艾美耳球虫（精选八篇）
艾美耳球虫 篇1
1 材料与方法
1.1 试验动物
1日龄817肉杂鸡210只, 购自廊坊职业技术学院养殖基地, 饲养于经严格消毒过的大棚内, 网上养殖, 鸡自由采食和饮水, 饮水中加入环丙沙星 (2.5 g/L) 预防大肠杆菌病和鸡白痢。饲养至9日龄, 取粪便镜检鸡球虫, 结果为阴性。
1.2 感染用卵囊
从河北省廊坊市某鸡场采集因球虫病死亡的鸡盲肠内容物, 采用饱和盐水漂浮法收集球虫卵囊, 置于含25 g/L重铬酸钾溶液的平皿中, 于28 ℃温箱通气培养至孢子化[1], 经鉴定为柔嫩艾美耳球虫。在实验室经鸡体传3代, 增殖到足够数量后进行试验。
1.3 试验药物
百球杀Ⅱ代 (有效成分为磺胺氯吡嗪钠等, 批号为20021113) 、球痢速治 (批号为20038976) 、海南霉素 (有效成分为海南霉素等, 批号为20015647) 、球虫宝 (有效成分为常山、柴胡、青蒿等, 批号为20040051) 、海南地克珠利 (有效成分为地克珠利等, 批号为20030302) , 市购。
1.4 试验设计
将试验用鸡于9日龄早晨逐只空腹称重, 淘汰弱雏及体重过大者, 然后根据初重相同随机分成7组:白对照组 (不感染不给药) 、红对照组 (感染不给药) 、百球杀Ⅱ代组、球痢速治组、海南霉素组、球虫宝组、海南地克珠利组[2], 每组30只, 从10日龄开始饲喂3 d抗球虫药物, 13日龄不饲喂药物, 14日龄接种法氏囊疫苗, 15日龄除白对照组 (不感染不给药) 外其他各组鸡用钝头注射器经口接种2.0×105个孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊。试验采用饮水给药, 于攻虫后第3天开始给药。
1.5 测定指标
1.5.1 临床表现
接种球虫卵囊后每天观察每组鸡只的精神状况、采食和饮水量、死亡情况、粪便色泽和性状, 并作好记录。对病死鸡进行剖检, 确定死因。
1.5.2 增重情况
试验鸡于感染后第1天和第10天逐只空腹称重, 并计算各组的增重, 由此算出平均增重和相对增重率。相对增重率 (%) =用药组或感染不给药组的平均增重/不感染不给药组的平均增重×100% 。
1.5.3 盲肠卵囊计数
于感染后第10天每组扑杀10只, 将各组盲肠内容物充分混匀, 称重, 用麦氏虫卵计数法记录每克盲肠内容物卵囊数 (OPG) , 计算各组鸡盲肠所含卵囊数, 再根据表1换算成卵囊值[3]。
1.5.4 免疫器官指数
于感染后第6天随机抽取组内体重相近的5只鸡剖杀, 摘取脾脏和法氏囊, 称重, 计算免疫器官指数。 法氏囊指数 (B/ W) = 法氏囊重 (mg) / 体重 (g) ×100;脾脏指数 (S/ W) = 脾脏脏重 (mg) / 体重 (g) ×100。
1.5.5 病变记分及病变值
按Johnson等的标准作盲肠病变记分。感染后第10天, 每组扑杀10只鸡, 剖检, 观察盲肠病变。按5级记分制进行病变记分:0分, 不见病变;1分, 盲肠黏膜有少量出血点;2分, 肠壁增厚, 黏膜有多量出血点;3分, 盲肠肿胀, 内容物含多量血液或形成硬固肠芯;4分, 盲肠极度肿胀, 外观呈紫红色, 内容物含血凝块, 或死于球虫病者。
根据公式:病变值=各组鸡的平均病变记分×10 换算成病变值。
1.5.6 抗球虫指数 (ACI)
选用美国Merck公司推荐的ACI作为判定药物效力的指标:ACI= (存活率+相对增重率) ×100- (病变值+卵囊值) 。ACI>180, 判定为高效抗球虫药;160
1.6 数据统计
试验结果采用SPSS13.0软件和Excel进行方差分析和显著性检验。
2 结果和分析
2.1 临床表现
试验期间, 白对照组鸡的精神、食欲、粪便均正常。红对照组从感染后第4天开始排血便, 持续6 d, 其中以第2天最严重, 死亡2只;感染7 d后多数鸡食欲恢复, 精神逐渐好转, 粪便趋于正常。百球杀Ⅱ代组、球痢速治组于感染后前3 d有血便, 后3 d不见血便;其他用药各组鸡6 d均有鸡只排出血便;其中以海南地克珠利组和红对照组鸡只最为严重, 海南地克珠利组在试验期死亡9只。
2.2 增重情况
红对照组的增重率与其他各组差异极显著 (P<0.01) , 各用药组间差异不显著 (P>0.05) , 说明各组药物均以抗球虫为主, 增重情况不明显。
2.3 盲肠病变记分
将每组鸡剖杀进行盲肠病变记分, 其中盲肠病变最严重的是海南地克珠利组, 病变记分为20.0;其次是球虫宝组, 盲肠记分为16.7;海南霉素组、球痢速治组和百球杀Ⅱ代组的盲肠病变记分分别为13.3, 6.9, 6.7。
2.4 免疫器官指数的变化 (见表2)
注:同行数据肩标含有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) ;小写字母完全不同表示差异显著 (P<0.05) ;大写字母完全不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
由表2可知:红对照组的脾脏指数与白对照组相比差异不显著 (P>0.05) ;红对照组的脾脏指数与百球杀Ⅱ代组、球痢速治组和海南霉素组差异极显著 (P<0.01) , 与球虫宝组和海南地克珠利组差异显著 (P<0.05) ;用药组及白对照组之间的脾脏指数差异不显著 (P>0.05) 。红对照组的法氏囊指数与其他各组之间差异不显著 (P>0.05) ;用药组及白对照组之间的法氏囊指数差异不显著 (P>0.05) 。
2.5 抗球虫药效综合判断结果 (见表3)
注:同行数据肩标含有相同小写字母表示差异不显著 (P>0.05) , 完全不同表示差异显著 (P<0.05) ;大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
结果表明:百球杀Ⅱ代的抗球虫指数ACI=191.5, 为高效抗球虫药;球痢速治、海南霉素、球虫宝ACI分别为184.6, 174.9, 165.2, 均为中效抗球虫药; 海南地克珠利的ACI为142.9, 为低效抗球虫药。
3 讨论
(1) 目前, 使用的抗球虫药物种类繁多, 这些药物被分为两类:聚醚类和化学合成药物。由于聚醚类药物使用时间早, 使球虫对大量此类药物产生了耐药性。而各类化学合成药物也因使用时间较长 (比如磺胺类某些药物应用已有数十年) 也有耐药性, 甚至存在交叉耐药性的现象。磺胺氯吡嗪钠是一种新型磺胺类抗球虫药物, 它的抗球虫活性峰期是球虫第2代裂殖体, 对第1代裂殖体也有一定作用, 是一种强效抗球虫药物。百球杀Ⅱ代的主要成分为磺胺氯吡嗪钠, 它的抗球虫指数为191.5, 为高效抗球虫药。
(2) 地克珠利是一种新型抗球虫药, 该药针对球虫的无性生殖和有性生殖过程都有很强的抑制作用, 但也有耐药性出现的报道, 且各地区耐药性不同。在本试验中, 地克珠利的ACI为142.9, 是低效抗球虫药, 说明廊坊地区球虫已对它产生了耐药性。
(3) 某些抗球虫药物还可促进鸡的增重率, 这是因为现在大多数药物都是中西药合剂, 其中许多中药成分有增重的效果, 如果在抗球虫的同时还可以增加机体抵抗力, 则会减少鸡的病死率, 降低经济损失, 这是目前抗球虫药物的研究方向之一。
参考文献
[1]林青, 于三科, 陈秀荔, 等.鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术的构建及致病性研究[J].西北农林科技大学学报:自然科学版, 2002, 30 (3) :35-37.
