关键词： 蛋白酶
胱氨酸蛋白酶抑制剂C（精选八篇）
胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇1
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C, Cys C) 是一种低分子量分泌性蛋白质, 所有有核细胞均可合成并很快分泌到细胞外, 无组织特异性, 可分布于肺、肝、肾、胃、肠、胰及胎盘等几乎全身所有脏器组织, 在脑脊液和精液中浓度最高, 受“管家基因”的调节, 产生速率恒定, 最重要的生理功能是参与细胞内外蛋白水解的调控, 保护细胞免受不适当的内源性或外源性蛋白酶水解。目前Cys C的检测方法很多, 包括单向免疫扩散法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法、放射免现自动化分析。
2 Cys C与肾功能
2.1 一项新的肾功能检测指标
理想的估计肾小球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR) 的内源血清物质应该具备以下特性:以恒定速率释放入血流, 不受年龄、性别和一些病理状态的影响, 不与蛋白质结合;通过肾小球自由滤过;不被肾小管重吸收入血或分泌;肾脏是唯一排泄途径。Cys C产生速率恒定, 不受性别、年龄、肌肉质量、体表面积、饮食、炎症、肝功能及血脂等因素的影响, 血清中的Cys C几乎全部由肾小球滤过, 不被肾小管重吸收和分泌, 在近端肾小管上皮细胞被分解代谢。因此血清Cys C是诊断早期肾功能损害较理想的标志物。Dharnidharka等[1]总结了46篇有关Cys C研究论文的荟萃分析, 表明其与GFR的相关性、诊断GFR下降的灵敏度、特异性均明显优于肌酐 (creatinine, Cr) 。
2.2 血清Cys C水平的影响因素
由于Cys C受“管家基因”的调节, 生成速率恒定, 目前仅确定少数情况对血清Cys C水平有影响。大量糖皮质激素升高血清Cys C水平, 而中少量糖皮质激素似乎不改变血清Cys C水平。另外, 有报道甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退改变血清Cys C浓度, 因此, 当Cys C作为肾功能标志物时可能要考虑甲状腺因素。甲状腺功能对血清Cys C水平的影响仍是反映GFR的改变, GFR随着基础代谢率改变。
2.3 Cys C与药物剂量调整
调整通过肾脏排泄药物的剂量要依据肾功能的下降程度。因此, 正确估计患者的肾功能以适当调整药物剂量是非常重要的。肌酐清除率 (creatinine clearance rate, Ccr) 和GFR的预测公式广泛应用, 然而, 以往的研究表明用血清Cr浓度作为老年人肾功能的标志时常常高估了肾功能。这会致使临床用药时给予不必要的高药物剂量, 这样治疗成本升高并且可能引起不良反应。因此, Cys C更适合调整主要通过肾脏清除药物的剂量。
3 Cys C与心血管疾病
心血管疾病是目前致死率最高的疾病之一。近年关于血管重构的酶学已逐渐成为研究的热点, Cys C作为其中重要的一种, 在心血管疾病的发生、发展中起着重要的作用。
3.1 Cys C与高血压病
高血压病会引起肾功能损害, 其发生率随病程长短呈逐年增高趋势, 高血压病患者中轻度肾损害较常见, 但现用的肾功能检查指标不能发现早期肾损害。Bhavasar[2]对866例高血压病患者的血清Cys C和Cr进行检测, 得出高血压病患者血清Cys C增高而Cr正常者在所有高血压病患者中所占比例达24.1%。所以, 通过检测高血压病患者的血清Cys C有助于发现血清Cr正常的早期肾功能损害。Watanade等[3]调查研究了血清Cys C水平与原发性高血压患者肾脏、心脏和血管等终末器官损害的关系, 60名原发性高血压患者参与了该研究, 结果显示血清Cys C与24h平均收缩压相关 (r=0.308, P=0.0167) , 与左心室质量指数相关 (r=0.528, P<0.0001) , 与血管内膜-中膜厚度相关 (r=0.539, P<0.0001) , 证明了血清Cys C水平是原发性高血压患者终末器官损害的早期指标。
3.2 Cys C与冠心病
目前基础研究证明动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程, 发病机制涉及细胞外基质降解与血管壁重构。炎症可刺激血管平滑肌细胞分泌组织蛋白酶S、K等, 使这类具有促弹性组织离解特性的半胱氨酸蛋白酶在动脉损伤处过度表达。最近越来越多的研究发现, 在血管平滑肌细胞中有该组织蛋白酶抑制剂Cys C的表达, Cys C可通过人类多核细胞趋化性的抑制而在人类免疫防御中起作用。然而在动脉粥样硬化及腹主动脉瘤的损伤处Cys C的表达则严重减少。为了以蛋白酶/抗蛋白酶比例失衡的观点评价血清Cys C在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用, 董巧玲等[4]探讨了血清期血清Cys C水平 (0.78±0.15) 与不稳定型心绞痛 (0.89±0.22) 、对照组 (0.84±0.21) 相比明显降低 (P=0.028) , 但急性心肌梗死发病1周后 (1.28±0.20) 接近正常, 甚至有所增高 (P=0.04) 。急性心肌梗死患者早期血清Cys C浓度的显著降低, 在一定程度上可为临床诊断急性心肌梗死提供参考。
另外, 在动脉粥样硬化中, 可以发现全身性的活性转化生长因子 (transforming growth factor-β, TGF-β) 减少, 且损伤局部对有活性的TGF-β有依赖性, 这可能解释为什么在损伤局部Cys C浓度较低, 并且通过TGF-β的治疗可以刺激Cys C的分泌, 从而与组织蛋白酶的降解作用相抗衡, 并可以抑制动脉粥样硬化过程的进展。这就引发了临床对TGF-β在心血管疾病中的应用产生极大的兴趣, 有望成为动脉粥样硬化治疗的新方法。TGF-β能抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞的迁移和增殖, 具有抑制动脉粥样硬化过程的特征。直到目前为止, TGF-β是唯一得到证明能刺激血管平滑肌细胞中Cys C转录和分泌的细胞因子, 有人推测可能TGF-β的抗动脉粥样硬化作用归结于Cys C产生的增加, 从而恢复早期动脉粥样硬化病变中组织蛋白酶和它们主要抑制剂之间的平衡。
3.3 Cys C与动脉瘤
如前所说, Cys C在血管损伤后出现血清水平降低, 进一步的研究还发现其浓度与疾病的严重程度呈负相关。Shi等[5]通过超声法观察122例患者颈动脉内膜-中膜厚度及腹主动脉直径, 同时采用免疫染色法与免疫杂交法测定了血清Cys C的水平, 结果发现血清Cys C水平与腹主动脉直径呈负相关, 而与内膜-中膜厚度无相关性, 经过体表面积校正后, 两者负相关关系仍然存在。Lindholt等[6]对151例腹主动脉瘤患者进行了接近3年的随访, 测定了其中142例患者血清Cys C、Cr和C-反应蛋白水平 (C-reactiveprotein, CRP) , 发现血清Cys C的水平与腹主动脉瘤的扩张程度呈负相关 (r=-0.22) , 经年龄、吸烟、舒张压、肾功能、C-反应蛋白水平和腹主动脉瘤瘤体大小校正后, 这种负相关关系仍然存在, 提示可能由于缺乏Cys C导致组织蛋白酶相对占优势, 加速了动脉瘤的进展。这些研究表明了半胱氨酸蛋白酶/蛋白酶抑制剂之间的平衡在动脉瘤形成中起着重要的作用。
