键酶。COX-2为诱导酶, 在大多数的正常细胞中是不存在COX-2的, 但在一些肿瘤促进因子、炎症细胞因子、癌基因和生长因子迅速诱导下形成过量PGs, 致使红肿、发热和疼痛等现象的发生。另有研究报道, COX-2还参与了动脉粥样硬化、炎症性肠病和消化性溃疡的炎性反应。在胃癌漫长的发生过程中, 有效发病途径为慢性胃炎-多灶性萎缩-肠上皮化生-不典型增生-浸润性癌[4]。研究表明 , COX-2在结肠癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、鳞状上皮癌变[8]等多种肿瘤组织中均高表达, 其致癌机制有以下几方面[9]:1通过PGs途径抑制免疫细胞的活性, 减少免疫蛋白的生成, 从而抑制抗肿瘤免疫的发生。2COX-2上调表皮生长因子的表达, 诱导肿瘤血管生成, 促进肿瘤发生、发展。3通过合成花生四烯酸, 上调Bcl-2基因表达, 抑制肿瘤细胞凋亡。4COX-2自身的过氧化物酶活性作用, 与其上调MMP-2、MMP-1蛋白联合作用, 使肿瘤细胞侵袭力增强。另有研究报道, COX-2还参与了消化性溃疡、炎症性肠病[10]和动脉粥样硬化[11]的炎性反应。在本研究中, 胃癌中的COX-2阳性表达率明显高于正常胃黏膜, 并在有无淋巴转移和临床分期中表达差异有统计学意义 (P < 0.05) , 表明COX-2与胃癌的发生、发展有关, 是胃癌转移的重要机制之一。

胃癌的生长和转移离不开肿瘤血管的生长 , VEGF在结肠癌[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]等多种组织中高表达。研究表明, 大多数癌前病变没有大量新生血管的形成, 与肿瘤组织相反, 说明癌前病变进展到肿瘤, 其大量新生血管形成是肿瘤发生的关键。VEGF是特异性的最强的血管内皮刺激因子, 其与血管内皮细胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体结合后, 产生促进血管内皮细胞增殖、迁移的作用, 还可以增加血管的通透性, 并且在血管通透性方面促进血管内物质渗出到血管外, 为促进肿瘤细胞的转移与浸润提供了良好的条件[15]。有研究表明, 血清中VEGF (S-VEGF) 水平在多种癌症患者体内的水平较正常人高, 其在一定程度上可以判断肿瘤的预后[16]。VEGF-C是VEGF家族成员之一, 不仅与只存在淋巴内皮上受体VEGFR-3结合, 促进淋巴管生成, 还与受体VEGFR-2结合, 抑制凋亡并增加血管通透性, 并协同VEGF促进血管的生成[17]。VEGF-C与其受体VEGFR-3结合使VEGFR-3发生自磷酸化后, 诱导淋巴内皮增殖的途径主要有三方面:1激活MAPK和Akt信号传导通路, 诱导淋巴管内皮细胞增殖, 并促进肿瘤细胞转移[18];2激活PI3K/Akt信号途径诱导淋巴管内皮增殖并抑制凋亡[19];3通过磷酸化Tyrl337位点的Shc和Grb2蛋白 , 激活PLC-γ/PKC通路促进淋巴管内皮增殖[20]。本研究结果显示, VEGF与VEGF-C的表达率均高于正常胃黏膜, 并都在临床病理特征中病理分级、淋巴转移和临床分期中的表达差异有统计学意义 (P < 0.05) 。提示VEGF与VEGF-C是胃癌血管、淋巴转移的重要原因, 其水平的检测对评估肿瘤的侵袭有意义。

COX-2、VEGF共同拥有转录启动子Tcf-4结合位点, 可能均受β-catenin蛋白的调控。研究发现, COX-2生成前列腺素E2 (PGE2) 致β-catenin蛋白上调, 通过激活Wnt/β-catenin通路使VEGF表达升高, 并且VEGF可以通过延长COX-2 m RNA的活性时间使COX-2的表达上调[21]。同时, COX-2也是VEGF-C处于转录水平的一个重要的上游调控基因[22]。通过COX-2催化产物前列腺素2 (PE2) 与前列腺素受体EP1结合使HER-2/Neu受体磷酸化, 通过MAPK/P38通路激活NF-κB, 导致VEGF-C基因蛋白的上调[23]。有学者研究认为, VEGF-C通过与VEGFR-2结合, 可以使VEGF表达上调, 而Maspin蛋白表达下调可能与VEGF、VEGF-C蛋白的上调有关[24]。本研究结果显示, COX-2与VEGF、VEGF -C蛋白表达呈正相关 , VEGF与VEGF-C蛋白表达之间也存在正相关, 提示3种蛋白相互作用, 协同促进胃癌的发生发展, 同时检测COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白表达水平 , 在肿瘤的形成、发展及早期应用基因靶向治疗方面具有积极意义。