[2]聂奎, 何大文.畜禽抗球虫药物[J].四川畜牧兽医学院学报, 1999, 13 (3) :51-55.
艾美耳球虫 篇2
选用超声法、渗漉法以及水煎法提取白头翁药效组分,超声法和渗漉法采用L9(34)正交设计.在试验前进行柔嫩艾关耳球虫卵囊毒力测定试验,建立鸡感染模型.通过比较存活率、相对增重率、盲肠病变值、卵囊值和抗球虫指数(ACI)以及药效指数来判定白头翁提取物的抗球虫效果.结果发现每只鸡感染8万孢子化卵囊效果较理想;超声提取物UEb、UEc、UEd组相对增重率较高,分别为99.6%、101.6%、100.6%,均明显高于感染对照;所有提取物中超声提取物UEb的ACI最高,为165.6,感染对照ACI值仅为77.9.
作 者：杨峰昆 张丽芳 费陈忠 薛飞群 王从丛 韩春周 作者单位：杨峰昆,张丽芳,费陈忠,薛飞群(中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫病重点开放实验室,中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室,上海,41)
王从丛(中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫病重点开放实验室,中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室,上海,200241;南京农业大学动物医学院,江苏南京,210018)
韩春周(中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫病重点开放实验室,中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室,上海,200241;河北科技大学化学与制药工程学院,河北石家庄,050018)
一起鸡柔嫩艾美耳球虫病的诊治 篇3
1 发病情况
安乐乡养鸡户黄某饲养蛋鸡125羽、雏鸡510羽 (30日龄) , 于2014年4月28日雏鸡死亡12羽, 4月3日雏鸡死亡30羽、成鸡死亡5羽。主诉鸡腹泻、羽毛蓬乱, 饲喂土霉素粉及青霉素加链霉素, 效果不佳, 陆续有死亡。在此次发病期间, 雏鸡死亡176羽, 死亡率34.5%, 成鸡死19羽, 死亡率15.2%。
2临床症状
患鸡病初不饮不食、精神不振、翅膀下垂、弓腰、拥簇成堆、颤栗、腹泻、便血, 严重者排鲜红色血粪, 有的鸡出现头向后仰等明显的神经症状, 可视黏膜苍白、贫血, 严重者衰竭死亡。
3 病理变化
取病危及病死鸡解剖, 见鸡肉淡白, 黏膜苍白, 盲肠重度肿大、出血, 呈暗红色瘀斑, 肠腔中充满凝血块和盲肠黏膜碎片, 严重的鸡盲肠变硬和干涸, 肠黏膜脱落。
4 实验室检查
取患鸡新鲜粪便15 份 (每份5~10 g) 送县疫控中心检查, 通过饱和食盐水漂浮法收集虫卵, 在显微镜下观察见到较多淡黄绿色的卵圆形卵囊。
5 诊断
根据发病情况、临床症状、病理变化和实验室检查结果, 初步诊断为鸡柔嫩艾美耳球虫病。
6 防治措施
1) 给患病鸡用球痢克 (北海吉利来动物药业有限公司) 每羽口服1 片 (0.2 g) , 每天1 次, 连用3~5 d, 同时用磺胺氯吡嗪钠可溶性粉 (溶血痢球) (广西北流市神普药厂) 稀释饮水, 每50 kg水加磺胺氯吡嗪钠可溶性粉50 g, 每天1 次, 连用3 d。
2) 对未发病的同群鸡每50 kg水添加磺胺氯吡嗪钠可溶性粉50 g作预防性治疗, 每天1 次, 连用3~5 d。
3) 搞好鸡舍及运动场所的环境卫生, 每天打扫、清理粪便, 用40%二氯异氰脲酸钠进行消毒, 以1∶400~1∶4 000 稀释倍数现配现用, 连续消毒5 d, 以后坚持每周消毒1 次, 粪便堆积发酵处理, 减少柔嫩艾美耳球虫虫卵的生存空间。
通过这些措施处理后, 收效明显。发病鸡及同群鸡使用2~3 d药物后, 死亡数量大大减少, 鸡群精神、食欲逐渐恢复, 腹泻减少。治疗1周后鸡群基本恢复正常;相隔2周后取粪便送检、镜检未发现虫卵。
7分析与体会
1) 柔嫩艾美耳球虫的生活史为直接发育型, 不需中间宿主, 发育需经3 个阶段: (1) 无性生殖阶段, 在其寄生部位的上皮细胞内以裂殖生殖法进行。 (2) 有性生殖阶段, 从配子生殖法形成雌性配子, 即大配子, 雄性配子即小配子, 大配子与小配子结合形成合子, 这一阶段也是宿主在上皮细胞内进行。 (3) 孢子生殖阶段, 是指合子变为卵囊后, 在卵囊内发育形成孢子囊和子孢子, 含有成熟的子孢子的卵囊称为感染性卵囊。裂殖生殖和配子生殖在宿主体内进行, 称内生性发育。孢子生殖在外界环境中完成, 称外生性发育。鸡感染球虫是由于吞食了散布在土壤表面、饲料和饮水等外界环境中的感染性卵囊而发生的。 此批雏鸡和成鸡放养于房屋后坪, 有可能吞食了散布在土壤表面等外界环境中的感染性卵囊而发生, 或雏鸡与成鸡混群放养致感染球虫而发病、死亡。
2) 感染球虫病与季节有一定的关联。 根据我县调查资料报道, 4~6 月份鸡球虫病感染率均高于70%, 明显高于其他月份。 11 月份感染率45.07%为全年最低, 因为我县4~6 月份阴雨连连、潮湿的天气多, 雨水多为汛期阶段, 更适宜球虫繁殖, 故此次发病鸡与季节有一定关联。
3) 感染球虫与日龄有一定关联。 据调查资料报道, 15~49 日龄雏鸡球虫感染率最高, 为80.41%, 其次为120 日龄以上成鸡, 为69.86%。 1~14 日龄雏鸡感染率最低, 为15.3% , 而此次雏鸡死亡率达34.5%、成鸡死亡率达15.2%, 雏鸡死亡率高于成鸡死亡率, 可见此次鸡发病、死亡、感染率与日龄有一定关联。
4) 从治疗上, 早期治疗有一定效果, 可一旦出现症状和造成组织损伤, 再使用药物已无济于事。因此对于球虫病应采取药物预防, 养鸡户应随时储备一些治疗效果好的药物, 以防鸡柔嫩艾美耳虫病的突然暴发, 如磺胺二甲基嘧啶 (SM2) 按0.1%混入饮水, 饮用4 d, 休药期为10 d;磺胺喹恶啉 (SQ) , 按0.1%混入饲料, 喂2~3 d, 停药3 d后按0.05%混入饲料, 连用2 d, 停药3 d后再给药2 d;百球清2.5%溶液按0.0025% 混入饮水, 即每升水加百球清1 m L;磺胺二甲氧嘧啶 (SDM) 按0.05%混入饮水, 连用6 d, 休药期5 d。
5) 鸡群发生球虫病后, 群体比较虚弱, 较容易并发或继发细菌性疾病。 在治疗过程中应配合抗生素如氟哌酸、诺氟沙星等, 饮水中添加多维、葡萄糖等, 可防止脱水。
艾美耳球虫 篇4
1.1 试验材料
1.1.1 虫株
纯种E.tenella卵囊 (山西分离株) , 由山西农业大学兽医病理室提供。通过健康小公鸡传代, 按常规分离、纯化卵囊方法进行分离、纯化, 孢子化后置4℃备用。
1.1.2 试验动物
海兰白产蛋母鸡和公雏鸡, 来自平遥龙海种鸡场;公雏鸡出壳后运回育雏室, 给予连续的人工光照和标准日粮 (不含抗球虫药) , 饲养至10日龄时用于本试验。产蛋母鸡在无球虫环境中照常饲养, 待用。
