四氯化碳复合、梯段用药法制备大鼠门脉高压模型的研究

关键词： 门脉 高压

大鼠门脉高压实验模型对研究该病的发生、发展、转归以及治疗具有着重要价值。自1936年Cameron和Karunaratn~e首次报道应用四氯化碳 (CCl4) 制作肝硬变门脉高压动物模型至今, 人们对该法不断探索、改进和完善。基于此目的, 我们对传统的制作方法进行改良, 即采用复合法、分段用药, 以求建立一种更加成熟、稳定可靠的模型制作方法, 为进一步实验打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

普通雄性SD大鼠 (华中科技大学同济医学院实验动物中心提供) 150g~170g/只, 共95只。按编号法随机分为模型对照组 (n=10) 以及模型组 (n=85) 。

1.1.2 主要试剂

CCl4 (分析纯, 浓度为99.5%) , 橄榄油, 新鲜配置的2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液 (由华中科技大学同济医学院超微病理教研室提供) , 苯巴比妥钠, 速眠新Ⅱ (军事医学科学院军事兽医研究所) 。

1.1.3 实验准备

将CCl4与橄榄油溶液混合配制成40%、50%的溶液, 大鼠适应性饲养, 食水供应充足。温度控制在22℃ (±) 。

1.2 方法

1.2.1 模型制备

分为两期:诱导期和成模期[1]。 (1) 诱导期:实验动物在诱导前以每升蒸馏水中含0.35g苯巴比妥钠的溶液作为大鼠的惟一饮用水, 时间为1周。饲料使用普通大鼠饲料。 (2) 成模期:模型组:按0.4mL/100g剂量予以背部皮下注射50%CCl4橄榄油溶液 (即5份CCl4+5份橄榄油溶液, 混匀) , 每周2次, 持续4周。第5周开始改为50%CCl4橄榄油溶液, 以0.5mL/100g标准背部皮下注射, 每周2次, 持续4周。对照组:按0.4mL/100g体重予以背部皮下注射橄榄油, 每周2次, 对照组给予普通饮水和饲料, 频度及剂量同实验组。停药2周后即可成模, 即制备门脉高压大鼠模型时间共计10周。

1.2.2 影像学检查

抽样部分模型大鼠采用速眠新Ⅱ麻醉后进行影像学 (MR、CT) 检查。

1.2.3 血流动力学指标测定

所有动物均在严格的无菌条件下进行手术。以1.0mL/kg体重肌肉注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠[2], 麻醉成功后, 手术助手将大鼠以仰卧位固定于手术台上, 剃除胸腹部毛发, 常规消毒铺巾, 术者穿手术衣, 作剑突下正中切口约3cm, 推开肝叶暴露门静脉主干, 使用游标卡尺量取门静脉主干外径 (D) , 注意手法轻揉, 勿牵拉门静脉, 以减少误差, 结果以mm表示。暴露脾脏, 将21G针头用肝素盐水冲洗后, 刺入脾脏髓质, 连接压力换能器和生理记录仪, 以脊柱前缘为零点, 间接测量门静脉压力 (PVP) , 结果以mmHg表示。

1.2.4 肝脏病理学检查

取新鲜肝脏组织以2.5%磷酸缓冲戊二醛固定后送超微病理检查, 以福尔马林溶液固定送HE、Masson染色检查。

1.3 统计学处理

所得实验数据用均数±标准差表示。应用SPSS统计软件包 (12.0版) 行One~Way ANONA组间方差分析, P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 模型检验及存活情况

大部分实验动物在诱导过程中活动减少, 精神萎靡, 食欲不振, 每日引水约25mL, 对外界刺激反应迟钝, 动物皮肤无光泽, 腹水明显, 体重下降;同期正常对照组大鼠饮食、精神和活动状态良好, ;模型组大鼠CT、MR检查及肉眼观见大鼠体形消瘦, 肝脏体积缩小, 表面凹凸不平, 脾脏略有增大, 伴有肝周少量腹水;模型结束后存活61只大鼠, 死亡率 (28%, 24/85) 。

2.2 肝脏病理学改变

模型对照组HE染色见肝小叶结构完整, 肝索排列整齐, 肝细胞形态正常, Masson染色见汇管区无纤维组织增生, 肝中央静脉周和肝血窦周偶见少量的网状纤维。模型组大鼠的肝组织发生了一系列病理学改变, 可见炎性细胞浸润, 纤维组织广泛增生, 并破坏了肝小叶正常结构, 并将其分割成大小不一、圆形或类圆形的肝细胞团, 形成假小叶和小结节性肝硬变, 但肝细胞再生不明显;电镜观察见肝细胞肿胀变性、坏死, 粗面内质网短、小, 肝窦间隙内充满大量胶原纤维, 巨嗜细胞活化。