3.4 Cys C的预测因子作用
近年来, 有研究发现Cys C对某些心血管疾病的发生发展及预后可能有预测作用。
Luc等[7]开展了一项有关Cys C与冠心病相关性的前瞻性调查研究, 共纳入了9758例50~59岁的非冠心病人群为研究对象, 研究终点为急性心肌梗死、心绞痛发生、心源性死亡, 随访5年期间159例发生急性心肌梗死或心源性死亡, 154例发生心绞痛, 结果发现Cys C水平跟第一次缺血性心血管事件明显相关, 在纠正了传统的冠心病危险因素 (包括年龄、高血压、糖尿病、吸烟、体重指数、血脂) 之后这种相关性仍然存在, 但是在加入了CRP这一因素后这种相关性被弱化;Johnston等[8]曾在健康成年人群中用高敏感性分析仪测量时发现, 轻度升高的血清Cys C和CRP水平之间成正相关, CRP轻度升高正是成人及儿童的动脉粥样硬化和慢性肾功能衰竭相关的慢性炎症状态的特征, Cys C应该参与了动脉粥样硬化的炎症过程。Koenig等[9]则对1033例30~70岁的冠心病患者开展另外一项较大规模的研究, 随访33.5个月, 对比Cr、Ccr、Cys C对第二次冠心病事件发生率的预测价值, 结果发现对出现第二次冠心病事件的患者中仅有Cys C水平与之明显相关, 多因素回归分析表明高Cys C水平可以作为冠心病患者再次发生事件的一个预测因素。
Jernberg等[10]对急性冠状动脉综合征 (acute coronary syndrome, ACS) 人群进行随访调查研究, 以评价Cys C对ACS预后的临床价值, 该研究纳入726例以急性胸痛为症状入院的可疑和确定的ACS明显相关, 提出临床单纯检测Cys C水平对ACS分层有较高的临床价值。Shlipak等[11]开展了另外一项共纳入4637例老年人的队列研究, 结果表明Cys C水平可以作为一项独立于性别、年龄等危险因素之外的预测高龄心血管疾病患者全因死亡率的指标, 同时其对肾功能损伤预测的敏感性明显优于Cr。另外ACS患者肾功能不全的发生对其预后有很大影响, 但是目前Cr和GFR值检测肾功能不全的不敏感性限制了它们作为预测因子的价值。Suwaidi等[12]一项荟萃分析纳入了全球4个大型ACS研究共37925个试验样本, 发现合并肾功能不全的ACS患者跟更高的死亡率和非致死性心肌梗死的发生明显相关, 而Cys C水平正是反映肾功能损伤的一个敏感指标。这可能是Cys C水平可以作为一项ACS患者预后判断指标的重要原因之一。
心力衰竭是多种心血管疾病的最后归宿和主要杀手, 近年来有关Cys C水平对心力衰竭发生及预后的预测价值的研究报道也很多。Shlipak等[13]对高龄心衰患者前瞻性调查, 随访平均6.5年发现Cys C水平每增加0.35mg/L, 心衰患者的死亡率就增加31%, 可以作为该人群预后判断的一种新的有力指标。Lassus等[14]一项关于Cys C水平和急性心衰的研究发现, 与传统预测冠心病患者发生急性心衰的指标相比, Cys C水平大于1.30mg/L可以作为预测患者未来12个月内发生急性心衰或者死亡的一项很有价值的生化指标。因此, Cys C水平跟心衰的关系其实也是Cys C水平可以作为其对多种心血管疾病预后判断的一项指标的机制所在。
4 总结
血清Cys C是一种较理想的评价GFR的指标, 目前其检测分析已实现全自动化且操作简便, 有希望在临床得到广泛应用。Cys C参与了心血管系统疾病诸多的病理、生理过程, 它的作用机制涉及抗炎、抑制酶与激素前体的活性等, 而且由于它产生的恒定性, 有可能在某些心血管疾病中成为诊断与检测的分子指标。当然, Cys C与心血管疾病的关系还需要更深入的研究, 以进一步明确其作用的确切机制。
摘要：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一种低分子量的肾小球滤过率内源性标志物, 大量研究表明它在体内产生速率稳定, 影响因素极少, 是反映早期肾小球滤过功能受损的一项较理想的指标, 近年来研究发现它在指导许多心血管疾病的诊断及治疗中有潜在的临床意义。
胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇2
关键词：家蚕；pull-down；蛋白相互作用
中图分类号： S881.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0037-03
收稿日期：2014-03-03
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-22）；江苏高校优势学科建设工程项目。
作者简介：王明慧（1986—），女，山东滨州人，硕士，主要从事家蚕资源与功能基因组学研究。E-mail：wangminghui.219@163.com。
通信作者：许雅香，副教授，主要从事家蚕资源与功能基因组学研究。Tel：（0512）65880260；E-mail：xuyaxiang@suda.edu.cn。Serpin全称为serine protease inhibitor，是一类能够抑制丝氨酸蛋白酶活性的超家族蛋白质，参与调节生物体内多种生理反应，包括血液凝集、纤维蛋白溶解、补体激活、免疫黑化、生长发育过程中组织构建等[1-5]。Serpin在昆虫各组织中均有分布，对昆虫的生命活动起到重要作用，目前关于家蚕Serpin的研究很多，但是几乎没有关于家蚕Serpin相互作用蛋白方面的研究，生物的生命活动主要体现在蛋白质水平，许多蛋白是通过与其他蛋白相互作用来发挥作用的，因此，研究蛋白质相互作用能更好地理解生物的生命活动。本研究原核表达并纯化了Bmserpin-3蛋白，应用pull-down及质谱技术筛选到Bmserpin-3的相互作用蛋白，并通过荧光定量PCR技术初步探索了这2个基因的组织分布，旨在为深入探讨 Bmserpin-3 的功能机制提供依据。
1材料与方法
1.1材料
家蚕品种为笔者所在研究室保存的大造，正常桑叶育，取5龄4 d幼虫的脂肪体，-70 ℃保存备用。Trizol RNA提取及M-MLV反转录试剂等化学常规试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2重组表达载体的构建和鉴定
采用反转录的家蚕5龄4 d幼虫脂肪体的cDNA模板，PCR扩增serpin-3基因。引物为F：5′-CTAGCTAGCAACATAGATCCGAACACCCTAAG-3′（下划线为NheⅠ酶切位点）和R：5′-ACGCGTCGACCTATAGTACTTTATAATCCCCATCG-3′（下划线为SalⅠ酶切位点）。扩增条件是：95 ℃ 预变性 3 min；95 ℃变性30 s，60.4 ℃退火35 s，72 ℃延伸3 min，33个循环；最后72 ℃终延伸10 min。将PCR扩增产物与pET-28a（+）进行双酶切，然后再将其目的片段与 pET-28a（+） 连接，转化至E.coli Top10中，挑选阳性克隆进行酶切鉴定及测序检验。
