关键词：
癌相关基因（精选九篇）
癌相关基因 篇1
1 Survivin基因
Survivin基因是在1997年由耶鲁大学的Altieri等效应细胞蛋白受体21 (effector cell protease receptor21, EPR21) cDNA在人类基因组文库中筛选克隆获得一种原癌基因, 其基因定位于染色体17q25, 全长14.7kb, 含有3个内含子和4个外显子, 编码有142个氨基酸组成的分子量约16.2kD的胞浆蛋白。它是近年来发现的一组凋亡抑制基因家族IAPs (inhibitors of apotosis proteins, IAPs) 成员之一, 是目前发现的分子量最小、作用最强的凋亡抑制蛋白。目前, survivin抑制凋亡的机制还不完全清楚, 已知的作用途径有: (1) survivin主要是通过抑制凋忘核心caspase-3和caspase-7的活性, 阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。 (2) survivin与周期蛋白激酶CDK4、p34cdc2相互作用阻断凋亡信号转导通路。大部分文献报道中认为Survivin表达于人与鼠的胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织, 在正常成人组织中几乎不表达。Lehner等[1]人采用RT-PCR研究发现:临床分期越晚, 组织分级恶性度越高, 对子宫浸润越深, survivin基因的阳性表达率越高, 但Erkanli S等[2]研究表明该基因仅与内膜癌的组织分级有关, 未发现其与临床分期有关。目前研究认为survivin基因不是子宫内膜癌的特异性指标, 但它的表达水平对判断内膜癌的恶性程度和预后有重要的价值。
2 p27Kip1基因
p27Kip1基因是1994年Polyak等在TGF-β处理的生长抑制细胞和接触抑制细胞中发现并克隆了一种新的细胞周期素依赖性激酶抑制物p27Kip1。定位在人类染色体12p12.0～12p13.1交界处, 含有2个参与编码的外显子, 编码1 9 8个氨基酸的多肽。p27Kip1的功能主要是通过抑制G1期cyclin E与CDK2结合形成复合物, 使细胞停滞于G0期 (静止期) , 从而抑制细胞的增殖。大量研究表明, p27Kip1蛋白表达降低与多种肿瘤的发生及发展有关。Nycum等[3]研究发现, p27Kip1蛋白在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌中的表达阳性率呈下降趋势, 其表达水平与肿瘤的临床分期、发病年龄和组织学类型无关, 在进展期子宫内膜癌的存活期上无预后价值, 但在肿瘤组织学分级增高时, p27Kip1蛋白水平表达增高。佘远萍等[4]p27Kip1研究发现在正常子宫内膜、内膜不典型增生、子宫内膜癌中的表达率分别为90%、70%、62.5%, 其中子宫内膜癌与正常子宫内膜差异有显著性 (P<0.05) , p27Kip1表达与子宫内膜癌的组织学分级、手术分期有关 (P<0.05) , 提示p27Kip1在子宫内膜癌发生相关, 且与子宫内膜癌的进展有关, 并可能成为判断预后的有用指标。但王华等人[5]报道p27Kip1蛋白表达与子宫内膜癌组织学类型、肌层浸润、患者年龄及淋巴结转移无明显相关性。
3 FH IT基因
FH IT基因是1996年Masatalka Ohta等利用外显子捕获法 (exontrapping) 从上皮癌细胞系中发现并成功克隆了的FH IT (fragile histid inetriad) 基因, 定位于人类染色体3p14.2, 涵盖了t (3.8) 易位断裂点、FRA3B和HPV16整合位点。其cDNA全长1095bp, 共有10个外显子, 其中5～9为编码外显子, 跨越t (3.8) 易位断裂点和极脆性区域FRA3B。研究发现, FHIT基因存在于大多数正常组织中且呈低水平表达, 近年来大量文献报道FH IT的失活与多种肿瘤有关, 如在头颈部肿瘤、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、消化道恶性肿瘤、肾癌、卵巢癌、宫颈癌等肿瘤中均存在异常, 目前认为Fhit基因的作用机制集中在细胞周期调控和细胞凋亡方面, 可使细胞受阻于增殖周期的S期, 并激活Caspase28, Caspase29引起Caspase酶介导的凋亡级联反应, 主要表现为异常转录、等位基因的缺失和插入, 其中以外显子427缺失表达为主.关于FHIT基因异常与子宫内膜癌临床病理参数的关系, 目前研究所得结论不相一致, YURA等[6]研究结果认为, FHIT蛋白表达缺失或低表达与高组织学级别的EC发生相关, 与晚期肿瘤呈显著相关有关.提示FHIT蛋白表达缺失可能与EC的侵袭性表型 (aggressive phenotype) 有关.而Hadaczek等[7]研究则表明, FHIT蛋白表达与子宫内膜癌的组织学分级关系不大, 认为FHIT基因的失活是子宫内膜癌发生的一个早期事件。
4 PETN基因
PTEN基因是1997年发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性抑癌基因。它位于人类10号染色体q23.3区, 有9个外显子, 8个内含子, 全长200kb, 其cDNA共有1209个核苷酸, RNA大小为5.5kb和2.5kb, 编码403个氨基酸残基组成的蛋白质。PTEN是通过调控原癌基因磷脂酰肌醇 (PI) -3-激酶 (PI3K) 和蛋白激酶B (简称PKB) 来调控细胞的增殖、凋亡、转移及黏附, 可使细胞停止于G0期或发生凋亡及调节细胞的转移和黏附作用的。PTEN的功能异常主要通过基因的无义突变、启动子甲基化、基因同源性丢失、mRNA表达缺失等方式发生。PETN基因是目前发现的子宫内膜癌中突变率最高的基因, 被称为子宫内膜癌的“看家基因”。据国外报道, PTEN基因在子宫内膜组织中广泛存在, 子宫内膜癌中PTEN基因存在突变和丢失, 突变发生率达33%～55%。Orbo等[8]对通过10～20年的追踪观察68例子宫内膜增生过长的患者, 最终有18例发展为子宫内膜癌, 其中PTEN基因发生突变率占到28%, 刘云春[9]等采用免疫组织化学S-P法检测得出56例子宫内膜癌中PTEN蛋白表达缺失率为57.11%, 明显高于正常子宫内膜中的完全表达 (P<0.105) 。PTEN蛋白在低分化组的表达缺失率明显高于中高分化组 (P<0.105) , 提示抑癌基因PTEN蛋白表达缺失在子宫内膜癌的发生、发展、浸润等过程中有一定作用。Athanassiadou P等[10]认为PTEN表达水平的高低与病理学分级、细胞分化程度、肌层浸润深度相关, 与手术病理分级无相关性。
综上所述, 子宫内膜癌的发生是一个多因素、多阶段、多基因变异累积的过程, 此外DNA错配修复基因也逐渐成为研究热点。相信随着分子水平不断的深入研究将为子宫内膜癌发生机制的阐明、早期诊断、病理监测、临床预后、个体化治疗方案及以及基因治疗等提供更多的科学理论依据。
摘要：子宫内膜癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一, 近年来发病率呈上升趋势。随着分子生物学技术的发展, 基因在子宫内膜癌发生、发展、预后中的作用成为学者们关注的热点, 目前主要认为与原癌基因的激活、抑癌基因的失活及DNA错配修复基因有关。深入研究相关基因对于阐述子宫内膜癌的发病机制、早期诊断、寻找基因疗法和制备有效的抗癌药物的提供理论依据。
关键词：子宫内膜癌,Survivin基因,p27Kip1基因,FH,IT基因,PETN基因
参考文献
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[3]Nycum LR, Smith LM, Farley J H, et al.The role of p27in en-dometrial carcinoma[J].Gynecol Oncol, 2001, 81 (2) :242～246.
[4]佘远萍, 史玉霞, 吕忠士.P27kip1和cyclin E在子宫内膜癌中的表达及其意义[J].肿瘤防治研究, 2002, 29 (3) :170～172.
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[9]刘云春, 王志军.子宫内膜癌PTEN蛋白表达及其临床意义[J].河北北方学院学报, 2006, 23 (4) :36～37.