2.3 门静脉血流动力学指标变化

门脉高压模型组大鼠门静脉压力 (PVP) 、门静脉内径 (D) 较对照组明显增加 (P<0.05) , 见表1。

3 讨论

肝硬化门脉高压动物模型在研究该病的发生、发展、转归以及治疗等方面的重要性是不言而喻的。CCl4诱发肝硬化门脉高压动物模型是一个较为经典的方法, 染毒方法有经消化道、皮下注射或腹腔内注射等途径[3~4]。以使用小动物如大鼠为多, 物模型较为稳定、可靠。为加快成模速度, 可配合应用酶诱导剂, 如乙醇、苯巴比妥等。1981年Chatamra采用50%CCl4、10%乙醇为主的多因素综合法来诱导大鼠肝硬化模型, 诱导时间约12周, 目前已成为一种标准的诱导方法。乙醇能增强CCl4毒性作用, 且能直接损伤肝细胞线粒体。但也有作者认为该方法存在一定的缺陷, 如动物模型形成周期长 (12周) 、形成率低 (低于80%) , 部分大鼠还出现拒饮乙醇水导致脱水乃至死亡, 因各种原因导致的死亡率甚至可超过30%。苯巴比妥可使细胞色素P-450活性增强, 滑面内质网增生。细胞色素P-450是肝微粒体最重要的药物代谢酶, 故合用苯巴比妥可增加肝细胞对CCl4的敏感性。在饮用水中加入苯巴比妥钠可促进大鼠产生持久的肝硬化。复合法动物肝硬化门静脉高压模型是目前最常用方法, 可节约时间, 提高成模率与降低死亡率。

注:*P<0.05, vs对照组

在此研究中, 笔者先对实验大鼠进行苯巴比妥诱导, 再对CCl4的用药浓度进行改进调整, 即先用40%CCl4诱导4周, 使大鼠对诱导药物产生一个耐受过程, 再提高CCl4的浓度至50%, 为了提高CCl4的吸收率同时并不增加急性中毒死亡率, 以及不对后面的研究造成干扰, 故采用皮下注射方法, 共选择了85只SD大鼠, 到第10周造模成功。我们通过HE染色、Masson三色染色证明, 增生的纤维组织破坏了肝小叶正常结构, 并将其分割成大小不一、圆形或类圆形的肝细胞团, 形成假小叶和小结节性肝硬变, 但肝细胞再生不明显。肝界板破坏, 纤维条索向肝内延伸、分隔, 亦压迫肝窦, 使肝窦水平的阻力增高, 从而引起门静脉系统血流动力学的改变。本研究通过对门静脉系统血流动力学的研究发现, 门静脉直径增加, 自由门静脉压力增高, 实验组明显高于对照组。

综上所述, 本实验成功地制备了大鼠肝硬化门脉高压模型, 具有典型的肝组织学改变、明显的门静脉系统血流动力学改变。为以后的实验研究打下了基础。

摘要：目的探讨构建一种稳定、可靠的门脉高压大鼠模型的制备方法, 并研究该模型肝脏病理结构以及血流动力学的改变。方法雄性SD大鼠95只, 体重150～170g, 按编号法随机分为模型组和对照组。模型组:按0.4mL/100g剂量予以背部皮下注射50%CCl4橄榄油溶液, 每周2次, 持续4周。第5周开始改为以0.5mL/100g标准注射, 每周2次, 持续4周。对照组:仅注射橄榄油, 频度及剂量同模型组。结果对照组10只大鼠全部存活。模型组85只大鼠, 死亡24只, 死亡率28%。存活61只大鼠, 肝脏均可观察到纤维组织不同程度地增生, 肝小叶结构破坏, 假小叶形成, 模型成功率100%。模型组门静脉压力和门静脉内径比对照组明显增加 (P<0.05) ;血清TB、ALT及AST较正常对照组均明显升高 (P<0.05) , 而ALB则明显降低 (P<0.05) 。结论该方法所构建的动物模型其组织学改变与人类肝硬变相似, 门静脉压力显著增高, 是研究门脉高压症的理想模型。

关键词：肝硬化,门脉高压,四氯化碳

参考文献

[1] 叶春华, 刘浔阳.四氯化碳综合法制备大鼠肝硬化模型[J].医学临床研究, 2005 (22) ∶619～622.

[2] 李纪鹏, 黄怡, 董光龙, 等.小肠缺血再灌注后氧自由基和肝超微结构改变及凋亡相关基因的表达[J].外科理论与实践, 2008 (13) ∶235～238.

[3] Mclean E, Mclean AEM, Sutton PM.Instant cirrhosis:An im-proved method for producing cirrhosis in rats simultaneous admin-istration of carbon tetrachloride and phenobarbiton[J].Br J Exppathol, 1996, 50 (3) :502～510.

[4] Proctcr E, Chatamra.High yield micronodular cirrhosis in the rat[J].Gast roenterology, 1982, 83 (5) :1183～1190.