大鼠骨折模型影像学论文提纲

关键词： 多发性 损伤 骨折 骨科

论文题目：杯苋甾酮促进骨折愈合的实验研究

摘要：骨折是最常见的因意外损伤而引起的骨科疾病。随着社会迅速发展,严重骨折发生率明显增加。骨修复失败的风险在慢性炎症、糖尿病、维生素缺乏、老年和多发性损伤中升高,治疗时间延长,病人伤残率增加。因此研究促进骨修复的机制、骨折愈合时间的方法显得尤为必要。间充质干细胞参与了骨折愈合过程的几个阶段。骨折损伤部位骨髓间充质干细胞募集在骨修复过程中发挥重要作用,骨折端募集足够数量的骨髓间充质干细胞是骨折愈合的前提条件和细胞学基础。牛膝具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨之功效,中医骨伤科临床上长期用其治疗骨折,本课题组前期研究发现杯苋甾酮通过靶向调控细胞趋化因子受体4促进骨髓间充质干细胞体外迁移。然而,牛膝杯苋甾酮促进干细胞体外迁移的机制,及是否促进干细胞成骨分化和骨折愈合,仍未可知。本文将通过细胞实验和动物实验,揭示杯苋甾酮促进骨折愈合的作用机制。目的:研究牛膝杯苋甾酮促进骨髓间充质干细胞迁移、成骨分化,及骨折愈合的作用机制。方法:1.采用全骨髓灌注法培养SD大鼠原代骨髓间充质干细胞,由于干细胞属于贴壁细胞,因此利用骨髓间充质干细胞贴壁培养法不断去除其他细胞,取生长状态佳、形态正常的P3细胞行骨髓间充质干细胞表面抗原流式细胞术实验检测。2.Cell Counting kit-8（CCK-8试剂盒）检测杯苋甾酮能否促进骨髓间充质干细胞增值。3.细胞体外迁移实验（Transwell）检测杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞体外迁移的影响作用。4.细胞免疫荧光实验检测杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维的影响。5.茜素红染色检测杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响作用。6.实时荧光定量PCR实验（RT-qPCR）检测杯苋甾酮在骨髓间充质干细胞成骨分化方面相关的mRNA的表达。7.建立SD大鼠单侧股骨干中段骨折模型,使用杯苋甾酮向骨折端局部注射。酶联免疫吸附测定（ELISA法）检测给药不同时期的骨折动物模型血清中SDF-1α的浓度。8.使用生理盐水或杯苋甾酮向实验动物骨折端局部注射,给药六周后提取标本并对骨折部位进行Micro-CT影像学观察。结果:1.流式细胞术细胞鉴定结果:检测细胞表面抗原干细胞阳性标志物结果显示,CD29、CD44、CD73阳性率分别为94.84%、93.71%、93.88%,阳性率均大于90%。表达造血细胞的标志物CD11、CD34、CD45阳性率分别为0.88%、0.88%、0.69%阳性率均小于1%。由流式细胞术结果证实,本实验所使用的细胞均为骨髓间充质干细胞。2.Cell Counting kit-8（CCK-8试剂盒）检测细胞增殖结果:在杯苋甾酮各梯度浓度干预下,与对照组相比,杯苋甾酮各浓度组在不同干预时间（24h、48h、72h）均可促进骨髓间充质干细胞增殖。最佳干预时间为48h,最佳浓度为2.5、5、10μg/mL,且有统计学意义（P＜0.0001）。可见,杯苋甾酮可促进骨髓间充质干细胞增殖,且其用于细胞实验的最佳浓度为2.5、5、10μg/mL。本研究采用5、10μg/mL进行后续实验。3.Transwell细胞体外迁移实验结果:在8小时的杯苋甾酮5、10μg/mL浓度干预下,与对照组相比,各组骨髓间充质干细胞呈现不同程度的细胞迁移。其中,10μg/mL浓度杯苋甾酮干预下,骨髓间充质干细胞穿过下室细胞数量显著增多,与空白组比较,差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）。可见,杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞迁移具有积极促进作用。4.细胞免疫荧光实验结果显示:与对照组相比,在杯苋甾酮不同浓度梯度干预下,可不同程度提高骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维收缩,肌丝清晰可见。因此在杯苋甾酮干预下,骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维收缩能力有显著提高。5.杯苋甾酮+骨髓间充质干细胞成骨诱导液干预下,茜素红染色结果:扫描仪及显微镜下观察发现,与单纯成骨诱导组（OIM）比较,杯苋甾酮+成骨诱导组对矿化结节的形成具有显著促进作用。可见,杯苋甾酮促进骨髓间充质干细胞成骨分化。此外实时荧光定量PCR的结果显示,与成骨诱导组（OIM）比较,杯苋甾酮+成骨诱导组ALP、0PN的mRNA较升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,且BMP-2的mRNA显著升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。6.SD大鼠骨折模型动物实验,给药一周后杯苋甾酮低剂量及高剂量治疗组的大鼠血清中SDF-1a含量开始升高,而模型组大鼠血清中SDF-1a含量呈下降趋势。给药两周后牛膝杯苋甾酮低剂量组及高剂量组的大鼠血清中SDF-1a含量均显著高于模型组（P＜0.01）。7.Micro-CT重建结果显示杯苋甾酮低浓度组及高浓度组的骨折部位接近愈合,而模型组（PBS组）骨折部位仍有较大骨折线。总骨体积分数统计图、新生骨体积分数统计图、原始固有骨体积分数统计图分析结果显示:杯苋甾酮低剂量组及高剂量组的新生骨骨体积分数均高于模型组,其中低剂量治疗组升高最为显著（P＜0.01）。结论:杯苋甾酮具有促进体外骨髓间充质干细胞增殖、迁移及成骨分化的作用;同时,杯苋甾酮促进骨折模型大鼠的损伤修复。因此,中药牛膝的有效提取物——杯苋甾酮可作为促进骨折修复的一种新型药物,为中医药加快骨折愈合开辟新的治疗思路,为新药开发奠定基础。

