衰老相关基因

关键词： 过氧化氢 乙烯 调控 人们

衰老相关基因（精选三篇）

衰老相关基因 篇1

研究发现, 叶片衰老过程中乙烯的含量在早熟早衰和早熟不早衰2种短季棉材料中差别明显[5]。笔者前期展开了相关研究, 探讨叶片衰老过程中抗氧化物酶变化情况 (针对不同类型的短季棉) [6]。然而, 由于大田中不可控因素很多, 风、雨等自然因素都会影响到抗氧化物酶的活性及其编码基因的表达。为了消除这种影响, 进一步揭示短季棉叶片的早衰机理, 通过试验, 对室内条件下乙烯诱导的短季棉叶片衰老进程中抗氧化物酶活性及其基因表达的变化和差异进行探讨, 以期为揭示短季棉叶片衰老机理及生化辅助育种奠定理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试棉花品种为中棉所10。选择塑料营养钵为容器进行播种, 并在光照培养箱中培养。设置光照周期为光照14 h, 黑暗10 h, 温度白天为 (30±3) ℃、夜间为 (22±3) ℃, 光照强度为350~450μmol/ (m2·s) 。仪器与试剂:紫外分光光度计, DU800 (BECKMAN) ;RNA所用试剂盒为RNAprep Pure Plant Kit (DP441) , 天根生化科技有限公司 (北京) ;定量PCR所用仪器为ABI 7500 Sequence Detection System。

1.2试验设计

为了探讨过氧化氢 (H2O2) 在抗氧化物酶对乙烯响应过程中的作用, 对离体幼苗设计3个处理:150μmol/L乙烯利和100μmol/L二亚苯基碘 (DPI, 过氧化氢抑制剂) 处理48 h (A) ;150μmol/L乙烯利和10 mmol/L Tiron (过氧化氢清除剂) 处理48 h (B) ;以清水作对照 (CK) 。各处理条件一致, 处理结束后, 取第2片真叶用液氮冷冻, 以备后续分析。

1.3试验方法

当植株第2片真叶完全展开15 d后进行诱导处理。将幼苗从茎基部剪下, 用蒸馏水冲洗, 放入水中1 h以消除伤害胁迫, 然后插入盛有150μmol/L乙烯利 (ETH, 乙烯供体) 溶液的烧杯中, 烧杯用铝箔纸包好, 温度为25℃, 光照强度为200μmol/ (m2·s) , 分别处理6、12、24、36、48、60 h。

RNA提取方法完全参照其说明书, 所提RNA存于-80℃冰箱备用。反转录参照Super Script R III First-Strand Synthesis Super Mix (Invitrogen, USA) 试剂盒。采用Primer Express3.0软件进行实时定量PCR引物设计。引物合成在Ta Ka Ra公司完成, 相关基因的引物序列见表1。参照SYBR®GREEN PCRMaster Mix (Roche) 试剂盒说明书进行定量PCR反应, 以棉花中的Actin基因 (Accession number AY305733) 作为内参。除了没有合适引物的序列外, 棉花中所有已知的编码过氧化氢酶 (CAT) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 和过氧化物酶 (POD) 的核酸序列 (http://peroxibase.isb-sib.ch) 都进行了基因表达量的检测和分析。本研究中, 仅对差异倍数最明显的基因进行深入研究。

1.4测定内容与方法

1.4.1生理生化指标的测定。

叶绿素 (Chl) 和丙二醛 (MDA) 含量的测定方法参考梁超英[7]等方法进行, 过氧化氢 (H2O2) 的测定采用钛的氧化形成过氧化氢—钛复合物的方法[1]。

1.4.2酶活性的测定。

称取新鲜组织样品0.5 g, 加入磷酸缓冲液5 m L (p H值7.5) , 研磨成匀浆后离心20 min (4℃, 10 000 r/min) , 取上清液测定。每个样品3次重复。CAT活性的测定波长为240 nm, 以减少0.01/min为1个酶活单位。POD的活性采用愈创木酚法测定, 以470 nm下增加0.1/min为1个酶活单位。SOD活性的测定波长为560 nm, 以抑制NBT还原的1/2为1个酶活单位。APX活性的测定波长为290 nm, 以减少0.01/min为1个酶活单位[9]。

