关键词： 促进作用
生长抑制（精选十篇）
生长抑制 篇1
关键词：肺癌细胞,生长抑制因子5,增殖,克隆形成,裸鼠成瘤
肺癌的发生是个涉及多基因改变的复杂过程,其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是两大关键要素。生长抑制因子(inhibitor of growth,ING)作为候选抑癌基因家族在肿瘤发生、发展中起重要抑制作用[1],目前已发现5个成员,包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5[2]。ING编码的蛋白在结构上具有相似性 ,功能上存在共同的作用,ING蛋白参与磷脂酰肌醇介导的脂类信号通路及激素介导的通路,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡和DNA损伤修复[3,4,5,6,7],同时ING蛋白也具有各自的特点[8,9,10,11,12,13]。在多种肿瘤中ING家族基因的表达均下调[7],已有的研究表明,在肝癌的发生、发展中ING1、ING2、ING4均起到重要作用[14,15]。ING5作为家族的最新成员于2003年被首次报道。2006年Cote课题组[16]研究揭示ING5参与构成两种组蛋白乙酰基转移酶(HAT)复合体, 并且能与组蛋白结合而作为连接HAT与组蛋白的桥梁分子参与组蛋白修饰和染色质重构,表明ING5可通过辅助HAT表观调控基因表达而发挥抑癌作用。ING5与临床肿瘤发生的关系研究表明,61%的原发口腔肿瘤组织中ING5 m RNA水平降低,31例中有3例检测到ING5基因发生突变;在肝癌组织中ING5 m RNA表达量下降,起到抑癌基因的作用[17];在食管鳞癌组织中ING5 m RNA的表达量同样下降[18]。进一步研究表明ING5可与P53相互作用,并促进P53转录活化,而引起结肠癌细胞周期阻滞和凋亡[19]。但ING5在肺癌中的作用尚未见报道,本实验拟建立ING5高表达肺癌细胞株,采用细胞增殖、克隆形成及裸鼠皮下荷瘤模型探讨ING5对肺癌细胞的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料
A549细胞(中科院上海细胞库),GV218载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司,蛋白定量试剂盒、SDSPAGE凝胶配制试剂盒、细胞裂解液均购自西安碧云天科技生物有限公司,蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche,G418购自美国Gibco,细胞培养液DMEM高糖、胎牛血清、胰蛋白酶消化液均购自美国Hy Clone,青链霉素混合液购自北京Solarbio,ING5抗体购自美国Proteintech,ECL化学发光试剂盒购自美国Advansta,兔二抗购自英国Abcam,电子游标卡尺购自哈尔滨量具刃具有限责任公司,4%多聚甲醛购自西安科昊生物技术有限公司,裸鼠由第四军医大学(以下简称“我校”)实验动物中心提供。
1.2 GV218 慢病毒载体转染构建 A549-ING5-OE 和A549-control 细胞系
含ING5 c DNA的慢病毒载体和对照载体为吉凯公司构建。用胰蛋白酶消化液消化293T细胞,计数,调整细胞密度为6×105个/m L,接种于细胞培养皿,待细胞密度达80%时进行转染。转染前2 h将培养液换成无血清培养液,将转染复合物加入293T细胞培养液中,培养8 h后弃掉含有转染复合物的培养液,用PBS清洗细胞, 加入10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养。48 h后收集293T细胞上清液,1000 r/min离心除去细胞碎片,收集上清即为病毒颗粒浓缩液。对数生长期A549细胞,培养液中加入病毒颗粒浓缩液进行感染,12 h后观察细胞状态, 没有明显的细胞毒副作用,继续培养24 h后更换新的培养液,感染3 d后观察GFP基因的的表达。感染后A549细胞计数,调整密度为300个/孔,接种至6孔板,用G418筛选,药物浓度为5μg/m L,每隔24 h更换新的培养液,筛选3 d后,用荧光显微镜观察细胞克隆,挑取阳性克隆扩大培养,直至获得需要的细胞量。
1.3 Western blot 检 测 ING5 在 A549 -control 和A549-ING5-OE 细胞中的表达
收集对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞在冰上裂解30 min, 细胞裂解液为150 mmol/LNa Cl、1%NP-40、0.5% 去氧胆酸、0.1%SDS、50 mmol/LTris(p H 8.0),蛋白酶抑制剂 (1∶25),裂解后高速离心20 min,收集上清即为细胞总蛋白 ,蛋白定量试剂盒定量。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制10%的凝胶。电泳,样品在浓缩胶电压100 V,20 min,在分离胶电压120 V继续电泳。转膜,电压55 V,210 min,转膜结束后用丽春红染液染色,PBST脱色。牛奶封闭1 h,一抗ING5(1∶1000)封闭4℃过夜。PBST洗3次,每次5 min,二抗封闭1 h,PBST洗3次,每次5 min。用增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒(Amersham Bioscience)检测蛋白的表达。
1.4 检测 ING5 对肺癌细胞增殖的抑制
将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化,计数,调整细胞密度为1×104个/孔,接种至24孔板,两种细胞各种4个复孔,每孔加1 m L 10%胎牛血清DMEM培养液。从细胞贴壁开始计时24、48、72、96 h后各计数1次。
1.5 检测 ING5 对肺癌细胞克隆形成能力的抑制
将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化,计数,调整细胞密度为300个/孔,接种至6孔板,每孔加2 m L 10%胎牛血清DMEM培养液。细胞接种5 d后每孔各加500μL胎牛血清继续培养。贴壁生长15 d后,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%结晶紫溶液染色15 min,PBS轻轻冲洗细胞, 室温风干后计数多于50个细胞的克隆。根据公式计算克隆形成率:克隆形成率(%)=克隆数/300×100%。
1.6 ING5 抑制裸鼠皮下成瘤实验
出生4周雄性裸鼠,对照组和实验组各7只随机分组,由第四军医大学(以下简称“我校”)实验动物中心代养。裸鼠适应7 d后,将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化,计数,调整密度为每只裸鼠5×106个/200μL,混匀在无血清DMEM培养液, 分别接种至对照组和实验组裸鼠皮下。7 d后裸鼠皮下成瘤,每隔3 d用电子游标卡尺测1次移植瘤长径(a)和短径(b),并计算肿瘤体积(V):ab2/2,绘制肿瘤生长曲线。裸鼠实验遵循我校关于动物保护和做好动物福利规定,并经我校实验动物伦理委员会批准。
1.7 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Western blot 检测 ING5 蛋白表达
为了检测ING5是否在所转染细胞中高表达,将A549-control和ING5高表达细胞对数生长期时用细胞裂解液 提取总蛋 白 ,Western blot结果显示 与A549-control相比 ,ING5在A549-ING5 -OE细胞中表达量显著增高。见图1。
2.2 ING5 抑制肺癌细胞增殖
显微镜下观察可见A549-control和A549-ING5OE细胞生长良好 ,紧密排列 ,形态为梭形 ,细胞之间形成连接。A549-ING5-OE细胞的增殖速度明显低于A549-control细胞,增殖速度为A549-control的一半,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见图2。
2.3 ING5 抑制肺癌细胞克隆形成能力
A549 - control和A549 - ING5 - OE细胞接种 在6孔板15 d后,计数细胞数多于50个的克隆 ,结果表明与A549-control相比ING5高表达肺癌细胞的克隆形成能力明显降低,A549-ING5-OE细胞的克隆形成率为A549-control细胞的50%,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见图3。
2.4 ING5 抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长
裸鼠皮下接种A549-control和A549-ING5-OE细胞,7 d后成瘤,随着时间的增加,接种A549-control裸鼠肿瘤生长较快 ,接种A549-ING5-OE的裸鼠肿瘤生长明显较慢,结果表明ING5高表达后显著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长。见图4。
2.5 接种 A549-ING5-OE 及 A549-control 细胞后大鼠体积变化情况
接种A549-ING5-OE细胞成瘤, 肿瘤体积大小基本无增加。A549-control细胞接种成瘤,肿瘤体积明显增大。从肿瘤生长曲线可以看出ING5高表达的肺癌细胞肿瘤生长明显被抑制, 肿瘤体积较对裸鼠A549-control细胞接种显著减小。见图5。
3 讨论
作为候选抑癌基因家族成员,近年来ING家族在肿瘤发生、发展过程中的作用和机制受到越来越多的关注。路美玲等[17]研究结果表明,与正常肝组织相比,肝癌细胞株ING5 m RNA表达明显降低,在肿瘤转化过程中与正常组织相比ING5表达明显被抑制。赵春阳等[18]研究结果表明,在肿瘤细胞中ING5表达水平越低,肿瘤的恶性程度就越高。
研究表明,肺癌的发生、发展以及侵袭、转移是多基因参与、多步骤发生的过程[19,20]。随着近年来外科技术发展的日趋完善,新的化学治疗药物和局部治疗方法不断出现, 但对肺癌的总体治疗效果却不甚理想,因此从分子水平研究肺癌发生、发展中的分子机制,针对肺癌中异常分子的治疗药物和治疗方法就成了新的研究热点, 并促进了肺癌分子靶向治疗的出现。本研究中, 通过慢病毒介导的基因转染方法使ING5在A549细胞中高表达, 发现ING5高表达后与对照肺癌细胞相比, 其增殖能力和克隆形成能力均降低,说明在细胞水平ING5抑制了肺癌细胞的增殖和克隆形成能力。通过裸鼠在体水平的研究同样发现,ING5抑制了裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长 , 动物实验研究结果同样说明ING5抑制了肺癌细胞的增殖,与上述细胞实验结果相符。
生长抑制 篇2
通过叶绿素a浓度及藻体密度变化研究了超声波对滇池水华藻类生长的影响.当超声辐照5min时,藻体密度为时照组的.35%,叶绿素a浓度下降了22.1%,表明超声波对滇池水华藻类生长有明显抑制作用.