1.2 试验方法
E.tenella感染鸡Ig G生成细胞和血清Ig G动态变化规律测定:将150只公雏鸡于第10日龄时随时分为T组和C组, 每组50只鸡, T组鸡口服感染E.tenella成熟卵囊8×104个/只, 在感染后第2、3、4、6、7、9、12、16、18、20、22天每次捕杀T组和C组鸡各5只, 取材, 检测各免疫器官及盲肠中的Ig G生成细胞数的动态变化。于第2、3、4、6、7、8、10、12、16、18、20、22、25、27、30天T组和C组各取5只鸡, 心脏采血, 检测循环血液中特异性Ig G含量的动态变化。
2 试验结果
2.1 DOT-ELISA检测结果
2.1.1 特异性试验
以灭菌生理盐水分别代替卵囊抗原、被检血清和酶标抗体, 进行DOT-ELISA检测, 结果表明均为阴性。
2.1.2 可溶性孢子化卵囊抗原与酶标抗体最佳工作条件的确定
通过试验比较两者的最佳工作条件分别为1︰40和1︰6000。
2.1.3 阻断性试验
以1∶10、1∶40稀释的正常鸡血清均能完全阻断, 结果为阴性;1∶80、1∶160可部分阻断, 1∶320不能阻断, 结果为阳性。
2.1.4 雏鸡感染E.tenella后血清中特异性Ig G含量动态变化结果
雏鸡初次感染E.tenella后, 第6天血清中开始检测出特异性Ig G, 随后抗体水平逐渐升高, 于第18天达到峰值, 持续4天后, 开始下降, 第30天时降至感染后第7天的水平。
2.2 球虫病鸡Ig G生成细胞测定结果
2.2.1 酶标抗体最佳工作浓度的确定
通过试验比较酶标抗体最佳工作浓度为1∶1000。
2.2.2 盲肠黏膜中Ig G生成细胞数的动态变化
阳性细胞主要位于淋巴滤泡和弥散淋巴组织, 特征为细胞核为淡蓝色、细胞浆为棕黄色。T组Ig G生成细胞从第3天开始增加, 第12天达到峰值。第9、12、16、18、20天与C组相比差异极显著 (P<0.01) , 第22天与C组差异显著 (P<0.05) 。
2.2.3 胸腺中Ig G生成细胞数的动态变化
胸腺中阳性细胞数量很少, 主要分布于髓质。在攻毒后的整个过程中, 有2个峰值, 分别出现在感染后第4天和第18天, 整体变化起伏不定, 无明显规律。
2.2.4 特异性试验结果
以灭菌生理盐水代替酶标抗体, 染色结果为阴性。
2.2.5 盲肠黏膜中Ig G生成细胞数的动态变化
阳性细胞主要位于淋巴滤泡和弥散淋巴组织, 特征为细胞核为淡蓝色, 细胞浆为棕黄色。T组Ig G生成细胞从第3天开始增加, 第12天达到峰值。第9、12、16、18、20天与C组相比差异极显著 (P<0.01) , 第22天与C组差异显著 (P<0.05) 。
2.2.6 脾脏中Ig G生成细胞数的动态变化
脾脏中的阳性细胞主要分布于白髓的淋巴小结、动脉周围淋巴鞘, 红髓中的脾索内也含有少量的阳性细胞。Ig G生成细胞在感染后第3天开始增加, 第12天达到峰值。从第4天开始直到第20天差异极显著 (P<0.01) , 第22天差异显著 (P<0.05) 。
2.2.7 盲肠扁桃体中Ig G生成细胞的动态变化
盲肠扁桃体中的阳性细胞主要集中于淋巴滤泡和弥散性淋巴组织。Ig G生成细胞在攻毒后的第2天即有显著增加, 峰值在第9天, 然后逐渐下降, 于第18天降至对照组水平, 在第4、6、7、9、12天差异极显著 (P<0.01) 。
2.2.8 法氏囊中Ig G生成细胞数的动态变化
法氏囊中的阳性细胞无论皮质、髓质均分布较多, 尤其以髓质部分分布密集。Ig G生成细胞从感染后第3天开始即显著增加, 差异显著 (P<0.05) , 于第6天开始差异极显著 (P<0.01) , 并一直持续到第22天, 峰值位于第16天。
3 分析与讨论
Dot-ELISA具有敏感性高、特异性强、被检样品用量少、不需特殊仪器、操作简便易行、结果便于长期保存等特点。因此, 该试验方法自问世以来, 不断应用于抗原抗体的检测。但在检测鸡球虫感染鸡血清中的特异性抗体和在卵黄中检测抗球虫特异性抗体方面, 尚未见有报道。本试验利用孢子化卵囊作为抗原, 感染球虫鸡血清或卵黄抗体为一级抗体, 酶标兔抗鸡Ig G为二级抗体, 建立了Dot-ELISA, 效果良好, 适合于球虫病鸡血清和卵黄抗体水平的检测。
试验研究结果表明:雏鸡初次感染E.tenella后于第6天即可在循环血液中检测出特异性Ig G, 随后抗体水平逐渐上升, 在第18天达到峰值, 第30天时下降至感染后第7天的水平。这个结果与Mockett (1986) 、Hasbullvh (1992) 等的报道基本一致。揭示了雏鸡感染E.tenella后, 鸡体Ig G生成细胞的动态变化规律为:主要免疫器官胸腺、法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体和盲肠局部的Ig G生成细胞于第2天和第3天开始增殖, 并分泌特异性Ig G, 此时, 球虫子孢子已穿过肠上皮细胞, 进入肠腺上皮细胞内进行发育, 并进入第一代裂殖生殖阶段。此期, 子孢子和第一代裂殖子均可刺激细胞产生和分泌Ig G, Ig G生成细胞数量于攻毒后第9天至第16天先后达到峰值, 然后逐渐下降, 盲肠扁桃体中的Ig G生成细胞在第18天降至对照组水平, 盲肠、脾脏和法氏囊中的Ig G生成细胞数在第22天仍高于对照组, 且差异显著。
成熟卵囊被鸡吞食后, 在肌胃中受机构作用囊壁破裂, 释放出4个孢子囊。孢子囊在十二指肠和小肠中部受胆汁和酶的作用, 子孢子逸出, 子孢子一逸出, 就侵入宿主的肠绒毛部黏膜上皮细胞, 然后经巨噬细胞和上皮淋巴细胞进行转移, 再进一步发育。在上述过程中, 巨噬细胞和上皮间淋巴细胞给辅助性T细胞 (TH) 提供抗原信息, TH接受抗原信息后, 通过释放一些可溶性因子作用于B细胞, 使处于休眠状态的B细胞活化, 并增生和分化, 先转化为浆母细胞, 进而增殖为浆细胞, 产生和分泌特异性抗体到体液中, 从而发挥抗体的抗球虫作用。这个作用的形式之一, 是抗子孢子抗体可与子孢子结合, 抑制子孢子侵入到肠上皮细胞内。
摘要：为了揭示鸡柔嫩艾美耳球虫 (E.tenella) 病的免疫机制, 试验从分子水平、细胞、亚细胞对人工攻毒病鸡特异性抗体、免疫细胞的动态变化及在抗球虫中的作用进行了探讨, 试验结果如下:一是雏鸡感染E.tenella后, 第6天即可在外周血液中检测出特异性IgG, 于第18天达到峰值, 第23天开始下降, 第30天时降至感染后第7天的水平;二是揭示了雏鸡感染E.tenella后, 鸡体IgG生成细胞的动态变化规律为:主要免疫器官胸腺、法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体和盲肠局部的IgG生成细胞于第2天和第3天开始增殖, 在第9天至第16天达到峰值, 然后逐渐下降, 盲肠扁桃体中的IgG生成细胞在第18天降至对照组水平, 盲肠、脾脏和法氏囊中的IgG生成细胞数在第22天仍高于对照组, 且差异显著。