2结果与分析

2.1乙烯诱导衰老进程中的叶片表型特征

由图1可知, 乙烯诱导的衰老进程中, ETH处理48 h后, 叶片开始表现出明显的衰老特征, 即有黄斑出现;处理60 h后叶片衰老的表型更加明显;与ETH单独处理48 h相比, ETH+Tiron和ETH+DPI分别处理48 h后, 叶片没有衰老, 叶色仍然正常, 无明显的失绿现象。

2.2乙烯诱导衰老进程中叶绿素、过氧化氢和丙二醛含量的变化

由图2可知, 叶绿素 (Chl) 含量随着ETH处理时间的增加而逐渐下降, 与CK相比, 处理36 h后叶绿素含量显著降低, 处理60 h后叶绿素含量达到最低 (图2a) 。而有DPI或者Tiron存在的情况下, ETH处理48 h后, 与CK相比, 植株的叶绿素含量并未明显降低。相反, 丙二醛 (MDA) 的含量则随着ETH处理时间的延长而升高 (图2b) , 与CK相比, MDA含量显著升高 (36 h) 和叶绿素含量显著降低 (36 h) 的时间点相同;DPI或者Tiron存在的2组中, MDA含量并无显著升高。过氧化氢 (H2O2) 含量变化的趋势和MDA类似, 只是其含量增加的更加迅速和明显, ETH处理后60 h达到最高水平;而有DPI或者Tiron存在时, ETH处理48 h后, H2O2的含量水平显著低于CK (图3c) 。

注:1、2分别为ETH处理48、60 h后的出现衰老区域的放大部分。

注:a为叶绿素;b为H2O2;c为MDA。ETH+DPI表示幼苗植株在同时含有150μmol/L ETH和100μmol/L DPI的溶液中处理48 h;ETH+Tiron表示幼苗植株在同时含有150μmol/L ETH和100μmol/L Tiron的溶液中处理48 h;以处理0 h为对照进行显著性分析。取3次重复的平均值进行显著性分析, 所用软件为Sigma Stat中的One-Way ANOVA和DMRT测验, 误差棒为3次重复的标准偏差, 不同字母代表p<0.05水平下差异显著, 下同。

2.3乙烯诱导衰老进程中各种抗氧化物酶活性及其基因表达的变化

由图3可知, 酶活性变化中, CAT (图3a) 、APX (图3c) 、SOD (图3e) 的活性都随着ETH处理时间的推进而逐渐下降, 并且在处理60 h后, 活性降到最低;而有DPI或Tiron同时存在的ETH处理组中, 上述抗氧化物酶的活性都和对照没有显著差别。对CAT、APX和SOD的相应编码基因的表达进行分析后发现, RNA水平上, CAT2 (图3b) 、APX1 (图3d) 的表达水平变化同各自酶活变化相吻合。

对编码不同亚型SOD各个基因的表达量进行q RT-PCR分析, 以探讨不同亚型SOD的作用。其中, 胞质Cu/Zn SOD (图3f) 、胞外Cu/Zn SOD (图3g) 和Fe SOD (图3i) 的基因变化与总SOD酶活性的变化趋势相同;而叶绿体Cu/Zn SOD (图3h) 和Mn SOD (图3j) 的基因表达水平在不同处理条件下, 无显著变化。

与其他酶活性变化趋势不同, POD活性随着ETH处理时间的延长而逐渐升高 (图3k) , 处理后6 h即显著高于对照, 处理后60 h达到最高水平;其编码基因的表达量同酶活性的变化趋势一致 (图3l) 。

