小白菜硝酸还原酶基因的克隆与初步鉴定

关键词：

小白菜硝酸还原酶基因的克隆与初步鉴定（共4篇）

篇1：小白菜硝酸还原酶基因的克隆与初步鉴定

小白菜硝酸还原酶基因的克隆与初步鉴定

蔬菜是一种易于富集硝酸盐的植物性食物,人体摄入的硝酸盐大部分(70%～80%)来自蔬菜[1].然而,我国蔬菜生产中氮肥用量迅速提高,造成了蔬菜,特别是喜氮的叶菜类蔬菜硝酸盐含量过高[2].不同蔬菜硝酸盐含量存在很大差异[3-4],同一种蔬菜不同品种体内硝酸盐含量也存在差异[5-8].不同器官累积硝酸盐的`能力不同[9],硝酸盐累积取决于硝态氮的吸收与同化的结果[10].

作 者：孙淑斌 罗金葵 徐国华 胡江 陈巍 沈其荣 SUN Shu-bin LUO Jin-kui XU Guo-hua HU Jiang CHEN Wei SHEN Qi-rong 作者单位：南京农业大学资源与环境科学学院,江苏,南京,210095刊 名：植物营养与肥料学报 ISTIC PKU英文刊名：PLANT NUTRITION AND FERTILIZER SCIENCE年，卷(期)：12(4)分类号：Q943.2关键词：

篇2：小白菜硝酸还原酶基因的克隆与初步鉴定

编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达

利用PCR技术从大肠杆菌 (Escherichia coli)中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到温控表达载体pHsh,得到重组载体pHsh-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达.SDS-PAGE分析显示:融合表达产物的相对分子质量均为43 000,同核酸序列测定所推导的值相符.对含有yqhD的基因工程菌进行表达研究表明: 42 ℃诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的`酶活力达到100 IU/mg,而对照菌株的酶活力仅为0.5 IU/mg.

作 者：张晓梅 唐雪明 诸葛斌 沈微 饶志明 方慧英 诸葛健 ZHANG Xiao-mei TANG Xue-ming ZHUGE Bin SHEN Wei RAO Zhi-ming FANG Hui-ying ZHUGE Jian 作者单位：江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214036刊 名：食品与生物技术学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：200625(4)分类号：Q786关键词：1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶 克隆 表达 基因 温控表达载体

篇3：小白菜硝酸还原酶基因的克隆与初步鉴定

1 试验材料与方法

试验于2009年4月5日~2009年5月20日在山西师范大学实习基地日光温室内进行。

1.1 试验点基本情况

供试土壤为黄土母质上发育而成的石灰性褐土, 土壤养分含量分别为有机质14.7g/kg, 碱解氮80.36mg/kg, 速效磷23.7mg/kg, 速效钾138.6mg/kg, 有效锌0.65mg/kg, 有效锰7.9mg/kg。

1.2 试验材料

供试小白菜 (Brassica campestris L.ssp.Chinensis) 品种为山西省侯马市农人种业有限公司生产的“耐抽苔五月慢”。使用肥料为硫酸锌 (天津市北辰方正试剂厂生产的ZnSO4·7H2O, Zn质量分数23%) 、硫酸锰 (天津市东丽区天大化学试剂厂生产的MnSO4·3H2O, Mn质量分数26%) 。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

参考国内外有关锌、锰肥施用量的研究结果[6,7,8], 采用双因子3水平完全组合设计, 设每hm2土壤分别施硫酸锌和硫酸锰30、75和120kg;各施肥水平分别以Zn1、Zn2、Zn3和Mn1、Mn2、Mn3代表, 组成Zn1Mn1、Zn1Mn2、Zn1Mn3、Zn2Mn1、Zn2Mn2、Zn2Mn3、Zn3Mn1、Zn3Mn2、Zn3Mn3 9个处理, 以不施锌、锰肥Zn0Mn0为对照 (CK) , 共计10个处理, 每处理重复3次, 随机区组排列。小区面积6m2, 小区间埋入0.5m深的塑料薄膜以防根系从相邻小区吸收养分。试验实施时以尿素全部施用量的1/3作追肥, 其余肥料皆用作基肥。在小白菜生长期间, 按当地田间管理措施进行管理。