作 者：付琨 高云涛 刘晓海 FU Kun GAO yun-tao LIU Xiao-hai 作者单位：付琨,FU Kun(云南曲靖一中,云南,曲靖,655000)高云涛,GAO yun-tao(云南民族大学化学与生物技术学院,云南,昆明,650031)
生长抑制 篇3
【例1】 将一盆栽植物横放于地，则其水平方向的主根近地一侧生长素浓度变化的曲线为
（ ）。
（图2中虚线表示对根生长既不促进也不抑制的生长素浓度）
解析：横放植物后，受重力作用，生长素从主根背地侧向近地侧运输，故主根近地侧生长素浓度是逐渐升高的，B选项排除；最终主根表现为向地生长，主要原因是近地侧生长素浓度过高，抑制了生长，所以最终浓度应该高于虚线处浓度，D排除；在发生向地生长之前，生长素的浓度应该是促进植物生长的，所以A对，C错。
此题虚线段的生长素浓度表示既不促进又不抑制，虚线以下是低浓度促进生长，虚线以上是高浓度抑制生长。那么虚线段表示的是植物生长还是不生长？是不是在根向地弯曲过程中会出现停止生长的时间段？若有，则表示由促进生长过渡到抑制生长中出现停止生长的阶段。所以关键问题是抑制生长的含义是什么。解释一：“既不促进又不抑制”是指植物不生长，“抑制生长”指不生长，甚至有回缩现象；解释二：既不促进又不抑制时植物能生长，“抑制生长”指比正常生长要慢。哪种解释正确呢？
【例2】 图4是生长素浓度对胚芽鞘生长的作用示意图。下列相关叙述正确的是（ ）。
A.琼脂块中生长素浓度为b点时，α具有最大值
B.只用图3实验即可证明生长素具有促进生长的
作用
C.琼脂块中生长素浓度为d时，胚芽鞘向左侧弯曲
D.琼脂块中生长素浓度不同，但可能形成相同的α
解析：b点生长素浓度对应的促进作用最大，所以α具有最小值，A错误。要证明生长素具有促进生长的作用必须要有对照，B错。d点生长素浓度是抑制生长的，绝不可能向左侧弯曲，C错。D正确，在横坐标上方作一条平行于横轴的辅助线，与曲线有两个交点，对应的两个生长素浓度的作用效果相同，所以可能形成相同的α。
这里有部分教师、学生认为C选项结果为不生长也不弯曲，认为左侧的d点高浓度抑制生长应该与右侧无生长素时不生长作比较，右侧都不生长了，左侧是抑制生长不可能缩回去，所以不生长，笔者认为不妥。d点生长素浓度是抑制生长（图中看出抑制强度没有达到浓度太高，严重抑制到不能生长的程度），指能生长，但比正常生长要慢，这里的“正常生长”是指没有去除苗尖端的时候，而不是与右侧一样，去除苗尖端，即生长素浓度为零时。右侧生长素浓度为零，细胞不生长。所以左边的高浓度抑制生长比右边的不生长细胞生长要快，应该向右侧弯曲生长。因此这里的对照要找准，真正理解曲线含义，要注意内源激素与外源激素的区别。此题应该是下一题的变式：
【例3】 （2009年高考福建卷第5题）某研究小组探究避光条件下生长素浓度对燕麦胚芽鞘生长的影响。胚芽鞘去顶静置一段时间后，将含有不同浓度生长素的琼脂块分别放置在不同的去顶胚芽鞘一侧，一段时间后测量并记录弯曲角度（α）时。图5（甲）为实验示意图。图5（乙）曲线中能正确表示实验结果的是（ ）。
解析：在低浓度范围内，生长素浓度越高，促进作用越强，弯曲程度越大，α值越小。当达到最适浓度时，α值最小，超过最适浓度也是促进作用，只是促进作用逐渐减弱，和前半段曲线大致对称，所以排除C和D选项。当生长素浓度再增加，表现为抑制生长，最低限度就是左侧长度不变，B选项符合。[2]
从该高考题图中可以看出：b曲线是逐渐接近与横轴平行的横线。但明显还是有一定的弯曲度，要达到不生长、不弯曲要求生长素浓度非常高，才会使α值为90°。
我们学过一个例子——顶端优势，顶芽产生生长素向下运输，堆积在侧芽，侧芽部位生长素浓度过高，生长受抑制，但侧芽依然可以缓慢生长发育。从中说明高浓度抑制生长应该是指比正常生长要慢，当抑制作用增强到一定值的时候，生长的速度慢得几乎为零。接着生长素浓度降低些过渡到既不促进又不抑制，应该是指植物能正常生长，浓度再降低时低浓度促进生长。
综上所述，解释二正确。即既不促进又不抑制时植物能生长，抑制生长指比正常生长要慢。从图中还可以看出，既不促进也不抑制时，植物体内的生长素浓度不为零。所以所谓的“促进生长”或“抑制生长”都是有其参照标准的。抑制生长不等于不生长，而是生长速度变慢，只有抑制作用达到一定程度时，才会停止生长；促进生长是指生长速度变快；既不促进也不抑制，也不等于不生长了，而是既没有加快也没有变慢，以一定的速度生长。
没有外加生长素的时候植物也能生长，只是缓慢，生长素加入后只是对其生长起促进或抑制作用。所以对根而言，抑制作用还不足以限制其生长，只是比正常情况下慢了许多。而杂草的情况则是浓度太高，严重抑制（造成不能生长），最终死亡。苗尖端不是没有生长素，生长素是苗尖端产生的，所以苗尖端肯定有生长素的。笔者想指出的是：植物激素分为内源激素和外源激素，课本上的图片是外源激素的浓度变化对植物的影响。苗尖端实验中，在去掉苗尖端时（幼苗中生长素浓度为零），去顶幼苗不生长。即生长素浓度为零时，停止生长，既不促进也不抑制时，植物体内的生长素浓度不为零，植物能生长。
大家也可以看下图数据，数据为一实验结果。为了直观反映生长素作用的“两重线”，绘制两条“辅助线”（如图6中m、n）。与曲线的交点（P）表示“既不促进也不抑制”，当浓度高于该点时，表现为抑制，当浓度低于该点时，表现为促进。[4]
图中的P点对应的根也有一定的长度，是和外加清水组作用效果相同的，空白对照组不加外源激素，而本身是有一定植物激素的，能促进生长。与P点对应浓度的作用结果显示的根平均长度相同，所以既不促进又不抑制时植物能生长。图中也看出抑制生长时根也有一定的长度，也能生长，但比正常生长要慢，这里的正常生长指加清水，不加外源激素，但本身有一定的植物激素时的生长。
（责任编辑 黄春香）endprint
在浙科版生物必修三中提到：植物激素作用的一个特点是低浓度促进作用，高浓度抑制作用。如图1所示，即为生长素浓度小于c时，促进植物生长（b点之前，随着生长素浓度的增大，促进作用逐渐增强，b点促进作用最大；b点之后，随生长素浓度的增大，促进作用逐渐减弱）；生长素浓度大于c时，抑制生长；等于c时，既不促进也不抑制。那么，这个c点时的作用效果到底是生长还是不生长，又是和什么时候作比较的呢？
【例1】 将一盆栽植物横放于地，则其水平方向的主根近地一侧生长素浓度变化的曲线为
（ ）。
（图2中虚线表示对根生长既不促进也不抑制的生长素浓度）
解析：横放植物后，受重力作用，生长素从主根背地侧向近地侧运输，故主根近地侧生长素浓度是逐渐升高的，B选项排除；最终主根表现为向地生长，主要原因是近地侧生长素浓度过高，抑制了生长，所以最终浓度应该高于虚线处浓度，D排除；在发生向地生长之前，生长素的浓度应该是促进植物生长的，所以A对，C错。
此题虚线段的生长素浓度表示既不促进又不抑制，虚线以下是低浓度促进生长，虚线以上是高浓度抑制生长。那么虚线段表示的是植物生长还是不生长？是不是在根向地弯曲过程中会出现停止生长的时间段？若有，则表示由促进生长过渡到抑制生长中出现停止生长的阶段。所以关键问题是抑制生长的含义是什么。解释一：“既不促进又不抑制”是指植物不生长，“抑制生长”指不生长，甚至有回缩现象；解释二：既不促进又不抑制时植物能生长，“抑制生长”指比正常生长要慢。哪种解释正确呢？
【例2】 图4是生长素浓度对胚芽鞘生长的作用示意图。下列相关叙述正确的是（ ）。
A.琼脂块中生长素浓度为b点时，α具有最大值
B.只用图3实验即可证明生长素具有促进生长的
作用
C.琼脂块中生长素浓度为d时，胚芽鞘向左侧弯曲
D.琼脂块中生长素浓度不同，但可能形成相同的α
解析：b点生长素浓度对应的促进作用最大，所以α具有最小值，A错误。要证明生长素具有促进生长的作用必须要有对照，B错。d点生长素浓度是抑制生长的，绝不可能向左侧弯曲，C错。D正确，在横坐标上方作一条平行于横轴的辅助线，与曲线有两个交点，对应的两个生长素浓度的作用效果相同，所以可能形成相同的α。
这里有部分教师、学生认为C选项结果为不生长也不弯曲，认为左侧的d点高浓度抑制生长应该与右侧无生长素时不生长作比较，右侧都不生长了，左侧是抑制生长不可能缩回去，所以不生长，笔者认为不妥。d点生长素浓度是抑制生长（图中看出抑制强度没有达到浓度太高，严重抑制到不能生长的程度），指能生长，但比正常生长要慢，这里的“正常生长”是指没有去除苗尖端的时候，而不是与右侧一样，去除苗尖端，即生长素浓度为零时。右侧生长素浓度为零，细胞不生长。所以左边的高浓度抑制生长比右边的不生长细胞生长要快，应该向右侧弯曲生长。因此这里的对照要找准，真正理解曲线含义，要注意内源激素与外源激素的区别。此题应该是下一题的变式：
【例3】 （2009年高考福建卷第5题）某研究小组探究避光条件下生长素浓度对燕麦胚芽鞘生长的影响。胚芽鞘去顶静置一段时间后，将含有不同浓度生长素的琼脂块分别放置在不同的去顶胚芽鞘一侧，一段时间后测量并记录弯曲角度（α）时。图5（甲）为实验示意图。图5（乙）曲线中能正确表示实验结果的是（ ）。
解析：在低浓度范围内，生长素浓度越高，促进作用越强，弯曲程度越大，α值越小。当达到最适浓度时，α值最小，超过最适浓度也是促进作用，只是促进作用逐渐减弱，和前半段曲线大致对称，所以排除C和D选项。当生长素浓度再增加，表现为抑制生长，最低限度就是左侧长度不变，B选项符合。[2]