3结论与讨论

CAT和APX都具有清除H2O2的作用, 本研究中, 二者的活性变化趋势相同, 都是随着ETH诱导的时间增加而显著降低。SOD是普遍存在于所有需氧组织和亚细胞区间的一种抗氧化物酶类, 并且具有多种不同的亚型。前人的研究表明, Mn-SOD和Fe-SOD在不同物种、不同类型的衰老进程中的表达变化是多种多样的[10,11];而对于Cu/Zn-SOD而言, 根据其存在的部位不同可以分为e Cu/Zn-SOD、c Cu/Zn-SOD和Chl Cu/Zn-SOD, 这些不同的亚型表达变化也是有差异的[12,13]。本研究中, c Cu/Zn SOD、e Cu/Zn SOD和Fe SOD基因变化与相应酶活的变化趋势相同, 而叶绿体Cu/Zn SOD和Mn SOD的基因表达水平在不同处理条件下, 没有显著变化。因此, Chl Cu/Zn SOD和Mn SOD在乙烯诱导的叶片衰老过程中不受调控。

注:ETH+DPI表示幼苗植株在同时含有150μmol/L ETH和100μmol/L DPI的溶液中处理48 h;ETH+Tiron表示幼苗植株在同时含有150μmol/LETH和100μmol/L Tiron的溶液中处理48 h;以处理0 h为对照进行显著性分析。其中, 用于q RT-PCR分析的基因序列在Gen Bank中的登录号分别如下:Fe SOD (登录号:DQ088821) , c Cu/Zn SOD (登录号:DQ088818) , CAT2 (登录号:X56675) , APX1 (登录号:EF432582) , Chl Cu/Zn SOD (登录号:DQ120514) , POD7 (登录号:AY311597) , Mn SOD (登录号:DQ088820) , e Cu/Zn SOD (登录号:EU597270) 。未标字母表示差异不显著。

控制基因能改变衰老？ 篇2

“不同物种之间，最根本的区别是什么？它们的基因！所以我想，衰老的秘密也许就藏在基因里。它们里面肯定有个操纵杆一样的东西，往上调一点，就老得快，调下一点，就可以老得跟乌龟一样慢。”美国加州大学的生物学教授肯云对基因的兴趣从大学就开始了，而她最终选了一种冷门的生物来寻找答案——秀丽隐杆线虫。

据她介绍，这是一种只能活三周的小虫子，一毫米长，跟一个逗号差不多，但它们身上却有50%的基因跟我们相同。在肯云教授看来，生命周期短的生物更容易观察结果，基因也更容易控制。她尝试在线虫身上使用不同的化学物质，随机改变它们的基因，看看对其寿命有什么影响。“这需要极大的耐心，成功率也很低，所以实验室几乎找不到愿意来干活的人。”

耐心和勤奋带来了回报。1993年，肯云在《自然》杂志上发表了自己的发现：“通过让一种名为Daf-2的基因部分失效后，线虫的寿命能延长一倍。”而且，比起懒洋洋的普通线虫，基因改变后的线虫充满活力。后来，她又发现了另一种名为Daf-16的基因，如果同时让它也活跃起来，线虫对疾病会产生超强的抵抗力，而生命能延长到144天，相当于人类活到近500岁。

“这两种基因在人类体内都是存在的，Daf-2能控制胰岛素，Daf-16则能指导身体的自我修复，比如增加抗氧化物。”更令人兴奋的发现是，改变人的这两种基因的活性并不需要通过化学物质，只要节制饮食，特别是减少碳水化合物和糖类的摄取就可以达到目的。从那以后，肯云教授自己彻底戒掉了甜食，饮食上则增加了大量的蔬菜水果，并把自己的养生饮食心得发表在2003年10月的《新科学家》上。

衰老的开关

从线虫身上寻找人类的长生秘诀，多少让人觉得隔靴搔痒，直接在人身上进行临床试验不是更好吗？但做这种实验并得出结果的科学家并没有多少。原因很简单：人类从年轻到衰老要跨越几十年，等待确切结果的时间太久了，更别说其间的花费会是多么巨大。对于有实力支持这种研究的机构来说，找跟人类基因相近的生物是更实际的选择。