环氧合酶抑制剂篇4

1 材料与方法

1.1 标本来源及制作

标本收集自新疆医科大学附属第一医院病理科2000～2008 年间存档的经病理诊断的石蜡标本38 例, 其中BCA 18 例, 年龄最大62 岁, 最小18 岁, 平均年龄37.3 岁。BCC 9 例, 年龄最大71, 最小21 岁, 平均年龄39.2 岁。NSG 11例 (取自涎腺多形性腺瘤或腺淋巴瘤手术切除标本中肿瘤周围的正常腺体组织) 。全部标本均查阅存档玻片, 由2 名病理科副教授重新阅片, 挑选最具代表性的玻片号, 然后选择对应石蜡块3 μm连续切片, 取3 张裱于防脱载玻片上备用。

1.2 主要试剂

一抗:兔抗人Cox- 2单克隆抗体, 兔抗人Ki- 67单克隆抗体。二抗:即用型辣根酶标记抗兔IgG多聚体。DAB kit (20X三管) 显色剂。以上试剂均购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 方法

采用免疫组化PV6001二步法。

1.3.2 切片预处理

石蜡切片:①标本置60 ℃干燥箱30 min后, 常规二甲苯梯度脱蜡, 乙醇梯度水化;②在0.01 mmol/L (pH 6.0) 枸橼酸缓冲液中, 98 ℃微波炉内高温抗原修复15 min, 自然冷却至室温;③滴加3%过氧化氢, 以阻断内源性过氧化物酶活性, 室温孵育10 min。

1.3.3 染色

①用PBS洗3 次, 每次2 min;②加一抗 (Cox- 2, Ki- 67工作浓度1∶100, 50 μl/切片) 在4 ℃冰箱过夜;③用PBS洗3次, 每次2 min;④加二抗, 置37 ℃恒温箱20 min; ⑤用PBS洗3 次, 每次2 min; ⑥DAB显色5～10 min, 显微镜下控制显色时间, 自来水适时终止反应;⑦苏木精复染, 室温7 min, 充分水洗, 盐酸乙醇分化5 s, 再次充分水洗, PBS缓冲液返蓝10 min;⑧梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。

1.4 结果判定

1.4.1 阳性对照

试验中以结肠癌、乳腺癌分别为Cox- 2、Ki- 67阳性对照, PBS代替一抗为空白对照。

1.4.2 各抗体染色结果的判断标准

免疫组化染色阳性反应为棕黄色颗粒。Cox- 2阳性表达位于细胞膜和细胞质;Ki- 67阳性表达位于细胞核。参照文献记录:高倍镜 (400 倍) 下随机计数10 个视野, 至少计数1 000 个细胞, 记录其中阳性染色的细胞数, 计算标记指数 (label index, LI) , LI%=阳性细胞数/计数细胞总数×100%, 用以评价2 种蛋白的表达水平。

1.5 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行数据处理, 计数资料采用undefined表示, 采用秩和检验;采用Spearman检验进行相关分析。各检验方法均以α=0.05为检验显著性水准。

2 结果

2.1 Cox- 2和Ki- 67在NSG、BCA与BCC中的表达

在BCA与BCC中, Cox- 2蛋白阳性颗粒, 主要分布在胞质, 少数胞膜着色, 经秩和检验分析, 其中NSG与BCA、BCC的LI值差异均有统计学意义 (P<0.01) ;BCA与BCC的LI值差异没有统计学意义 (P>0.05) ;Ki- 67蛋白阳性表达在胞核, 胞质不着色, 呈团块状或散在分布, NSG与BCA的LI值差异没有统计学意义 (P>0.05) ;NSG与BCC的LI值差异具有统计学意义 (P<0.01) ;BCA与BCC的LI值差异具有统计学意义 (P<0.01) (表 1, 图 1～6) 。

