“血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳”样板的制备

关键词：实验课

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳在临床诊断和治疗上有很重要的价值[1], 是《生物化学》最常开设的基本实验项目之一, 为了提高实验课的教学质量, 帮助学生更进一步了解血清蛋白质的基本组成及正常含量, 让学生在动手前就有一个比较直观的了解, 制作高质量的样板就成了一项重要的工作, 笔者通过多年的实践, 用液体石腊处理醋酸纤维薄膜, 并用玻片压封, 所得样板既可防潮、防水, 蛋白质条带清晰可辨, 可以长期使用而不褪色不变形。现把方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 电泳仪北京六一仪器厂生产的DYY-2C型。

1.1.2 电泳槽的准备

北京六一仪器厂生产的DYCP-38B型, 将电泳槽置水平实验台上, 两侧注入等量的p H8.6的缓冲液, 液面至指示线, 注意将支架的宽度调节在5.5~6cm, 支架过宽电阻加大产生的热对电泳不利, 膜条的长度也不够, 支架过窄血清蛋白分离的距离过短, 血清蛋白往往会渗入对侧滤纸桥中去, 影响实验结果。电泳槽两侧支架上应垫4层纱布为桥垫, 桥垫面应有1.5cm宽的平面, 可增加醋酸纤维膜条与桥垫的接触面, 有利于拉紧膜条。

1.1.3 醋酸纤维薄膜条的准备

选择透水性好的CAM, 在无光泽面的一端1.5 cm处用硬铅笔轻画一条横线并编号, 浸入p H8.6的缓冲液中, 使之充分浸透, 一般在20min左右, 如使用时发现CAM上有白斑存在, 应弃之不用。

1.1.4 巴比妥-巴比妥钠缓冲液 (p H8.6, 离子强度0.06)

取二乙基巴比妥酸钠10.3g, 取二乙基巴比妥酸1.84g置于烧杯中, 加蒸馏水400m L, 加热溶解, 冷却后用蒸馏水稀释置1000m L。

1.1.5 染色液氨基黑10B0.5g, 95%乙醇50m L, 冰醋酸10m L, 蒸馏水40m L。

1.1.6 漂洗液95%乙醇45m L, 冰醋酸5m L, 蒸馏水50m L。

1.1.7 液体石蜡日本进口分装, 由广州市化学试剂玻璃仪器批发部提供。

1.1.8 载玻片规格:25.4mm×762mm (长×宽) , 1mm~1.2mm (厚) , 用硫酸--重铬酸钾洗液浸泡过夜, 再用清水冲洗干净晾干, 待用。

1.1.9 血清取新鲜且无溶血现象正常人血清。

1.2 样板制作的基本步骤与方法

1.2.1 点样

点样是血清蛋白电泳的关键步骤[2], 也是最易出现问题的环节, 血清点样过少, 电泳时样品量太少不易观察结果;点样过多, 不易分离成5条区带, 所以点样时必须注意以下几个方面的问题: (1) 准备:用镊子从缓冲液中取出CAM, 置于洁净的滤纸上吸去多余的水分, 使CAM保持湿润状态又无明显的水分, 如用滤纸吸水过度至CAM上出现白斑则不能使用, 否则影响电泳结果; (2) 点样:辨别光泽面和无光泽面, 点样应点在无光泽面上。首先将血清置载玻片上铺开, 厚薄适中且无气泡, 将CAM置于一张洁净的滤纸上, 然后用胶片蘸适量血清 (3~5μL) 垂直印在CAM无光泽面一端的1.5cm处, 由于CAM置滤纸上, 血清渗入膜内后多余的血清可被滤纸吸收使点样均匀, 有利于血清蛋白在电泳中分离;点样时还应注意血清离膜条两侧要空1~2 mm, 如点样靠边易产生边流现象, 影响实验结果。

1.2.2 电泳

将点样后的CAM置电泳槽架的滤纸桥垫上, 放置时应将无光泽面 (点样面) 向下, 点样端置于负极, 点有血清的部位应离桥垫2mm, 如血清压在桥垫上会影响分离结果;膜条与两侧桥垫要贴紧并拉直, 中间不能下垂, 如膜条中间下垂可导致血清蛋白电泳时, 蛋白质泳动至中间下垂区段时阻力加大, 使蛋白质挤在一起不易分离。一个电泳槽支架上放置多条醋酸纤维薄膜条时, 膜条之间要间隔几毫米。盖上电泳槽盖平衡5min通电, 电压为110伏, 时间为50min。

1.2.3 染色与漂洗

将电泳好的CAM放置于事先配置的氨基黑染色液中, 染色5min后取出置漂洗液中漂洗, 期间需更换漂洗液3次 (如室温过低, 可将漂洗液加温至37℃) , 每次5~10min, 直至背景白色即可得到血清蛋白分离出的清晰区带。

1.2.4 样板的制作

将有清晰蛋白区带的CAM平放在干净的滤纸上, 待其晾干。在干透的CAM上滴加液体石腊, 使CAM变得均匀而透明, 用滤纸吸去多余的石蜡油。将一张白纸裁剪成大小与玻片相同, 并放置于玻片的上面, 再将CAM放在白纸的上面, 蛋白条带用笔标记好, 上面再盖上一张玻片并夹紧, 迅速用透明胶将玻璃两头扎紧, 这样样板就做好了。

2 讨论

石蜡油是几种高级烷烃的混合物, 主要是正二十二烷 (C22H46) 和正二十八烷 (C28H58) , 含碳元素约85%, 含氢元素约14%。没有单一的化学元素符号。石蜡油中加入聚烯烃添加剂后, 其熔点增高, 粘附性和柔韧性增加, 石蜡油的用途十分广泛, 将纸张浸入石蜡油后就可制取有良好防水性能的各种蜡纸, 所以在醋酸纤维薄膜上滴加石蜡油既可防潮、防水, 蛋白质条带清晰可辨, 可以长期使用而不褪色, 不变形。

摘要：为了提高实验课"血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳"的教学质量, 需要制作一批蛋白电泳后的样板, 供学生观察之用, 本人摸索出一种制作方法 , 样板的蛋白质条带清晰可辨, 效果良好, 又经济耐用, 本文介绍了具体的制作方法。

关键词：醋酸纤维薄膜,血清蛋白电泳,样板制备