1.3.2 测试内容与方法

硝酸还原酶活性测定用磺胺-α-萘胺比色法[9];SOD活性用氮蓝四唑 (NBT) 法测定, 以抑制NBT光化学还原的50%为一个酶活性单位;POD活性用愈创木酚法测定, 以每克鲜重每分钟在470nm处光吸收变化0.1为一个过氧化物酶活性单位;CAT活性测定用紫外吸收法, 以每克鲜重1分钟内240nm处光吸收变化0.1为一个过氧化氢酶活性单位。MDA含量的测定用硫代巴比妥酸 (TBA) 法[10]。

2 结果与分析

2.1 锌锰肥配施对小白菜硝酸盐含量及硝酸还原酶活性的影响

2.1.1 对小白菜硝酸盐含量的影响

大量研究证明, 蔬菜属易富集硝酸盐的作物, 人体摄取的硝酸盐80%来自蔬菜。硝酸盐对作物本身并无害处, 但对人畜健康却造成了较大威胁, 过量摄入硝酸盐可能诱发癌症[4]。因此, 有关硝酸盐积累及其调控问题, 已引起人们的极大关注。由表1可以看出, 施用锌、锰肥均有利于降低小白菜中NO3-N含量, 且锰肥的肥效大于锌肥。在不同的施锌水平下配施锰肥, 均能降低小白菜中NO3-N含量, 且其作用随着锌用量的增加而加强。例如Zn1Mn3处理较Zn1Mn2处理NO3-N含量降低4.76%, 而Zn3Mn3处理较Zn3Mn2处理硝态氮含量降低15.72%。在不同的施锰水平下配施锌肥, 也能降低小白菜中NO3-N含量, 但低锰条件下作用不明显, 而在高锰、中锰条件下差异显著。表明锌、锰肥配合施用有利于降低小白菜中NO3-N的积累, 二者在中、高水平下表现出明显的互作效应。

2.1.2 对小白菜硝酸还原酶活性的影响

硝酸还原酶 (NR) 是植物进行氮代谢的关键酶, 它催化NO3-到NO2-的还原反应, 其活性大小, 反应了植物吸收利用氮素能力的高低, 且NR的活性对产量和品质也有影响。

从表1可以看出, Mn是影响小白菜叶片NR活性的主要因子, Zn水平相同时, NR活性随着施Mn量的增加而增大, 各处理间均达到显著性差异水平 (P<0.05) , 当施Mn量由Mn1水平提高至Mn2时, NR活性提高幅度较大, 当施Mn量由Mn2水平提高至Mn3时, NR活性提高幅度较小, 如Zn1Mn2比Zn1Mn1 NR活性提高33.3%, 而Zn1Mn3比Zn1Mn2 NR活性提高11.5%。当施锰量相同时, 在低Mn水平下, NR活性随着施Zn量的增加而提高, 如Zn2Mn1比Zn1Mn1 NR活性提高12.0%, 达到显著性差异水平 (P<0.05) ;当施Zn量由Zn2水平增加至Zn3水平时, NR活性没有显著变化。在中Mn、高Mn水平下, NR活性随着施Zn量的增加而提高, 当施Zn量由Zn1水平提高至Zn2时, NR活性提高幅度较小, 当施Zn量由Zn2水平提高至Zn3时, NR活性提高幅度较大, 如Zn2Mn2比Zn1Mn2、Zn2Mn3比Zn1Mn3 NR活性分别提高4.3%、6.5%, 未达到显著性差异水平 (P>0.05) ;Zn3Mn2比Zn2Mn2、Zn3Mn3比Zn2Mn3 NR活性分别提高8.6%、9.1%, 达到显著性差异水平 (P<0.05) 。由此表明, 适量施用锌、锰肥能提高小白菜叶片NR活性, 有利于叶片的氮素代谢, 二者间具有明显的交互作用。