1.3重组表达载体的诱导表达
含家蚕serpin-3全长cDNA的阳性菌株在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基中加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5 mmol/L，37 ℃诱导表达6 h后，4 ℃ 5 000 r/min离心10 min收集菌体，用PBS重悬，在冰浴中超声破碎，直到溶液变澄清。4 ℃ 5 000 r/min离心 10 min，收集沉淀即得包涵体形式的6His-Bmserpin-3。
1.4重组蛋白的纯化、鉴定
4 ℃ 5 000 r/min离心20 min收集细胞，以1 ∶20比例添加0.01 mol/L PBS （pH值为 8.0），在PBS中悬浮细胞，冰上超声后添加等量的蛋白loading buffer，蛋白样品煮沸5 min，5 000 r/min 离心20 min。上清通过SDS-PAGE（没有梳子）来纯化，锌染后，将胶条切成1 cm的条带，装到透析袋里，4 ℃ 透析过夜。用Brandford法检测蛋白含量后，-20 ℃保存备用，将纯化好的蛋白用SDS-PAGE来鉴定。
1.5pull-down筛选与Bmserpin-3重组蛋白相互作用蛋白
按照每100 mg组织加入1 mL裂解液的比例加入RIPA裂解液（使用前数分钟加入PMSF使PMSF终浓度为1 mmol/L），通过强烈的涡旋使样品裂解充分，5 000 r/min离心5 min，取上清，储存于-20 ℃冰箱中备用。用10 mL binding buffer 平衡250 μL树脂，将纯化后的Bmserpin-3蛋白与树脂在4 ℃下缓慢摇晃结合5 h，使Bmserpin-3蛋白与树脂充分结合，让蛋白液流出，用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脱Ni2+柱，祛除未结合的Bmserpin-3蛋白，将1 mL血液总蛋白加入Ni2+柱中，与Bmserpin-3蛋白复合物共同4 ℃孵育过夜，使血液内靶蛋白与Bmserpin-3蛋白结合，从而形成树脂-Bmserpin3-血液总蛋白的复合物，用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脱Ni2+柱，祛除未结合的血液总蛋白，用含 200 mmol/L 咪唑的 elution buffer洗脱液，将Bmserpin3-血液总蛋白复合物与树脂分离，收集洗脱液，12% SDS-PAGE分析收集的洗脱液。
nlc202309012308
1.6靶标蛋白基因的分布
采用Primer 5.0软件，引物如表1所示。采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒测定，具体步骤按照说明书进行，反应程序为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火 30 s，循环45次。反应体系为：SYBRPremix Ex TaqTM（2×） 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反应过程由ABI7300荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司）软件自动设定，每个样品重复3次。表1实时荧光定量PCR的检测基因、内参照基因的引物
基因名称引物序列Tm（℃）Actin3F：5′-CGGCTACTCGTTCACTACC-3′；R：5′-CCGTCGGGAAGTTCGTAAG-3′59.27Bmsp-2F：5′-TTAATTCTGGCTGGGCTTGT-3′；R：5′-TTAGTTGGCTCACATCTTGG-3′ 55.80Bmsp-3F：5′-GATTTTAGCGGGGCTTATTG-3′；R：5′-AGTCCTGGGCGACTTTGTAG-3′ 55.80
2结果与分析
2.1重组表达载体的构建与鉴定
含有酶切位点NheⅠ、SalⅠ的引物扩增serpin-3基因的ORF，得到1 300 bp左右的条带，PCR纯化的目的片段与 pET-28a（+）连接后，转化至E.coli Top10中，挑选阳性克隆进行酶切鉴定（图1），条带约1 300 bp，表明重组质粒构建成功，命名为pET-28a-Bmserpin-3。
2.2重组蛋白的纯化与鉴定
重组质粒转化至E.coli BL21，经IPTG诱导表达重组 Bmserpin-3 蛋白，表达的蛋白多是以包涵体方式存在，用锌染、透析的方式进行纯化，结果如图2所示，SDS检测到1条单一的约49 ku的蛋白条带。
2.3重组蛋白相互作用蛋白的鉴定
样品组内形成树脂-Bmserpin-3-血液总蛋白的复合物后，先用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脱，祛除非特异性结合，然后用含200 mmol/L咪唑的elution buffer洗脱液使 Bmserpin-3-血液总蛋白复合物与树脂分离，收集样品，后期用SDS-PAGE分析（图3）。可见与Bmserpin-3相互作用的3条蛋白条带。从SDS-PAGE胶上将3条蛋白条带切下，放入EP管中，加入胰蛋白酶进行胶内酶切，然后用LC-MS/MS技术对获得的3条蛋白条带进行分析（图4）。鉴定出的蛋白是家蚕储存蛋白、性别特异储存蛋白2，相关蛋白信息见表2。
2.4家蚕幼虫Bmsp-2，3在不同组织的表达变化
由图5可以看出，sp-2、sp-3在各个组织都有分布，且sp-2在脂肪体、血淋巴中表达量比较高；sp-3在精巢、脂肪体、血淋巴中表达量比较高。
4结论与讨论
蛋白质是生物生命活动的重要体现者之一，几乎参与生物所有的生命过程、细胞活动。它在体内主要通过与自身或其他蛋白质及核酸形成复合体来进行基因调节、免疫应答、信
表2相互作用蛋白相关信息
蛋白质名称基因登录号得分等电点分子量
（ku）性别特异储存蛋白2gi|1244307251015.7083.57家蚕储存蛋白gi|3793278111785.9083.04
号转导、细胞组装等生物学功能[6-7]。通过研究蛋白质之间的相互作用可获得更多的细胞功能信息。目前蛋白质相互作用的主要研究方法有酵母双杂交技术、免疫共沉淀法、噬菌体展示技术、pull-down技术、荧光共振能量转移（FRET）技术及生物信息学分析法等。已有学者利用pull-down 方法鉴定已知的2种蛋白质间的相互作用，或采用少量Ni2+-NTA agarose beads 在Eppendorf 管中进行小体积的pull-down[8-9]。笔者采用Ni2+-NTA agarose beads 柱使整个体系放大，更利于蛋白质的结合、洗脱，并结合质谱分析来筛选与Bmserpin-3相互作用的蛋白质。丝氨酸蛋白酶抑制剂在生物体内分布广泛，参与调节生物体内多种生理反应。研究发现，云杉卷叶蛾serpin-1在表皮中高表达，且在蜕皮期间的转录水平高于蜕皮期。烟草天蛾serpin-1mRNA在5龄幼虫脂肪体中含量丰富，但在蜕皮、化蛹时mRNA水平骤然降低[10]。冈比亚按蚊serpin-2与丝氨酸蛋白酶CLIPB9结合调节黑化反应，此外CLIPB9与serpin2的相互作用还影响雌性成虫寿命[11]。