2.2 Cox- 2和Ki- 67表达与组织病理分型的关系

Cox- 2在BCA小梁型、管状型、实性型3组的LI值差异没有统计学意义 (P>0.05) 。Ki- 67在3 组的LI值差异没有统计学意义 (P>0.05) (表 2) 。

与NSG比较:①P<0.01; 与BCA比较:②P>0.05;与BCA比较:③P<0.01

组间比较, 均P>0.05

2.3 Cox- 2和Ki- 67表达与部位的关系

Cox- 2在BCA腮腺组与小涎腺组的LI值差异具有统计学意义 (P<0.01) 。Ki- 67 在腮腺组与小涎腺组的LI值差异没有统计学意义 (P>0.05) (表 3) 。

2.4 Cox- 2和Ki- 67在BCA和BCC中表达的相互关系

采用Spearman相关分析:Cox- 2和Ki- 67在BCA中的表达呈负相关, rs=-0.21, P>0.05。Cox- 2和Ki- 67在BCC中的表达呈正相关, rs=0.94, P<0.01。

与腮腺组比较:①P<0.01; ②P>0.05

3 讨论

3.1 Cox- 2在BCA、BCC中的表达

正常情况下, 绝大多数细胞不表达Cox- 2, 只有在细胞外许多刺激因子作用下才诱导表达。近年研究发现, 人类多种恶性肿瘤及癌前病变组织中均有Cox- 2的高表达, Cox- 2可通过以下机制参与肿瘤的发生、发展:①刺激细胞生长;②抑制细胞凋亡;③刺激新生血管生成;④Cox- 2与肿瘤的侵袭、转移有关;⑤通过催化花生四烯酸代谢产物而影响细胞增殖, 促进肿瘤细胞生长, 抑制局部免疫功能等[2]。Renkonen等[3]采用免疫组化方法研究人舌部病损, 发现在正常口腔黏膜-单纯性增生-浸润癌发展的过程中, Cox- 2的表达呈梯度增高。本研究结果提示NSG与BCA组间、BCC组间Cox- 2的表达均具有统计学意义 (P<0.01) , 而BCA与BCC在细胞形态学上非常相似, 由大小、形态较一致的基底样细胞构成;且都是异质性肿瘤, 含肿瘤性导管上皮和肿瘤性肌上皮两种细胞[4,5,6]。Cox- 2在BCA与BCC中的高表达表明其在两者发生、发展过程中发挥了重要作用。由于本研究BCC病例数较少 (9 例) , 仅对BCA病理分型中Cox- 2的表达进行了比较, 结果没有统计学意义 (P>0.05) ;但是在表达部位比较中有统计学意义 (P<0.01) , 说明BCA的发生与部位有一定的联系, 小涎腺似乎更具发生BCA的潜能, 但是其具体机制尚待进一步研究。

3.2 Ki- 67在BCA、BCC中的表达

Ki- 67是人类所有增生细胞核中普遍存在的标志性抗原。近年来, 国内外许多文献均报道Ki- 67在肿瘤中存在高表达。而且它只与增生细胞核反应, 符合细胞增殖失控是肿瘤的基本生物学这一特征, Schluter[7]等论证了Ki- 67具有重要的核功能, 对细胞的增殖不可缺少。随着人们对Ki- 67抗体结构、生物学特性方面的不断了解, 其与肿瘤关系的研究也更加深入。本研究结果显示Ki- 67在NSG与BCA组间表达差异无统计学意义 (P>0.05) 、在BCA与BCC组间的表达差异具有统计学意义 (P<0.01) , 其在BCA (4.66±4.58) %、BCC (32.27±22.77) %的阳性表达率呈增强趋势, 表明Ki- 67参与了BCA的发生及恶变过程, 可能对评估BCA良、恶性程度有所帮助, 与Kikuchi、何伟、邱嘉旋[8,9,10]等研究结果相似。我们同样对BCA病理分型、部位进行了分析, 结果两者没有统计学意义 (P>0.05) , 说明BCA不同病理分型和部位与增殖无关, 这与Carlinfante等[11]的研究结果一致。