2.2 锌锰配施对小白菜抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

2.2.1 对小白菜超氧化物歧化酶 (SOD) 活性的影响

超氧化物歧化酶 (SOD) 是植物体内清除自由基最关键的保护酶之一, 它与过氧化物酶 (POD) , 过氧化氢酶 (CAT) 等酶协同作用, 防御活性氧或其它过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害, 能催化氧自由基 (O2-) 的歧化作用, 生成过氧化氢[10]。Zn、Mn是植物体内Cu-Zn-SOD和Mn-SOD的组成成分, 对SOD的活性有直接影响。表2结果表明, 本试验条件下, 适量施用锌、锰肥均有利于小白菜超氧化物歧化酶活性的提高, 其影响顺序为:Zn2Mn2>Zn1Mn3>Zn2Mn3>Zn3Mn2>Zn1Mn2>Zn2Mn1>Zn3Mn1>Zn1Mn1>Zn3Mn3;在低锰水平下, 随着施锌量的增加超氧化物歧化酶活性先逐渐提高而后逐渐下降, 各处理均显著高于对照 (364.4 Unit·g-1FW·h-1, P<0.01) , 且处理间差异显著 (P<0.01) ;在中锰水平下, 随着施锌量的增加超氧化物歧化酶活性先提高后降低, 变化幅度较大, 各处理间差异极显著 (P<0.01) ;在高锰条件下, 随着施锌量的升高超氧化歧化酶的活性持续下降, 各处理间差异显著 (P<0.01) , 在高锰下配施高锌 (Zn3Mn3) SOD活性急剧下降 (280.9 Unit·g-1FW·h-1) , 且低于对照 (364.4 Unit·g-1FW·h-1) , 说明高锌、高锰配施对超氧化物歧化酶活性有抑制作用。当施锌水平相同时, 在低锌水平下, 随着施锰量的增加超氧化物歧化酶活性持续升高, 各处理间均差异显著;在中、高锌水平下, 随着施锰量的增加超氧化物歧化酶活性先升高后降低, 各处理间差异均显著。在中锌、中锰条件下, 有利于小白菜SOD活性的提高。

2.2.2 对小白菜过氧化物酶 (POD) 活性的影响

过氧化物酶 (POD) 广泛分布于植物的各个器官中, 它能清除植物体内的过氧化氢 (H2O2) , 提高植株的抗逆性, 延缓植株衰老。

表2结果表明, 施用锌、锰肥均能影响小白菜过氧化物酶 (POD) 的活性, 其中Zn3Mn2最高 (1112.07 Unit·g-1·min-1) , Zn3Mn3最低 (325.53 Unit·g-1·min-1) , 各处理均高于对照 (321.17 Unit·g-1·min-1) 。施锌水平相同时, 在低锌、中锌水平下, 随着施锰量的增加, 过氧化物酶 (POD) 的活性逐渐提高, 各处理间差异显著 (P<0.01) ;在高锌条件下, 随着施锰量的增加, 过氧化物酶 (POD) 的活性先升后降, 各处理之间差异显著 (P<0.01) ;施锰量相同时, 在Mn1、Mn2水平下, 随着施锌量的提高, 过氧化物酶 (POD) 活性提高, 但低锰条件下Zn1与Zn2、Zn3处理之间差异显著, Zn2与Zn3处理之间差异不显著;中锰条件下, 各处理之间差异显著;在Mn3水平时, 随着施锌量的提高, 过氧化物酶 (POD) 活性先提高后降低, 各处理间之间差异显著。高锌高锰配施过氧化物酶 (POD) 的活性达到最低, 略高于对照, 且与对照差异不显著;高锌中锰配比过氧化物酶 (POD) 的活性达到最高, 表明锌、锰之间有一定的交互作用。

2.2.3 对小白菜过氧化氢酶 (CAT) 活性的影响

过氧化氢酶 (CAT) 能有效催化过氧化氢 (H2O2) 分解为H2O和O2, 保护细胞不受过多H2O2的危害。

表2结果表明, 本试验条件下, 施用锌、锰肥均有利于小白菜过氧化氢酶 (CAT) 活性的提高, 各处理过氧化氢酶 (CAT) 活性均显著高于对照 (1.32 Unit·min-1·g-1FW) 。锌水平相同时, 在低锌水平下, 随着施锰量的增加过氧化氢酶 (CAT) 活性逐渐升高, Mn1与Mn2之间差异不显著 (P>0.01) ;其它处理之间差异显著 (P<0.01) 。在中锌、高锌水平下, 随着施锰量的增加过氧化氢酶 (CAT) 活性逐渐升高, 各处理之间差异显著 (P<0.01) 。锰水平相同时, 随着施锌量的增加过氧化氢酶 (CAT) 活性逐渐升高, 在Mn1、Mn2、Mn3水平下, 各处理之间均达到显著性差异水平 (P<0.01) 。Zn3Mn3过氧化氢酶 (CAT) 活性最高 (6.737 Unit·min-1·g-1FW) ;Zn1Mn1最低 (2.512 Unit·min-1·g-1FW) 。锌、锰之间对CAT活性升高的效应有叠加现象。