癌相关基因 篇2
【关键词】 c-erbB-2基因 乳腺浸潤性导管癌 腋窝转移淋巴结
【中图分类号】 R737.9 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-8801（2014）03-0013-01
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在许多西方国家其中发病率及病死率居于女性恶性肿瘤的首位，危及女性生命健康[1]。近年来，我国女性乳腺癌发病率逐渐上升，且日趋年轻化。目前乳腺的发生、发展的分子机制仍未完全明确，肿瘤分子生物学研究证实，肿瘤是一种基因疾病，是由于多种基因变异并长期积累导致的[1]。原癌基因c-erbB-2在受到体外某些因素作用被截获后，可具有肿瘤转化活性，并促进细胞的癌变和癌细胞生长及增殖。本文主要探讨c-erbB-2在乳腺浸润性导管癌以及腋窝转移淋巴结中的表达相关性，现将相关临床资料报道如下：
1 对象和方法
1.1 一般资料
选取我院2010年1月-2014年1月75例乳腺浸润性导管癌患者的临床资料，所有的病例资料均十分完整，患者年龄29-77岁，平均年龄49.5±10.2岁。所选75例患者，其中合并≥1个腋窝淋巴结转移者33例，无腋窝淋巴结转移者42例。肿瘤直径>2cm者36例，肿瘤直径≤2cm者39例。所有患者术前没有接受化学治疗及任何辅助项的治疗，术后经病理组织学试验确诊为乳腺浸润性导管癌，在病情的诊断结果中表明均为原发性浸润性导管癌。病理诊断均参照世界卫生组织《乳腺及女性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》2003年，进行分类。
1.2 方法
试剂选用c-erbB-2单克隆抗体、DAB显色试剂盒与SP免疫组化染色试剂盒，上述试剂均出自北京中杉金桥生物技术有限公司。采集的标本以10%中性甲醛予以固定，石蜡包埋标本5μm连续切片处理，每例取2片标本，1片用于进行HE染色复核病理诊断，1片用于c-erbB-2表达的检测，至切片脱蜡后，高温高压柠檬酸抗原修复120s，后按照S-P法进行操作，具体操作步骤为：首先滴过氧化酶阻断溶液试剂，室温孵育10min；滴正常非免疫动物血清试剂，室温孵育10min；后滴鼠抗人c-erbB-2多克隆抗体，4℃冰箱孵育一夜；滴生物素编辑第二抗体试剂，室温孵育10min；滴链霉素抗生物素-过氧化酶溶液试剂，室温孵育10min，在各步骤间应用0.01mol/L PH7.4 PBS缓冲液进行冲洗，但滴加正常非免疫动物血清试剂除外，经DAB液显色、苏木素复染、脱水、透明、封固等后续步骤即可[2]。
1.3 判定标准
试验结果采用FDA，即美国食品和药品监督管理局新判断标准：c-erbB-2染色阳性细胞膜出现棕黄色，且着色细胞数>30%，可判定为阳性着色[3]。
2 结果
75例原发病灶标本中c-erbB-2高表达者18例，占全部乳腺浸润性导管癌患者的24%，c-erbB-2与患者年龄和排卵情况无关，但与肿瘤大小有一定联系，肿瘤直径≤2cm 的39例患者中，c-erbB-2高表达者3例，占7.69%；肿瘤直径>2cm的36例患者中，c-erbB-2高表达者11例，占30.56%。原发灶c-erbB-2高表达，其表达水平与病发肿瘤的大小以及淋巴结的转移情况成正相关，与ER、PR的表达成负相关。33例腋窝淋巴结转移乳腺浸润性导管癌患者中，原发病灶c-erbB-2高表达14例，腋窝淋巴结转移者11例。
3 讨论
c-erbB-2又称为HER-2，是neu基因在人的同源基因，由胞外结构域、跨膜结构域、细胞内结构域三部分组成，是表皮生长因子受体的组成成员之一[4]。c-erbB-2定位于17q21，编码为185kDa分子量的跨膜糖蛋白，这一点与糖蛋白络氨酸激活酶的活性密切相关[4]。目前临床医学研究领域检测主要是运用免疫组织化学法检测c-erbB-2原癌基因的高表达，通过荧光原位杂交法检测c-erbB-2拷贝数，通过酶联免疫吸附试验检测血清中的c-erbB-2 ECD。
在正常情况下，c-erbB-2原癌基因一般处于非激活状态，能够参与细胞生长和分化的调节过程，但如果受到体内外一些因素的影响后，其结构或表达会发生调控失常，从而被激活[5]。c-erbB-2具有一定肿瘤转化活性，可通过抑制肿瘤细胞死亡，促进肿瘤细胞存活，刺激肿瘤新生血管的生成。临床认为c-erbB-2是乳腺癌发生于发展的重要因素，因此c-erbB-2的高表达提示肿瘤的恶性程度和复发几率[5]。大量临床研究表明，c-erbB-2的阴性表达与组织性分级低和淋巴结低转移、肿瘤低增殖活性有关，与患者自身的性别、年龄等无关[5]。本组研究中，c-erbB-2高表达者占全部乳腺浸润性导管癌患者的24%，且c-erbB-2高表达与肿瘤大小有关，这与已报道的临床资料结果相似。说明c-erbB-2可作为判断肿瘤发展的临床依据，对于判断乳腺癌生物学行为具有重要意义，值得进一步关注和应用推广。
参考文献
[1] 刘延菊， 李东辉，曹明耀. C-erbB-2 基因表达与乳腺癌关系的研究[J] . 现代预防医学， 2006 ，33 （12） ： 2302-2303 .
[2] 史忠新，贺颖，王文慧，等. 乳腺癌中 Fa s 抗原与 C -e r bB -2 表达及其意义[J] .北华大学学报（自然科学版），2007，8（2）：142-144 .
[3] 张军， 张孝忠， 刘振华. C-erbB-2 、p53 、 nm23 基因表达与乳腺癌淋巴结转移关系的研究[J]. 中国实验诊断学，2003，7（5）：439 -440 .
[4] 张琼，朱玉兆 .C-erbB-2、P53、PCNA 、ER、PR及TopoⅡ在乳腺癌的表达及其临床意义[J]. 蚌埠医学院学报，2006，31（5）：447-450 .
癌相关基因 篇3
1 MMR基因突变与EC发病风险
迄今为止已分离鉴定9种人类同源的MMR基因, 即h MSH2、h M S H 3、h M S H 4、h M S H 5、h M S H 6、h M L H 1、h M L H 3、h P M S 1和h P M S 2。9 0%H N P C C与这些基因的异常有关, 其中h M S H 2、h MLHl与EC关系最为密切。EC是HNPCC家族中最常见的肠外恶性肿瘤, 大约20%~30%的HNPCC女性表现为EC。HNPCC家族携带MMR突变基因的女性终生患EC的风险为60%, 而普通人群仅2.3%[1]。Vasen等通过对19个HNPCC家族的382位亲属进行研究发现, h MSH2和h MLHl突变基因携带者发生EC的风险分别为61%和42%。此外, h MSH6和h MLH3的突变也增加EC的发病风险[2]。
2 MMR基因表达与EC发生、发展
子宫内膜细胞是不稳定细胞, 其基因复制活跃, 错配几率高, 对MMR系统的依赖性较高。MMR基因一旦发生改变, 可导致广泛的肿瘤易感。朱艳宾等用免疫组化方法检测了104例子宫内膜癌、8例子宫内膜非典型增生及35例正常子宫内膜 (其中增生期17例, 分泌期18例) 中h MSH2、h MLHl蛋白表达情况, 结果显示:子宫内膜癌、子宫内膜非典型增生、正常子宫内膜增生期和分泌期h MSH2表达缺失率分别为68.3%、50%、5.9%和5.6%。h MLHl表达缺失率分别为64.4%、37.5%、11.8%和5.6%。子宫内膜癌及子宫内膜非典型增生h MSH2、h MLHl的表达缺失率明显高于正常增生期及分泌期子宫内膜 (P均为0.0001) ;子宫内膜非典型增生和子宫内膜癌组织h MSH2、h MLHl表达缺失率无明显差异 (P分别为0.294, 0.132) , 说明h MSH2、h MLHl表达缺失可能与子宫内膜癌发生早期有关。
薛凤霞等用甲基化敏感性核酸内切酶酶切方法 (PCR法) 和甲基化特异性PCR方法 (MSP法) 检测48例子宫内膜癌、6例子宫内膜不典型增生及34例正常子宫内膜 (其中增生期19例、分泌期15例) 组织中h MLH1和h MSH2启动子甲基化状态, 结果显示:子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生、正常子宫内膜增生期和分泌期组织中h MLH1启动子甲基化率分别为37.5%、0/6、0/19和0/15, h MSH2启动子甲基化率分别为12.5%、0/6、0/19和0/15。提示子宫内膜不典型增生及正常子宫内膜组织中h MLH1、h MSH2基因启动子均无甲基化, 子宫内膜癌组织h MLH1启动子甲基化率明显高于正常子宫内膜 (P=0) , 子宫内膜癌组织h MSH2启动子甲基化率较正常子宫内膜高, 但差别无统计学意义 (P=0.087) 。说明子宫内膜癌的发生发展可能与h MLH1启动子甲基化有关。
也有研究认为, MMR基因缺陷与异常的肿瘤抑制基因联合作用可加速肿瘤的发生。Yong等对MSH6-/-和p53-/+基因敲除小鼠的肿瘤发生情况进行研究, 结果显示, 与MSH6-/-和p53-/+单基因敲除小鼠相比, MSH6-/-和p53-/+基因敲除小鼠死于恶性肿瘤的速度明显加快 (P<0.001) 。因此认为MSH6的缺失与p53基因的杂合性丢失相互作用可促进肿瘤的发生发展。
3 MMR基因缺陷与EC预后
此外, MMR基因缺陷的EC患者多预后不良。Cohn等利用免疫组化法对336例EC患者MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达情况进行检测, 结果显示, 29%的EC患者有MMR基因缺陷, 且MLH1表达缺失的患者明显增加淋巴管和宫颈浸润的风险, 与预后呈负相关。
4 展望
从MMR基因被发现至今, 对其研究已取得了很大进展。相信随着MMR基因研究的深入及分子生物学技术的发展, 能使人们进一步理解MMR基因突变所致EC的发病机理, 并将检测MMR基因突变作为筛选EC高危人群的有效方法, 使EC的预防和早期诊断成为可能。
摘要：DNA错配修复 (mismatch repair, MMR) 基因是人体细胞中存在的一种能识别并修复DNA碱基错配的安全保障系统。近来研究发现, MMR基因缺陷可增加子宫内膜癌发病风险, 与子宫内膜癌发生、发展及不良预后有关。本文综述MMR基因与子宫内膜癌相关性研究进展。
关键词：DNA错配修复,碱基错配,肿瘤,子宫内膜癌
参考文献
[1]Liu FS.Molecular carcinogenesis of endometrial cancer[J].Taiwan-ese J Obstet Gynecol, 2007, 46 (1) :26～32.