果蝇serpin27A与serpin28D都参与了先天性免疫反应，但果蝇serpin28D只参与由创伤引起的酚氧化酶激活产生的黑化，serpin27A在酚氧化酶激活路径中调节病毒或病原菌引起的黑化[12-13]。果蝇中serpin43AC参与了toll途径调节的先天性免疫反应[14-15]。研究发现，冈比亚按蚊中serpin10在中肠上皮细胞聚集与疟疾病原体的传播有关[16]。Serpin家族在昆虫的表皮、头部、血淋巴、脂肪体、丝腺、中肠、精巢、卵巢中均有分布，对家蚕的各种生理活动起到调节作用[17]。董照明等认为，serpin-16在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用[18]。查宏贤研究表明，家蚕serpin-4参与了先天性免疫反应[19]。王彦云等证实serpin-6与家蚕表皮黑化、蜕皮变态、先天性免疫等生理过程有关[20]。李国胜等推测serpin-5与家蚕的生殖生理有关，可能参加了家蚕的先天免疫反应[21]。serpin-3是以单体的形式发挥作用还是与伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用还不得而知。本研究选择适宜大分子量蛋白质的六聚组氨酸作为标签，构建了家蚕serpin-3六聚组氨酸蛋白，并以此为饵蛋白，采用His-pull down技术，从家蚕血液中调取了2个与该蛋白相互作用的蛋白。它们均是血液储存蛋白，同源性很高，与β-芳基储存蛋白亚基（烟草天蛾）、芳基储存蛋白（棉铃虫）、血清储存蛋白2（印度蚕）具有很高的同源性，功能也相似，主要是参与免疫、信号传导。对家蚕幼虫sp-2、sp-3在不同组织的表达变化分析可知，sp-2在脂肪体、血淋巴中表达量比较高，sp-3在精巢、脂肪体、血淋巴里表达量比较高。
胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇3
1 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定方法
Cys C的测定方法很多, 包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。目前, 我国临床实验室测定Cys C的方法主要有颗粒增强散射免疫比浊法 (PENIA) 和颗粒增强透射免疫比浊法 (PETIA) 2种。PETIA:将抗胱抑素C、Ig G共价结合到均一的胶乳颗粒上, 与抗原结合形成的免疫复合物被聚乙二醇一6000沉淀, 在特定的波长处比浊, 与同样处理的校准液比较, 计算标本中胱抑素C的含量。此法反应时间短, 精密度好, 检测范围宽、黄疸、溶血和脂血标本均不受影响, 是目前使用非常广泛的一种检测Cys C的方法。PENIA:将抗人胱抑素C的多克隆抗体标记在聚苯乙烯胶乳颗粒上, 利用胶乳颗粒增强的免疫散射比浊法测定。此法优于PETIA法, 反应时间短, 精密度好, 检测范围宽, 不受血红蛋白、胆红素和甘油三酯、类风湿因子和骨髓瘤异常蛋白的影响。但试剂成本较高, 需要特定的检测仪器。
2 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C临床应用
2.1 Cys C与肾移植
肾脏移植目前已成为治疗终末期肾病最有效的方法, 因此肾脏移植手术后移植肾的功能监测成为临床工作之重点。王盛华等人的研究发现, Cys C在肾移植后诊断急性排斥反应时明显优于血清肌酐, 即Cys C比Scr提前 (2.7±1.8) d升高;与排斥前比较, Cys C升高148.9%, 远高于Scr的43.9%。Le Bricon等也曾报道, Cys C在排斥时比Scr升高得更早、更明显, 更有利于肾移植的临床监测。
Cys C在肾移植术后诊断感染时虽然升高幅度与Scr无明显差异, 但比Scr早 (4.4±1.5) d出现变化, 有利于早期发现, 这对肾移植患者来说有重大临床意义。
2.2 Cys C与肝脏疾病
Cys C在肝脏疾病患者中显著升高, 且慢性肝炎、肝硬化和肝癌均有不同幅度的升高变化, 推断Cys C与肝病的严重程度相关。血清Cys C在乙肝、丙肝、肝硬化及肝癌升高的阳性率分别为90%, 93%, 100%, 100%, 高于常用的生化指标。该研究还发现:各肝病组ALT、AST、GGT、TBIL等指标与正常对照组比较差异非常显著, 但各肝病组间差异不是很明显。
2.3 Cys C与糖尿病肾损害
糖尿病肾损害的主要病理改变为肾小球基底膜受损, 而作为全部肾功能单位滤过率的总和, GFR是评价肾功能受损的一项好的指标, 国内外很多研究都说明Cys C在评价肾损害比Scr要更为灵敏、特异。糖尿病肾病是糖尿病常见而严重的并发症, 其早期诊断和治疗极为重要, 微量清蛋白是实施干预治疗的关键时期。
2.4 Cys C与肿瘤
Strojan等收集了82例头、颈部鳞状细胞癌患者的癌组织和其相匹配的癌旁组织, 应用ELISA对组织中Cys C的浓度进行检测。他们在将癌组织与癌旁组织中的Cys C的表达量进行统计学分析后发现, 肿瘤样本Cys C的平均浓度要比癌旁组织低了1.18倍 (P=0.041) , 其中喉部肿瘤Cys C平均浓度要比其相匹配的正常组织中的量低1.42倍 (P=0.029) , 而非喉部肿瘤与其相匹配的癌旁组织间未发现明显差异。
2.5 Cys C与心血管疾病
Cys C与动脉硬化研究发现, 在血管平滑肌细胞中有该组织蛋白酶抑制剂Cys C的表达, Cys C可通过人类多核细胞趋化性的抑制而在人类免疫防御中其作用。在血管损伤后炎症因子产生增加, 轮流刺激血管损伤处促使胱氨酸蛋白酶含量增加, 加速血管损伤, 而这一作用可被Cys C所抗衡。然而在动脉粥样硬化及腹主动脉瘤的损伤处Cys C的表达则严重减少。Per等检测了急性心肌梗死患者急性期、恢复期及健康对照组的血清Cys C水平, 发现两者的Cys C水平均显著低于健康对照组, 提示Cys C的血清浓度改变, 在一定程度上可以作为急性心肌梗死诊断的参考指标。
摘要：随着医学上对血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的深入研究, 发现其不仅在肾脏疾病方面有临床价值, 而且在肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等方面也具有一定的价值。本文旨在研究血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定方法及临床应用。
关键词：血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,测定方法,临床应用
参考文献
[1]顾万建, 张春兵.胱抑素C在心脑血管疾病中的研究进展[J].国际检验医学杂志, 2007, 28 (12) :1120-1121.
[2]王盛华, 杨小静, 邹雄.血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在肾移植功能检测中的应用价值[J].中华检验医学杂志, 2007, 30 (11) :1223-1226.
胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇4
1 资料与方法
1.1 检测对象
湖南省人民医院2008年5月~2009年3月门诊及住院SLE患者56例,所有病例符合美国风湿病协会1997年SLE诊断修订标准[3]。其中,男性6例,女性50例,年龄16~49岁,平均年龄(32.2±5.7)岁;正常对照组为随机抽取的门诊健康体检人员50例(病史、查体、心电图、胸片、B超、血液常规、生化及免疫检查等均正常者)。其中,男性5例,女性45例,年龄17~50岁,平均年龄(33.5±6.2)岁。
1.2 标本采集
1.2.1 血液标本的采集
采取正常对照组和SLE患者空腹静脉血2 m L于促凝采血管,常温下以3 000 r/min离心分离血清于Eppendorf管内,置于-20℃冰冻保存。检测时从-20℃冰箱取出血清,置于室温待其融化后进行检测。
1.2.2 尿液标本的采集
患者留取晨尿,在2 h内检测完毕。
1.3 方法
血清肌酐(serum cystatin,SCr)采用肌氨酸氧化酶法、Cys C采用免疫比浊法,在日立7600全自动生化分析仪上完成,试剂由上海科华公司提供;尿蛋白定性试验采用干化学分析法,迪瑞H-500尿液分析仪干化学试纸由迪瑞公司提供。
1.4 统计学处理
采用SPSS 11.0软件对结果进行数据统计。数据以均数±标准差表示,组间差异采用两样本均数比较t检验,组间异常率进行χ2检验。以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 SLE患者与对照组的比较
SLE患者SCr、Cys C检测结果与对照组比较,结果见表1。
注:覮与对照组比较,P<0.01
2.2 SLE各组病人Cys C与Ccr检测结果
依病人晨尿中尿蛋白定性结果进行分组,患者血清SCr、Cys C检测结果,见表2。
注:1)与尿蛋白阴性组比较,P<0.01;2)与尿蛋白阴性组比较,P<0.05
2.3 SLE病人CysC与SCr阳性率的比较
以本室建立的正常成年人参考区间为标准,SCr>133μmol/L、Cys C>1.4 mg/L为异常(阳性)。比较尿蛋白阳性与阴性病人Cys C与SCr异常检出率,结果如表3所示。
注:两组比较,差异有显著性,P<0.01
3 讨论
Cys C是一种分泌性蛋白,由122个氨基酸组成,相对分子质量为13 359,带正电荷,等电点为9.3,是一种碱性非糖基化的低分子蛋白,为半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。机体内,几乎所有有核细胞都产生Cys C,完全由肾小球滤过,并几乎全部在近端肾小管被吸收分解,在血中浓度相对稳定,不易受年龄、性别、饮食、炎症、血脂、肝脏疾病及大多数药物等因素的影响,能较早的反映肾小球滤过功能的受损情况[2]。
狼疮性肾炎的早期发现、早期系统治疗是改善SLE患者预后的一个重要因素。临床观察中发现,有一部分SLE患者,即使临床无狼疮性肾炎的表现,但肾穿活检时,可有狼疮性肾炎的组织病理改变,称为“隐匿性狼疮性肾炎”。吴振彪等的研究证实,在无肾炎表现的SLE病人,经肾穿证实有肾炎病理改变的高达89%[4]。早期发现这类LN,对于指导临床工作有重要意义。
目前,临床最常用SCr评价肾功能损害[5]。由于SCr参考范围较宽,个体差异大,且只有当GFR下降超过50%时才能导致SCr轻微上升。这些缺陷导致SCr无法作为肾功能损害的敏感性指标。相反,Cys C做为一种新的反映肾脏早期损害的指标,正逐步被临床应用[6,7]。本研究结果显示,血清Cys C、SCr在SLE患者血清中的浓度显著升高,与健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。另外,血清Cys C、SCr在SLE患者不同程度尿蛋白人群中的浓度也存在差异,尿蛋白越严重的病人,其血清中的平均Cys C、SCr浓度也越高。然而,在全部SLE病人中,有21.43%(12/56)的病人尿蛋白为阴性,其血清Cys C有83.33%(10/12)为阳性,说明这部分病人的肾脏已不同程度受累,而SCr只能检出25%(3/12)的病人。在出现尿蛋白的SLE病人中,血清Cys C水平全部高于参考上限,而SCr中只有81.82%病人被检出异常。研究结果表明,血清Cys C水平用于判断SLE病人累及肾脏比SCr和尿蛋白都要敏感。随着Cys C检测技术的不断进步,检测方法已由以前的酶免疫检测发展到现在的免疫透射比浊与散射比浊等,能够进行自动分析,有望在临床得到广泛的应用。
摘要：目的 探讨血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cysc)检测在狼疮性肾炎早期诊断中的意义。方法 对56例系统性红斑狼疮患者和50例正常对照组血清进行血清肌酐(SCr)和血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)测定,同时进行尿蛋白定性测定,并作相关分析。SCr采用肌氨酸氧化酶法,CysC采用免疫比浊法,尿蛋白定性试验采用干化学分析法。结果 正常对照组和SLE患者SCr分别为(72.80±14.70)和(226.85±45.80),Cysc分别为(0.95±0.21)和(3.88±1.05);两组比较,SLE患者SCr和Cysc较对照组明显增高(P<0.01),SLE患者尿蛋白定性阳性组较尿蛋白定性阴性组血清SCr、Cysc有明显增高(P<0.01),SLE患者血清Cysc阳性率较SCr明显增高(P<0.01)。结论 血清Cysc是反映狼疮性肾炎的一个敏感性指标。
关键词：系统性红斑狼疮(SLE),狼疮性肾炎(LN),血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cysc),血清肌酐(SCr)
参考文献
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胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
利用LIS数据库的数据导出功能以Excel2003的格式导出2010年6月-2013年2月的901名包含Cys C的儿童生化筛查组合结果数据, 其中男485名, 女416名;排除严重的全身疾病及血清标本为溶血、黄疸或脂浊者。
1.2 标本采集处理
静脉血的采集由护士完成, 采集2ml左右血样置含惰性胶体促凝集真空管内, 室温静置至少0.5h后, 800g离心5min分离血清, 标本采集后8h内完成检测。
1.3 仪器和试剂
Modular DPP全自动生化分析仪购自Roche公司;Cys C透射比浊检测试剂盒购自广东虹业抗体科技公司。
1.4测定方法
采用液相透射比浊法在Roche生化仪上按说明书要求测定临床标本, 样品中的Cys C与试剂盒中Cys C抗体试剂发生抗原—抗体反应, 使反应液浊度增加, 并在一定范围内反应液浊度与所加入抗原的量呈线性相关。
2 结果
经单因素方差分析, 总体上2岁前相邻2组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 各组间两两比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。3~4岁与4~5岁、12~13岁及13~16岁间差异有统计学意义 (P<0.05) , 而其他组间显示差异无统计学意义 (P>0.05) 。综合分析后最终分为5个年龄组, 即1~29d、1~3个月、4~11个月、1~2岁、2~16岁。lg (Cys C) 浓度在5个年龄组男性均值依次为0.224、0.170、0.112、0.061、0.011 (mg/L, lg) , 女性依次为0.222、0.164、0.089、0.057、-0.010 (mg/L, lg) , 其性别间差异无统计学意义 (P>0.05) , lg (Cys C) 浓度在上述年龄组间的均值依次为0.222、0.166、0.100、0.059、-0.0104, 经单因素方差分析, 总体上组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 各组间两两比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。2岁前血清Cys C水平变化较大, 其中1个月内Cys C水平最高, 以后随着年龄增长而逐渐降低, 但在2~16岁总体趋于稳定。
3 讨论
Cys C与性别、年龄的关系尚有争论, 部分文献表明血清Cys C浓度几乎不受年龄、性别、肌肉、体质量等因素的影响, 但也有文献报道年龄、性别等可影响血清Cys C水平[2]。笔者发现, 儿童Cys C水平与特定年龄组密切相关, 2岁前血清Cys C水平变化范围较大, 其中1个月内Cys C水平最高, 以后随着年龄的增长而逐渐降低, 但在2~16岁与年龄差别不大, 总体趋于稳定。Cys C水平在性别间差异无统计学意义 (P>0.05) 。结果显示, 1~29 d组为0.95~2.92 mg/L, 1~3个月组为0.81~2.67mg/L, 4~11个月组为0.65~2.45mg/L, 1岁组为0.56~2.35mg/L, 2~16岁组为0.45~2.13mg/L。本文中儿童Cys C随年龄的变化趋势与国外报道基本一致, 证实了新生儿Cys C水平最高, 以后随着年龄的增长而逐渐降低至成人水平, 新生儿期Cys C血清水平较高可能与出生后肾功能尚不完善有关。本文中儿童血清Cys C水平上限总体略高于国外报道, 可能与检测方法或试剂的差异有关, 另外, 种族的不同也可能与参考区间的差异等有关, 目前国内儿童Cys C水平参考区间的报道仍较少见[3]。
摘要：目的 探讨半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (CysC) 与儿童肾功能相关性, 并分析CysC与年龄、性别的相关性。方法 从LIS系统导出2010-2013年包含CysC的1335名儿童生化筛查组合检测数据, 通过排除条件, 筛选出901名儿童为参考人群, 其中男485名, 女416名。CysC的测定采用液相透射比浊法在Roche DPP全自动生化分析仪上进行。结果 901名本地区儿童血清CysC浓度对数呈正态分布, 其男女间差异无统计学意义 (P>0.05) 。2岁前血清CysC水平变化较大, 其中1个月内CysC水平最高, 以后随着年龄增长而逐渐降低, 但在216岁总体趋于稳定。结论 儿童血清CysC参考区间与性别无密切相关性, 但不同年龄段之间变化较大, 临床应用CysC评价儿童肾功能时应考虑年龄因素。
关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,儿童肾功能,儿科学
参考文献
[1] 李丽, 陆怡德.对《儿童透射比浊法血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C参考区间的建立及其与年龄、性别的相关性》一文的商榷[J].中华检验医学杂志, 2012, 35 (10) :955-956.