艾美耳球虫 篇5
当前, 鸡球虫全世界报道的有9种。其中公认的有7种, 分别是柔嫩艾美耳球虫 (Eimeria tenella) 、毒害艾美耳球虫 (E.necatrix) 、堆型艾美耳球虫 (E.acervulina) 、布氏艾美耳球虫 (E.brunetti) 、巨型艾美耳球虫 (E.maxima) 、和缓艾美耳球虫 (E.mitis) 和早熟艾美耳球虫 (E.praecox) 。各种球虫的致病性不同, 以柔嫩艾美耳球虫的致病性最强, 其次是毒害艾美耳球虫, 但生产中多是几种球虫混合感染。
堆型艾美耳球虫是集约化养鸡场普遍公认的3种常见球虫之一, 流行率最高, 对养鸡业的危害仅次于柔嫩艾美耳球虫。具有中等致病力, 感染后虽不引起鸡只大批死亡, 但可引起亚临床型球虫病, 影响鸡只的生产性能。堆型艾美耳球虫不仅伴随柔嫩艾美耳球虫混合感染引起临床型球虫病, 有时主要由堆型艾美耳球虫感染引起的亚临床型球虫病对养鸡业造成的损失比临床型球虫病大得多。该病是鸡最常见的球虫之一, 分布于世界各地, 通常寄生于小肠前段, 在严重感染时, 常使雏鸡精神不佳, 厌食, 排白色黏液样粪便, 此后生长停滞, 体重不增, 产蛋停止, 甚至死亡。因此, 有必要对堆型艾美耳球虫病的特性进行全面了解, 尤其是流行特点、致病性、造成的危害及防治等方面深入了解。
1. 堆型艾美耳球虫病的流行状况
(1) E.acervulina的流行状况
1929年Tyzzer在《美国卫生学杂志》上发表“鸡形目的球虫病”, 详述了鸡的Eimeria tenella和之外3个新种 (E.acervulina, E.maxima和E.mitis) 的形态特征。之后, 许多国家相继报道有堆型艾美耳球虫存在, 越来越多的学者开始对其生物学特性进行深入研究。于1981年林昆华和熊大仕报道我国在北京查出E.acervulina等6种鸡球虫。
Williams1994年对法国的41个鸡场的球虫流行情况调查发现, E.acervulina的流行率达100%。1990年, Kucera对前捷克斯洛伐克的16个鸡场的球虫进行了调查, 结果发现E.acervulina流行率达94%。Long等于1987报道, 英国豪顿家禽研究所的鸡只在1960年-1962年E.acervulina的流行率分别为31.37%、25.12%、31.62%。
在我国, E.acervulina是养鸡场最常见的一种球虫, 分布十分广泛, 众多学者对其流行状况进行了研究。例如黄兵等 (2002) 对上海地区不同区县的种鸡场、肉鸡场和蛋鸡场的鸡球虫病存在情况进行了调查, 发现E.acervulina出现率67%。李培英等 (2004) 对安徽合肥市79份鸡的粪样进行了鸡球虫感染情况的检查, 得出鸡球虫优势虫种为E.acervulina。王纯 (2011) 对丹东地区肉仔鸡球虫病流行病学调查发现堆型艾美耳球虫占60%～70%, 为该地区优势虫种。该种球虫已在我国29个省市区均有报道。
(2) 流行特点
本病一年四季发病, 但多发生于温暖潮湿的季节, 从4月份开始到9月末为流行季节, 8月份最严重, 尤其是在多雨、闷热的时候。近年来, 由于人工控制饲养环境使季节性差别越来越小。多变应激因素可使发病率增高。应激因素包括营养失调、转群、疫苗接种、饲养方式 (平养、网养) , 不适宜的小气候 (如密度、温度、湿度、舍内氨浓度) 。其中湿度是维持球虫感染的关键因素, 密度是维持球虫感染的基础, 其他是辅助因素。饲养管理条件不良、鸡舍潮湿、饲养密度大、卫生条件恶劣以及各种应激导致机体免疫力下降而容易感染发病;饲料中维生素A缺乏, 容易使消化道黏膜的完整性、自我保护性和血液凝固机制受损, 使球虫卵囊易于侵袭。
鸡球虫是宿主特异性和寄生部位特异性都很强的原虫, 鸡是各种鸡球虫的唯一宿主。E.acervulina只感染鸡而不感染其他畜禽。所有日龄和品种的鸡对球虫都有易感性。一般多发于3～6周龄鸡, 2周龄以内的鸡群很少感染, 感染后多表现为亚临床型, 但影响饲料转化率和增加体质量, 体质量比正常鸡低25%左右, 不容忽视。感染高峰在14～22日龄。E.acervulina也经常与其他球虫混合感染, 病程多为6～10 d, 如果不采取措施, 死亡率也可达50%～100%。
目前发病日龄呈现越来越早的趋势, 往往3～5日龄雏鸡即可感染此球虫。混合感染较多, 最常见一种或几种球虫同时爆发, 或球虫与法氏囊混合感染, 鸡痘与球虫混合感染, 也与坏死性肠炎混合感染等。
(3) 传播途径及其他感染因素
病鸡和带虫鸡是本病的主要传染源, 被粪便污染的饲料、饮水、垫料等都具有大量的卵囊, 易感鸡采食后就会暴发此球虫病。卵囊在28℃左右的温暖和潮湿环境中经1～3 d可发育成具有侵袭性的孢子化卵囊。摄入有活力的孢子化卵囊是唯一的天然传播方式。球虫无天然中间宿主, 但可经不同的动物昆虫等进行机械传播, 在鸡舍内经常出没的甲虫是卵囊的机械性携带者。可将球虫卵囊从一个鸡场传播到另一个鸡场, 故昆虫多的潮湿季节易感染此球虫病。同群易感鸡通过啄食行为摄入。
球虫对外界消毒剂及恶劣的外界环境有抵抗力。卵囊对高温和干燥的抵抗力较弱, 湿度为21%～33%, 温度在40℃以上, 经l～5 d就会死亡。卵囊在土壤中生活力达4～9个月, 在有树荫的地方甚至可达15～18个月。在鸡舍内由于粪便的氨气和细菌真菌的作用, 只能存活几天。
2. 堆型艾美耳球虫的生物学特性
(1) E.acervulina卵囊及孢子囊特征
卵囊为中等大小, 呈卵圆形, 无色。囊壁光滑分为2层, 厚度为1μm, 卵囊壁淡黄绿色。大小为17.7～20.2μm×13.7～16.3μm, 平均为18.3μm×14.6μm, 形态指数为1.2。孢子囊也呈卵圆形, 大小为9～12μm×4.5～7.5μm, 平均10.5μm×5.5μm。不同地区、不同虫种的卵囊形态大小略有不同。E.acervulina的潜在期为97～99 h, 最短孢子化时间为11～21 h。
(2) E.acervulina的致病性
雏鸡吞食成熟的孢子化卵囊后, 先在肌胃中通过机械研磨使卵囊壁破裂, 释放出孢子囊。进入十二指肠, 孢子囊在胰酶和胆汁的作用下, 子孢子脱囊而出, 随即通过内吞作用在十二指肠和空肠黏膜上皮细胞内形成带虫空泡;或通过吞噬细胞的吞噬, 被运送至肠腺上皮细胞。发育成为滋养体, 经裂殖生殖法进行增殖, 形成大量的裂殖子从而破坏上皮细胞, 裂殖子逸出后再次侵入新的上皮细胞, 以同样的裂殖生殖法进行增殖, 因而又破坏新的上皮细胞, 如此反复多次, 可使上皮细胞受到严重的破坏, 导致血管破裂, 肠上皮细胞崩解, 从而影响肠黏膜的完整性。当无性生殖进行了若干世代之后, 即转为有性繁殖配子生殖过程, 这也是在上皮细胞内进行, 最后形成卵囊, 上皮细胞破裂后, 卵囊又进入肠管内, 并随动物粪便排出于外界环境中, 在适当条件下, 又发育形成侵袭性的卵囊。