从该高考题图中可以看出：b曲线是逐渐接近与横轴平行的横线。但明显还是有一定的弯曲度，要达到不生长、不弯曲要求生长素浓度非常高，才会使α值为90°。
我们学过一个例子——顶端优势，顶芽产生生长素向下运输，堆积在侧芽，侧芽部位生长素浓度过高，生长受抑制，但侧芽依然可以缓慢生长发育。从中说明高浓度抑制生长应该是指比正常生长要慢，当抑制作用增强到一定值的时候，生长的速度慢得几乎为零。接着生长素浓度降低些过渡到既不促进又不抑制，应该是指植物能正常生长，浓度再降低时低浓度促进生长。
综上所述，解释二正确。即既不促进又不抑制时植物能生长，抑制生长指比正常生长要慢。从图中还可以看出，既不促进也不抑制时，植物体内的生长素浓度不为零。所以所谓的“促进生长”或“抑制生长”都是有其参照标准的。抑制生长不等于不生长，而是生长速度变慢，只有抑制作用达到一定程度时，才会停止生长；促进生长是指生长速度变快；既不促进也不抑制，也不等于不生长了，而是既没有加快也没有变慢，以一定的速度生长。
没有外加生长素的时候植物也能生长，只是缓慢，生长素加入后只是对其生长起促进或抑制作用。所以对根而言，抑制作用还不足以限制其生长，只是比正常情况下慢了许多。而杂草的情况则是浓度太高，严重抑制（造成不能生长），最终死亡。苗尖端不是没有生长素，生长素是苗尖端产生的，所以苗尖端肯定有生长素的。笔者想指出的是：植物激素分为内源激素和外源激素，课本上的图片是外源激素的浓度变化对植物的影响。苗尖端实验中，在去掉苗尖端时（幼苗中生长素浓度为零），去顶幼苗不生长。即生长素浓度为零时，停止生长，既不促进也不抑制时，植物体内的生长素浓度不为零，植物能生长。
大家也可以看下图数据，数据为一实验结果。为了直观反映生长素作用的“两重线”，绘制两条“辅助线”（如图6中m、n）。与曲线的交点（P）表示“既不促进也不抑制”，当浓度高于该点时，表现为抑制，当浓度低于该点时，表现为促进。[4]
图中的P点对应的根也有一定的长度，是和外加清水组作用效果相同的，空白对照组不加外源激素，而本身是有一定植物激素的，能促进生长。与P点对应浓度的作用结果显示的根平均长度相同，所以既不促进又不抑制时植物能生长。图中也看出抑制生长时根也有一定的长度，也能生长，但比正常生长要慢，这里的正常生长指加清水，不加外源激素，但本身有一定的植物激素时的生长。
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在浙科版生物必修三中提到：植物激素作用的一个特点是低浓度促进作用，高浓度抑制作用。如图1所示，即为生长素浓度小于c时，促进植物生长（b点之前，随着生长素浓度的增大，促进作用逐渐增强，b点促进作用最大；b点之后，随生长素浓度的增大，促进作用逐渐减弱）；生长素浓度大于c时，抑制生长；等于c时，既不促进也不抑制。那么，这个c点时的作用效果到底是生长还是不生长，又是和什么时候作比较的呢？
【例1】 将一盆栽植物横放于地，则其水平方向的主根近地一侧生长素浓度变化的曲线为
（ ）。
（图2中虚线表示对根生长既不促进也不抑制的生长素浓度）
解析：横放植物后，受重力作用，生长素从主根背地侧向近地侧运输，故主根近地侧生长素浓度是逐渐升高的，B选项排除；最终主根表现为向地生长，主要原因是近地侧生长素浓度过高，抑制了生长，所以最终浓度应该高于虚线处浓度，D排除；在发生向地生长之前，生长素的浓度应该是促进植物生长的，所以A对，C错。
此题虚线段的生长素浓度表示既不促进又不抑制，虚线以下是低浓度促进生长，虚线以上是高浓度抑制生长。那么虚线段表示的是植物生长还是不生长？是不是在根向地弯曲过程中会出现停止生长的时间段？若有，则表示由促进生长过渡到抑制生长中出现停止生长的阶段。所以关键问题是抑制生长的含义是什么。解释一：“既不促进又不抑制”是指植物不生长，“抑制生长”指不生长，甚至有回缩现象；解释二：既不促进又不抑制时植物能生长，“抑制生长”指比正常生长要慢。哪种解释正确呢？
【例2】 图4是生长素浓度对胚芽鞘生长的作用示意图。下列相关叙述正确的是（ ）。
A.琼脂块中生长素浓度为b点时，α具有最大值
B.只用图3实验即可证明生长素具有促进生长的
作用
C.琼脂块中生长素浓度为d时，胚芽鞘向左侧弯曲
D.琼脂块中生长素浓度不同，但可能形成相同的α
解析：b点生长素浓度对应的促进作用最大，所以α具有最小值，A错误。要证明生长素具有促进生长的作用必须要有对照，B错。d点生长素浓度是抑制生长的，绝不可能向左侧弯曲，C错。D正确，在横坐标上方作一条平行于横轴的辅助线，与曲线有两个交点，对应的两个生长素浓度的作用效果相同，所以可能形成相同的α。
这里有部分教师、学生认为C选项结果为不生长也不弯曲，认为左侧的d点高浓度抑制生长应该与右侧无生长素时不生长作比较，右侧都不生长了，左侧是抑制生长不可能缩回去，所以不生长，笔者认为不妥。d点生长素浓度是抑制生长（图中看出抑制强度没有达到浓度太高，严重抑制到不能生长的程度），指能生长，但比正常生长要慢，这里的“正常生长”是指没有去除苗尖端的时候，而不是与右侧一样，去除苗尖端，即生长素浓度为零时。右侧生长素浓度为零，细胞不生长。所以左边的高浓度抑制生长比右边的不生长细胞生长要快，应该向右侧弯曲生长。因此这里的对照要找准，真正理解曲线含义，要注意内源激素与外源激素的区别。此题应该是下一题的变式：
【例3】 （2009年高考福建卷第5题）某研究小组探究避光条件下生长素浓度对燕麦胚芽鞘生长的影响。胚芽鞘去顶静置一段时间后，将含有不同浓度生长素的琼脂块分别放置在不同的去顶胚芽鞘一侧，一段时间后测量并记录弯曲角度（α）时。图5（甲）为实验示意图。图5（乙）曲线中能正确表示实验结果的是（ ）。
解析：在低浓度范围内，生长素浓度越高，促进作用越强，弯曲程度越大，α值越小。当达到最适浓度时，α值最小，超过最适浓度也是促进作用，只是促进作用逐渐减弱，和前半段曲线大致对称，所以排除C和D选项。当生长素浓度再增加，表现为抑制生长，最低限度就是左侧长度不变，B选项符合。[2]
从该高考题图中可以看出：b曲线是逐渐接近与横轴平行的横线。但明显还是有一定的弯曲度，要达到不生长、不弯曲要求生长素浓度非常高，才会使α值为90°。
我们学过一个例子——顶端优势，顶芽产生生长素向下运输，堆积在侧芽，侧芽部位生长素浓度过高，生长受抑制，但侧芽依然可以缓慢生长发育。从中说明高浓度抑制生长应该是指比正常生长要慢，当抑制作用增强到一定值的时候，生长的速度慢得几乎为零。接着生长素浓度降低些过渡到既不促进又不抑制，应该是指植物能正常生长，浓度再降低时低浓度促进生长。
综上所述，解释二正确。即既不促进又不抑制时植物能生长，抑制生长指比正常生长要慢。从图中还可以看出，既不促进也不抑制时，植物体内的生长素浓度不为零。所以所谓的“促进生长”或“抑制生长”都是有其参照标准的。抑制生长不等于不生长，而是生长速度变慢，只有抑制作用达到一定程度时，才会停止生长；促进生长是指生长速度变快；既不促进也不抑制，也不等于不生长了，而是既没有加快也没有变慢，以一定的速度生长。
没有外加生长素的时候植物也能生长，只是缓慢，生长素加入后只是对其生长起促进或抑制作用。所以对根而言，抑制作用还不足以限制其生长，只是比正常情况下慢了许多。而杂草的情况则是浓度太高，严重抑制（造成不能生长），最终死亡。苗尖端不是没有生长素，生长素是苗尖端产生的，所以苗尖端肯定有生长素的。笔者想指出的是：植物激素分为内源激素和外源激素，课本上的图片是外源激素的浓度变化对植物的影响。苗尖端实验中，在去掉苗尖端时（幼苗中生长素浓度为零），去顶幼苗不生长。即生长素浓度为零时，停止生长，既不促进也不抑制时，植物体内的生长素浓度不为零，植物能生长。
大家也可以看下图数据，数据为一实验结果。为了直观反映生长素作用的“两重线”，绘制两条“辅助线”（如图6中m、n）。与曲线的交点（P）表示“既不促进也不抑制”，当浓度高于该点时，表现为抑制，当浓度低于该点时，表现为促进。[4]
图中的P点对应的根也有一定的长度，是和外加清水组作用效果相同的，空白对照组不加外源激素，而本身是有一定植物激素的，能促进生长。与P点对应浓度的作用结果显示的根平均长度相同，所以既不促进又不抑制时植物能生长。图中也看出抑制生长时根也有一定的长度，也能生长，但比正常生长要慢，这里的正常生长指加清水，不加外源激素，但本身有一定的植物激素时的生长。
生长抑制 篇4
【例1】将一盆栽植物横放于地, 则其水平方向的主根近地一侧生长素浓度变化的曲线为 ( ) 。
( 图2中虚线表示对根生长既不促进也不抑制的生长素浓度)
ABCD
解析: 横放植物后, 受重力作用, 生长素从主根背地侧向近地侧运输, 故主根近地侧生长素浓度是逐渐升高的, B选项排除; 最终主根表现为向地生长, 主要原因是近地侧生长素浓度过高, 抑制了生长, 所以最终浓度应该高于虚线处浓度, D排除; 在发生向地生长之前, 生长素的浓度应该是促进植物生长的, 所以A对, C错。
此题虚线段的生长素浓度表示既不促进又不抑制, 虚线以下是低浓度促进生长, 虚线以上是高浓度抑制生长。那么虚线段表示的是植物生长还是不生长? 是不是在根向地弯曲过程中会出现停止生长的时间段? 若有, 则表示由促进生长过渡到抑制生长中出现停止生长的阶段。所以关键问题是抑制生长的含义是什么。解释一: “既不促进又不抑制”是指植物不生长, “抑制生长”指不生长, 甚至有回缩现象; 解释二: 既不促进又不抑制时植物能生长, “抑制生长”指比正常生长要慢。哪种解释正确呢?