在这点上，美国威斯康星大学的两位教授魏德理和彭乐涛选择了恒河猴做研究对象，并且试验一做就是三十多年。他们从1989年开始，选择了76只健康的恒河猴，随机分为两组，第一组不限制饮食，第二组则严格节食，按照第一个月减少10%的摄入热量，第二个月再减少10%的摄入量来进行。恒河猴的寿命可以长达40年，所以他们投入了很大的耐心，持续观察着两组的健康状况和老化征兆。

十年后，第一份报告发表在了多家科学期刊上：“限制热量摄取的猴子，有超过50种引发炎症的基因表现性被下调了，并开启了部分帮助能量新陈代谢的基因表达。”

二十年后，又一份报告发表在2009年的《科学》期刊上：“热量控制组的猴子身体更加健康，肌肉因老化而流失的比例更低，因老化引起的病变几率降低了三倍。”

至于两者的寿命呢，由于美国对动物实验规定，参与实验的动物必须受到最全面的照顾，不论生病还是受伤，都得把它们治好。因此，两组恒河猴都还活得好好的，很难对比寿命的长短。于是两人决定，同时在老鼠身上也进行类似的实验。

得益于科技的进步，老鼠实验动用了基因晶片做工具。这种指甲盖大小的晶片每片对应一只老鼠，里面含有上百万个基因数据点。“它让我们能同时观察这只老鼠体内数千个基因表达的变化，否则如此庞大的工作量是很难完成的。”魏德理解释。

魏德理和彭乐涛的实验引起了一些商业机构的关注，其中包括如新。如新的白理曼博士认为，抗衰老并不是抹掉皱纹那么简单，而应当让人的整体维持在年轻状态。“随着年龄增长，细胞本身是会退化的。就像一所房子，住久了总要修修补补，坏了的部分要换掉。通过辨识老化后基因表达的变化，我们希望也能找到人体需要维修替换的部分，让人维持最年轻的状态。”

吃什么抗衰老？

改变基因的表达方式，跟改变基因是两码事。在我们细胞的染色体中，有一条条由DNA卷成的细丝，把它们完全拉开的话，上面可以看见一节节的基因片段。人体里大概有两万五千个基因，每个都像一个食谱，指导身体合成不同的产品。每个人出生时，基因已经是固定不变的。但每个基因上都有个开关键，打开之后它的指令才会发生作用，这就是基因表达。

在动物老化过程中，不断有一些基因的开关被打开，一些被关上。“比如，我们年轻时，制造胶原蛋白的基因开关是打开的，因此肌肤弹性会很好；随着年龄渐长，另一个破坏胶原蛋白的基因开关被打开了，皮肤就渐渐衰老。但整个DNA是没有改变的。”白理曼解释。

那么，有没有什么方法能控制这些基因的开关，把年老时变化的基因表达调回年轻状态呢？白理曼的科研中心和魏德理合作进行了一系列的老鼠实验，希望在这种基因与人极其相似的动物身上发现年龄增长后，到底哪些基因的表达方式发生了改变。

与恒河猴实验不同，他们这回更感兴趣的是，有没有哪些营养物质，既可以达到热量限制摄取的长寿效果，又不用真的节食。

他们先将14个月到30个月（老鼠寿命通常为两三年）的老鼠分成几组，要么控制饮食热量，要么每天添加喂养低剂量（每公斤体重4.9mg）的白藜芦醇（一种存在于红酒中的化合物），对比观察它们的基因表达方式。根据他们发表在2008年六月的《PloS One》期刊上的论文：“在心脏、大脑皮层、腓肠肌这三种最具代表性的生物组织上，我们辨识出了几百种随着年龄表达方式会发生变化的基因。服用白藜芦醇和控制饮食都让高龄老鼠的部分基因表达调回了年轻时的状态：它们提升了老鼠的心血管功能，预防了其他跟衰老相关的疾病。”

而他们在2009年11月《老化细胞（Aging Cell）》上发表论文称：“番茄红素、白藜芦醇、左旋肉碱和四甲基哌啶对于心脏的好处跟控制饮食的作用是同等的，α硫辛酸和Q10辅酶对小脑也有跟控制饮食不相上下的效果。”