由于E.acervulina广泛寄生于十二指肠和空肠上段, 整个肠上皮细胞被球虫占领, 肠壁弹性丧失, 黏膜层变薄, 上皮组织广泛脱落, 饲料消化率、利用率低, 而且饮水量的40%～60%不能被吸收, 尽管鸡大量饮水仍出现脱水症状。所以说E.acervulina有较强的致病性, 病变主要集中在十二指肠。轻度感染时, 病变集中于十二指肠袢, 肠黏膜内出现许多点线状的灰白色坏死灶 (有性生殖体在小肠绒毛上皮细胞形成集落所致) , 与肠管大致成直角, 从肠管外也清晰可见砂粒样结节。根据病灶的形状, 而赋予堆型 (acervulina砂粒样堆) 艾美耳球虫这一学名。严重感染时可引起肠壁增厚和病灶融合成片, 肠道含水样液体。临床一般症状为食欲减退, 精神不振。从人工感染试验结果看, 感染量超过5万个卵囊时, 鸡的生长就会受到明显影响, 体质量增速显著下降, 随着感染剂量的增加, 体质量增速显著减少, 甚至相对增长率可下降40%以上, 即使在生长后期也难以得到补偿;粪便明显变稀, 带有大量黏液, 部分试验鸡拉血样红色粪便, 很少鸡出现死亡。正是由于E.acervulina的感染呈隐性感染, 一般不会引起明显的临床症状, 因而常被养鸡者忽视。其实, 这种隐性感染造成的损失更加严重。
3. 堆型艾美耳球虫对养殖业危害的新趋势
在集约化养殖场流行率最高的堆型艾美耳球虫不仅伴随柔嫩艾美耳球虫混合感染引起临床型球虫病, 有时主要由堆型艾美耳球虫感染引起的亚临床型球虫病对养殖业造成的损失比临床型大的多。由于卵囊无处不在, 饲养员、工具、饲料、飞虫、禽兽、尘土都可作为球虫病的传播媒介, 使鸡感染球虫病。随着养鸡方式的改变, 鸡 (尤其肉鸡) 球虫病对养殖的业危害越来越大。
(1) 鸡球虫病分布广泛, 对养鸡业危害普遍
鸡球虫病分布地区广泛, 几乎所有养鸡的地方都有球虫病。据文献报道, 全世界鸡球虫病的发病率高达50%～70%。全世界每年因鸡球虫病造成的经济损失超过80亿美元。在我国华南、华东南、华西南、华中地区, 由于气候温暖潮湿, 更有利于球虫卵囊的生存和传播, 该病对养鸡业的危害更加严重。
(2) 鸡球虫病由春秋多发病向常年发病发展
该病过去多发生于春秋季节, 随着养鸡业的进步与发展, 孵化由季节性转变为常年孵化, 温湿度由自然型转变为人工控制, 以及随着现代养鸡规模的扩大, 养殖密度的增大, 人工控制适宜养鸡业发展空间的增大, 也给球虫卵囊增大了生存和传播的空间。因该病原体不仅生存期长, 抵抗力强, 一般消毒药物难以将其杀灭, 老鸡场普遍发病率较高, 病原体的污染周期延长。
(3) 鸡球虫病由雏鸡多发向成鸡和种鸡发展
过去认为该病是雏鸡的多发病, 但随着养鸡环境变化, 抗球虫病药物的广泛使用, 以致种种不规范地使用抗球虫药物的不断发生, 导致球虫的耐药性增强, 引起球虫的遗传因子突变, 球虫的耐药性一代比一代增强, 球虫病的感染范围也逐渐由雏鸡发展到成鸡和种鸡。鸡球虫病感染成鸡虽然多数呈隐性经过, 但该病不仅影响育成鸡的生长发育, 而且对种鸡的成活率、产蛋率, 以及种蛋的受精率等均会造成相应的影响。
(4) 现代集约化养鸡业给鸡球虫病的传播和蔓延增大了机会
现代养鸡业已逐渐向产业化方向发展, 集约化的大批量生产。密集的饲养方式以及人工控制适宜于养鸡业发展的生活环境, 虽然大大促进了养鸡业的生产效率, 然而鸡群的高密集, 人工给鸡球虫病的互相传播和蔓延增大了机会。
(5) 与其他致病菌或病毒混合感染和继发感染率增高
细菌感染影响了球虫的致病程度, 球虫感染也可影响细菌感染的后果。研究表明, 许多种病毒感染可加剧球虫病的临床表现, 提高球虫病的死亡率。
4. 防治建议
艾美耳球虫 篇6
1 材料
1.1 虫株
E.tenella HN株, 由海南省农业科学院畜牧兽医研究所实验室提供。
1.2 试验动物
刚出壳的文昌鸡, 购自文昌龙泉文昌鸡实业有限公司。饲养用的鸡笼和所有用具进行严格消毒, 雏鸡自由采食和饮水;饲喂不加任何抗球虫药的全价配合饲料, 饲喂前高温 (80℃) 消毒30 min。试验前检查球虫卵囊, 未发现球虫感染。
1.3 主要试剂和菌株
总RNA提取试剂盒、Quant c DNA第1链合成试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、重组质粒抽提试剂盒, 均购自天根生化科技 (北京) 有限公司;T4 DNA连接酶、EcoRⅠ、HindⅢ、p MD18-T载体, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;JM109感受态细胞, 由海南省农业科学院畜牧兽医研究所实验室提供。
2 方法
2.1 球虫卵囊的复苏与纯化
取单卵囊繁殖的鸡E.tenella HN株孢子化卵囊, 按照每羽2×104个卵囊经口感染10日龄无球虫文昌鸡;感染7 d后扑杀, 取其盲肠用组织粉碎机充分粉碎;按照2 mg/m L的剂量加入胃蛋白酶, 调节p H值至2.0, 在38~39℃水浴锅中消化1.0~1.5 h;将消化液依次用100, 200, 300, 400目的铜筛过滤, 收集滤液于离心管中, 以3 000 r/min离心15 min;弃上清液, 向沉淀中加入饱和食盐水, 混匀后静置10 min;以3 000 r/min离心15 min, 离心管上层漂浮的白色似“塞子”状的物质即为球虫卵囊;转移上清液于另一支离心管中, 加入多量体积的纯化水, 以3 000 r/min离心15 min;收集沉淀物, 其沉淀再用纯化水重复离心水洗几次, 即可得到纯化的未孢子化的卵囊。将卵囊置25 g/L重铬酸钾溶液中, 于29℃通风培养, 当80%以上的卵囊孢子化时停止培养;将卵囊置25 g/L重铬酸钾溶液中, 4℃保存, 备用。
2.2 E.tenella HN株孢子化卵囊总RNA的提取
取适量纯化卵囊经DEPC处理水离心洗涤后, 用液氮研磨破碎卵囊, 按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。
2.3 引物的设计与合成
参照Gen Bank中报道的鸡堆型艾美耳球虫 (E.acervulina) 美国株 (US) 3-1E基因c DNA序列 (登录号为AF113613) 设计引物P1和P2, 目的片段长度为513 bp。引物序列:P1 5'-ATGGGTGAAGAGGCT-GAT-3';下游引物P2 5'-TTAGAAGCCGCCCTGG-TA-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.4 E.tenella HN株c DNA的合成
按照Quant c DNA第1链合成试剂盒说明书反转录合成c DNA第1链, PCR反转录体系:总RNA约12.5μL, 随机引物 (10μmol/L) 2.0μL, d NTP Mixture (2.5 mmmol/L) 2.0μL, Quant反转录酶1.0μL, 补加DEPC-H2O至20.0μL。反应条件:37℃60 min。