【例2】图4是生长素浓度对胚芽鞘生长的作用示意图。下列相关叙述正确的是 ( ) 。
A. 琼脂块中生长素浓度为b点时, α具有最大值
B. 只用图3实验即可证明生长素具有促进生长的作用
C. 琼脂块中生长素浓度为d时, 胚芽鞘向左侧弯曲
D. 琼脂块中生长素浓度不同, 但可能形成相同的α
解析: b点生长素浓度对应的促进作用最大, 所以α具有最小值, A错误。要证明生长素具有促进生长的作用必须要有对照, B错。d点生长素浓度是抑制生长的, 绝不可能向左侧弯曲, C错。D正确, 在横坐标上方作一条平行于横轴的辅助线, 与曲线有两个交点, 对应的两个生长素浓度的作用效果相同, 所以可能形成相同的α。
这里有部分教师、学生认为C选项结果为不生长也不弯曲, 认为左侧的d点高浓度抑制生长应该与右侧无生长素时不生长作比较, 右侧都不生长了, 左侧是抑制生长不可能缩回去, 所以不生长, 笔者认为不妥。d点生长素浓度是抑制生长 ( 图中看出抑制强度没有达到浓度太高, 严重抑制到不能生长的程度) , 指能生长, 但比正常生长要慢, 这里的“正常生长”是指没有去除苗尖端的时候, 而不是与右侧一样, 去除苗尖端, 即生长素浓度为零时。右侧生长素浓度为零, 细胞不生长。所以左边的高浓度抑制生长比右边的不生长细胞生长要快, 应该向右侧弯曲生长。因此这里的对照要找准, 真正理解曲线含义, 要注意内源激素与外源激素的区别。此题应该是下一题的变式:
【例3】 ( 2009年高考福建卷第5题) 某研究小组探究避光条件下生长素浓度对燕麦胚芽鞘生长的影响。胚芽鞘去顶静置一段时间后, 将含有不同浓度生长素的琼脂块分别放置在不同的去顶胚芽鞘一侧, 一段时间后测量并记录弯曲角度 ( α) 时。图5 ( 甲) 为实验示意图。图5 ( 乙) 曲线中能正确表示实验结果的是 ( ) 。
甲乙
A. a B. b C. c D. d
解析: 在低浓度范围内, 生长素浓度越高, 促进作用越强, 弯曲程度越大, α值越小。当达到最适浓度时, α值最小, 超过最适浓度也是促进作用, 只是促进作用逐渐减弱, 和前半段曲线大致对称, 所以排除C和D选项。当生长素浓度再增加, 表现为抑制生长, 最低限度就是左侧长度不变, B选项符合。[2]
从该高考题图中可以看出: b曲线是逐渐接近与横轴平行的横线。但明显还是有一定的弯曲度, 要达到不生长、不弯曲要求生长素浓度非常高, 才会使α值为90°。
我们学过一个例子———顶端优势, 顶芽产生生长素向下运输, 堆积在侧芽, 侧芽部位生长素浓度过高, 生长受抑制, 但侧芽依然可以缓慢生长发育。从中说明高浓度抑制生长应该是指比正常生长要慢, 当抑制作用增强到一定值的时候, 生长的速度慢得几乎为零。接着生长素浓度降低些过渡到既不促进又不抑制, 应该是指植物能正常生长, 浓度再降低时低浓度促进生长。
综上所述, 解释二正确。即既不促进又不抑制时植物能生长, 抑制生长指比正常生长要慢。从图中还可以看出, 既不促进也不抑制时, 植物体内的生长素浓度不为零。所以所谓的“促进生长”或“抑制生长”都是有其参照标准的。抑制生长不等于不生长, 而是生长速度变慢, 只有抑制作用达到一定程度时, 才会停止生长; 促进生长是指生长速度变快; 既不促进也不抑制, 也不等于不生长了, 而是既没有加快也没有变慢, 以一定的速度生长。
没有外加生长素的时候植物也能生长, 只是缓慢, 生长素加入后只是对其生长起促进或抑制作用。所以对根而言, 抑制作用还不足以限制其生长, 只是比正常情况下慢了许多。而杂草的情况则是浓度太高, 严重抑制 ( 造成不能生长) , 最终死亡。苗尖端不是没有生长素, 生长素是苗尖端产生的, 所以苗尖端肯定有生长素的。笔者想指出的是: 植物激素分为内源激素和外源激素, 课本上的图片是外源激素的浓度变化对植物的影响。苗尖端实验中, 在去掉苗尖端时 ( 幼苗中生长素浓度为零) , 去顶幼苗不生长。即生长素浓度为零时, 停止生长, 既不促进也不抑制时, 植物体内的生长素浓度不为零, 植物能生长。
大家也可以看下图数据, 数据为一实验结果。为了直观反映生长素作用的“两重线”, 绘制两条“辅助线” ( 如图6中m、n) 。与曲线的交点 ( P) 表示“既不促进也不抑制”, 当浓度高于该点时, 表现为抑制, 当浓度低于该点时, 表现为促进。[4]
生长抑制 篇5
哈茨木霉是一类重要的植病生防因子.哈茨木霉TH-1分别在PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基上培养均能产孢,其中PDA培养基为最适培养基.PDA培养基上,菌丝生长适宜温度27.5℃～35℃,最适温度32.5℃,产孢最适温度27.5℃.菌丝生长适宜pH值为3～7,产孢适宜pH值为5～9,生长与产孢最适pH值为5.光照对菌丝生长影响不大但明显影响菌株的产孢数量,光照时间越长产孢量越大.对峙培养试验表明TH-1明显抑制疫霉菌的生长速率,其无菌滤液明显抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发,并抑制游动孢子芽管的伸长,TH-1对游动孢子萌发的.相对抑制率为12.7%,对芽管生长长度的相对抑制率为63.1%.水解酶平板活性测定显示,TH-1产生β-1,3葡聚糖酶与纤维素酶,从而使烟草疫霉菌细胞壁的消解,产生非挥发性抗生素抑制烟草疫霉菌孢子萌发,但对菌丝生长影响不大.
作 者：李梅云 谭丽华 方敦煌 李天飞 王革 刘开启 LI Mei-Yun TAN Li-Hua FANG Dun-Huang LI Tian-Fei WANG Ge LIU Kai-Qi 作者单位：李梅云,方敦煌,LI Mei-Yun,FANG Dun-Huang(云南省烟草科学研究所,玉溪,653100)
谭丽华,TAN Li-Hua(鲁南制药股份有限公司,临沂,276003)
李天飞,王革,LI Tian-Fei,WANG Ge(玉溪红塔集团,玉溪,653100)
刘开启,LIU Kai-Qi(仲凯农业技术学院资源环境系,广州,510225)
生长抑制 篇6
在此之前，有3个研究指出钙可有帮助，但是这个更严谨的新研究发现并无帮助，有关钙的发现尤其令人失望。
北卡罗来纳大学教堂山分校（UNCChapel Hill）巴龙（John Baron）说：“这真是意外。”
巴龙带领的新研究结果刊登在日前出刊的“新英格兰医学期刊”（New England Journal of Medicine），研究对象是近来使用结肠镜移除息肉和癌前生长的2259人。他们每日服用1000国际单位维生素D3，以及1200毫克的钙，或两者都不服用。
在追踪3到5年后，不论是否服用钙和维生素D，43%到45%研究对象长出新的息肉。
研究人员已将年龄、性别和其他因素计算在内，显示补充钙和维生素D不会影响结果。
日常衣服或存化学物质残留
纺织印染过程中会用到大量的化学物质，因此我们对于买回家的成衣也需加倍小心。瑞典斯德哥尔摩大学研究人员最新研究发现，日常穿的衣物中存在大量化学物质残留，其中一些有害物质可能成为健康的“隐形杀手”。
瑞典研究人员检测了60件来自瑞典和国际服装生产链的衣服。初步分析发现，这些衣服中含有数以千计的化学物质，约有百种化学物质成分被初步识别。其中，有些物质并非来自生产者，而可能是由运输过程导致的化学物质残留。
斯德哥尔摩大学分析化学博士焦万娜·卢翁戈说：“与这些化学物质的接触增大了患过敏性皮炎的风险。此类化学物质还可能对人类健康和自然环境带来更多危害，其中一些物质已被怀疑或被证实是致癌物，另一些则对水生生物有毒害作用。”
根据这些化学物质的出现率、数量、毒性以及渗入皮肤的难易程度，研究者选定了四组物质进行进一步分析。
其中，涤纶类衣物中浓度最高的两种物质分别是属于喹啉和芳香胺，而棉质衣物中含量最高的化学物质是苯并噻唑，就连有机的棉织品衣服中也有残留。
其中，喹啉具有中等毒性，会对皮肤产生刺激作用。芳香胺因具有致癌性，是一种被禁用的化学染料。苯并噻唑则具有急性毒性，会刺激眼睛和皮肤，并轻度危害水体。
研究者清洗了用于研究的衣物样本，并测量了其中的化学物质残留水平。一些化学物质被洗掉了，但又成为了污染水生环境“罪魁祸首”，而另一些化学物质则仍在衣物中保持高浓度残留。
日本美女机器人会中英日三国语
由日本东芝公司所开发的人工智能机器人“地平Junko”，近日于东京都港区的一处商业设施内亮相。
活动当天，该机器人使用了日文、英文、中文三种语言，给外国游客等介绍景点及相关各项活动。
据了解，这款美女机器人于2014年10月首次亮相，是会讲日文的人工智能机器人“地平Aiko”的妹妹，年龄设定为26岁。
虽然目前仅能对各项活动与商家信息进行简单介绍，但预计将在2017年度内增设图像与声音识别功能，未来可实现配合对方进行对话的功能。
懒汉的福音：日本展出全球首个叠衣机器人
还在为叠衣服而发愁吗？看看这款全球首个全自动衣物折叠机器人吧！放进一件衬衫，3分40秒后，你就可以拿回叠得整整齐齐的衬衫。
在日本千叶幕张国际展览中心，这款机器人可谓人气暴涨。据日本媒体报道，这款机器人可以分析衣物，识别衬衫、裤子、裙子和毛巾4类。完成识别后，内部的机器人手臂开始工作，用合适的折叠方式把衣服叠好。再次打开衣柜，之前皱皱巴巴的衣服已经平整如新了。
制造商说，机器人干活的速度还不能跟人手相比，但会不断改良完善。该产品争取2017年投放市场。
看3D电影不再戴眼镜：影像直接投射视网膜
近日，获谷歌5亿美元投资的Magic Leap公司发布了最新视频，展示了一项增强现实技术，这项新技术意味着未来人们不需要佩戴额外的设备就可以观看3D投影。
在这个视频中，一头巨大的鲸鱼从学校体育馆的地板下面忽然跃出，随着溅起大量的水花。在现场观看的学生们纷纷躲避四溅的水花，但实际上没有一滴水溅出，也没有一头大鲸鱼能从地板下面跃起。
现场观看的学生们并没有佩戴任何辅助设备，就能体验到真实的3D效果。
Magic Leap表示，实现这种效果需要核心处理器、传感器、软件无缝结合，再加上一些独家的技术。
显然，Magic Leap似乎在刻意保持神秘感。从其发布的多款宣传影片来看，它在影像、游戏、教育领域的应用形式，其真实感的渲染和与现实场景的完美结合令人印象深刻。Magic Leap将其技术称之为“动态光场信号”或“数字光场”，本质上是将影像直接投射在眼球视网膜，实现“欺骗”大脑的目的，极大增强真实感和临场感。
2015年3月，Magic Leap公布的一段演示视频就让大家眼前一亮：用户在办公室小隔间玩射击游戏，虚拟的机器人敌人会从办公室家具后面跳出来。看过视频的人都直呼想玩！