抑癌基因P53与肿瘤的研究进展 篇4
【关键词】P53；肿瘤；表达
【key words 】P53；cancer；expression
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0776-02
随着社会的发展，人类生活习性的改变，恶性肿瘤的发病率在逐年升高，其对人类生命的威胁仅次于心血管疾病。恶性肿瘤又称癌，是由于机体内的原癌基因及抑癌基因突变，表达异常致细胞生长、凋亡异常所致。P53基因作为重要的抑癌基因，其表达异常对多数肿瘤的形成起重要作用。P53基因具有阻滞细胞周期，促进细胞凋亡，维持基因组稳定，抑制肿瘤血管生成的作用。其突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用，从而转变为癌基因，导致肿瘤发生。P53与诸如肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等多种癌症的发生有关。目前针对癌症基因治疗的研究越来越受到科研工作者的重视。P53基因是目前所知研究最透彻，功能最强大的一种抑癌基因。研究表明，P53具有抑制并杀灭肿瘤细胞及防止肿瘤复发、转移，提高自身免疫力的作用，其对受照射、细胞毒制剂、热疗打击的癌细胞，具有更大的杀伤作用，从而增强放化疗杀灭癌细胞的功效，达到1+1大于P53的效果。对P53的研究将为肿瘤的发生发展和治疗提供新的思路和方法。
P53的基因结构及功能
人类P53基因位于17P13.1，全长约20kb，由11个外显子和10个内含子组成。第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8分别编码5 个进化上高度保守的结构域， P53基因转录成2.5kbmRNA，编码由393个氨基酸组成的肽链核蛋白，分子量为53kd。P53基因的表达至少受转录及转录后两种水平的调控。P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100～250bp， P2位于第一内含子内，在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53 基因内含子也起作用，内含子中有正调控作用，其调控有组织特异性。 野生型P53 基因的N-末端的转录激活结构域（activtiondomain， AD）AD1，AD2位于氨基酸1-50位，与通用转录因子TF11D 结合而发挥转录激活功能。TF11D 是由TBP（TATAbinding protain）和TAF（TBP associatedfactor）结合而成的复合物，P53与TF11D中的TAF结合，作用于下游基因启动子中的TATA box ，达到转录激活功能。P53基因生长抑制结构域位于氨基酸60-94位，富含脯氨酸，含5个重复的pxxp序列，可与含SH3 结构域的蛋白质相互作用，将P53与信息传递途径连接起来。
P53基因还有：序列特异的P53结合结构域，位于氨基酸100-290位间；核定位信号NLS位于氨基酸残基313-323；四聚体寡聚化结构域，定位于氨基酸残基323-355；C-末端非专一DNA调节结构域，定位于氨基酸残基370-393。这些结构域与具有激活靶基因、抑制癌细胞生长、阻止基因错配等功能。P53与DNA的结合能力并非特异性地与DNA 结合，参与核心区与DNA 结合的别构调节，同时在碰到DNA损伤时，P53可能补充其他蛋白质到损伤部位，提供DNA损伤信号。
P53的功能主要表现在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定，抑制肿瘤血管生成等方面。在細胞周期中，P53的调节功能主要体现在对G1和G2/M 期校正点的监测，与转录激活作用密切相关。P53一方面阻碍肿瘤抑制基因的磷酸化而使转录调节因子不能活化，引起G1期阻滞。另一方面P53 能下调Cyclin B1表达，从而使细胞不能进入M期。P53通过上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡的作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡。同时P53可通过参与DNA的修复，达到维持基因组的稳定，以及刺激抑制血管生成的相关基因表达，从而抑制肿瘤血管生成。
P53与肿瘤的发生、发展
在细胞周期中，野生型P53 蛋白通过阻止G1期细胞进入S期，使受损的DNA或染色体得以修复；若DNA 或染色体损伤过于严重时，P53 能触发凋亡机制清除受损的细胞，从而达到调节功能。相反，突变型P53 基因则发挥着原癌基因的作用，可促进肿瘤的的发生、发展。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了P53基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素之一。突变和缺失是其失活的主要机制，另外还包括重排、插入、基因融合等。P53突变不仅失去抑癌的功能，还能促使细胞恶性转化。
既往研究表明，P53基因与人体各大系统肿瘤的发生、发展密切相关。
呼吸系统：肺癌中P53异常以突变最常见，绝大部分小细胞肺癌（NSCLC）中有P53突变，在非小细胞肺中P53突变也超过一半。一些研究提示，P53多态性是肺癌发生的一个危险因素。Mcchanlc等[1]认为P53基因突变谱的不同可能影响到肺癌的易感性以及相应肿瘤形成。P53不仅可以用于早期肺癌的诊断和高危人群的筛检，同时可以用于肺部原发癌及转移癌的鉴别。外显子4处的第72号密码子编码不同的氨基酸对患者的病情进展和预后具有很大的影响。NSCLC患者中，该密码子编码脯氨酸往往比编码精氨酸的生存期更短，预后更差[2]。毛等证实[3]：P53突变与肺腺癌的分期及预后不良呈正相关（P〈0.01）。Gu等认为P53基因突变也可用于评价肺癌患者淋巴结微小病灶转移及预后。
消化系统：P53突变与消化系统肿瘤的发生发展密切相关P53表达增高，增加大肠癌、小肠癌、胃癌及贲门癌发生发展及转移的风险。研究表明，50%以上的肝癌有P53基因的突变。P53的阳性表达率与细胞分化及预后呈负相关，与肿瘤分期成正相关。P53功能失活与食管癌癌变过程，组织学分级密切相关。
循环系统：Thornton等发现慢性淋巴细胞性白血病（CLL）伴有P53基因缺失的CLL患者，细胞形态多不典型（幼稚淋巴细胞>0.10），血清LDH增高，病程进展快，瘤细胞负荷高，多处于疾病晚期（Binet B/C期），对多种治疗（包括核苷类似物）反应差，生存期短，难治组P53基因缺失的发生率高。多数研究表明p53基因突变的淋巴组织肿瘤治疗效果差，生存期短。淋巴组织肿瘤中突变型P53蛋白的表达率明显增高，复发/难治患者显著高于初治患者，与化疗抗药和预后差有关。
运动系统：Toguchida等认为P53基因异常是骨肉瘤生物演化过程中的重要事件。但目前对P53与骨肉瘤转移和预后的关系， 尚存在争议。有研究证实，P53能够在一定程度上反映眼眶横纹肌肉瘤的生物学特性，有可能成为判断肿瘤预后的指标。
神经系统：在对儿童胶质瘤研究中发现，1/3 病例可检出P53基因突变，并且约50%的胶质瘤组织中P53表达显著。还有报道，激活的P53 基因还具有增强Fas诱导脑胶质瘤细胞凋亡的作用。Nayak 等的研究结果表明，胶质母细胞瘤中P53 蛋白阳性率为50% 。与其相一致的是，也有研究报道，在一项研究中胶质母细胞瘤P53 突变率高达35% ～60%。
泌尿系统：Kwak等证明在前列腺癌中由于P53基因的突变导致血管生成促进因子VEGF的上调及血管生成抑制因子TSP—l的下调，从而引起肿瘤新生血管的生成，为肿瘤的发生、发展、转移提供必需的条件。杨[4]等研究表明P53与膀胱癌的临床分期、病理分级及预后密切相关。而P53的阳性表达与肾癌的病理类型、病理分级无关而与临床分期有关.