3.3 Cox- 2和Ki- 67在BCA、BCC中的相互关系

本研究采用Spearman相关分析得出Cox- 2和Ki- 67在BCA中的表达呈负相关 (rs=-0.21, P>0.05) , 而在BCC中的表达却呈正相关 (rs=0.94, P<0.01) 。BCA是一种临界性肿瘤, BCA在某种特定条件下可以恶变为BCC, 而在BCC中的表达恰好相反, 随着Cox- 2表达的逐渐增高, Ki- 67也随之相应增高, 提示BCA向BCC转化的潜能, 可能出现潜在的恶性倾向, 这些结果表明Cox- 2和Ki- 67参与了BCA的发生及恶变过程。由此可见, 联合检测Cox- 2和Ki- 67, 有可能成为判断BCA、BCC预后的新的指标, 对确定临床拟定治疗方案有所帮助。由于本研究标本数量有限, 其内在分子作用的机制尚待进一步研究。

参考文献

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[2]Howe LR, Dannenberg AJ.A role for cyclooxygenase-2 in-hibitors in the prevention and treatment of cancer[J].Se-min Oncol, 2002, 29 (3 Suppl 11) :111-119.

[3]Renkonen J, Wolff H, Paavonen T.Expression of cyclooxygen-ase-2 in human tongue carcinoma and its precursor lesions[J].Virchows Arch, 2002, 440 (6) :594-597.

[4]Mulliken JB, Glowacki J.Hemangiomas and vascular mal-formation in infants and children:A classification based onendothelial characteristics[J].Plast Reconstr Surg, 1982, 69 (3) :412-422.

[5]Garzon M.Hemangiomas:Update on classification, clinicalpresentation, and associated anomalies[J].Cutis, 2000, 66 (5) :325-328.

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[7]Schluter C, DuchrowM, Woblenberg C, et al.The cell pro-liferation associated antigen of antibody Ki-67:Avery large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements, representing a new kind of cell cyclemaintaining proteins[J].J Cell Biol, 1993, 123 (3) :513-522.

[8]Kikuchi Y, Dinjens WN, Bosman FT.Proliferation and ap-optosis in proliferative lesions of the colon and rectum[J].Virchows Arch, 1997, 431 (2) :111-117.

[9]何伟, 何巍, 曹选平, 等.涎腺腺样囊性癌组织中P27及Ki-67蛋白的表达[J].郑州大学学报 (医学版) , 2006, 41 (3) :554-556.

[10]邱嘉旋, Sudhoff H, Hildman H, 等.PCNA、Ki-67在腮腺肿瘤中的表达[J].实用癌症杂志, 2003, 18 (5) :474-475.

环氧合酶抑制剂篇5

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

所有研究对象来自我院患者数据库。本次实验大部分的样本采集时间为2007-08～2008-05,主要来源于广东省口腔医院,广州医学院第二附属医院,南方医科大学附属珠江医院,顺德明景糖尿病医院,以及广州市内海珠区、白云区、黄埔区等多个社区。本实验采用病例对照实验设计,根据以下纳入标准从数据库中选择研究对象。要求所有的纳入对象为广东地区汉族人,年龄分布为40～80 岁。

1.2 牙周炎组的纳入标准

明显的牙石、菌斑,探诊有出血;牙周探诊深度平均值>5 mm,最大的探诊深度>6 mm,且这样的位点>2 个;平均附着丧失>4 mm;存在根分叉病变;有牙周炎病史:如经常性的牙龈出血,口腔异味,牙龈肿痛,牙齿松动;若有缺牙,缺牙原因为松牙等;妇女无妊娠。

1.3 糖尿病组纳入标准

根据WHO1999 年诊断标准:服用75 g葡萄糖后2 h,血糖浓度>11.1 mmol/L (200 mg/dl)。2型糖尿病患者均由广州医学院第二附属医院内分泌科、珠江医院内分泌科、顺德明景糖尿病专科医院确诊。

1.4 健康对照组的纳入标准

未接受过牙周系统治疗,1 年内未接受过洁治;牙周探诊深度平均值<3 mm, 最大的探诊深度≤4 mm,且这样的位点≤2 个;或有牙龈炎,或有轻度牙周炎(最大附着丧失<2 mm);牙龈有生理性退缩或是因为创伤牙合、楔缺等原因而造成的退缩;无牙周炎病史:如经常性的牙龈出血,口腔异味,牙床肿痛,牙齿松动等;若有缺牙,缺牙原因为龋齿,外伤拔出等;妇女无妊娠;3 个月内未应用抗生素。