之后Magic Leap又在官方网站上公布了一个新视频，视频中，电脑、平板以及手机的使用界面都悬浮在你四周，这一切让屏幕前的你难免会有种正在看科幻大片的错觉。
该视频的发布也意味着Magic Leap掌握了一项增强现实技术，代表未来人们不需要佩戴额外的设备就可以观看全息投影。
科学家发现植物生长素抑制剂 篇7
植物生长素是一种植物荷尔蒙, 能够促进植物根系和果实生长, 控制植物发育的所有阶段。例如, 在黑暗的地方大豆可以发芽, 经过光照, 便可长出叶片进行光合作用;倒伏的植物最快情况下经过30min便可直立, 这些植物对环境的应答反应都有生长素的参与。
鉴于生长素在植物成长控制中具有重要作用, 其在农业栽培领域具有广泛的应用前景, 但与其他植物荷尔蒙相比, 人们对它的不了解尚不充分。生长素在植物体内含量甚微, 其生物合成路径复杂, 化学性质不稳定, 设计生物合成抑制剂也极其困难。诸多问题导致了生长素的基础研究和相关应用滞后, 目前仅限于在农业除草剂和植物调节剂中应用具有生长素活性的生长素亲体, 但尚无控制生长素作用的有效药剂和技术。
该联合研究小组对模型植物拟南芥的遗传发现类型进行了大规模的破解, 并对获得的数据进行分析, 以寻找可控制植物荷尔蒙作用药剂, 结果发现了妨碍生长素生物合成的候补化合物AVG和AOPP。研究小组通过对这些化合物的功能进行深入研究后, 确认了阻碍生长素生物合成的物质。该研究成果发表在4月出版的《植物和细胞生理学》杂志。
水花生生长抑制剂与防治技术研究 篇8
水花生又名空 心莲子草、空心苋 ( Altemanthera philoxeroides Griseb. ) ,苋科莲子草属,多年生宿根草本,原产于巴西,1930年传人我国,是危害性极大的外来入侵物种[1]。由于具有较强的适应能力和快速繁殖能力,水花生不仅危及生物多样性、破坏生态环境[2,3,4],还对种植、水产、水利、航运、物种资源、环境、 人类健康等造成极为不利的影响[5,6]。有研究结果显示,水花生对水稻、小麦、玉米、莴苣等作物的生长和产量会造成严重影响[7],成为亟待防除的重要外来恶性杂草[8]。2003年1月,国家环境保护总局、中国科学院制定了统一灭除行动方案[9]。目前,水花生的防除方法主要包括人工防除、化学防除和生物防除[10,11,12], 但防除效果均存在一定的局限性。
本研究采用植物对某种营养元素的敏感性特点, 筛选出水花生的敏感性物质,复合配制成防除水花生的专用生长抑制剂。该抑制剂与传统的化学防除药物相比,具有防除效果好、无农药残留、无重金属污染问题等优点。
材料与方法
2. 1实验材料
实验材料采用成都平原地区生长的水花生。该植物为多年生宿根性草本,以根茎进行繁殖,匍匐茎发达,在节处生根,茎的节段可萌发生成植株,借以蔓延与扩散[13]。在川渝地区,自2月下旬开始水花生从地下根茎抽出新芽,3—11月靠地下根茎进行营养繁殖, 5月上旬至10月下旬开花,花期长,结的果实种子少[14]。水花生繁殖能力极强,且具有很强的适应性, 水旱皆长,酸性土、碱性土甚至连无土的垃圾堆也能生长。有研究报道,水花生可在p H3—12的环境中生长,p H5—9是其生长的适宜范围,p H7是水花生生长的最佳酸碱度值[15]。
2.2水花生生长抑制剂配方设计
锌是植物生长发育必需的营养元素,是植物体内多种酶的组成成分,影响二氧化碳光合反应等代谢过程,能促进植物生长素的合成,促进碳水化合物的转化与蛋白质的合成。锌元素不足时会影响植物的生长与生殖,但过量时会对植物造成毒害[16]。本研究采用植物对某种营养元素的敏感性特点,在前期大量敏感性物质筛选实验的基础上发现水花生对锌元素较敏感, 因此选取硫酸锌作为水花生生长抑制剂的主要原料, 并配以尿素等叶面喷施肥,通过不同剂量组合,配置成A、B、C三种生长抑制剂配方。
2.3生长抑制剂喷施浓度设计
我们将A、B、C三种配方按照7种浓度梯度进行溶解稀释( 表1) ,以相同方式喷洒到盆栽水花生的茎叶上,观测水花生的生长状态,测定其生理指标,从而筛选出最佳的生长抑制剂配方和喷施浓度,确定有效防治水花生的最小生长抑制剂用量。
3结果与分析
3.1生长响应分析
经A、B、C三种生长抑制剂配方喷施处理,水花生植株体均呈现明显的抑制反应,起初叶脉间失绿,并出现白色斑点,以后叶片枯黄、茎杆萎蔫,并出现死亡现象。不同的生长抑制剂配方以及不同的浓度处理,水花生呈现出不同的抑制现象。
实验发现,经A、B、C三种配方喷施处理2小时后,均从T4开始水花生叶片失水现象较明显,但仍呈绿色; T6、T7的水花生茎杆出现失水变黄的斑块明显, 抑制反应表现为A > B > C。三天后,从T2开始每盆水花生的大部分叶片失水现象明显,且叶片呈失水枯黄状态。A配方处理T4、T5盆栽的水花生叶片90% 枯黄,茎杆顶端失水枯萎; T6、T7呈现明显干枯死亡状态,60% 的茎杆失水干枯死亡,干枯长度约8cm。B配方T4、T5处理85% 的叶片枯黄,T6、T7处理50% 的茎杆失水干枯死亡,干枯长度约5cm。C配方T4、T5处理80% 的叶片枯黄; T6、T7处理40% 的茎杆失水干枯死亡,干枯长度约4cm。15天后,A配方T1处理70% 的叶片枯黄,顶端茎杆枯黄; T2、T3处理95% 的叶片枯黄,50% 的茎杆失水枯萎; T6、T7处理盆栽的水花生呈现明显的干枯死亡状态,70% 的茎杆失水干枯死亡,干枯长度约12cm。B配方T1处理60% 的叶片枯黄; T2、 T3处理90% 的叶片枯黄,50% 的茎杆失水枯萎; T6、T7处理65% 的茎杆失水干枯死亡,干枯长度约10cm; C配方T1处理60% 的叶片枯黄,T2、T3处理85% 的叶片枯黄,40% 的茎杆失水枯萎; T6、T7处理60% 的茎杆失水干枯死亡,干枯长度约8cm。1个月后,三种配方的T1处理水花生开始返绿生长,T2、T3处理有部分水花生新芽发出,T4—T7处理水花生85% 的茎杆失水干枯死亡,T6、T7土壤附近的根系失水现象严重。2个月后,三种配方的T1—T3处理水花生开始返绿,新芽从茎节、根系处发出,T4—T7处理的水花生全部干枯死亡,T6、T7土壤中的根系失水干枯死亡。
A、B、C三种水花生生长抑制剂配方的防治效果均明显( 图1,见封二) ,且见效快,一般喷施后2小时即可见效,叶片叶脉间失绿,出现白色斑点,地上部分失水萎蔫; 3天后植株叶片干枯,药物在植物体内传递导致茎杆开始干枯; 15天后高浓度处理植株整株失水干枯; 1个月后高浓度处理植物整株死亡,包括根系死亡; 2个月后,低浓度T1—T3处理水花生开始发出新芽,T4—T7处理的水花生全部干枯死亡,说明T4是防治水花生的最佳喷施浓度。三种配方与一浓度处理效果比较,A配方处理效果强于B、C配方。
3.2生物量影响分析
在不同浓度梯度A配方处理下( 图2) ,水花生的生物量随着处理浓度的升高而呈下降趋势。处理后根部鲜重与CK( 14. 72g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了3. 36g、3. 73g、4. 03g、3. 95g、5. 31g、6. 13g、 6. 52g,平均降低了4. 72g; 处理后水花生根部干重与CK( 3. 18g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了0. 37g、0. 93g、0. 97g、1. 20g、1. 29g、1. 31g、1. 46g,平均降低了1. 19g; 处理后水 花生地上 部鲜重与CK( 16. 00g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了6. 32g、7. 53g、7. 66g、8. 96g、8. 41g、11. 22g、11. 86g,平均降低了8. 85g; 处理后的 水花生地 上部干重 与CK( 8. 20g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了2. 06g、3. 31g、3. 43g、3. 49g、4. 37g、4. 55g、5. 04g,平均降低了3. 75g。经过相关性分析得出,水花生根部鲜重、根部干重、地上部鲜重、地上部干重均与A配方处理浓度呈极显著的负相关关系,相关系数分别为 - 0. 920**、- 0. 933**、- 0. 892**、- 0. 921**( P < 0. 01) ,说明高浓度的A配方对水花生生物量的累积具有较强的影响。经过方差分析得出,各处理T1—T7的水花生根部鲜重、地上部鲜重、地上部干重与CK均具有极显著的差异性( P < 0. 01) ,说明随着配方A处理对水花生的生长影响效果极显著; 除T5与T6处理下的水花生根部干重差异性显著外( P < 0. 05) ,其余处理下的 水花生根 部干重差 异性均为 极显著 ( P < 0. 01) 。
在不同浓度梯度B配方处理下( 图3) ,水花生的生物量随着处理浓度的升高而呈下降趋势。处理后水花生根部鲜重与CK( 14. 72g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了2. 78g、3. 23g、5. 17g、5. 31g、5. 61g、 8. 97g、9. 54g,平均降低了5. 80g; 处理后水花生根部干重与CK( 3. 18g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了0. 74g、1. 11g、1. 24g、1. 38g、1. 51g、1. 57g、1. 91g, 平均降低了1. 45g; 处理后水 花生地上 部鲜重与CK( 16. 00g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了2. 99g、4. 49g、4. 55g、6. 94g、8. 67g、8. 90g、11. 83g,平均降低了6. 91g; 处理后水花生地上部干重与CK( 8. 20g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了1. 10g、 1. 41g、1. 55g、2. 62g、4. 37g、4. 94g、6. 52g,平均降低了3. 22g。经过相关性分析得出,水花生根部鲜重、根部干重、地上部鲜重、地上部干重均与A配方处理浓度呈极显著的负相关关系,相关系数分别为 - 0. 969**、 - 0. 933**、- 0. 983**、- 0. 973**( P < 0. 01) ,说明高浓度的B配方对水花生生物量的累积具有较强的影响。经过方差分析得出,各处理T1—T7的水花生根部鲜重、根部干重、地上部鲜重、地上部干重与CK均具有极显著的差异性( P < 0. 01) ,说明随着B配方处理对水花生的生长影响效果极显著。