2.2.4 对小白菜丙二醛 (MDA) 含量的影响

丙二醛 (MDA) 是细胞膜脂过氧化作用的产物之一, 它的产生能加剧膜的损伤。因此, 丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度, 也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。由表2可以看出, 当施锌量相同时, 在低锌水平下, 随着锰含量的增加, 丙二醛含量降低, 各处理间差异显著 (P<0.01) ;在中锌水平下配施锰肥效果最好, 随着施锰量的增加, 丙二醛含量先降低后升高, Mn2与Mn1、Mn3处理间差异显著 (P<0.01) , Mn1与Mn3处理间差异不显著;在高锌水平下, 随着锰含量的增加, 丙二醛含量也表现为先降低后升高, 但Mn1、Mn2、Mn3处理间差异均显著。当施锰水平相同时, 在不同的施锰水平下, 随着施锌量的增加, 丙二醛含量均呈现先下降后升高的趋势。在低锰水平下, 均表现出Zn1与Zn2、Zn3之间差异显著, Zn2与Zn3之间差异不显著;在中、高锰水平下, Zn1、Zn2、Zn3之间差异均显著。本试验条件下, Zn2Mn2 DMA含量最低, 表明锌锰之间存在着一定的交互作用。

3 结 论

根据以上研究结果, 本试验的主要结论如下:

3.1 适量的锌锰肥配施

可显著提高小白菜叶片SOD、POD、CAT的活性, 降低MDA的含量, 增强植物组织的抗氧化能力, 提高植株的抗逆性, 延缓植株衰老。其中Zn2Mn2 SOD活性最高, Zn3Mn2 POD活性最高, Zn3Mn3 CAT活性最高, Zn2Mn2 MDA含量最低。

3.2 锌、锰肥配施可显著提高小白菜硝酸还原酶 (NR) 活性, 降低硝酸盐含量

不同处理组合比对照NR活性分别提高19.1%~105.7%, 硝酸盐含量降低2.0%~27.2%。其中Zn3Mn3处理硝酸还原酶 (NR) 活性最高, 硝酸盐含量最低, 其次为Zn2Mn3和Zn3Mn2, 锰对硝酸还原酶活性的影响大于锌。

3.3 锌锰配施对小白菜相关生理指标具有明显交互作用

综合本试验结果, 小白菜锌锰肥配施方案为每hm2土壤施用硫酸锌75~120kg, 硫酸锰75kg左右。

摘要：采用田间试验的方法, 研究了石灰性土壤上锌锰肥配施对小白菜硝酸还原酶和抗氧化酶活性的影响。结果表明:适量的锌锰肥配施可显著提高小白菜叶片抗氧化酶 (SOD、POD、CAT) 的活性, 降低丙二醛 (MDA) 的含量, 其中Zn2Mn2SOD活性最高, Zn3Mn2POD活性最高, Zn3Mn3CAT活性最高, Zn2Mn2MDA含量最低。锌与锰肥配施可显著提高小白菜硝酸还原酶 (NR) 活性, 降低硝酸盐含量。不同处理组合比对照NR活性分别提高19.1%105.7%, 硝酸盐含量降低2.0%27.2%。其中Zn3Mn3处理硝酸还原酶 (NR) 活性最高, 硝酸盐含量最低, 其次为Zn2Mn3和Zn3Mn2, 锰对硝酸还原酶活性的影响大于锌。综合本试验结果, 小白菜锌锰配施方案为每hm2土壤施用硫酸锌75120kg, 硫酸锰75kg左右。

关键词：锌锰配施,小白菜,硝酸还原酶,抗氧化酶

参考文献

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[9]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出版社, 2000

篇4：小白菜硝酸还原酶基因的克隆与初步鉴定

关键词：粟酒裂殖酵母；丙酮醛降解酶；丙酮醛；基因克隆；基因表达

中图分类号： Q785文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）02-0062-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2015-03-24

基金项目：国家自然科学基金（编号：31070703） 。

作者简介：王平（1990—），女，河南南阳人，硕士研究生，从事粟酒裂殖酵母分子机理研究。E-mail：350479708@qq.com。

通信作者：黄鹰，教授，从事微生物生物化学与分子生物学研究。E-mail：paula_wong@163.com。[HJ]