1.5 排除标准

不符合纳入标准者;有其他系统疾病者;所需资料不全者,包括后续基因型检测失败者;诊断不明确者。

将纳入对象经过性别,年龄匹配后,最终分为4 组:糖尿病组46人, 糖尿病伴牙周炎组76 人, 牙周炎组158 人,以及健康对照组112 人。

1.6 方法

1.6.1 样品DNA制备

取颊黏膜拭子,剥取拭子表层,加入5% Chelex- 100(Sigma, 美国) 200 μl,使其浸没标本,再加入20 mg/ml蛋白酶K(宝生物,大连)4 μl,漩涡混匀;37 ℃水浴过夜;煮沸8 min,置于冰上3 min,12 000 r/min离心3 min;取上清液,-20 ℃保存备用。

1.6.2 基因型测定

采用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性基因分析方法(PCR- RFLP)检测COX- 2基因- 1195GA 多态性。①引物由Introgen公司合成,使用浓度为50 μmol/L,其中正义引物: 5′- CCCTGAGCAGCACTACCCATGAT- 3′,反义引物: 5′- GCCCTTCATAGGAGATACTGG- 3′[5]。②PCR反应体系:DNA样品2 μl,dNTP 2 μl (宝生物,大连),10×缓冲液 (宝生物,大连) 2 μl,引物各2 μl,Taq酶 (宝生物,大连)1 U,用纯水补足体积至25 μl。③扩增程序:95 ℃ 5 min,32×(94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s), 72 ℃ 6 min。扩增后,产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证,为273 bp的产物。④限制性酶切反应:取8 μl产物用PvuII (New England Biolab,美国) 酶切,反应按说明书推荐反应条件进行。⑤电泳:酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳,直接读取结果。

1.6.3 统计学分析

用SPSS 13.0统计软件包(SPSS Inc., Chicago, 美国),做Hardy- Weinberg平衡检测,用卡方检验分析病例组和对照组基因型分布差异,用logistic回归计算OR值,显著性水平设为α=0.05。

2 结果

2.1 -1195GA位点的典型酶切结果

等位基因G由于存在PvuII酶切位点而被切开成为220 bp和53 bp 2 个片段,其中片断53 bp太小而不能辨认;等位基因A由于酶切位点消失而不能被切开,仍为一条273 bp片段。所以,如图 1显示,GG纯合子显示为一条220 bp的条带,AA纯合子显示为一条273 bp的条带,GA杂合子显示为273 bp和220 bp的2 条带。

M: DL 2000 (Takara, Dalian, China); GG homozygosity: lanes 5, 13; GA heterozygosity: lanes 1, 3, 4, 6,8, 9, 10, 12, 15, 16; AA homozygosity: lanes 2, 7, 11, 14Marker: DL 2000(宝生物,大连); GG纯合型: 第5,13道; GA杂合型:第1,3,4,6,8,9,10,12,15,16道;AA纯合型:第2,7,11,14道

2.2 COX- 2- 1195GA基因型分布及分析

基因型的分布在各组间均满足Hardy- Weinberg平衡。基因型分布如表 1, 4 组间可进行6 次比较,其中,糖尿病组和健康对照组间的比较以及糖尿病组与牙周炎组的比较与本研究无太多相关,故表中只罗列4 次比较结果。结果显示,基因型AA或GA的分布在病例组中都多于对照组,糖尿病伴牙周炎组与对照组间有“边界性”统计学差异(P=0.053);等位基因A在糖尿病伴牙周炎组与对照组间的差异具有显著性(P=0.017)。该结果表明- 1195GA多态性与糖尿病并发牙周炎相关,由于前期研究已显示- 1195GA与牙周炎易感性相关,我们推测糖尿病患者中伴有AA或GA 基因型的个体更易患有牙周炎,于是做进一步危险度的分析。

变量采用数量(百分比)表示; ①有统计学差异

2.3 COX- 2- 1195GA基因型和糖尿病的相互作用

将牙周炎、无糖尿病伴保护型GG纯合子的群体与无牙周炎、无糖尿病伴GG纯合子群体相比得出的危险度作为基准,分析糖尿病、基因型这2 个因素变化时牙周炎的危险度变化。结果显示,基因型为GA+AA时,无糖尿病患者对牙周炎的危险度为2.027;基因型为GG但有糖尿病的患者对牙周炎的危险度为1.667;当基因型为GA+AA并同时患有糖尿病时,对牙周炎的危险度为2.130,大于单独糖尿病因素或GA+AA因素,且具有统计学差异(表 2)。