在不同浓度梯度C配方处理下( 图4) ,水花生的生物量随着处理浓度的升高而呈下降趋势。处理后水花生根部鲜重与CK( 14. 72g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了5. 31g、4. 75g、5. 66g、6. 14g、6. 30g、 8. 19g、8. 19g,平均降低了6. 36g; 处理后水花生根部干重与CK( 3. 18g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了1. 25g、1. 79g、1. 35g、1. 98g、1. 26g、1. 58g、1. 92g, 平均降低了1. 65g; 处理后水花生地上部鲜重与CK ( 16. 00g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了4. 07g、6. 43g、6. 63g、7. 57g、7. 68g、9. 97g、10. 73g,平均降低了7. 58g; 处理后水花生地上部干重与CK( 8. 20g) 相比,T1—T7的水花生生物量分别降低了2. 14g、 2. 76g、3. 47g、3. 47g、4. 12g、4. 37g、5. 61g,平均降低了3. 71g。经过相关性分析得出,水花生根部鲜重、根部干重、地上部鲜重、地上部干重均与A配方处理浓度呈极显著的负相关关系,相关系数分别为 - 0. 871**、 - 0. 652**、- 0. 940**、- 0. 947**( P < 0. 01) ,说明高浓度的C配方对水花生生物量的累积具有较强的影响。经过方差分析得出,除T3与T4的水花生地上部干重、T1与T5根部干重、T6与T7根部鲜重的差异性不显著外,其余各处理T1—T7的水花生根部鲜重、 根部干重、地上部鲜重、地上部干重与CK相比均具有极显著的差异性( P < 0. 01) ,说明C配方处理对水花生的生长影响效果极显著。
水花生分别在A、B、C三种配方喷施处理下,其生物量均受到一定的影响。对比分析表明,水花生根部鲜重受到的 影响效果依次 为B ( - 0. 969**) > A ( - 0. 920**) > C( - 0. 871**) ,根部干重受到的影响效果依次 为A( - 0. 933**) = B ( - 0. 933**) > C ( - 0. 652**) ,说明A、B配方中的敏感性物质对水花生根部生物量的累积影响强于C,且B配方中敏感性物质在水花生的叶片、茎部传递到根部的移动性最强。 地上部鲜重受到的影响效果依次为B( - 0. 983**) > C ( - 0. 940**) > A( - 0. 892**) ,地上部干重受到的影响效果依次为B( - 0. 973**) > C( - 0. 947**) > A ( - 0. 921**) ,说明配方B中的敏感性物质对水花生地上部生物量的影响效果比A和C显著。且在B配方T4处理开始,生物量明显降低,说明T4浓度是影响水花生生物量累积的一个浓度临界点。
3.3叶绿素含量影响分析
在不同浓度梯度A配方处理下( 图5) ,水花生叶片中的叶绿素含量随着处理浓度的升高而呈下降趋势。与CK( 0. 11mg /g) 相比,T1—T7的水花生叶绿素总量平均减少了0. 026mg /g。T7的水花生叶绿素含量最低,总含量为0. 051mg /g,与CK相比减少了0. 059mg /g; 叶绿素a含量为0. 037mg /g,与CK( 0 . 087 mg / g) 相比减少了0 . 050 mg / g; 叶绿素b含量为0. 014mg /g,与CK( 0. 026mg /g) 相比减少了0 . 012 mg / g。经过相关性分析得出 ,水花生叶绿素a、叶绿素c、叶绿素总量与A配方处理浓度呈极显著的负相关关系,相关系数分 别为 - 0. 965**,-1 . 879**,- 0. 960**( P < 0. 01) ,说明高浓度的A配方对水花生叶绿素含量具有较强的影响。经过方差分析得出,T1—T7的水花生叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量与CK相比均具有极显著的差异性 ( P < 0. 01) ,说明A配方处理对水花生叶绿素的影响效果极显著。
在不同浓度梯度B配方处理下( 图6) ,水花生叶片中的叶绿素含量随着处理浓度的升高而呈下降趋势。与CK( 0. 11mg /g) 相比,T1—T7的水花生叶绿素总量平均减少了0. 022mg /g。T7的水花生叶绿素含量最低,总含量为0. 081mg /g,与CK相比减少 了0. 029mg / g; 叶绿素a含量为0. 060mg / g,与CK ( 0. 087mg / g) 相比减少了0. 027mg / g; 叶绿素b含量为0. 021mg / g,与CK( 0. 026mg / g) 相比减少了0. 004mg / g。 经过相关性分析得出,水花生叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量与B配方处理浓度呈极显著的负相关关系,相关系数分别为 - 0. 798**,- 0. 809**,- 0. 923**( P < 0. 01 ) ,说明高浓度的B配方处理对水花生叶绿素含量具有较强的影响。经过方差分析得出,T1—T7的水花生叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量与CK相比均具有极显著的差异性( P < 0. 01) ; T1与T2的水花生叶绿素总量差异性不显著,说明高浓度B配方处理对水花生叶绿素的影响效果极显著,低浓度处理对水花生叶绿素含量的影响不显著。
在不同浓度梯度C配方处理下( 图7) ,水花生叶片中的叶绿素含量随着处理浓度的升高而呈下降趋势。与CK( 0. 11mg /g) 相比,T1—T7的水花生叶绿素总量平均减少了0. 020mg /g。T7的水花生叶绿素含量最低,总含量为0. 047mg /g,与CK相比减少 了0. 063mg / g,叶绿素a含量为0. 035mg / g,与CK ( 0. 087mg / g) 相比减少了0. 052mg / g,叶绿素b含量为0. 013mg / g,与CK( 0. 026mg / g) 相比减少了0. 013mg / g。 经过相关性分析得出,叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量与C配方处理浓度呈极显著的负相关关系,相关系数分别为 - 0. 930**,- 0. 779**,- 0. 906**( P < 0. 01) ,说明高浓度C配方对水花生叶绿素含量具有较强的影响。方差分析得出,T1—T7的水花生叶绿素a、 叶绿素b、叶绿素总量与CK均具有极显著的差异性 ( P < 0. 01) ,T1与T2、T4的水花生叶绿素b含量的差异性不显著,说明C处理对水花生叶绿素a和叶绿素总含量的影响效果极显著,低浓度处理对叶绿素b含量的影响不显著。
水花生分别在A、B、C三种配方喷施处理下,其叶绿素含量均受到影响。对比分析表明,叶绿素总量受到的影响效 果依次为A ( - 0. 960**) > B ( - 0. 923**) > C( - 0. 906**) ,其中水花生叶绿素a受到的影响效果依次为A( - 0. 965**) > B( - 0. 798**) > C ( - 0. 930**) ,叶绿素b受到的影响效果依次为A( - 0. 879**) > B ( - 0. 809**) > C( - 0. 779**) ,说明配方A中的敏感性物质对水花生叶绿素含量的影响显著高于B和C。在A配方处理中,T3的水花生叶绿素含量明显降低,说明T3浓度是影响水花生叶绿素含量的一个浓度临界点。
3.4土壤中锌含量分析
由于该研究涉及重金属元素锌的使用,考虑到重金属对土壤的污染问题,在试验后期对盆栽土壤进行了重金属锌含量测定,结果见表2。
在不同浓度梯度A、B、C生长抑制剂配方处理水花生的土壤中,锌含量最高的是A配方T6( 55. 75mg / kg) ,最低的是C配方T5( 32. 03mg /kg) ,三种配方处理下的土壤锌平均含量为: A52. 33 mg /kg、B43. 94mg / kg1、C36. 51mg / kg,均在土壤环境质量标准 ( GB15618 - 1995) 自然背景的土壤环境质量限制值范围内。经过相关性分析得出,A、B、C配方处理浓度的土壤锌含量相关性不显著,说明三种配方中的锌对土壤的影响较小,在最高浓度处理下土壤的重金属锌含量仍在安全范围内,因此该配方对土壤是安全的。
4结论
从外观生长情况来看,A配方处理对水花生的生长影响显著高于B、C配方,A配方的高浓度处理造成水花生叶片严重失水,约15天后经吸收传导至茎杆和根部,引起根系失水、失去活力而死亡。1个月后, T4—T7处理的水 花生均呈 现死亡状 态,2个月后T1—T3处理有复发迹象,T4—T7处理均呈现死亡状态, 根系干枯死亡无复发迹象。从对生物量的影响来看, B配方处理对水花生的生长影响显著高于A、C配方, 高浓度B处理造成水花生失水干枯,对生物量累积的影响较强。B配方中敏感性物质经水花生的叶片、茎部传递到根部的移动性最强,且从T4浓度处理开始, 生物量明显降低,说明T4浓度是影响水花生生物量累积的一个浓度临界点。从对水花生叶绿素含量的影响来看,A配方中的敏感性物质对叶绿素含量的影响效果显著高于B和C。且从A配方T3处理开始,水花生叶绿素含量明显降低,说明T3浓度是影响水花生叶绿素含量的一个浓度临界点。
该配方中的生长抑制剂对土壤无重金属污染的风险。综合考虑A、B、C三种配方的防治效果和经济性, 认为对水花生的最佳防治配方为A和B,最佳处理浓度为T4( 浓度为2% ) 。为达到最佳的防治效果,避开对农作物生育期可能引起的伤害,并根据水花生的生长规律,认为防治时期一般在每年的5月中上旬和7月中下旬[17],在10月前喷施的防治效果更佳。
摘要：针对外来入侵植物水花生对农林渔业生产造成的严重影响,采用植物对某种营养元素的敏感性原理,筛选出水花生敏感的物质,结合叶面喷施肥配置出A、B、C三种水花生生长抑制剂配方;再采用水溶液喷施的方式对水花生进行不同浓度处理,观察测定水花生的生理指标,筛选出最佳的防治水花生配方及处理浓度。研究结果表明,随着处理浓度的升高,生长抑制剂对水花生的生物量、叶绿素含量的影响逐渐增加,A、B配方的防治效果较好,且最佳处理浓度为2%。