内分泌系统：Olivier等[5]认为P53基因突变可能是甲状腺癌的发生、发展的晚期分子事件，与甲状腺癌的进展、侵袭和转移有关，它对甲状腺癌的分级以及预后有重要的提示作用。P53的异常表达与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移有关，其过度表达可能涉及肿瘤的进展及预后[6]。
生殖系统：研究证实P53与上皮性卵巢癌组织的发生、发展及转移有关，可作为判断卵巢癌预后不良的指标。对中国乳腺癌患者P53表达进行meta分析发现，P53表达阳性与淋巴结转移、术后复发、生存时间、肿瘤大小、组织学分级和临床分期有相关性。P53对于判断预后有较好的特异度和敏感度，与临床预后有较好的相关性[7]。P53蛋白表达与子宫内膜癌临床分期、病理类型、组织病理学分级、淋巴结转移、肿瘤肌层浸润及生存率有明显相关性。
其他：研究表明，在皮肤癌、鼻咽癌、头颈部鳞癌中均有P53表达异常，这些肿瘤的发生与P53的表达异常明显相关。
P53与肿瘤的治疗
通过基因治疗可望从根本上杀灭癌细胞已成为研究热点。P53基因突变或缺失，其调节细胞凋亡的功能丧失，从而导致肿瘤的发生。基于P53基因的作用，目前研究最多的是腺病毒-p53基因对肿瘤的治疗作用。P53基因通过P53蛋白作用于细胞周期、DNA修复细胞、细胞分化和凋亡，起到对肿瘤的治疗作用。实验已经证实，将野生型P53导入肿瘤细胞，可以控制细胞周期和诱导细胞凋亡，增加肿瘤对化/放疗的敏感性，还可通过旁观者效应达到杀灭肿瘤细胞的作用[8]。
rAd-p53（重组腺病毒-p53）基因治疗肿瘤已广泛开展。导入途径有呼吸道，肿瘤内，血管内和腹腔内注射。常用经动脉导管引入rAd-p53。基因转导方式由病毒转染、脂质体融合、配体与膜受体结合、基因枪和微注射等多种物理方法。rAd-p53自1995年在美国批准进入临床试验目前有50多项临床试验方案在世界各国实施。采用肿瘤内注射联合放/化疗法治疗头颈部癌和非小细胞肺癌临床试验已进入Ⅲ期，腹腔内注入rAd-p53对卵巢癌的临床治疗试验已进入Ⅱ/Ⅲ期，通过肝动脉灌注rAd-p53治疗肝细胞癌在临床试验中进入了Ⅰ/Ⅱ期。目前利用rAd-p53对胃癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、软组织肉瘤等的治疗也在积极开展中。rAd-p53感染肿瘤细胞能有效控制肿瘤细胞生長，引起细胞凋亡，患者耐受性良好，无严重毒副作用。它为肿瘤患者提供了一个新的有希望的治疗方法。
参考文献
[1]Mcchanic LE，Marrogi AJ，wclsh JA，et al.Polymorphisms in XPD and Tp53 and mutation in human lung cancer[J]. Carcinogenesis，2005，26（3）：597—604.
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[3]陈国平，毛伟敏，赵力，等。nm23和p53基因与肺腺癌生物学特性的关系[J]，中华肿瘤防治杂志，2007，14（14）：1088-90。
[4] 杨立新，张海峰，白淑芬。p53、Ki一67基因表达与膀胱癌相关性的回顾性研究[J]。现代医学，2010，2；38（1）：32-35.
[5] Olivier M，Eeles R，Hollstein M，et a1.The IARC TP53 database：New online mutation analysis and recommendations to users[J].Hum Mutat，2002，19（6）：607—614.
[6]贺斌，胰腺癌组织中Runx3和p53蛋白的表达及临床意义[D]，2013，中南大学。
[7]杜长征，李惠平，马力文，等。中国乳腺癌患者p53表达临床生物学意义的Meta分析[J]。中国癌症杂志，2005，15（6）：514-517。
癌相关基因 篇5
1 乳腺癌癌前病变
乳腺癌癌前病变是一组形态学和遗传学方面均有改变的疾病, 其本身尚不具备恶性特征性改变, 或认为某些较容易发展成为癌的病变。这一过程是谱带式的连续过程 (即正常-增生-非典型增生-原位癌-浸润癌) [2], 非典型增生是癌变过程中必经的一个阶段, 多数学者认为导管上皮非典型增生 (ADH) 、小叶非典型增生 (ALH) 、乳腺乳头状瘤病、小叶原位癌 (LCIS) 和导管原位癌 (DCIS) 是乳腺癌癌前病变[3], 在此阶段针对高危乳腺癌癌前病变患者, 采取有效的预防措施可以逆转癌变进程或延缓癌变进展。所以针对乳腺癌癌前病变病人高危因素普查的研究对乳腺癌早期预防至关重要。
乳腺癌癌前病变属病理学概念, 其所对应的疾病目前被称为良性乳腺病, 但良性乳腺病并非都归属乳腺癌癌前病变范畴。乳腺癌癌前病变属乳腺癌高危人群, 目前国外有许多研究者致力于建立一个除年龄以外的乳腺癌高危人群模型来提高普查的效果, 如Gail模型、Claus模型、BRCAPRO模型[4], 较为被认可的高危人群即根据乳腺癌患者既往良性乳腺病的特点, 将良性乳腺病用乳腺癌相关风险系数作区分, 以明确何类良性乳腺病更易进展为癌, 并总结其系数在1.5以上即具有乳腺癌癌前病变特征。乳腺癌相关危险系数在1.5~2.0的是上皮增生性病变 (但不伴有不典型增生) , 危险因素在2.0以上的为不典型增生。具有5年以上危险因素、其危险系数在1.67以上的良性乳腺病即属高危乳腺癌癌前病变, 都建议服用药物进行乳腺癌的预防[5]。国外另一项大宗临床研究对9087名被诊断为良性乳腺病的妇女进行随访, 中位随访期15年, 发现确诊为良性乳腺病后进展为乳腺癌的高危因素为组织病理学分级和乳腺癌家族史, 其中乳腺癌相关危险系数高并伴有乳腺癌家族史者癌变机率最高[6]。但到目前为止基于一个或几个高危因素的乳腺癌普查发现病例仍不高。即便诊断为乳腺癌癌前病变, 因其未必必然进展为乳腺癌, 还应着手找寻乳腺癌癌前病变阶段必然进展为乳腺癌的关键影响因素, 如果关键影响因素找到, 将大幅度提高乳腺癌早期诊断率。
2 中医体质学说
中医体质学说是以中医理论为指导, 研究人类各种体质特征、体质类型的生理、病理特点, 并以此分析病症的反应状态、病变的性质及发展趋向, 从而指导疾病预防和治疗的一门学科。体质的形成是诸多因素共同作用的结果, 其性状受遗传因素和环境因素的双重作用, 其中遗传是主要因素[7]。体质的偏颇是疾病发生的内因, 是决定疾病发展过程及证候类型演变的重要因素[8], 如《医宗金鉴·订正伤寒论注》曰:“六气之邪, 感人虽同, 人受之而生病各异者, 何也?盖以人之形有厚薄, 气有盛衰, 脏有寒热, 所受之邪, 每从其人之脏器而化, 故生病各异也, 是以或从虚化, 或从实化, 或从寒化。”体质病理上表现为个体对某些疾病的易感性, 疾病传变转归中的某种倾向性[9]。中医体质类型研究是中医研究的前沿课题, 对不同个体体质疾病预防、个体化治疗具有重要意义。体质分型主要以人体生命活动的物质基础——阴、阳、气、血、津液的盛、衰、虚、实变化为主。现代中医体质研究从临床角度根据疾病群体中的体质变化、表现特征及与疾病的关系等方面对体质作出分型, 目前体质分型各家学说已统一规范。王琦教授综合各家学说经过文献研究、流行病学调查分析、临床观察方法形成了9种基本中医体质分类法:平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、痰湿质、湿热质、瘀血质、特禀质、气郁质, 因其已经通过教育部及“973”项目专家论证[8] , 获得认可并获2006年度国家科技进步二等奖[10], 故采用王琦的9种体质分类法作为乳腺癌癌前病变进展为乳腺癌高危体质分型标准。
3 中医学体质学说与乳腺癌癌前病变癌变的相关性认识
中医药对有明确病理诊断为乳腺癌癌前病变的研究刚起步, 从中医体质角度入手进行危险因素分析的研究尚未见报道, 但却是必要的。原因有三:第一, 目前的研究已从不同角度证明了中医药诊治此病的客观有效性[11,12,13,14];第二, 有学者根据临证心得认为气滞-痰凝 (肝郁脾虚) -血瘀-痰瘀互结 (冲任失调) 是乳腺癌癌前病变不典型增生的演变规律[15,16], 另有学者认为不典型增生初期阶段以肝郁血瘀为主要矛盾, 此型占乳腺非典型增生总人数的65%, 继续发展, 直至由重度不典型增生向原位癌转变, 冲任失调这一病机改变同时成为机体的主要矛盾[17]。乳腺癌患者中早期中医治疗也大多围绕郁、瘀进行, 上述治疗规律的总结促使我们思考这样的问题:郁、瘀的体质在乳腺癌癌前病变进展为乳腺癌中是否起到了关键作用。第三, 现代基础和临床研究均显示家族遗传背景及强弱对乳腺癌癌前病变进展为乳腺癌的重要性[18]。乳腺癌家族史对乳腺癌癌前病变向乳腺癌的促发作用说明体质研究的重要性, 从体质分型角度入手研究乳腺癌癌前病变可能会从根本上把握乳腺癌癌前病变进展为乳腺癌的关键点。除需要大宗的临床流行病学调查筛选出高危体质病人以分析研究验证外, 更为主要的是明确这些高危体质病人基因谱, 从分子水平确定体质的客观诊断标准。因为规范化、标准化的研究结果是实现理法方药有机结合的关键, 是指导中医药干预治疗的理论基础。