关键词：骨髓间充质干细胞;杯苋甾酮;细胞迁移;成骨分化;骨折愈合

学科专业：中医骨伤科学

摘要

Abstract

引言

第一章 文献研究

第一节 骨髓间充质干细胞治疗骨折的研究进展

一、促进BMSCs成骨分化在骨折治疗的研究进展

二、促进BMSCs归巢在骨折治疗的研究进展

第二节 中药有效成分在骨髄间充质干细胞的应用

第三节 本课题组前期研究进展

第四节 牛膝杯苋甾酮在骨伤科中的研究进展

第二章 实验研究

第一节 研究思路

一、BMSCs的培养及流式细胞术鉴定

二、杯苋甾酮对BMSCs增殖影响的研究

三、杯苋甾酮对BMSCs体外迁移影响的研究

四、杯苋甾酮对BMSCs成骨分化影响的研究

五、杯苋甾酮对大鼠骨折愈合影响的研究

第二节 SD大鼠骨髓间充质干细胞取材、原代培养及鉴定

一、实验材料

(一) 实验动物

(二) 实验试剂

(三) 实验耗材

(四) 实验仪器

(五) 实验试剂的配制

二、实验方法

(一) 骨髓间充质干细胞取材

(二) 骨髓间充质干细胞的传代培养

(三) 骨髓间充质干细胞的计数

(四) 骨髓间充质干细胞的流式细胞仪鉴定

三、实验结果

(一) 骨髓间充质干细胞的流式细胞鉴定

第三节 杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞增殖的影响

一、实验材料

(一) 实验细胞

(二) 实验药物单体

(三) 实验试剂

(四) 实验耗材

(五) 实验仪器

(六) 实验试剂的配制

二、实验方法

(一) 种板

(二) 药物干预

(三) CCK-8试剂盒检测杯苋甾酮对BMSCs增殖的影响

(四) 统计学处理

三、实验结果

第四节 杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞迁移的影响

一、实验材料

(一) 实验细胞

(二) 实验药物单体

(三) 实验试剂

(五) 实验耗材

(六) 实验仪器

(七) 实验试剂的配制

二、实验方法

(一) Transwell细胞迁移实验

(二) 肌动蛋白(F-actin)细胞免疫荧光实验

(三) 统计学处理

三、实验结果

(一) 骨髓间充质干细胞Transwell迁移实验的结果

(二) 杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维的影响结果

第五节 杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

一、实验材料

(一) 实验细胞

(二) 实验药物单体

(三) 实验引物

(四) 实验试剂

(五) 实验耗材

(六) 实验仪器

(七) 实验试剂的配制

二、实验方法

(一) 诱导骨髓间充质干细胞成骨分化

(二) 提取干预后骨髓间充质干细胞RNA

(三) RNA逆转录及RT-PCR测定骨髓间充质干细胞成骨相关标志物的mRNA表达

(四) 统计学处理

三、实验结果

(一) 杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞成骨分化影响结果

(二) 杯苋甾酮对骨髓间充质干细胞成骨分化相关mRNA表达量的影响结果

第六节 杯苋甾酮对大鼠骨折愈合影响的研究

一、实验材料

(一) 实验动物

(二) 实验药物单体

(三) 实验试剂

(五) 实验耗材

(六) 实验仪器

(七) 实验试剂的配制

二、实验方法

(一) SD大鼠股骨干骨折的造模

(二) SD大鼠基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)的浓度测定

(三) SD大鼠股骨干骨折端Micro-CT扫描分析

(四) 统计学处理

三、实验结果

(一) 杯苋甾酮对骨折大鼠基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)的影响结果

(二) 杯苋甾酮对大鼠骨折愈合的影响结果

第三章 实验讨论

一、牛膝杯苋甾酮作用于骨髓间充质干细胞的实验基础

二、牛膝杯苋甾酮促进骨髓间充质干细胞迁移

三、牛膝杯苋甾酮促进骨髓间充质干细胞成骨分化

四、牛膝杯苋甾酮促进骨折模型大鼠的损伤修复

(一) 现今骨折疾病的概况

(二) 中药川牛膝治疗骨伤科疾病的优势

(三) 杯苋甾酮的对骨折的愈合的作用及机理

1. 杯苋甾酮促进BMSCs迁移影响骨折愈合

2. 杯苋甾酮促进BMSCs成骨分化影响骨折愈合

结语

一、研究结论

1. 牛膝杯苋甾酮促进骨髓间充质干细胞的增殖、迁移、成骨分化

2. 牛膝杯苋甾酮促进骨折的损伤修复,其机制可能是促进BMSCs的迁移、成骨分化

二、意义和创新点

三、存在的问题

四、研究前景

参考文献

附录1: 英文缩写附录

国家实用新型专利

参与课题

致谢

统计学审核证明