生长抑制 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株,由广东医学院衰老研究所提供。Synergy2多功能酶标仪(Biotek),FACSCanto2流式细胞仪(美国BD公司),CO2培养箱(RSBiotech),OLYMPUS XD-101倒置显微镜(南京江南永新光学有限公司),超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)。
1.2 细胞培养
用10%小牛血清DMEM培养基培养Hela细胞,置于5%CO2,37℃培养箱中培养。
1.3 药物配制
取0.5 g肉桂单味中药颗粒(广东一方制药有限公司)加5 ml超纯水,高压灭菌制得浓度为100 mg/ml肉桂水煎液;氟尿嘧啶(5-FU,25 mg/ml,天津金耀氨基酸有限公司)注射液用除菌无血清培养基稀释为2.5 mg/ml,备用。
1.4 方法
1.4.1 CCK-8法测定细胞生长抑制率
1.4.1.1 肉桂抑制肿瘤细胞增殖的量效作用
采用96孔板,设高中低3个剂量肉桂组、5-FU组、对照组,每组3个平行孔,每孔加入100μl细胞悬液(含5×103个细胞),待细胞贴壁完全后,加入5μl药液,高中低3个剂量肉桂组终浓度分别为5.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.2 mg/ml的肉桂水煎液,5-FU组终浓度为0.1 mg/ml的5-FU,对照组加等体积培养液。5%CO2,37℃孵育48 h后,按照CCK-8试剂盒说明书操作,酶标仪测吸光值。
1.4.1.2 肉桂抑制肿瘤细胞增殖的时效作用
采用96孔板,设对照组和肉桂组,每组3个平行孔,每孔加入100μl细胞悬液(含5×103个细胞),待细胞贴壁完全后,加入5μl药液,肉桂组终浓度为5.0 mg/ml肉桂水煎液,对照组加等体积培养液。5%CO2,37℃孵育分别12、24、48、72 h后,按照CCK-8试剂盒说明书操作,酶标仪测吸光值。
1.4.2 贴壁率实验
采用48孔板,设对照组和肉桂组(终浓度为5.0 mg/ml肉桂水煎液),每组3个平行孔,每孔加入200μl细胞悬液(含1×104个细胞),孵育4 h贴壁后,吸去培养液用PBS洗2遍后,每孔加入200μl培养液和20μl的CCK-8混合液,37℃5%CO2孵育1 h后,用酶标仪测每孔的吸光值。
1.4.3 对细胞迁移能力的影响
采用划痕实验,实验分组同上,按参考文献[3]进行。
1.4.4 FCM测细胞周期
实验分组同上,采用PI染色法,将PI染色的单细胞悬浮液用流式细胞仪测试10 000个细胞,进行细胞计量术分析,用Wincycle 32软件进行数据分析。
1.5 统计学处理
实验数据用SPSS 17.0处理,计量资料以表示,采用t检验。计数资料采取字2检验,实验图像采用Image pro plus 6.0分析处理,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CCK-8法测定细胞生长抑制率
肉桂对肿瘤有明显抑制作用且随着药物浓度的增加而增强。作用48 h后,0.2、1.0、5.0 mg/ml肉桂水煎液的抑制率分别为15.40%、24.58%、97.12%,5-FU组为68.41%。5.0 mg/ml肉桂水煎液作用12 h的细胞增殖抑制率为57.46%,24 h为88.52%,48 h为95.32%,72 h为95.81%。
2.2 贴壁率结果
Hela细胞对照组的贴壁率为100%,肉桂组的贴壁率为48.3%(P<0.05)。
2.3 对细胞迁移能力的影响
细胞划痕实验结果见表1。与对照组相比,肉桂组的Hela细胞划痕间隙恢复缓慢,说明肿瘤细胞迁移能力显著下降(P<0.05)。
*与对照组比较,P<0.05
2.4 FCM检测细胞周期
对照组相比,肉桂组G1期比例略降低,S期比例明显降低,G2期明显增多。表明肉桂使宫颈癌细胞主要阻滞在G2期,见表2。
%
3 讨论
肉桂含有多种有效成分,以往实验已证实肉桂中的桂皮醛对人多种肿瘤细胞具有杀伤作用,肉桂酸对人肺腺癌细胞有诱导分化作用,邻羟基肉桂酸锗对小鼠宫颈癌有抑制作用,肉桂提取物可通过调节CD8+T细胞抑制肿瘤的生长[4,5,6]。
本实验结果表明肉桂能显著抑制宫颈癌细胞增殖,且该抑制作用具有量效和时效作用,并能显著抑制宫颈癌细胞的贴壁,降低细胞迁移能力。细胞周期结果显示肉桂组S期比例明显降低,G2期明显增多,说明肉桂可能通过抑制染色体复制,将宫颈癌细胞阻滞在G2期。
参考文献
[1]韦如萍,黄永芳,胡德活,等.肉桂的研究现状及发展趋势[J].经济林研究,2006,24(3):65-70.
[2]Andrawiss M.Cervical cancer vaccines available in2005[J].Drug Discov Today,2005,10(14):949-950.
[3]黄敏丽,罗国客,陈维平,等.Tumstatin肽对条件培养基下视网膜脉络血管内皮细胞迁移的影响[J].实验研究,2008,26(6):448-450.
[4]梁秋霞.肉桂有效成分提取及其生物活性研究[D].广西大学,2010.
[5]叶连宝,欧小敏,涂洁琼,等.邻羟基肉桂酸锗对小鼠U14宫颈癌的抑制作用[J].西北药学杂志,2010,25(6):438-439.
生长抑制 篇10
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性SD大鼠104只, 体重 (200±15) g, 动物批号SCXK (京) 2012-0001, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
1.2 动物分组及干预方式
采用随机数字表法将实验动物分为正常组, 假手术组, 模型组, 模型对照组, 电针组。正常组, 假手术组, 模型组各24只;模型对照组, 电针组各16只。各组均常规喂养, 于造模后7天开始干预。电针治疗组:采用电针仪治疗, 取损伤侧环跳、殷门、阳陵泉、承山, 两电针正负极分别接环跳和阳陵泉, 殷门和承山, 电流2 m A, 频率为5 Hz, 疏密波, 一次10分钟, 每日治疗一次, 每治疗10次为一个疗程, 休息1天后, 再进行第二个疗程。模型对照组:与治疗组动物同期每天束缚一次, 一次10分钟, 每治疗10次为一个疗程, 休息1天后, 再进行第二个疗程。正常组、假手术组、模型组无特殊干预。整个实验过程中, 在动物取材前, 未出现动物死亡。
1.3 模型制备
采用神经夹持损伤法制造坐骨神经损伤大鼠模型, 具体方法:先将大鼠用10%水合氯醛以0.35 ml/100 g的剂量腹腔注射麻醉;然后俯卧位固定, 手术区 (右侧臀股交界处) 剪毛、常规消毒;用手术剪沿坐骨神经走行方向剪开大约1 cm的皮肤切口, 止血, 用止血钳钝性分离肌肉层, 暴露梨状肌下缘及坐骨神经;用弯钩镊确认所暴露的组织确为坐骨神经后, 用10号持针器钳夹梨状肌下缘5 mm处的坐骨神经, 满扣 (经过测量压力为5 kg) , 时间5秒, 造成长约2 mm的损伤点, 然后逐层消毒、缝合。
1.4 试剂
MAG Antibody (D-7) , 为小鼠单克隆IgG2b, 200μg/ml。生产厂家Santa Cruz Biotechnology, 编号sc-376145。
1.5 取材时间点
第一次取材:造模后7天取材, 正常组、假手术组、模型组3组每组随机抽取8只。第二次取材:电针治疗10次后, 5组随机抽取8只。第三次取材:电针治疗20次后。每次取材前进行行为学检测, 取材后用免疫组化法检测MAG的表达。
1.6 检测项目
1.6.1 行为学检测
(1) 坐骨神经功能指数 (sciatic nerve function index, SFI) :采用SFI测定方法检测损伤神经的恢复率。具体方法为:于各检测点, 测定大鼠实验足 (E) 及正常足 (N) 的足印长度 (PL) 、足趾宽度 (TS) 及中间足趾距离 (IT) 。将数据代入Bain公式, 计算SFI。SFI=-38.3[ (EPL-NPL) /NPL]+109.5[ (ETS-NTS) /NTS]+13.3[ (EIT-NIT) /NIT) ]-8.8。以SFI=0为正常值, SFI=-100为神经完全断离的指标, 计算SFI的恢复率 (%) 。 (2) 热痛阈测定:在室温 (20±2) ℃的安静环境下, 将大鼠放入辐射热测痛仪的玻璃桥架上的鼠格内, 全身可以自由活动。待大鼠安静后, 用强光从玻璃桥架下面向上照射大鼠足掌, 测定大鼠的抬脚潜伏期 (foot withdrawl latency, FWL) , 以左右两脚掌抬脚潜伏期的差值 (手术侧-对照侧) 作为痛敏分数 (秒) 。本方法主要观察神经损伤后的温度觉变化。
1.6.2 免疫组化
取大鼠脊髓L3～L6节段, 用4%多聚甲醛固定, 梯度脱水, 石蜡包埋后5μm连续切片, 捞片后置烤箱60℃/60分钟以使切片紧密粘附。用ABC法:切片常规脱蜡至水, 二甲苯Ⅰ5分钟→二甲苯Ⅱ5分钟→无水乙醇3分钟→95%酒精3分钟→85%酒精3分钟→蒸馏水中浸泡2分钟→30%H2O2 (30 ml) +蒸馏水10份 (300 ml) 室温8分钟以灭活内源性酶→蒸馏水2分钟×3次。热修复抗原:将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液 (pH值6.0) , 电炉加热至沸腾后断电, 间隔10分钟, 反复2次。冷却后用pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS) 洗涤2分钟×2次。滴加5%牛血清蛋白 (BSA) 封闭液, 室温20分钟, 甩去多余液体, 不洗。滴加适当稀释 (稀释液用双蒸水稀释液250μl后, 抗体:PBS=1∶100稀释一抗) 的MAG抗体, 4℃过夜后37℃温箱复温30分钟。PBS (pH值7.2～7.6) 洗2分钟×2次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 37℃, 20分钟。PBS洗2分钟×3次。滴加试剂链霉亲和素—生物素复合物 (strept avidin-biotin complex, SABC) , 37℃, 20分钟。PBS (pH值7.2～7.6) 洗5分钟×4次。3, 3'-四盐酸二氨基联苯胺 (3, 3’-diaminobenzidine, DAB) 显色:使用DAB显色试剂盒 (AR1022) 。取1 ml蒸馏水, 加试剂盒中A, B, C试剂各一滴, 混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间, 10分钟后蒸馏水洗涤终止反应。苏木素中1分钟, 水洗, 盐酸中提两下, 水洗, 氨水中60秒, 85%酒精3分钟→95%酒精3分钟→无水酒精Ⅰ2分钟→无水酒精Ⅱ2分钟→二甲苯Ⅰ2分钟→二甲苯Ⅱ2分钟, 封片。用光镜观察蛋白表达, 并用Image-Pro Plus 6.0图像软件进行平均光密度半定量统计。