丙酮醛（methylglyoxal）是在糖酵解、脂质和氨基酸代谢过程中产生的一种对生物体有毒害作用的代谢物[1-2]，性质活跃，属于α-酮基醛类，由糖酵解的中间产物丙糖磷酸化裂解生成，或由丙酮和氨基丙酮代谢生成[3]。其醛基可与蛋白质的氨基基团之间发生非酶性糖基化反应（又称Maillard反应）[4]形成一系列具有高度活性和高度异质性的终产物，从而导致蛋白功能的修改和缺陷，Ward等研究证实，丙酮醛能通过细胞内颗粒释放而加强应激反应[5]，并进一步诱导细胞的应激反应，包括胞吞、细胞因子释放和细胞凋亡[6]等，丙酮醛在生物体内过度累积会导致细胞死亡；此外，丙酮醛与生物体的很多病变有关，如慢性糖尿病[7-8]、结肠癌和乳腺癌等。因此，丙酮醛在生物体内的累积量必须受到严格的控制，丙酮醛降解酶是代谢丙酮醛的一种关键酶，于是对丙酮醛降解酶的研究显得尤为重要。

近年来，各种慢性病患病率的增加，使得丙酮醛在体内的代谢途径受到越来越多的关注，丙酮醛代谢相关酶的研究也成为国际热点。研究报道在细菌体内丙酮醛的降解主要通过3条途径：（1）依赖于谷胱甘肽的醛酮变位酶Ⅰ和醛酮变位酶Ⅱ[9]；（2）不依赖于谷胱甘肽的醛酮变位酶Ⅲ；（3）依赖于NADPH的醛还原酶和依赖于NADH的乙醇脱氢酶[10]。人体内的DJ-1也具有分解丙酮醛的作用，我们以粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）为模式生物，通过构建系统进化树和基因比对，找到了粟酒裂殖酵母体内的能够降解丙酮醛的酶，即SPAC22E12.03C的产物。

本试验根据SPAC22E12.03C的基因序列设计引物，以粟酒裂殖酵母的cDNA为模板通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因，构建T7强启动子表达载体和重组工程菌株，研究丙酮醛降解酶的高效表达，希望以后能够通过高效表达丙酮醛降解酶来调控和优化丙酮醛的代谢途径，从而为解决因丙酮醛在体内累积过多引起的各种慢性疾病提供研究基础。

1材料与方法

1.1菌株与质粒

本试验中所用的菌株名为Escherichia coli BL2l （DE3）、Escherichia coli top10，所用的質粒为pET-28a（+），这些材料均为笔者所在实验室保存。粟酒裂殖酵母cDNA文库来自美国，重组克隆pET-28a（+）-SPAC22E12.03C为笔者所在实验室构建。

1.2试剂及其来源

限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ、solutionⅠ[kite code.6022]、rTaq DNA 聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、蛋白marker、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），均购自TaKaRa 公司；DNA 割胶回收试剂盒，来源于BioSpin Gel Extraction Kit；PCR过柱纯化，来源于BioFLUX BioSpin PCR Purification Kit试剂盒；DNA marker 来源于北京全式金生物技术有限公司；PCR引物由南京思普金生物科技有限公司合成；卡那霉素（Kan）来源于Sigma 公司，其他常规试剂均为国产分析纯。

1.3粟酒裂殖酵母中目的片段SPAC22E12.03C的获得

根据S.pombe_GeneDB数据库中的丙酮醛降解酶基因（SPAC22E12.03C）序列设计上、下游引物，分别为SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up：5′-CATG[ZZ（Z]CCATGG[ZZ）]TAAAGGTTTGCCTATTTGTTG-3′，SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down：5′-CCG[ZZ（Z]CTCGAG[ZZ）]GGGCATACTAAGAGATTTATAGACA-3′ （下划线分别为NcoⅠ和XhoⅠ酶切识别位点）。以粟酒裂殖酵母cDNA为模板扩增丙酮醛降解酶基因，PCR反应体系为25 μL：ddH2O 14.7 μL、5×PS buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL、cDNA模板1 μL、SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up 1 μL、SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down 1 μL、高保真DNA聚合酶 03 μL。[JP3]PCR反应条件为：95 ℃预变性 2 min；95 ℃ 变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30个循环；最后 72 ℃ 延伸10 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