2.5 E.tenella HN株3-1E基因的PCR扩增
以反转录获得的球虫c DNA为模板, PCR扩增E.tenella HN株3-1E基因。PCR扩增体系:c DNA模板4.0μL, 10×PCR Buffer (不含Mg2+) 2.5μL, d NTP Mixture (2.5 mmol/L) 2.0μL, Mg Cl2 (25 mmol/L) 2.5μL, Ex Taq聚合酶 (5 U/μL) 0.6μL, P1、P2 (10 pmol/L) 各0.5μL, 无菌去离子水12.4μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性1 min, 52℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共32个循环;最后72℃再延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.6 E.tenella HN株3-1E基因的克隆及序列测定
回收纯化PCR产物, 于4℃与p MD18-T载体连接过夜;转化JM109感受态细胞后, 涂布于含异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 (X-gal) 和氨苄西林的平板上, 37℃培养;挑取白斑接种于LB培养基中, 增菌培养后提取重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定, 将鉴定正确的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。用BLAST和DNAStar软件对E.tenella HN株3-1E基因序列与已发表的国内外虫株3-1E基因序列进行比较分析, 并绘制系统进化树。
3 结果与分析
3.1 E.tenella HN株3-1E基因的RT-PCR扩增结果
以总RNA为模板, 反转录出单链c DNA, 经PCR扩增, 获得1条长约513 bp的预期特异性目的片段, 结果见图1。
1.PCR产物;M.DL-2 000 Marker。
3.2 E.tenella HN株3-1E基因的克隆
回收的PCR产物与p MD18-T载体连接所构建的重组质粒p MD-3-1E用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定, 结果在约513 bp处出现特异性DNA条带, 见图2, 说明扩增的DNA片段被成功插入p MD18-T载体。
1.p MD-3-1E酶切产物;M.DL-2 000 Marker。
3.3 E.tenella HN株3-1E基因的序列测定及分析
通过NCBI的ORF Finder分析, E.tenella HN株3-1E基因包含1个阅读框 (ORF) , 长度为513 bp, 共编码170个氨基酸。利用DNAStar软件对E.tenella HN株3-1E基因序列与已发表的E.tenella GS株3-1E (登录号为AY660552.1) 、E.tenella YL株3-1E (登录号为EF069437.1) 、E.tenella sporozoite antigen 3-1E (登录号为EF426471.1) 、E.acervulina US株3-1E (登录号为AF113613.1) 和E.acervulina QH株3-1E (登录号为AY660553.1) 基因序列进行对比分析发现, 核苷酸的同源性分别为99.8%、99.6%、99.8%、99.8%和99.2%, 核苷酸的差异主要表现在5个位点上, 分别是284, 286, 292, 441, 447;氨基酸的同源性分别为99.4%、99.8%、100%、100%和98.2%, 氨基酸的差异主要表现在4个位点上, 而位点441处核苷酸发生的变化未引起相应的氨基酸发生改变。核苷酸和氨基酸的差异性比较结果见表1。
利用DNAStar软件进行序列比对, 绘制3-1E基因的系统发育进化树, 见图3。同种间3-1E基因比较, E.tenella HN株与E.tenella sporozoite antigen株的遗传关系最近;同属间3-1E基因比较, E.tenella HN株与E.acervulina US株的遗传关系最近。
4 讨论
对于鸡球虫基因工程疫苗的研制来说, 抗原的选择至关重要, 必须具有良好的免疫原性和交叉保护性[2]。3-1E基因是E.tenella子孢子与裂殖生殖阶段的表面抗原, 在虫体与宿主的相互关系中起重要作用。研究表明, 以E.acervulina 3-1E重组蛋白作为免疫原可使感染E.acervulina的鸡卵囊产量降低30%[3]。克隆表达的鸡E.tenella YL株3-1E基因产物对鸡E.tenella的攻击有一定的免疫保护作用[4,5,6]。扈炳新等[7]克隆表达了鸡E.tenella哈尔滨株的3-1E基因, 结果发现, 肌肉注射3-1E重组蛋白能刺激鸡体产生一定的免疫反应, 对E.tenella感染产生有力的保护。说明3-1E基因是一个较为理想的疫苗候选抗原基因, 值得深入研究。
对球虫免疫的研究发现, 不同种及同种不同株间存在抗原差异, 同一个体的不同发育阶段抗原也不同。本研究发现:不同地理来源的E.tenella虫株非常保守, 各虫株的核苷酸同源性为99.2%~99.8%, 氨基酸的同源性为98.2%~100%;同种间3-1E基因比较, E.tenella HN株与E.tenella sporozoite antigen株的遗传关系最近;同属间3-1E基因比较, E.tenella HN株与E.acervulina US株的遗传关系最近。由此说明, E.tenella HN株3-1E基因序列非常保守, 可作为有效的疫苗候选因子进行下一步基因工程疫苗研究。
参考文献
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艾美耳球虫 篇7
1 材料与方法
1.1 球虫
斯氏艾美耳球虫,由吉林大学畜牧兽医学院寄生虫及寄生虫病实验室保存。
1.2 试剂与酶
Trizol,购自Invitriogen公司;AMV反转录酶、限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ以及pMD18-T载体,TaKaRa公司产品;质粒DNA小量快速制备试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒,博日公司产品;大肠杆菌TOP10感受态细胞,宝泰克公司产品。
1.3 斯氏艾美耳球虫卵囊
E.stiedai 卵囊,经吉林大学畜牧兽医学院寄生虫及寄生虫病实验室分离、纯化、鉴定后保存于重铬酸钾盐溶液中。取该溶液加入等体积的水混匀,3 500 r/min离心15 min;弃上清液,再加水,重复洗涤沉淀3次;向沉淀中加入终浓度为10%的次氯酸钠,于4 ℃条件下杀菌15 min;再用纯化水洗涤3次,去除残留的次氯酸钠,镜检;取1×107个卵囊用于提取总RNA,备用。