4 应用基因芯片技术研究乳腺癌癌前病变与中医体质的相关性
基因芯片又称为DNA 芯片、DNA 微阵列, 它是由大量已知序列的DNA 或者寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列。基因芯片的基本工作原理是:经过标记的待测样本DNA 通过与芯片上特定位置的探针杂交, 可根据碱基互补配对的原理确定靶DNA 序列。经过分析处理芯片的杂交检测图像, 可以对细胞和组织中大量的基因信息进行分析。基因芯片能够实现生物信息的大规模检测分析, 是一种进行DNA 序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。基因芯片由支持物、连接层和DNA 分子探针阵列三部分组成, 该项技术主要包括DNA 方阵的构建、样品的制备和标记、分子杂交和杂交图谱的检测分析。按其功能的不同又可分为表达型芯片和测序型芯片。基因芯片技术能大规模、高通量的研究成千上万个基因在各种生理、病理状态下的表达, 预测发现它们的功能, 并辨明它们间的相互作用和调控的关系。它为肿瘤分子生物学研究开辟了一条新途径。
乳腺癌发生是遗传与环境因素相互作用, 多因素、多基因和多阶段的复杂过程, 其基因的异常要远远先于形态改变, 乳腺癌癌前病变基因表达状况可以反应其在病理方向上的进展方向和潜能。具有相同症状、不同病理或同一病理类型不同个体之间其病变机转均存在个体差异。基因芯片技术可以在基因组范围内对组织细胞的基因表达谱进行研究, 采用高通量基因表达谱芯片通过比较乳腺癌不典型增生与其配对的癌旁正常乳腺组织基因表达差异, 筛选乳腺癌癌前病变相关基因, 并探讨其作为乳腺癌癌前病变分子诊断基因标志群的临床意义。通过比较乳腺癌癌前病变患者癌与癌旁乳腺组织基因表达差异, 筛选在多病例中有共同表达趋势的差异基因。乳腺癌癌前病变病人群特异的基因表达谱决定了病人是否进展为乳腺癌。我们可以借助于中医体质分型采用流行病学方法筛选并验证高危中医体质, 以此类高危病人基因标志群与其他体质乳腺癌癌前病变病人基因谱进行差异比较, 找出乳腺癌癌前病变进展为乳腺癌的关键标志性基因, 将为乳腺癌早期诊断、预防治疗提供靶点。也将为临床应用中药对乳腺癌癌前病变人群进行体质的调节提供重要的依据。
癌相关基因 篇6
关键词：FHIT,PTEN,肝细胞癌,免疫组织化学
研究抑癌基因在肝癌中的表达及其与肝癌生物学特性的关系,以及抑癌基因之间的相关性,有利于揭示肝癌发生、发展的分子机制,为早期诊断和基因治疗提供新的靶点;有利于揭示抑癌基因与原发性肝癌临床病理学指标和预后的关系。目前,联合检测FHIT和PTEN基因在肝细胞癌(HCC)组织中的表达的相关研究较少,本研究应用免疫组化方法检测FHIT和PTEN基因在HCC组织中的表达,结合临床探讨HCC的发生、发展及其与FHIT及PTEN蛋白表达的关系,以及两者可能存在的协同作用。
1 材料与方法
1.1 材料
随机抽取哈尔滨医科大学附属肿瘤医院2004~2006年经手术治疗的44例HCC患者的存档标本作为实验组,其中,男30例,女14例;年龄31~72岁,平均52岁;术前均未行放、化疗,其中39例患者经信件或电话随访。HBsAg阳性30例;抗-HBc阳性2例;血清AFP水平阳性27例;分化程度按Edmondson标准[1]:Ⅰ级10例,Ⅱ级14例,Ⅲ级16例,Ⅳ级4例;TNM临床分期按文献标准[2]:Ⅰ期8例,Ⅱ期28例,Ⅲ期8例。另取6例肝血管瘤术后组织及4例因胆道手术切除的部分正常肝组织标本作为对照组。所有标本均经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋,4μm厚连续切片。
1.2 实验方法
1.2.1 试剂
兔抗人FHIT多克隆抗体、小鼠抗人PTEN单克隆抗体、鼠抗人P27蛋白单克隆抗体和PV-6000二步法免疫组化检测试剂盒均为即用型产品,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2 免疫组化操作
按PV-6000试剂盒说明书进行。染色步骤:组织切片常规脱蜡、水化;3%H2O2去离子水孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶,PBS缓冲液冲洗;分别滴加兔抗人FHIT多克隆抗体、小鼠抗人PTEN单克隆抗体,室温过夜,PBS缓冲液冲洗,2 min×3次;滴加通用型IgG抗体(Fab段)-HRP多聚体,室温孵育20 min,PBS缓冲液冲洗,2 min×3次;应用DAB溶液显色;蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。同时用PBS代替一抗作为染色的阴性对照,用已知的染色阳性切片作阳性对照。
1.3 结果判断标准
1.3.1 FHIT结果判定
参考文献报道的方法观察FHIT蛋白的分布及阳性率[3]。先按染色强度打分:0分为无色;1分为浅黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色。再按阳性细胞所占百分比打分:0分为阴性;1分为阳性细胞数≤10%;2分为11%~50%;3分为51%~75%;4分为>75%。以染色强度与阳性细胞百分比的乘积[0~4分为免疫反应阴性(-);4~8分为阳性(+);9~12分为强阳性(++)]来确定FHIT蛋白的表达情况。1.3.2 PTEN结果判定PTEN阳性表达为棕黄色颗粒。每张病理切片随机选取5个视野,每个视野计数100个细胞,共500个细胞,计算PTEN阳性细胞所占比例,<10%为阴性(-),10%~50%为低表达(+),>50%为高表达(++)。
以上检测由两位不知患者临床资料的病理科医师采用盲法独立检测,结果取平均值。
1.4 统计学方法
分类资料根据样本理论频数用χ2检验或Fisher确切概率法,等级资料相关性检验采用Spearman等级相关分析,经SPSS 12.0软件分析,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 FHIT在HCC及正常肝组织中的表达
FHIT蛋白定位于正常肝细胞和阳性病例肿瘤细胞的胞质和胞核中,呈粗大棕黄色颗粒(图1~3)。44例HCC组织中FHIT蛋白表达的阴性率为38.6%(17/44)。10例正常肝组织中FHIT蛋白表达均呈强阳性(图4)。与正常肝组织比较,HCC组织FHIT蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),见表1。随病理分级增加,FHIT蛋白表达阴性率升高,差异有统计学意义(P<0.05);随肿瘤病程进展(TNM分期),FHIT蛋白表达阴性率升高,差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤直径不同(≤5 cm和>5 cm),其FHIT蛋白表达阴性率差异也有统计学意义(P<0.05),而在AFP水平、HBsAg(+)和有无包膜组,其蛋白表达阴性率差异无统计学意义(P>0.05),见表2。
2.2 PTEN在HCC及正常肝组织中的表达
PTEN阳性定位于癌细胞胞质及胞核(图5~7)。44例HCC组织中PTEN蛋白表达的阴性率为47.7%(21/44)。10例正常肝组织中PTEN蛋白表达均呈强阳性(图8)。与正常肝组织比较,HCC组织PTEN蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),见表1。随病理分级增加,PTEN阴性率升高,差异有统计学意义(P<0.05),而在TNM分期、血清AFP水平、肿瘤直径、HBsAg(+)和有无包膜组,其阴性率差异无统计学意义(P>0.05),见表2。
2.3 FHIT与PTEN在HCC组织中表达的相关性
本研究分析了FHIT与PTEN蛋白表达在HCC组织中的相关性,结果表明,在PTEN呈阴性表达的21例HCC标本中有12例FHIT亦呈阴性表达,FHIT和PTEN的阴性表达率之间差异有统计学意义(P<0.05),经Spearman等级相关分析,两者呈正相关(rs=0.427,P<0.01),即FHIT高表达,PTEN高表达;FHIT低表达,PTEN低表达。见表3。
2.4 FHIT与HCC患者术后生存率的关系