nlc202309040708

1.4重组表达质粒的构建和鉴定

将上述PCR扩增片段SPAC22E12.03C过柱纯化后与质粒pET-28a （+）双酶切验证。酶切位点为NcoⅠ和XhoⅠ。将酶切产物回收得到目的DNA片段与质粒pET-28a （+）酶切产物。接下来建立酶连体系为16.6 μL：SPAC22E12.03C目的片段8 μL、pET-28a （+）酶切产物0.3 μL、连接酶（SolutionⅠ） 8.3 μL。16 ℃ 连接4 h，将酶连产物导入到E. coli Top10感受态细胞中，涂布到含Kan抗性的LB培养基上。随机挑取转化子提其质粒进行酶切验证，将阳性质粒送到南京斯普金科技有限公司测序。将测序正确的重组质粒和pET-28a（+）空载质粒分别通过转化导入E. coli BL21（DE3）感受态细胞，得到重组表达菌和带有空载质粒的对照菌。

1.5目的蛋白的表达

将得到的重组表达菌和带有空载质粒的对照菌分别接种于5 mL LB培养基中，其中含有50 mg/L Kan。37 ℃ 220 r/min 恒温摇床过夜培养之后将重组表达菌和对照菌分别转接至15 mL 同样含50 mg/L Kan的LB培养基中，此时菌液D600 nm≈0.2，继续培养，当D600 nm达到0.6时，加入1 mmol/L IPTG，37 ℃ 220 r/min 培养过夜，次日，4 ℃ 8 000 r/min离心5 min，收集菌体，用100 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH值为7.0）重悬菌体进行洗涤，重复洗涤3遍后加入适量的缓冲液（包含0.1 mmol/L PMSF和14.3 mmol/L的β-巯基乙醇）置于冰浴中进行超声波破碎，破碎10 s，冷却10 s，待菌体破碎完全后，4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，收集细胞上清，取适量进行SDS-PAGE，分析目标产物表达情况。

1.6目标蛋白表达条件的优化

优化表达条件时分别选择不同起始诱导菌浓度（D600 nm=0.307，D600 nm=0.455，D600 nm=0.557，D600 nm=0.603，D600 nm=0.805，D600 nm=1.117）与不同温度（37、30、25、18 ℃）培养；培养基中添加不同终浓度的IPTG（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）进行诱导培养，每个试验重复3次。通过SDS-PAGE 、总蛋白含量测定和酶活测定考察培养条件对目的蛋白表达的影响。

1.7酶活测定

酶活测定根据丙酮醛降解酶在一定温度条件下能降解丙酮醛，而丙酮醛可以与2，4-二硝基苯肼反应生成黄橙色的2，4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显紫红色，可在540 nm处检测[11]。反应体系是用100 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH 值为7.0）配制成不同丙酮醛浓度的反应液，总体积为200 μL，加入适量的丙酮醛降解酶，在45 ℃反应一定时间，加入2，4-二硝基苯肼终止反应，室温下静置15 min，再加入10%的NaOH，室温放置15 min后用分光光度计在540 nm处测定吸光度。酶活单位（U）定义为在该反应条件下，1 min内催化降解0.1 μmol丙酮醛所需的酶量。

2结果与分析

2.1丙酮醛降解酶基因的克隆

以粟酒裂殖酵母cDNA为模板，以SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up、 SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down为引物进行PCR，扩增获得1条大于500 bp的DNA产物（图1），与目的基因576 bp相吻合，过柱纯化PCR产物，用NcoⅠ和XhoⅠ对纯化后的PCR产物进行双酶切。

2.2表达载体pET-28a（+）-SPAC22E12.03C的构建及验证

[CM（24]获得丙酮醛降解酶基因并纯化后，将其连接到pET-28a

（+）（NcoⅠ和XhoⅠ双酶切）得到pET-28a（+）-SPAC22E12.03C重组质粒并转化E. coli Top10感受态细胞，挑选菌落，PCR验证有条带的阳性重组子继续培养，并提取重组质粒进行双酶切验证，双酶切后得到大小分别为500 bp和5 400 bp的条带，基因片段大小正确。重组质粒经测序比对与S.pombe_Gene DB上公布的基因序列一致，证明丙酮醛降解酶基因已插入到pET-28a（+）载体中（图2），成功构建了pET-28a（+）-SPAC22E12.03C表达载体。将構建成功的pET-28a（+）-SPAC22E12.03C 转入到E. coli BL21（DE3）感受态细胞中，得到重组菌。