当然，这些食物成分早就有营养学家推荐过，也有过争议，但相关研究还比较初级，充满空白。正如白理曼所说，基因表达的研究开启了另一扇门，“它让我们可以更精确地分析每种食物的效果，并在科研方向走得更远。”

衰老相关基因 篇3

1 材料与方法

1.1 药品和制剂

山茱萸购于佳木斯大学医学院药店, 经鉴定符合药典标准。

1.2 实验动物

1.2.1人工饲养自然衰老小鼠 (11~12月龄) 90只, 体重41~52g, 随机分成9组, 每组10只, 青年小鼠 (2~3月龄) 10只, 体重20~25g, 分1组, 总计10组动物。同室分笼饲养, 自由进食 (基础饲料) 和水, 室温 (24±2) ℃饲养, 相对湿度50%~60%。

1.2.2自然衰老小鼠基础饲养5d后再次称重给药, 1) 青年对照组、衰老对照组自由进食 (基础饲料) 和水;2) 给药组:纳米水提大剂量组、纳米水提小剂量组、纳米醇提大剂量组、纳米醇提小剂量组、常药水提大剂量组、常药水提小剂量组、常药醇提大剂量组、常药醇提小剂量组山茱萸大剂量组、小剂量组分别按照1.5g/kg·d、0.75g/kg·d体重剂量连续灌服30d。

1.3 实验方法和指标测定

各组小鼠于实验结束时断头处死, 4℃条件下立即取出全脑, DEPC配置的盐水冲洗去除杂质, 锡纸包裹后置于液氮备用。RT-PCR试剂盒测定脑组织akt基因mRNA转录活性, 操作步骤按照试剂盒说明进行。

1.4 统计学方法

应用SAS统计分析软件对实验数据进行统计学处理, 用均数±标准差 (±s) 表示实验结果, 组间比较采用方差分析, t检验、q检验。

2 结果

山茱萸及其纳米制剂对小鼠脑组织akt基因mRNA表达的影响见图1, 见表1。

图1山茱萸对小鼠脑组织akt基因mRNA和β-actin表达的影响

注:与CONTROL比*P<0.05, **P<0.01;与YOUNG比△P<0.05, △△P<0.01;与NMWL相比▲▲P<0.01, 与NMWS比◇P<0.05, ◇◇P<0.01;与CWL比☆P<0.05, ☆☆P<0.01;与CWS相比★P<0.05, ★★P<0.01。

3 讨论

本实验小鼠脑组织akt基因mRNA表达因衰老而显著降低, 山茱萸可以提高akt基因mRNA转录活性。实验研究显示:衰老小鼠脑组织akt-mRNA表达较青年组表达明显降低, 其中纳米水提液大剂量组、纳米水提液小剂量组脑组织Akt-mRNA表达有明显升高。结果提示山茱萸除对衰老小鼠脑组织的p66shc-p-Fox O1蛋白途径影响达到延缓小鼠脑衰老外[4~7], 还有可能通过PI3K-AKT途径发挥延缓脑衰老作用 (见图2) 。我们还将探讨山茱萸对PI3-K表达的影响, 进一步阐明山茱萸延缓脑衰老的作用机制。

摘要：目的:探讨山茱萸纳米制剂对自然衰老小鼠脑组织akt基因mRNA表达的影响。方法:以衰老小鼠 (1112月龄) 、青年小鼠 (23月龄) 为研究对象, 灌服山茱萸纳米制剂, 采用RT-PCR方法检测akt基因mRNA的表达。结果:衰老小鼠脑组织akt基因mRNA表达量较青年小鼠低, 山茱萸纳米制剂可以不同程度的提高衰老小鼠脑组织akt基因mRNA的表达。结论:山茱萸纳米制剂显著提高衰老小鼠脑组织akt基因mRNA的表达, 使衰老小鼠脑组织akt基因mRNA表达趋于年轻化。

关键词：山茱萸,衰老小鼠,akt基因

参考文献

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