1.4 引物的设计
根据GenBank中登录的柔嫩艾美耳球虫ADF基因核苷酸部分序列(登录号为EF195234.1)设计合成1对引物,P1 5′-AGGAATTCATGGCGAGCGGAATGCCAGTC-3′(下画线处为EcoRⅠ酶切位点),P2 5′-GAAAGCTTCTAATGGAGCACGCTTAGGTC-3′(下画线处为HindⅢ酶切位点)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.5 球虫卵囊总RNA的提取
取纯化的球虫卵囊约1×107个,加液氮研磨,然后以Trizol方法提取球虫卵囊的总RNA。
1.6 RT-PCR及克隆
使用AMV反转录酶试剂盒将总RNA反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR 扩增。反应体系(总体积为20 μL):2×PCR Master Mix 10 μL,引物P1和P2各1 μL,模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,回收扩增条带,与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞;涂布于含氨苄西林的LB平板上,过夜培养;挑取单克隆抗体,收集菌液提取质粒;用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定,将阳性克隆菌送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.7 序列分析
用DNAStar软件对测得的斯氏艾美耳球虫与GenBank登录的柔嫩艾美耳球虫相应核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比对和分析。
2 结果
2.1 ADF基因部分序列的扩增结果
电泳结果显示,成功扩增出长为357 bp的斯氏艾美耳球虫ADF基因,与柔嫩艾美耳球虫ADF基因片段大小相同,见图1。
1.ADF基因;M.DL-2 000 Marker。
2.2 重组质粒的酶切鉴定结果
用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pMD18-ADF,得到2条带,与预期结果相同,见图2。
1.pMD18-ADF重组质粒EcoRⅠ和HindⅢ双酶切结果; M.DL-2 000 Marker。
2.3 ADF基因核苷酸序列分析结果
斯氏艾美耳球虫长春株与GenBank公布的柔嫩艾美耳球虫ADF核苷酸序列和氨基酸序列的同源性均为99.2%,并且已经将测序获得的序列提交到GenBank,登录号为JF358017.1。斯氏艾美耳球虫ADF基因的核苷酸序列与柔嫩艾美耳球虫ADF基因的核苷酸共有3个不同碱基(见图3)。第114 bp和240 bp处的变化属于同义密码子,但85 bp(参与编码第29个氨基酸)处由T变为C,氨基酸由F(苯丙氨酸)变为L(亮氨酸)(见图4)。经DNAStar软件对斯氏艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的ADF基因所编码的氨基酸序列进行分析,第29个氨基酸的变化并没有影响到此处蛋白的抗原决定簇(见图5)。
3 讨论
斯氏艾美耳球虫是危害养兔业最为严重的病原之一,寻找抗兔球虫的理想保护性抗原是研制球虫亚单位疫苗和基因工程疫苗的关键。一直以来,由于微线蛋白在寄生虫与宿主细胞的黏附中起重要作用[5,6],被认为是理想的阻断子孢子侵入宿主的候选基因[7]。近年来,越来越多的学者对微线蛋白作为疫苗候选基因的免疫效果进行了研究,得到了良好的效果,已证实柔嫩艾美耳球虫子孢子的EtMIC-2能同时诱导不同种球虫间的交叉免疫保护性[8]。孟庆玲[9]利用MIC-5制备了减毒鼠伤寒沙门菌介导的斯氏艾美耳球虫DNA疫苗,并进行了动物保护性试验,结果表明,重组DNA疫苗能够诱导机体产生较高水平的抗球虫体液免疫和细胞免疫应答,有较好的免疫效果。
ADF作为ADF/cofilin家族的成员,是构成微线蛋白的重要肌动蛋白结合蛋白,其分子由单独的折叠区和ADF同源区构成[10],虽然整个ADF/cofilin家族在氨基酸顺序和数量上有相当大的变化,但目前已获得的结构表明,该家族的序列具有高度的保守性[11,12]。近年来,在寄生虫领域的研究发现,ADF在寄生虫侵染宿主的过程中起到了重要作用,很多学者对ADF免疫原性及作为疫苗候选基因的可能性进行了研究。由弓形虫ADF基因构建核酸疫苗能够有效引起机体的细胞免疫和体液免疫,对免疫小鼠产生有效的保护作用,说明ADF可能是一个潜在的疫苗候选基因。
研究根据GenBank中登录的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,扩增出斯氏艾美耳球虫的ADF基因序列,与GenBank中登录的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列相比有3个不同的碱基,分别位于85 bp(T→C)、114 bp(C→T)和240 bp(A→C)处,但只有85 bp处参与编码的氨基酸由F(苯丙氨酸)变为L(亮氨酸),其余位置氨基酸并未发生改变。DNAStar软件的分析结果表明,此处单氨基酸的改变并没有影响蛋白质的疏水性质和抗原决定簇的性质(图5箭头处所示),ADF基因在进化过程中结构上的保守性保证了功能的稳定性和统一性。因此,对斯氏艾美耳球虫ADF基因的克隆和分析为下一步进行其作为保护性抗原的可行性研究奠定了一定基础。
摘要：为了获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因并分析其与柔嫩艾美耳球虫长春株相应序列的同源性,试验根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因部分序列,然后将其克隆到pMD18-T载体中,应用DNAStar软件对测得序列进行序列分析。结果表明:斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因大小为357 bp;经DNAStar分析,我国斯氏艾美耳球虫长春株与柔嫩艾美耳球虫长春株ADF核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99.2%。说明ADF基因在进化过程中高度保守。
关键词：斯氏艾美耳球虫,ADF基因,克隆,序列分析
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艾美耳球虫 篇8
1材料与方法
1. 1试验动物