[FK（W14][TPWP2.tif][FK）]

2.3重组菌的诱导表达

重组菌诱导表达经SDS-PAGE验证（图3），得到分子量大小约为20 ku的重组酶，与目的蛋白S.pombe_GeneDB上公布的21.08 ku相符，证明丙酮醛降解酶得到了表达。

[FK（W10][TPWP3.tif][FK）]

2.4丙酮醛降解酶的优化表达

2.4.1温度对丙酮醛降解酶可溶性表达的影响据文献报道，温度对目的蛋白的可溶性表达有很大的影响[12-13]。选定的条件为：在37、30、25、18 ℃，220 r/min 培养至D600 nm为0.8时，加入1 mmol/L IPTG，诱导4 h。由SDS-PAGE（图4和表1）分析可得，丙酮醛降解酶在37 ℃培养后上清中可溶蛋白的含量最多，相对沉淀中目的蛋白含量最少，酶活最高。可见37 ℃不仅是E. coli BL21的最适生长温度，并且在这个温度下有活性的菌和带外源基因的菌更多，从而表达的目的蛋白也多，且大部分以可溶形式存在，酶的活性也最高。

2.4.2IPTG对丙酮醛降解酶可溶性表达的影响在一定范围内，IPTG 浓度对重组蛋白诱导表达有一定影响[14]，降低表达水平可能提高某些目的蛋白的产量。因此，本试验选取了5个IPTG浓度，分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。在 37 ℃ 220 r/min 培养D600 nm=0.6时，加入上述不同浓度的IPTG，37 ℃诱导4 h，分析IPTG浓度对丙酮醛降解酶可溶性表达的影响。表达载体pET28a（+）-SPAC22E12.03C含有T7/Lac 启动子，受IPTG诱导启动表达蛋白。当IPTG浓度过低时，外源基因不能被完全表达，而高浓度的IPTG将对细胞的生长产生毒害作用，由图5和表2分析可知，IPTG浓度在0.6～1.0 mmol/L 时，总蛋白量略微升高，此范围内酶的活性也相对较高，但就三者目的蛋白的相对含量分析：0.6 mmol/L时相对含量为74.4%，0.8 mmol/L 时目的蛋白相对含量为77.9%，1.0 mmol/L时相对含量为73.3%，由蛋白相对含量和酶活大小分析可得，0.8 mmol/L时蛋白相对表达含量最高，酶的活性最高，因此选择0.8 mmol/L作为诱导剂IPTG的最适浓度。

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2.4.3诱导起始菌浓度不同对丙酮醛降解酶可溶性表达的影响据文献报道，诱导起始菌浓度不同，菌体的生长速率不同，外源蛋白表达水平会受到影响[15]。本试验选取了6个不同起始菌浓度：D600 nm=0.307，D600 nm=0.455，D600 nm=0.557，D600 nm=0.603，D600 nm=0.805，D600 nm=1.117，加入0.8 mmol/L的IPTG，37 ℃诱导4 h。由图6和表3分析可知，随着诱导起始菌浓度的增加，总蛋白水平在增加，目的蛋白的表达量也有

3结论

在前期研究基础上，本试验开展了对丙酮醛降解酶基因的克隆及其目的蛋白表达的研究。在对目的基因SPAC22E12.03C进行克隆时，选取的验证酶切位点为NcoⅠ和XhoⅠ。接下来经过酶联与转化，得到重组质粒，经测序，确定其为阳性质粒。再次经过转化，成功得到重组表达菌和带有空载质粒的对照菌。

接下来本试验采取单因素控制变量法对目的蛋白最佳表达条件的进行了探索。试验采用的3个变量分别为温度、诱导剂IPTG、起始诱导菌浓度。检测最佳条件的3个指标为SDS-PAGE、总蛋白含量测定和酶活测定。结果表明，在培养温度为37 ℃，IPTG浓度为0.8 mmol/L，诱导起始菌浓度的D600 nm在0.5～0.6时，结合酶活性分析，目的蛋白相对含量最高。通过对目的蛋白诱导表达条件的优化，为更好地揭示丙酮醛降解酶的作用机理提供了很好的平台。

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