进入实验的44例HCC患者中,39例患者进行了术后生存情况随访,结果表明,FHIT呈阳性表达者术后1、3年生存率分别为80.8%(21/26)和34.6%(9/26);阴性表达者术后1、3年生存率分别为38.5%(5/13)和23.1%(3/13),FHIT阳性和阴性表达者的术后1、3生存率比较,差异有高度统计学意义(P<0.01),而PTEN呈阳性表达者术后1、3年生存率分别为81.8%(18/22)和36.4%(8/22);阴性表达者术后1、3年生存率分别为47.1%(8/17)和23.5%(4/17),PTEN阳性和阴性表达者的术后1、3年生存率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。
3 讨论
FHIT是1996年Ohta等[4]利用外显子捕获法在人类染色体3p14.2区域克隆的一个新的基因。在正常情况下,FHIT存在于大多数正常细胞中。研究发现,多种肿瘤组织中FHIT蛋白表达频发地降低或丢失,并发现与FHIT基因转录及缺失有关,且该蛋白有肿瘤抑制特点和很强的诱导细胞凋亡的能力[5],提示FHIT基因为多种肿瘤的抑癌基因[6]。
本研究提示,HCC组织中FHIT蛋白的阴性表达率显著高于正常肝组织,说明FHIT表达的缺失与HCC的发生密切相关,FHIT基因缺失在HCC的发病过程中起重要作用。Zhao等[7]研究发现,64.3%(9/14)的肝癌细胞系存在FHIT基因的低表达;免疫染色发现,50%(5/10)的肝癌细胞系中无FHIT蛋白的表达;原位杂交发现,29.4%(10/34)的肝癌组织中存在FHIT基因第5外显子的缺失,61.5%(8/13)的肝癌细胞系中存在LOH或染色体转位。赵坡等[8]研究发现,肝细胞癌FHIT表达阴性者为29/83例(34.9%),缺失者为50/83例(65.1%)。本研究结果显示,肝细胞癌表达阴性率为17/44例(38.6%),与国内外研究结果较一致。在有FHIT基因异常转录的癌组织中,检测到FHIT基因表达不同,可能是因为癌组织中存在大量间质成分,也可能与癌组织的异质性有关,还有可能是癌变途径不同,提示在细胞癌变过程中,不同阶段可能存在不同的基因突变,即细胞癌变是一个多基因参与、多阶段进行的过程。本研究结果中,肝细胞癌组织病理学分级为Ⅰ~Ⅱ级的FHIT蛋白的表达阴性率低于Ⅲ~Ⅳ级者,差异有统计学意义(P<0.05),说明FHIT蛋白表达减少与癌组织分化程度有一定的相关关系。本研究结果显示,FHIT基因缺失与HCC的临床分期及肿瘤直径密切相关,说明FHIT基因缺失对HCC的分子生物学行为有重要影响,它的异常表达与肝癌的演化及侵袭进程密切相关,FHIT蛋白表达下调的肿瘤细胞更具有恶性表型和恶性行为,且病程发展越到晚期,FHIT基因改变越显著。这与国外关于结直肠癌和乳腺癌的研究一致;而FHIT表达在AFP水平、HBsAg(+)和有无包膜组,其阴性率差异无统计学意义。本研究还分析了FHIT的蛋白表达与HCC术后生存期的关系,说明FHIT阳性表达的原发性肝癌患者生存期明显比FHIT阴性表达组长。因此,FHIT可以作为原发性肝癌的预后指标之一。
PTEN是1997年由Stick等3个研究小组分别发现的一种抑癌基因,被认为是继p53基因后另一个改变较为广泛、与肿瘤发生关系密切的抑癌基因,它是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,它的突变与许多肿瘤有关,包括前列腺癌、乳腺癌、脑肿瘤、肝癌、膀胱癌和甲状腺癌等[9]。
对PTEN与HCC的相关性研究,尤其是对其在HCC中的蛋白表达的研究较少。本研究结果表明,PTEN在癌组织中的阴性表达率与在正常肝组织中的阴性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05),本研究中,47.7%的阴性表达率低于Whang等[10]发现的PTEN在蛋白水平上有55.56%(5/9)表达减少或缺失以及周旭等[11]得出的PTEN mRNA和PTEN蛋白在HCC组织中的阴性率为58.62%(34/58)和55.17%(32/58),可能与本研究应用单克隆抗体有关。本研究从蛋白水平揭示了HCC组织中存在PTEN表达异常、较高的PTEN蛋白表达阴性率,说明PTEN基因的失活在HCC组织的发生、发展过程中可能起重要作用。本研究表明,病理分级在Ⅰ~Ⅱ级PTEN蛋白的表达阴性率低于Ⅲ~Ⅳ级者,差异有统计学意义(P<0.05)。恶性程度越高的HCC组织中,PTEN蛋白表达阴性率越低,提示PTEN蛋白表达与HCC的恶性程度有一定的关系。该特点具有一定的临床病理意义,即检测PTEN蛋白在HCC组织中的表达可以辅助判断HCC的进展程度,评估预后,指导综合治疗。而在TNM分期、血清AFP水平、肿瘤直径、HBsAg(+)和有无包膜组,其阴性率差异无统计学意义。
Frank等[12]的研究表明,低水平表达PTEN蛋白的肿瘤患者比相对高水平表达PTEN蛋白的肿瘤患者具有显著的预后不良。本研究结果也表明PTEN阳性表达的原发性肝癌患者生存期明显比PTEN阴性表达组长,表明PTEN可以作为HCC的预后指标之一,对协助病理科医师进行诊断有一定的参考意义。
癌相关基因 篇7
关键词：半枝莲多糖,HepA瘤细胞,C-myc基因,N-ras基因
半枝莲别名并头草,狭叶韩信草、牙刷草,为唇形科植物半枝莲[Scutellaria barbata D.Don]的干燥全草[1]。其全草入药,性辛、苦、寒,入肺、肝、肾,具有清热解毒、活血化瘀、抗毒蛇咬伤的作用[2]。其化学成分主要含黄酮类、多糖、昌醇、有机酸、生物碱及其它类成分[3]。半枝莲现代研究及临床证明,半枝莲具有良好的抗癌活性,常与其他中药联合复方治疗原发性肝癌等消化道肿瘤、肺癌及子宫颈癌等妇科肿瘤[4],但其单味药的抗肿瘤作用及其作用机制尚不清楚,是一种有待于人们进一步研究和开发利用的抗肿瘤药。癌基因N-ras的表达产物为分子量21KD的G蛋白,癌基因C-myc的表达产物为分子量62KD的核内蛋白,许多实验证实在肝癌等人类恶性肿瘤都有C-myc与N-ras mRNA高水平表达[5]。2007年10月～2008年6月,我们研究应用原位杂交技术和免疫组化方法检测半枝莲多糖(Scutellaria barbata polysaccharides,SBPS)对HepA瘤细胞N-ras、C-myc基因表达的影响,以进一步探讨半枝莲多糖抗肿瘤的分子生物学作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
昆明种小白鼠(20±2)g,雌雄各半,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 瘤株
由黑龙江肿瘤研究所引进,以腹水传代。无菌取腹水,以0.2ml/只接种于小鼠右侧腋窝下。
1.3 主要试剂及仪器
N-ras、C-myc原位杂交检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品;DEPC和原位杂交专用盖玻片为Sigma公司产品;SP免疫组化检测试剂盒和DAB染色试剂盒为北京中山生物工程公司产品;C-myc、N-ras抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品;半枝莲多糖粉针剂由本教研室制备;猪苓多糖注射液为连云港正大天晴制药有限公司产品;OLYKMPUS显微镜;多媒体彩色病理图文分析系统。
1.4 分组
将接种后的小鼠随机分成三组:半枝莲多糖组、猪苓多糖组及荷瘤对照组。接种6h后,各组(空白对照组除外)注射给药0.15ml/只,荷瘤对照组腹腔注射NS,猪苓多糖组以5mg/kg肌注,半枝莲多糖组按50mg/kg腹腔注射,连续10d,直到荷瘤对照组肿瘤达到1g以上,于末次给药24 h后处死小鼠,剥离肿瘤组织。
1.5 原位杂交法mRNA测定
取瘤组织经10%多聚甲醛固定、石蜡包埋5μm切片。常规脱蜡至水,3%H2O2室温孵育10min,蒸馏水洗两次,滴加胃蛋白酶消化15min,PBS洗3×5min蒸馏水洗1次,然后滴加预杂交液37℃3h,滴加杂交液加盖原位杂交专用盖玻片37℃过夜,30～37℃2×SSC洗2×5min,0.5×SSC洗15min,0.2×SSC洗15min。滴加封闭液37℃30min后滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60min,PBS洗4×5min,再滴加SABC37℃20min,PBS洗3×5min后滴加生物素化过氧化物酶37℃20min,PBS洗4×5min后DAB染色、苏木素复染、常规脱水、中性树胶封片。观察结果,显微摄影,运用多媒体彩色病理图象分析系统分析。
1.6 免疫组化法蛋白测定
取瘤组织经常规固定、石蜡包埋5μm切片。石蜡切片后常规脱蜡至水,3%H2O2室温孵育10min,PBS浸泡,抗原微波修复。正常山羊血清封闭,加1:50稀释的抗体孵育过夜,PBS洗后加生物素标记的二抗,再用PBS洗后加辣根酶标记链酶卵白素,PBS洗后DAB染色、苏木素复染、常规脱水、中性树胶封片。观察结果,显微摄影,运用多媒体彩色病理图象分析系统分析。光镜下观察细胞浆中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,每个标本在高倍镜下(400×)观察不重叠的2个视野,采用图像分析仪计数阳性细胞数,取平均值。