[2] 黄宝兴, 马东礼, 肖丽霞.深圳地区儿童血清胱抑素C水平调查[J].国际检验医学杂志, 2012, 33 (24) :3012-3013.
胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2005年2月—2008年7月我院住院的129例冠心病患者, 均符合WHO冠心病临床诊断标准并经冠脉造影确诊。其中男87例, 女42例, 年龄43岁～89岁 (59.1岁±8.1岁) 。冠心病患者按血清Cyst-C浓度和血Cr浓度分为3组:肾功能不全组11例 (血Cyst-C与Cr浓度均增高) , 早期肾功能损害组62例 (血Cyst-C增高, 而Cr浓度未增高) , 肾功能正常组56例 (血Cyst-C与Cr浓度均正常) 。同时选取健康体检者65名为对照组, 无心、肝、肾等疾患, 其中男38名, 女27名, 年龄51岁～72岁 (56.1岁±8.6岁) 。对照组与冠心病组年龄及性别比较无统计学意义 (P>0.05) 。
1.2 仪器和测定方法
所有受检者均于清晨空腹采静脉血3 mL, 3 000 r/min离心分离血清, 快速冻存于-70 ℃冰箱, 避免反复冻融。使用芬兰雷勃MK-3型酶标仪, 采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测定血清Cyst-C浓度, 以≥1.6 mg/L为样品阳性。试剂由上海德波生物技术公司生产。同时记录患者的各种临床表现, 检测血尿素氮 (BUN) 、Cr、β2微球蛋白 (β2-MG) 及尿常规、尿白蛋白 (MA) 、尿β2-MG。
1.3 统计学处理
采用SPSS 14.0版本软件建立数据库, 计量资料以均数±标准差
2 结果
2.1 各组血清Cyst-C浓度及血Cr浓度检测结果 (见表1)
2.2 血清Cyst-C浓度阳性组和阴性组血β2-MG、尿MA及尿β2-MG的测定结果 (见表2)
3 讨论
肾脏是人体重要的排泄器官。在各种致病因子作用下, 肾小球滤过膜和肾小管发生结构与功能损伤, 使尿液中蛋白质浓度升高, 形成蛋白尿。目前用于评价肾小球滤过率功能的指标有外源性和内源性指标。外源性指标包括菊粉清除率试验和放射性核物质测定, 由于操作步骤繁琐或成本较高, 尚不能广泛应用于临床检测常规。目前普遍采用内源性指标血Cr、BUN等 来评价GFR。血Cr是肌酸代谢产物, 由肾小球滤过, 肾小管少量分泌。肾功能轻度受损时血Cr浓度可无变化, 只有当肾小球滤过功能丧失50%以上时才升高。BUN是蛋白质代谢的终产物, 轻度肾功能损害时可无变化, 只有当有效肾单位60%以上受损时才出现异常。这些项目难以发现早期肾的损害, 无法满足肾病科学的发展需要。而肾组织学检查虽然比较灵敏, 但必须做侵害性的肾活检, 难以普遍推广。
Cyst-C是近年发现的一种反映GRF变化的内源性标志物[2,3,4,5,6], 是半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (GPIs) 家族中的一员[2], 为低分子量的非糖基化的碱性蛋白质, 包括120个氨基酸, 分子量为13.3 kD, 等电点 (PI) 为93。Cyst-C的基因和启动子的结构分析显示其基因型为“看家基因”, 定位于染色体20 pb 1.2上, 其生理作用可能是抑制半胱氨酸蛋白酶的活性, 参与细胞内外蛋白质水解的调控。Cyst-C是一种所有有核细胞都能稳定产生的蛋白质, 不受年龄、性别、肌肉量、饮食、炎症、胆红素、溶血及三酰甘油等因素的影响。血清中的Cyst-C几乎全部由肾小球滤过, 不被肾小管重吸收和分泌, 在近端肾小管上皮细胞被分解代谢。因此血清Cyst-C有稳定的生成速度和循环水平, 不受其他病理状态的影响[5], 可以反映肾小球滤过功能 (GRF) , 是早期肾功能受损的标志物[2,3,4,5]。
有学者指出慢性肾脏病是冠心病的独立危险因素, 认为冠心病患者, 出现血清Cr升高, 肌酐清除率下降;且冠状动脉病变越重, 血清Cr越高, 肌酐清除率越低, 显示肾脏受损与冠心病发生发展有关[6]。本研究也显示在冠心病患者肾功能轻度受损时, 血清Cyst-C升高比血Cr升高更敏感, 与多数文献相符[2,3,4,5,6], 提示轻度肾功能受损可增加冠心病的危险, 血清Cyst-C可能参与冠心病的发病过程。同时本研究结果提示, 冠心病患者在血清Cyst-C阳性组和阴性组间血β2-MG、尿MA及尿β2-MG 差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明冠心病患者高Cyst-C血症的冠心病患者肾脏损害较为严重。当慢性肾脏病时一氧化碳合成酶抑制物——对称二甲基精氨酸 (ADMA) 含量明显增加, 可能加速冠心病的形成, 且在肾功能减退早期即已发生。另有研究证实微炎症和氧化应激程度与肾功能恶化及冠心病病死率和总病死率密切相关[2], 可能与轻度慢性肾脏损害患者体内糖基化终产物、氧化蛋白产物等水平明显增高而引起, 这些大分子代谢毒物可能通过促发炎症和氧化应激加速冠心病的发生[3,4]。
总之, 冠心病患者血清Cyst-C可能参与冠心病的发病过程, 是一种较血Cr更敏感、更准确的反映肾小球滤过功能新指标, 特别对血Cr不能检出的冠心病早期肾损害的发现有重要意义。同时血清Cyst-C检测方法操作简便, 重复性良好, 成本较低, 临床上有一定的应用前景。
参考文献
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胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇7
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取我科于2014年3月至2014年11月确诊为缺氧缺血性脑病的患儿53例为观察组, 其中男26例, 女27例, 体重 (3.15±0.23) kg, 日龄0~3 d, 轻度28例, 中度15例, 重度10例。同时选取我院产科同期出生的母亲正常, 无窒息史的健康新生儿31例作为对照组。
1.2 病例入选标准:
(1) 所有患儿均于出生后12 h入院, 胎龄37~40周, 出生体重2.5-4.0 kg, (2) 符合邵肖梅等主编的《实用新生儿科学》第4版新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准: (1) 有明确的可导致胎儿宫内窘迫的异常产科病史, 以及严重的胎儿宫内窘迫表现 (胎心〈100次/min, 持续5 min以上;和或羊水Ⅲ度污染) , 或者在分娩过程中有明显窒息史; (2) 出生时有重度窒息, 指Apgar评分1 min≤3分, 并延续至5 min时仍≤5分, 和或出生时脐动脉血气PH≤7.0; (3) 出生后不久出现神经系统症状, 并持续至24 h以上, 如意识改变 (过度兴奋、嗜睡、昏迷) , 肌张力改变 (增高或减弱) , 原始反射异常 (吸吮、拥抱反射减弱或消失) , 病重时可有惊厥, 脑干征 (呼吸节律改变、瞳孔改变、对光反应迟钝或消失) 和前囟张力增高; (4) 排除电解质紊乱、颅内出血和产伤等原因引起的抽搐, 以及宫内感染、遗传代谢性疾病和其他先天性疾病所引起的脑损伤。 (3) 同时排除感染性疾病、神经系统先天畸形、先天性心脏病等疾病。