1日龄海兰雏鸡,购自沈阳农业大学孵化场,购回后在严格消毒的环境下饲养,喂食无抗球虫药的全价饲料至14日龄,试验开始前检查有无球虫感染。
1. 2试验虫株
试验虫株分离自沈阳市新民某肉鸡场。从病死鸡的盲肠采集内容物,分离并鉴定为柔嫩艾美耳球虫。经药物敏感性检测,该分离株对地克珠利敏感。
1. 3起始诱导浓度的确定
对14日龄无球虫感染的雏鸡逐只称重,随机分组并调整各组雏鸡的体质、重量基本相同。试验共分7组,每组10只雏鸡,将地克珠利按照0. 05,0. 1, 0. 3,0. 5,1. 0 mg / kg的剂量添加到各试验组饲料中, 另设感染不用药组和不感染不用药组。分组后开始给药直至试验结束,除不感染不用药组外,其余各组每只鸡接种2. 5 × 104个柔嫩艾美耳球虫( 沈阳分离株) 孢子化卵囊。参照参考文献[2]中的方法确定诱导药物的起始浓度。
1. 4抗地克珠利虫株诱导试验
取14日龄无球虫感染雏鸡称重后分成3组,即地克珠利组、感染不用药组和不感染不用药组,每组10只雏鸡。在15日龄时,除不感染不用药组外,其余2组每只雏鸡均经口感染2. 5 × 104个柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊,接种后第8天剖杀所有雏鸡,收集盲肠和粪便中的卵囊,孢子化后供下一次传代使用。
地克珠利组采用药物浓度递增的方法分批对柔嫩艾美耳球虫敏感株进行诱导,从低浓度到高浓度, 地克珠利组每次传代诱导后所收集的卵囊需供下一次感染,根据相对卵囊产量和抗药性程度逐渐提高药物浓度,直至诱导出柔嫩艾美耳球虫对地克珠利的抗药性虫株。当提高药物浓度后,若收集不到足以传代的卵囊,则重复原药物浓度传代。感染不用药组用同样方法重复传代。
1. 5诱导后虫株的抗药性检测
1. 5. 1试验分组取14日龄雏鸡逐只称重,随机分为5组,即敏感组、抗药组及其对应的感染组和感染不用药组,每组10只雏鸡。各感染组每只雏鸡口服接种5. 5 × 104个孢子化卵囊,于感染当天分别在饲料中添加地克珠利1. 4 mg /kg。感染后每天观察雏鸡的体况及第5 ~ 7天血粪便情况; 感染后第8天,逐只称重,剖杀后进行盲肠病变记分; 收集各组雏鸡粪便,计数卵囊产量。
1. 5. 2抗药性的判定分别用最适抗球虫活性百分率( POAA) 、病变记分减少率( RLS) 、相对卵囊产量( ROP) 、抗球虫指数( ACI) 等4项指标判定抗药性［3］,根据4项指标中出现阳性指标的数量确定抗药程度。判断标准: 1) 无抗药性,4项指标均为阴性; 2) 轻度抗药,4项指标有3项指标为阴性; 3) 中度抗药, 4项指标有2项指标为阳性; 4) 完全抗药,4项指标有3项及3项指标以上为阳性。
2结果与分析
2. 1药物诱导起始浓度的确定
0. 05 mg / kg地克珠利组的相对卵囊产量为63. 7% ,其他计量药物浓度组的卵囊数较少或无卵囊产生,因此确定地克珠利的起始诱导浓度为0. 05 mg / kg。
2. 2抗地克珠剂虫株的诱导试验
以0. 05 mg /kg地克珠利作为起始诱导浓度,逐渐增加药物浓度,经过18次传代,获得了对浓度为1. 4 mg / kg地克珠利的抗药株。 具体过程: 0. 05 mg / kg地克珠利传3代→0. 1 mg / kg地克珠利传3代→0. 2 mg / kg地克珠利传3代→0. 5 mg / kg地克珠利传2代 → 0. 8 mg /kg地克珠利传2代 → 1. 0 mg / kg地克珠利传2代→1. 4 mg / kg地克珠利传3代。
2. 3诱导后虫株的抗药性检测
诱导后虫株对1. 4 mg /kg地克珠利产生了完全抗性,结果见表1。
3讨论
虽然在实验室条件下抗药性产生的时间和生产实践中抗药性产生的时间并无直接的一致性,但若能用实验室诱导的方法检测得知球虫对某种新药产生抗药性的时间,就可以针对该药物的使用时间事先作出准确的预测。研究人员采用过的诱导方法有在较高药物浓度压力下大剂量感染法［4］和药物浓度递增法［5］,这两种方法都可以获得抗药虫株,但笔者认为后者略好一些,虽然诱导的时间较长,但可以获得比较稳定的抗药性,因此本次试验采用的是药物浓度递增法。
在球虫抗药性诱导的两种方法中,一种如韩红玉等［2］对每只鸡接种1 × 105个卵囊,以0. 05 mg /kg地克珠利和2. 0 mg /kg马杜拉霉素作为起始诱导浓度, 分别经过18次和20次传代,获得了柔嫩艾美耳球虫对浓度为1. 2 mg /kg地克珠利和对7. 0 mg /kg马杜拉霉素的抗药株; 另一种就是大剂量接种球虫,如李安兴等［6］对每只鸡接种2 × 106个孢子化卵囊,以0. 125 mg / kg地克珠利作为起始诱导浓度,只经过5次传代,就获得了柔嫩艾美耳球虫对浓度为1. 5 mg / kg地克珠利的抗药株。本试验采用逐渐递增药物浓度的方法,从0. 05 mg /kg地克珠利开始,经过18次传代,获得了柔嫩艾美耳球虫对1. 4 mg / kg地克珠利的抗药株。抗药株的成功诱导为下一步敏感株和抗药株的超微结构对比提供了试验材料。
摘要：为了获得柔嫩艾美耳球虫抗地克珠利虫株,试验采用连续递增药物浓度的方法对柔嫩艾美耳球虫沈阳分离株进行实验室诱导。结果表明:地克珠利从0.05 mg/kg的起始药物浓度开始经18次传代,获得了对浓度为1.4 mg/kg地克珠利的抗药性;经抗球虫指数(ACI)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)、最适抗球虫活性百分率(POAA)检测,沈阳新民分离株对地克珠利失去了敏感性。说明短时间应用地克珠利,球虫也能够产生抗药性。
关键词：柔嫩艾美耳球虫,地克珠利,抗药性,沈阳分离株,鸡,药物诱导
参考文献
[1]王建民,李驰,姚龙泉,等.鸡柔嫩艾美耳球虫田间分离株对抗球虫药物的敏感性试验[J].湖北农业科学,2009,48(1):150-152.
[2]韩红玉,赵其平,陈兆国,等.柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株的实验室诱导[J].中国兽医学报,2004,24(2):138-140.
[3]赵其平,韩红玉,黄兵,等.鸡球虫广东清远分离株对七种药物的耐药性试验[J].中国兽医寄生虫病,2003,11(2):13-17.
[4]WEPPELMAN R M,BATTAQLIA J A,WANG C C.Eimeris tenella:The selection and frequency of drug resistant mutants[J].Exp Parasitol,1997,42(1):56-66.
[5]CHAPMAN H D.Eimeria tenella:experimental studies on the development of resistance to amprolium,clopidol and methyl banzoquate[J].Parasitology,1978,76(2):177-183.