1.7 统计学处理
所得数据组间比较采用方差分析。
2 结果
2.1 半枝莲多糖对HepA瘤细胞中N-ras基因表达的影响
半枝莲多糖组和猪苓多糖组中N-ras基因mRNA量和蛋白表达量均非常显著低于荷瘤对照组(P<0.01),半枝莲多糖组N-ras基因mRNA量和蛋白表达量与猪苓多糖组比较没有显著性差异(见表1)。
与荷瘤对照组比较*P<0.05**P<0.01
2.2 半枝莲多糖对HepA瘤细胞中C-myc基因表达的影响
半枝莲多糖组和猪苓多糖组中C-myc基因mRNA量和蛋白表达量均非常显著低于荷瘤对照组(P<0.01),半枝莲多糖组C-myc基因mRNA量和蛋白表达量与猪苓多糖组比较没有显著性差异(见表2)。
与荷瘤对照组比较*P<0.05**P<0.01
3 讨论
现代分子生物学研究认为,肿瘤的发生与癌基因的激活及抗癌基因的失活密切相关,且肿瘤的形成是两种以上癌基因激活的结果。在转染实验中,有时使用一种癌基因不能使被转染的细胞转化,必须使用两种以上癌基因转染才会使细胞转化。例如单独使用ras或myc癌基因都不能使大鼠胚胎成纤维细胞转化,但是联合使用ras和myc两种癌基因,就可使之转化。有人以小鼠前列腺为模型,如将ras或myc癌基因单独导入,只能诱发癌前损伤,myc造成器官的增生,而ras则导致血管发育异常的表型,当ras与myc共同转染时,则出现明显的癌生长。这与化学致癌的二个阶段颇为相似,ras癌基因相当于启动作用,而myc的作用与促癌作用相似[6]。
林月珍[7]等通过研究大鼠实验性肝癌早期阶段N-ras和C-myc的表达,发现N-ras和C-myc基因的表达主要见于绝大多数分化较差的癌前变异肝细胞中,这一结果表明,N-ras和C-myc基因的表达与大鼠实验性肝癌的癌前病变密切相关,可能参与癌前肝细胞的增殖和恶性转化,在肝细胞癌变过程中两者可能起协同作用。
研究发现[8],大鼠肝癌癌前病变中C-myc和N-ras的表达,结果发现从早期异常增生的小肝细胞和噬碱性肝细胞增生灶,到增生结节和腺瘤,均有C-myc和N-ras的过表达,且两者随病变的进程呈表达增加趋势,表明C-myc和N-ras的活化与大鼠肝细胞癌变有关,并直接参与诱导癌前病变的形成。
本实验结果表明,半枝莲多糖能够同时降低小鼠HepA瘤细胞中N-ras和C-myc两个癌基因的mRNA和蛋白的量,说明半枝莲多糖可影响小鼠HepA瘤细胞中N-ras和C-myc两个癌基因的协调表达。提示半枝莲多糖的抑瘤作用途径不是单一的而是多方面共同作用来达到其抗瘤功效。在前期工作中已证实半枝莲多糖还能抑制HepA瘤细胞增殖及调节白介素等细胞因子表达,因此说明半枝莲多糖可能通过协调调节癌基因与抑癌基因的表达来实现其抑瘤作用的。半枝莲多糖无毒无害,国内资源十分丰富,如果能加强开发应用于临床,可望成为有效的抗癌、防癌的治疗和保健制剂。
参考文献
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癌相关基因 篇8
1 资料与方法
1.1 研究对象
肿瘤标本来自我院实验中心建立的胰腺癌模型裸鼠30只,雌雄各半,饲养于我院SPF级动物实验室。该鼠肿瘤经性质鉴定证实保留原肿瘤生物学特性,模型稳定,具有良好的研究基础。饲养3~4周时,可见并能触及肿瘤,继续饲养至肿瘤体积100~200 mm3。将30只肿瘤鼠分成3组,每组10只,也是雌雄各半,分别为空白组、对照组与实验组。
1.2 RNA干扰抑制DNMT基因体系的建立
选择Panc-1胰腺癌细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中,于37℃、体积分数5%CO2条件下培养,培养液中含青霉素、链霉素各10 U·ml-1。DNMT1 siRNA、GAPDH的序列由美国Ambion公司设计和合成,其中DNMT1 siRNA正义链:5'-GGAUGAGA AGAGACGUAGATT-3';反义链:5'-UCUACGUCUCUUC UCAUCCTG-3'。在细胞转染培养中,加入含有DNMT1siRNA 10μg·μl-1的转染液,行RT-PCR检测干扰对DNMT1的沉默效率。
1.3 处理方法
空白组:腹腔注射普通细胞培养液50 mg·kg-1。对照组:腹腔注射普通常规RNA干扰载体细胞培养悬浮液50 mg·kg-1。实验组:腹腔注射RNA干扰DNMT1 siRNA载体细胞培养悬浮液50 mg·kg-1。3组都连续给药15 d。
1.4 观察指标
肿瘤体积:所有模型鼠在处理前后进行肿瘤体积的测定,计算各组裸鼠肿瘤体积,用游标卡尺测量肿瘤最大径(a)和最小径(b),取平均值,绘制肿瘤生长曲线。
裸鼠体质量:所有模型鼠在处理前与处理后进行裸鼠体质量的测定。
肿瘤瘤质量:所有模型鼠在药物干预结束后处死小鼠,迅速将肿瘤组织完整剥离取出,测定瘤质量。
原癌基因表达:将剥离的肿瘤组织立即用10%福尔马林固定,石蜡包埋、5μm切片,进行免疫组化染色,AFP、Ki-67均为即用型鼠抗人单克隆抗体,效价比为1∶500,操作方法按照Envision(一步法)操作。根据各抗原表达部位即阳性表达部位,对各组肿瘤的不同检测指标分别选择视野良好的10个高倍视野(×400),用进行免疫组化阳性相对表达量计算与测定。
1.5 统计学处理
选择SPSS 14.0统计软件进行统计学分析,计量数据采用均数±标准差表示,组间多重比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成瘤情况
对肿瘤模型鼠进行观察,肿瘤结节明显、瘤体不规则、没有破溃与坏死。肿瘤生物学特性稳定,准确复制了原肿瘤组织学和遗传学等特性。
2.2 肿瘤生长曲线比较
实验中所有肿瘤小鼠均生长良好,无小鼠死亡,进食、饮水正常,未出现明显消瘦等表现。不过在第3天后,各组肿瘤生长开始出现变化,实验组肿瘤生长曲线平缓,但未停滞;空白组与对照组生长较快,曲线陡直。干预后各组瘤体积比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。
图1 不同组别的肿瘤生长曲线比较Fig 1 Comparison of different groups of tumor growth curve
2.3 裸鼠体质量与瘤质量的变化
经过干预后,3组处理前的裸鼠体质量差异无统计学意义;处理后实验组的体质量明显低于其他两组,同时瘤质量也明显低于其他两组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
通过病理分析,空白组与对照组的肿瘤表面血管丰富,色泽红润(图2a、b)。实验组的肿瘤体积明显缩小,表面浅黄色,未见肿瘤转移灶,可见部分细胞核固缩、裂解,出现凋亡(图2c)。
2.4 原癌基因表达分析
处理后实验组的AFP与Ki-67的相对表达量都明显低于对照组和空白组(均P<0.05)。见表2。
表1 两组处理前后的裸鼠体质量与瘤质量的变化(±s)Tab 1 Nude body weight and tumor weight change in three groups before and after treatment(±s)
g
3 讨论
肿瘤的发生是一个涉及多种肿瘤基因功能改变的多步骤过程,肿瘤抑制基因的功能失活为细胞的恶性转化所必须[9]。分子靶向治疗是现代肿瘤治疗领域中的最新发展方向之一,其相对手术、放疗和化疗三大传统治疗方法而言,更具有针对性,更能有效地选择并杀死肿瘤细胞,可有效抑制肿瘤细胞转移、侵袭,也能调控抑癌基因和原癌基因的表达;同时对于肿瘤血管再生、细胞增殖与凋亡信号转导途径也有一定的影响[10]。
a.空白组;b.对照组;c.实验组
图2 不同组别处理后的肿瘤组织在HE染色下(×100)的表现Fig 2 Different groups of tumor tissues treated under the HE staining of the performance(×100)
表2 3组处理后的原癌基因表达分析(±s)Tab 2Gene expression analysis of the original cancer treated groups(±s)