1.3 方法
将所有缺血缺氧性脑病患儿作为观察组, 于患儿入院12 h内抽取其静脉血3 m L, 促凝后, 3 500 r/min的离心机进行离心处理, 离心3 min后, 取上层血清进行实验室测定。对照组新生儿于出生断脐同时采集脐血3 m L, 检测方法同观察组。血标本均采用全自动生化分析仪, 分别测定两组新生儿的胆碱酯酶、腺苷脱氨酶及胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量, 测定结果均采用统计软件进行统计数据分析处理, 并得出结果进行比较。
1.4 统计分析
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理分析, 计量资料组间比较均应用t检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
两组新生儿在性别、平均体重、日龄等方面比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。胆碱酯酶活性测定结果比较, 观察组的胆碱酯酶活性水平较对照组的水平明显下降 (P<0.05) , 两组比较, 观察组腺苷脱氨酶及胱氨酸蛋白酶抑制剂的测定水平明显高于对照组 (P<0.05) 。
3 讨论
新生儿缺氧缺血性脑病是由于缺氧窒息导致的脑血流改变所致脑损伤, 当缺氧缺血发生时, 除了脑部之外, 全身各个脏器包括肝、肾等重要脏器亦发生缺血-再灌注损伤, 造成严重的肝肾功能损害, 各种酶学指标也随之发生改变。肝功能检测的指标包括有丙氨酸氨基转移酶、谷氨酰转移酶等已被证实是肝功能的标志性酶, 但目前胆碱酯酶、腺苷脱氨酶二者在缺氧缺血性肝损害中的作用被越来越多的重视。肾发生缺氧缺血性损伤后, 胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的变化也成为一种重要的酶学改变指标。
胆碱酯酶是由肝细胞合成的一种水解酶, 其在肝细胞生成后即分泌入血, 故能够对肝实质细胞损害的具体情况进行反应[1]。正常人体血清的胆碱脂酶以拟胆碱脂酶和乙酰胆碱酯酶两种形式存在, 其中前者含量最多, 目前临床上实验室采用的检测方法检测到的均是拟胆碱酯酶, 拟胆碱酯酶主要由肝细胞代谢产生, 当肝功能受损后, 其合成减少, 活性降低, 故其能够敏感地反映肝细胞的合成功能[2]。研究显示拟胆碱酯酶水平下降并不仅是原发性肝病引起的, 任何类型肝损害的分解代谢状态均可引起拟胆碱酯酶水平下降[3]。
腺苷脱氨酶 (ADA) 是嘌呤代谢中重要的酶类之一, 在核苷酸代谢中起脱氨基作用, 催化腺苷转变为次黄嘌呤腺苷。腺苷脱氨酶同工酶有3种, 分别为ADA1, ADA1+CP和ADA2。其中ADA1+CP在肝组织重分布最广, ADA活性是反映肝损伤的敏感指标, 现在已经做为肝功能测定项目之一, 与ALT或GGT等组成肝酶谱能较全面地反映肝脏病的酶学改变, 其较ALT、GGT更能反映急性肝功能损害程度。
肾小球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR) 是直接反映肾滤过功能, 确定是否肾损害的重要指标, 临床上多以Scr、Uree等指标的测定结果作为依据, 进行判断[4]。但Scr受患者年龄、性别的影响较大, 在检查过程中受到溶血等因素的干扰, 对于那些生命体征不稳定的患者, 过多的因素会影响到Scr的检测结果, 导致其不能够准确地反映出肾小球滤过率的变化[10]。胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一种非糖基化的碱性蛋白质, 分子量为12.3×103, 由于其表达时受其它影响因素作用较小, 故含量较恒定, 且能被肾小球完全滤过, 不被肾小管重吸收和分泌, 最终在近端肾小管被分解代谢, 所以能够很灵敏地反应肾小球滤过功能。即肾损伤的变化。
本研究中胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、血清胱抑素C在观察组及对照组间比较差异具有统计学意义, 这有助于指导儿科医生在临床工作中, 将这三个生化学指标与其他标志性酶联合运用, 及时发现早期肝、肾损伤的指征, 尽早进行干预、治疗, 避免和减轻缺氧缺血性脑病合并症的发生。
参考文献
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胱氨酸蛋白酶抑制剂C 篇8
关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶,信号转导,靶标
蛋白酪氨酸磷酸化是细胞用来调控信号传导的一个最主要的手段。在细胞内,酪氨酸磷酸化是同一个动力学可逆的过程,并且该磷酸化过程可以抑制蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的活性 (图1)。 PTKs是用来催化酪氨酸磷酸化,而PTPs控制着去磷酸化过程。因此,PTKs、PTPs及它们相应的底物都属于可调节信号传导网的一类化合物,它们在体内的细胞生长、分化、代谢、细胞周期、细胞间通讯、细胞迁移等这些基本活动中起着极为重要的信号传导调节作用。这一信号转导网的缺陷和不适当则会导致酪氨酸磷酸化的异常,进而引发许多人类疾病如癌症和糖尿病等[1]。
虽然PTPs是构成信号传导通路中很重要的部分,但是它们在人类健康和疾病中的重要性直到近二十年来才受到足够的重视。基于对PTKs的观察,PTP活性的失调是许多人类疾病的致病机理[2]。因此,PTPs在发展临床试剂中代表着一类新的分子目标物,下面我们首先介绍下PTPs结构和机理特性,之后我们将综述下PTPs在信号传导和人类疾病中的重要作用,举例说明特异性的PTP抑制剂的临床意义。最后我们将重点介绍近年来小分子PTP抑制剂方面的发展进程,讨论基于有选择性的PTP抑制剂临床疗效技术的发展。
1 PTP 家族化合物
最初的人类基因序列分析揭示了112种PTPs化合物[3]。与蛋白激酶不同,PTPs的氨基酸序列和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶是不相关的。