1.7 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件包, 对行为学检测结果进行比较以及对脊髓中MAG在不同时间点中的免疫染色结果进行比较。统计采用一维方差分析进行组间比较, 所有数据用均数±标准差表示。
2 结果
2.1 行为学检测结果
2.1.1 坐骨神经功能指数 (SFI)
如表1所示, 统计采用一维方差分析进行组间比较, SNK法进行两两比较。造模7天后:模型组明显低于正常组和假手术组, 有显著差异性 (P<0.05) ;假手术组高于模型组, 有显著差异性 (P<0.05) 。治疗10次、20次后:假手术组明显高于模型组, 有显著差异 (P<0.05) ;模型组明显低于正常组, 有显著差异 (P<0.05) ;模型组与模型对照组无明显差异 (P>0.05) ;模型对照组明显低于正常组, 有显著差异 (P<0.05) ;电针组高于模型组, 有显著差异性 (P<0.05) ;电针组低于正常组, 有显著差异性 (P<0.05) ;电针组高于模型对照组, 有显著差异性 (P<0.05) 。
注:与模型组比较aP<0.05;与正常组比较, bP<0.05;与模型对照组比较cP<0.05
2.1.2 热痛阈测定
如表2所示, 统计采用一维方差分析进行组间比较, SNK法进行两两比较。造模7天后:模型组明显高于正常组和假手术组, 有显著差异性 (P<0.05) ;假手术组低于模型组, 有显著差异性 (P<0.05) 。治疗10次、20次后:假手术组明显低于模型组, 有显著差异 (P<0.05) ;模型组明显高于正常组, 有显著差异 (P>0.05) ;模型组与模型对照组无明显差异 (P<0.05) ;模型对照组明显高于正常组, 有显著差异 (P<0.05) ;电针组高于正常组, 有显著差异性 (P<0.05) ;电针组低于模型组, 有显著差异性 (P<0.05) ;电针组低于模型对照组, 有显著差异性 (P<0.05) 。
注:与正常组比较, aP<0.05;与模型组比较bP<0.05;与模型对照组比较cP<0.05
2.2 免疫组化结果
MAG表达:经Image-Pro Plus 6.0进行平均光密度检测, 统计采用一维方差分析进行组间比较, SNK法进行两两比较, 如表3所示。造模7天后:假手术组低于模型组, 有显著差异性 (P<0.05) ;模型组高于正常组, 有显著差异性 (P<0.05) 。治疗10次、20次后:假手术组高于正常组, 有显著差异性 (P<0.05) ;模型组高于正常组, 有显著差异性 (P<0.05) ;模型组与模型对照组无明显差异 (P>0.05) ;模型对照组高于正常组, 有显著差异性 (P<0.05) ;电针组高于正常组, 有显著差异性 (P<0.05) ;电针组低于模型组, 有显著差异性 (P<0.05) ;电针组低于模型对照组, 有显著差异性 (P<0.05) 。表达情况如图1、2、3所示。
注:与正常组比较, aP<0.05;与模型组比较bP<0.05;与模型对照组比较cP<0.05
3 讨论
3.1 标本的选取
周围神经损伤的再生修复除了受内在环境的影响, 神经元胞体的功能恢复至关重要。神经元胞体是神经细胞代谢, 营养中心, 是轴突生长发育所需要蛋白质及其它功能物质的主要合成部位, 坐骨神经损伤后再生轴突不能到达远端神经, 以至经逆行轴浆运输至胞体的神经营养因子及功能等随之发生相应的变化, 部分神经元死亡而消失, 存活的神经元发生不同程度的退行性变[3]。脊髓L3～L6节段前角外侧核大, 中型神经元的轴突大多数进入到坐骨神经中, 因而观察这些核团神经元的形态变化基本能反应坐骨神经损伤后神经元的退变情况。本实验观察到坐骨神经损伤后脊髓神经元中MAG含量都高于正常组, 说明选择脊髓来检测指标是行之有效的方法。
3.2 选穴依据
中西医理论相结合, 精选治疗点。依中医循经取穴原则, 选取殷门、承山、阳陵泉、环跳。根据解剖分析, 这些穴位正好分布于坐骨神经干 (殷门) 和其分支胫神经 (承山) 、腓总神经 (阳陵泉) 上;穴位的周围是股二头肌 (殷门) 、腓肠肌 (承山) 、胫前肌 (阳陵泉) [4]。
3.3 分组依据
本实验组前期研究证明, 本实验的大鼠坐骨神经夹持模型非常稳定。在干预之前模型组、模型对照组及电针组三组情况几乎一致。所以本次实验, 在造模后7天, 取材只取三个组。而在开始干预后, 每次取材五个组都取。
3.4 检测指标的选择
MAG是一个双功能蛋白, 对大多数神经元有抑制作用而对发育早期的背根神经节神经元有促进作用, 即在神经发育的不同时期发挥不同的作用。人们最早发现在CNS中有潜在的生长抑制活动, 并指出这种抑制与髓鞘有关, 而MAG即是第一个被鉴定出的具有轴突再生抑制作用的髓鞘蛋白。通过DEAE柱层析法, 从CNS髓鞘中分离得到的可溶性髓鞘蛋白———MAG可以明显抑制突起的生长, 引起生长锥的塌陷, 抑制包括神经节细胞在内的多种神经元突起的生长;通过免疫耗竭法除去MAG后, 可明显减少髓鞘对轴突生长的抑制作用。Wong等[5]在视神经受损后用激光急性选择性地灭活MAG分子, 发现有大量的视网膜轴突再生, 并通过了含有CNS髓鞘的损伤部位, 因此推断MAG是髓鞘来源的神经抑制分子的主要成分。McKerracher等[6]通过针对性地耗竭MAG, 可使轴突生长数量增加63%, 部分消除了髓鞘对神经元的轴突生长抑制作用。Mukhopadhyay等[7]在体外试验中, 发现MAG可以抑制发育中的小脑神经元和成体背根神经节神经元的轴突生长, 这种抑制作用可以通过抗MAG抗体部分逆转本次实验中, MAG在神经受到刺激后表达显著增高, 在电针干预下表达有所下降, 大鼠伤侧下肢感觉及运动功能也有所提高, 但其具体起效机制有待进一步研究。
3.5 研究展望
临床实践证明, 针灸是治疗周围神经损伤有效方法之一。多年来对其作用的机理研究也越来越受重视, 但对其机理的揭示众说纷纭。周围神经损伤后的再生修复过程是自我调节的过程, 其中有着众多的影响因素, 大部分研究者都是积极探索恢复中如何促进修复的正面因素, 而很少从如何抑制负面因素入手研究。本实验选择MAG进行测试观察, 实验结果表明, 电针能改善坐骨神经急性损伤大鼠的运动及感觉功能。本实验中电针组大鼠脊髓中MAG含量明显减少, 说明电针能抑制脊髓中抑制分子的释放, 有助于触突的生长, 促进周围神经损伤再生修复。神经营养因子与神经抑制在整个神经生长发育过程中相辅相承, 又相互制约。针灸疗法对于神经功能的修复有着不可替代的作用, 针灸又具有双向调节的作用, 因此研究针灸对神经抑制因子的影响有很大的前景。
摘要：目的 通过电针对坐骨神经损伤大鼠脊髓中髓鞘相关糖蛋白 (myelinassociated glycoprotein, MAG) 表达影响的实验研究, 进一步探讨电针治疗周围神经损伤的修复机理, 为临床治疗提供理论支持。方法 采用神经夹持损伤的方式建立大鼠坐骨神经损伤模型, 通过坐骨神经功能指数 (sciatic nerve function index, SFI) 及热痛阈检测观察大鼠的行为学变化;通过免疫组织化学染色观察大鼠脊髓内MAG表达情况, 进而统计分析各组间的差异。结果 行为学检测结果显示, 在基本功能改善方面, 与模型组及模型对照组比较, 电针治疗组 (P<0.05) 大鼠右后腿感觉及运动功能明显改善。免疫组化结果显示模型组、模型对照组及电针组MAG表达均比正常组高 (P<0.05) , 但电针组治疗1、2个疗程后, MAG表达明显降低, 越来越接近正常组。结论 通过本实验研究发现, 电针能改善坐骨神经损伤大鼠的一般状况, 电针组大鼠脊髓中MAG的表达明显降低, 说明电针能抑制脊髓中抑制性生长因子的释放, 促进周围神经损伤再生修复。
关键词：电针,坐骨神经损伤,髓鞘相关糖蛋白 (MAG)
参考文献
[1]Wang KC, Koprivica V, Kim JA, et al.Oligodendrocyte-myelin glycoprotein is a Nogo receptor ligand that inhibits neurite outgrowth[J].Nature (S0028-0836) , 2002, 417 (6892) :941-944.
[2]Vourc'h P, Dessay s, Mbarek O, et al.The oligodendrocyte-myeIin glycoprotein gnne is highly expressed during the late stages of myelinalion in the rat central nervous system[J].Brain Res, 2003, 144 (2) :159-168.
[3]蔡文琴, 阮怀珍, 黎海蔕.医用神经生物学基础[M].重庆:西南师范大学出版社, 2001:416-420.
[4]梅旭晖, 吴剑聪, 于天源.推拿对坐骨神经损伤大鼠神经生长因子受体TrkA的影响[C]//中华中医药学会推拿分会.第十三次中医推拿学术年会暨推拿手法治疗脊柱相关疾病高级培训班论文汇编, 安徽, 2012.北京:中华中医药学会推拿分会:2012, 6-9.
[5]Wong EV, David S, Jacob MH, et al.Inactivation of myelinassoi-ciated glycoprotein enhancesoptic nerve regeneration[J].J Neurosci, 2003, 23 (8) :3112-3117.
[6]McKerracher L, David S, Jackson DL, et al.Identification of myelin-associated glycoprotein as amajormyelin-derived inhibitor of neurite growth[J].Neuron, 1994, 13 (4) :805-811.