3 讨论

COX- 2作为将花生四烯酸转化为前列腺素(PGE2)的关键酶,在炎症反应中起到重要作用[6]。COX- 2- 1195GA位点等位基因A的出现,产生了一个启动子激活单位C- MYB,增加启动子活性,提高COX- 2的表达,使机体表现出更强的炎症反应。近年来研究显示- 1195GA多态性与哮喘、大肠癌、食道癌等多种疾病的易感性相关[7,8,9],AA基因型是炎性疾病的危险因素,我们前期的研究也显示基因型AA与重度牙周炎具有相关性[4]。本研究进一步分析了- 1195GA多态性与糖尿病对牙周炎的危险性,提出- 1195GA多态性可能提高了2型糖尿病对牙周炎的易感性。

Tervoner的研究显示糖尿病患者与牙周炎患者牙周组织内的细菌在数量和种类上都没有明显差异[10],但实际上糖尿病患者更易罹患牙周炎,并且伴糖尿病的牙周炎往往炎症程度更严重,提示糖尿病患者对牙周炎的危险性可能还是由基因易感性决定。本研究发现AA+GA基因型分布在糖尿病伴牙周炎组与对照组比较时有统计学差异,并且相比于糖尿病或基因型单独的危险度,糖尿病患者同时伴有AA+G A基因型的个体对牙周炎的危险度最高,提示- 1195GA多态性与2型糖尿病对牙周炎的危险性具有叠加效应。

目前为止,有关糖尿病和牙周病在基因多态性方面的相关研究还非常有限,可供参考的实验设计及统计方法等还比较少。2003 年一项在100 位糖尿病患者中进行的研究发现白细胞介素IL- 1B- 511和IL- 1B+3954在对照组(仅有糖尿病)和病例组(糖尿病伴牙周炎)间分布有差异[11],然而,该研究中涉及到多个种族,分层统计后样本量在每个亚层中太小,所以论证力度不是太高;2004 年智利人群中进行了一项有关肿瘤坏死因子(TNF)α- 308多态性与侵袭性牙周炎和1型糖尿病的病例对照研究[12],该研究设计了4组,然而样本量仍然有限,该研究并未得出阳性结果,是否与样本量有关还需要后面的验证。2008 年一个横断面调查研究结果显示[13], IL- 1的多态位点增加了糖尿病患者对牙周炎的危险性,提示糖尿病患者伴有基因型时可能更容易患牙周炎,这与我们的结论是类似的。近期国内也有研究报道C反应蛋白(CRP)多态性与慢性牙周炎伴2型糖尿病的易感性无明显相关,作者提出可能存在其他的多态位点或混杂因素有关[14]。

糖尿病和牙周炎同属于多因素复杂疾病,尽管基因因素可能在众多因素中起到决定作用,但是探讨其单独作用是极其困难的,建立成熟的研究模式还需要更多的探索。本研究初步探讨了COX- 2- 1195GA多态性与2型糖尿病和慢性牙周炎的易感性,限于本实验的一些局限性,我们的结论还需更完善的实验设计,更大的样本量来进一步证实。

摘要：目的:研究环氧合酶-2(COX-2)-1195GA多态性与2型糖尿病对牙周炎易感性的影响。方法:采用病例对照实验设计,选择46例单纯2型糖尿病患者、76例糖尿病伴牙周炎患者、158例单纯牙周炎患者以及112例健康对照者。应用聚合酶链反应—限制性内切酶片段长度多态性基因分析方法(PCR-RFLP),采用卡方检验比较COX-2基因-1195GA位点的基因型和等位基因频率在各组间的分布差异,并计算其与牙周炎的危险度(OR)。结果:与健康组比较,COX-2基因-1195GA位点的AA基因型以及等位基因A在牙周炎组和糖尿病伴牙周炎组中存在统计学差异(P=0.053和P=0.017);2型糖尿病对慢性牙周炎的危险度为1.667(95%CI 0.658～4.222,P=0.281),AA+GA基因型对慢性牙周炎的危险度为2.027(95%CI 1.135～3.621,P=0.017),两者叠加效应对慢性牙周炎的危险度为2.130(95%CI 1.104～4.108,P=0.024),差异具有统计学意义。结论:COX-2基因的-1195GA多态性可能提高了2型糖尿病患者对慢性牙周炎的易感性。