PTPs也可以被划分为三大类,即特异性酪氨酸PTPs(tyro-, sine-specific)、双重特异性PTPs(dual-specific)和低分子量的PTPs(图2)。特异性酪氨酸PTPs和低分子量的PTPs目标物必须是含有酪氨酸的蛋白,而双重特异性的PTPs目标物既可以是含有酪氨酸的蛋白,也可以是含有丝氨酸和苏氨酸的蛋白。一些双重特异性的PTPs也可以水解底物而不是水解磷酸蛋白。双重特异性的PTPs包括MAP磷酸酶激酶(MKPs),细胞循环调节器Cdc25磷酸酶和肿瘤干扰抑制器PTEN。
2 PTP结构和催化机理
几十种PTPs的晶体结构已经被确认。虽然氨基酸序列具有多样性和底物具有特异性,双重特异性的PTPs和低分子量的PTPs的晶体仍显示出与特异性酪氨酸PTPs的结构相似性。并且,对催化器重要作用的核心晶体结构部分如PTP活性位点的环状部位,H/V)C(X)R(S/T的序列模式在三类PTPs化合物中均得到了保留。对Yersinia PTP, PTP1B, VHR和小分子PTPs的机理研究表明所有的PTPs都有类似的催化机理,利用活性位点部位的半胱氨酸作为亲核试剂形成一个具有硫代磷酰共价结构的酶中间体,保持不变的精氨酸残基则起着稳定调控状态和保持底物配位亲和功能的作用。磷酸酶中间体第二步则是水解过程,它可以催化天冬氨酸残基。
3 PTPs和人类疾病
许多疾病都与信号传导有障碍有关,其特征就是酪氨酸磷酸化过度或者不能正常实现磷酸化(表1)。例如,SHP-1的突变可以引发人类免疫系统紊乱,导致老鼠中moth-eaten显性因子增多。SHP-1是一种重要的细胞因子信号传导的负调控因子,失去SHP1将会导致酪氨酸不断地磷酸化,继而导致细胞繁殖增生不断增强。这种调控模式增加了有丝分裂,导致了细胞转化。
一些PTPs已经与人类疾病联系在一起。例如: PTEN肿瘤抑制基因突变能够导致很多关键部位的癌症,如脑癌、胸癌和前列腺癌等[4]。遗传学和生化研究表明一些PTPs可以发展为有效的靶向药物,如PTP1B、LAR和PTPα等[5]。PTP活性的的增加或许是造成Ⅱ型糖尿病的一个因素,Ⅱ型糖尿病的典型特征就是胰岛素信号受阻或削弱胰岛素受体的信号传导。PTP1B在胰岛素信号中的负调控作用已被老鼠实验研究证实,可以推测,特异性的PTP1B抑制剂或许能够增加胰岛素的灵敏性,发展成为一种治疗Ⅱ型糖尿病、胰岛素受阻和肥胖症的有效方法。
PTPα抑制剂能够有效抑制肿瘤激酶的活性。Cdc25磷酸酶可以从控制细胞循环的激酶中的酪氨酸和苏氨酸残基上脱去磷酸化,因此在调控细胞循环中起着很重的作用,有证据表明Cdc25A和Cdc25B可能都是致癌基因[6]。抗癌药物就是针对抑制Cdc25磷酸酶的活性发展的。
综上所述,一些人类疾病的致病机理可归因于PTP活性紊乱,其中包括癌症、糖尿病和免疫紊乱等疾病。PTPs在不同的病理生理学上的重要性已经使它们成为研究药物靶点的焦点。因此,PTPs抑制剂也被预测有很好的治疗研究价值。
4 PTP抑制剂发展
酪氨酸磷酸酯(pTyr) 模拟化合物的设计是发现PTPs抑制剂的一条最主要的途径。在早期,pTyr 模拟化合物的设计主要是针对PTPs的催化活性区域,通常用磷酸、乙酸、丙二酸、磺酸和草酸等来取代磷酸酯基,因为所有的PTPs都拥有相同的磷酸化的酪氨酸活性位点,所以设计单一的,选择性的PTPs的抑制剂存在着不小的挑战。幸运的是,PTPs的特异性研究表明,单独的酪氨酸磷酸酯(pTyr)对没有足够的亲和力,与pTyr相连接的残基对PTPs的识别作用很重要。经证明,靠近PTPs活性位点的残基最有可能发展为抑制剂的靶点。这些研究对控制PTP抑制剂的能力和特异性提供了分子基础,也暗示了一种发展有效的特异性强的PTP抑制剂的范例,即发展能同时与活性位点和相邻近的外部位点(有强亲和力的二齿配体),因此独特的与PTP活性位点相临近的部位能够作为靶点增强抑制剂的亲和力和选择性。基于此原理人们已经发展了几种有效的选择性好的PTPs抑制剂,在下文中我们将做讨论。
4.1 无机化合物抑制剂[7]
研究发现,Zn2+、Ni2+和钒酸盐具有抑制PTPs的活性作用,其中钒酸盐的抑制效果最显著,钒酸根在结构上类似于酶的天然底物的磷酸根。最早发现的一类可逆的非特异性PTPs抑制剂是钒酸盐和过氧钒酸盐。其中钒酸盐能竞争性抑制活性位点中的半胧氨酸残基。在矾酸盐与PTP1B复合物的晶体结构中,矾原子与活性位点中的硫醇非常靠近,并与酶形成三角双锥形的过渡态结构,类似于磷酞基转移过程中形成的硫代磷酸盐过渡态。PTPs包含一个具有催化功能的半胱氨酸残基,因此一些碱性试剂和氧化试剂可能成为潜在的PTPs抑制剂。过氧矾酸盐则为一种强氧化试剂,它使活性位点中的半胱氨酸残基氧化成为磺酸,因此它对PTPs的选择性要强于矾酸盐;其它的无机类PTP抑制剂还有一氧化氮和苯胂化氧;这些无机化合物除了可以抑制PTPs外,还有其它的酶抑制活性,正是这种非专一性限制了其作为药物的可能性。
4.2 肽类抑制剂[8]
含有磷酸化酪氨酸残基(pTyr)的肽类底物与PTPs有较高的亲和性,保留pTyr而得到的肽类似物与酶有较高的亲和性,但事实上没有取得预期的结果。因为肽类化合物容易受到体内蛋白酶的降解作用,并且不易通过生物膜,故而肽类化合物一般不是优良的药物先导。正是由于肽类抑制剂代谢快,化学稳定性和生物稳定性差,使得人们寻找一些小分子。
4.3 醌类抑制剂[9]
S W Ham等发现许多PTPs抑制剂具有醌的结构,猜测其机理可能是醌类化合物具有氧化性,可以氧化PTPs活性位点中的半胱氨酸。从而形成了共价结合物,达到抑制酶活性的作用。
4.4 噻二唑烷酮类抑制剂[10]
噻二唑烷酮类是一类直接针对胰岛素抵抗的新药,该类药物通过增加靶器官内的胰岛素敏感性来改善血糖控制。该类化合物是酪氨酸磷酸酯的生物电子等排体。磷酸酯中的两个氧原子与砜基上的氧配适,而磷酸酯中的第3 个氧原子与2 位氮原子重叠。由于1 位砜基和3 位羰基均为吸电子基团,2 位氮上的质子具有弱酸性,可以模拟磷酸酯与催化活性区的碱性氨基酸形成静电作用,增加与酶的亲和力。噻二唑烷酮类抑制剂的开发为pTyr 模拟物设计提供了一条新思路,有望成为高活性、高选择性、药学性质适合的新药物。
4.5 磷酸酯类抑制剂[11]
经研究表明磷酸酯类化合物具有较强的抑制活性,一直作为PTPs 抑制剂设计的重点。在磷酸的α位引入负电性的卤原子后,降低了磷酸根的pKa 值,增强了磷酸与PTPs 催化活性区域的静电作用及氢键相互作用。拥有两个DFMP结构单元抑制剂分别与催化活性区及第二结合位点作用,其活性是单DFMP化合物的450 倍,并且对PTP1B 有一定的选择性。为了构建分子多样性的化合物库,采用平行合成技术,以不同的肽模拟物片段连接两个二氟亚甲基磷酸结构单元,筛选得到的化合物对PTP1B 具有很高的亲和力。