DNA甲基化是一种在原核和真核生物基因组中常见的复制后修饰,参与体内多种重要生理过程。当前DNA甲基化涉及的甲基化酶主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3等,这些DNMTs对于哺乳动物的生长发育是十分重要的,DNMT可能成为一个重要的分子靶标,在疾病的治疗和预防中发挥重要作用[11]。肿瘤细胞中DNA甲基化状态的改变涉及DNMTs在细胞内的催化作用,并且DNMTs本身作为一种作用因子和其他活性蛋白的相互作用同样对肿瘤细胞DNA甲基化状态产生影响[12]。研究显示,在肿瘤形成的早期,DNMTs的过高表达能够引起肿瘤抑制基因的DNA高甲基化,从而导致表达抑制、肿瘤的形成。并且在不同类型的肿瘤组织中,DNMTs表达水平具有明显的差异性[13]。
由于高度甲基化而导致的抑癌基因转录失活并不改变基因本身的序列,因此恢复基因的正常甲基化状态,可以重新激活抑癌基因的功能[14]。RNA感染技术是近年来发展起来的一项新技术,能够靶向目的基因降低或消除其mRNA表达水平,以关闭或抑制异常表达的基因。miRNA-148a在结肠癌、食管癌和胰腺癌等肿瘤中都有明显下降,转染miRNA-148a mimics后Hep G2的侵袭力和增殖力都明显下降,DNMT1可能为miRNA-148a的靶基因之一[15]。我们建立了RNA干扰抑制DNMT基因体系,结果显示处理后实验组的体质量与肿瘤体积明显低于其他两组,同时瘤质量也明显低于其他两组,表明实验组能明显抑制肿瘤生长,差异均有统计学意义(P<0.05)。当前也有研究表明转染反义DNMT1基因真核表达载体,能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,并促进凋亡的发生[16]。还有学者发现,转染DNMT1 siRNA重组质粒能在体外抑制膀胱癌细胞BIU-87细胞生长,促进细胞凋亡发生[17]。
DNA甲基转移酶活性的高低是DNA甲基化模式的确定因素,特定的甲基化模式需要有活性的DNMT来维持,抑制DNMT活性的部分会导致甲基化模式的改变。不过在特定肿瘤发生和发展中,特定肿瘤可能有它自己独特的导致肿瘤发生的甲基化模式。而且在体内和体外试验中,它们可能也是不同的。本研究空白组与对照组的肿瘤表面血管丰富,色泽红润。实验组的肿瘤体积明显缩小,表面浅黄色,未见肿瘤转移灶,可见部分细胞核固缩、裂解,出现凋亡,表明在体内实验中也具有同样的效果。
研究已经表明肿瘤的形成、生长、浸润和转移的关键是肿瘤的新生血管化,而肿瘤血管的形成是一个极其复杂过程,这一过程有许多种相关原癌基因的参与[9]。AFP可以作为多数肿瘤的特异性标志物,在临床上常被用来作为诊断和监测的指标。在最近对恶性肿瘤的研究中发现Ki-67基因呈过度表达状态,同时也有研究证实通过对卵巢癌进行免疫组织化学染色,发现其在全部此肿瘤中呈阳性表达[10]。本研究实验组的AFP与Ki-67的相对表达量都明显低于对照组与空白组(P<0.05),表明实验组对于一些原癌基因的表达有抑制作用。
总之,DNA甲基化与DNA甲基转移酶催化发生密切相关,甲基转移酶的异常激活和表达与肿瘤发生和发展密切相关。RNA干扰抑制DNMT基因在裸鼠肿瘤的应用能抑制原癌基因表达,抑制肿瘤生长与体质量增加,从而有利于发挥抗肿瘤作用。
摘要：目的:探讨RNA干扰抑制DNMT基因对小鼠肿瘤体积和原癌基因表达的影响。方法:将30只胰腺癌模型裸鼠平均分为空白组、对照组与实验组,空白组腹腔注射普通细胞培养液50 mg·kg-1,对照组腹腔注射转染空载体细胞培养悬浮液50 mg·kg-1,实验组腹腔注射转染RNA干扰DNMT1 siRNA载体细胞培养悬浮液50 mg·kg-1,均连续注射15 d。结果:胰腺癌模型裸鼠的肿瘤结节明显、瘤体不规则、没有破溃与坏死,肿瘤生物学特性稳定。实验组肿瘤生长曲线平缓,但未停滞;空白组与对照组肿瘤生长较快,曲线陡直,处理后各组体积比较差异有统计学意义(P<0.05)。3组处理前的裸鼠体质量差异无统计学意义,处理后实验组的体质量明显低于其他两组;同时处理处死后实验组的瘤质量也明显低于其他两组,实验组肿瘤生长明显受抑制,差异均有统计学意义(P<0.05)。处理后空白组与对照组的肿瘤表面血管丰富,色泽红润;实验组的肿瘤体积明显缩小,表面浅黄色,未见肿瘤转移灶,可见部分细胞核固缩、裂解,出现凋亡。免疫组化分析结果显示处理后实验组的AFP与Ki-67的相对表达量均明显低于对照组与空白组(P<0.05)。结论:RNA干扰抑制DNMT基因在裸鼠肿瘤的应用能抑制原癌基因表达,抑制肿瘤体积与体质量的增加,从而有利于发挥抗肿瘤作用。
癌相关基因 篇9
1 资料与方法
1.1 一般资料
40例癌及癌旁组织标本取自我院2007年12月~2008年6月间术后病理确诊为肾透明细胞癌的患者,术前均未进行任何抗肿瘤治疗,行肾癌根治术,分别取肿瘤组织及肿瘤外正常组织(经病理证实无肿瘤组织)。标本切除后经过甲醛固定,石蜡包埋,做成切片备用。另外20例癌及癌旁正常组织切除后,立即放入液氮中备用。40例中男25例,女15例,年龄32~80岁,中位年龄56岁。UICC临床分期:Ⅰ期~Ⅱ期31例,Ⅲ期~Ⅳ期9例。Fuhrman病理分级:G1~G2级23例,G3~G4级17例。所有病例术前均未行放疗或化疗。
1.2 实验方法
1.2.1 试剂和仪器
Trizol裂解液、反转录及PCR试剂盒购自北京全式金有限公司。PCR扩增仪为美国MJ Research公司产品,ZF-4型多功能紫外投射反射分析仪为上海长明光学电子仪器厂产品。Pdcd4引物由博尚生物技术有限公司合成。其中Pdcd4扩增引物序列上游引物:5'-CAGTTGGTGGGCCAGTT-TATTG-3',下游引物:5'-AGAAGCACGGTAGCCTTA TCCA-3',产物片段长131 bp,对照β-actin引物序列上游引物:5'-TCGACAACGGCTCCGGCA-3'下游物:5'-CGTACATGGCTGGGGTGT-3',产物片段长372 bp。Pdcd4抗体及二抗试剂盒购自北京博奥森生物技术公司。
1.2.2 RNA的提取
逆转录及PCR扩增以Trizol试剂提取肾癌和正常肾组织总RNA,取标本100mg,将组织在液氮中磨碎,加入Trizol试剂进行匀浆,氯仿抽提,异丙醇沉淀,75%(体积分数)乙醇洗涤,干燥后,产物溶解于双蒸水中,经紫外分光光度仪测得组织RNA的光密度值。在经过DEPC处理过的EP管中加入样本RNA 1μL、Oligo(dT)1μL、2×ES Reaction Mix 10μL、Easy Script RT 1μL、再加去RNase水至20μL,快速离心混匀。逆转录条件:42℃孵育50 min,70℃加热15 min,所得cDNA产物用于PCR扩增。PCR过程:取2μL逆转录产物,加入上下游引物各1μL,2×Easy Tap PCR super mix 10μL,最后加无RNase水至20μL。循环条件:94℃5min,94℃30 s,56℃30 s,72℃45 s,共28个循环,最后72℃延长10 min。反应完成后取8μL PCR产物,加溴乙锭染色,进行琼脂糖凝胶电泳。使用紫外投射反射分析仪拍照。
1.2.3 免疫组织化学染色
采用免疫组织化学两步方法,按试剂盒说明书进行操作。步骤为石蜡切片常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,PBS漂洗3次;滴加3%的过氧化氢去离子水15 min,PBS漂洗3次;抗原修复后,滴加1∶100的兔抗人Pdcd4多克隆抗体,4℃冰箱孵育过夜;PBS漂洗3次,按照一抗的来源滴加二抗,37℃孵育30 min,PBS漂洗3次;然后加入DAB显色5 min,苏木素复染1 min;常规乙醇脱水,二甲苯透明,封片。
1.2.4 结果判定
PCR结果:将电泳图泳图像输入日本pansonic凝胶分析系统,应用1 D Image Analysis Software进行表达强度分析:以条带的大小及深浅判断Pdcd4基因和β-actin产物量,以平均吸光度×条带面积表示总的吸光度,以此代表mRNA的量,计算Pdcd4/β-actin吸光度比值。免疫组化:Pdcd4蛋白阳性信号定位于细胞质或细胞核内,以出现棕黄色颗粒为阳性细胞。400倍显微镜下每张切片计数10个视野,取阳性细胞数百分比的平均值。细胞不显色或阳性细胞数≤30%为阴性(-);阳性细胞数>30%为阳性(+)。
1.3 统计学方法
Pdcd4 m RNA表达水平以均数±标准差表示,其差异的显著性检验用配对t检验,P<0.05为差异有显著性,Pdcd4蛋白在肿瘤及正常组织的表达率的应用χ2检验。
2 结果
2.1 P CR结果
RT-PCR方法检测了20对肾癌及癌旁正常组织中Pdcd4 m RNA表达水平。癌旁正常组织Pdcd4m RNA表达水平为(0.83±0.27)(Pdcd4/β-actin),而肾透明细胞癌肿表达水平为(0.62±0.24),癌旁正常组织中Pdcd4 m RNA的表达高于肾脏透明细胞癌。(t=5.664,P<0.05)见图1。
2.2 免疫组织化学结果
免疫组织化学染色特异性良好,背景着色淡或不着色,癌旁正常组织中Pdcd4蛋白表达主要定位于胞浆。肾透明细胞癌中Pdcd4蛋白在癌旁正常肾脏组织中阳性表达率为90%(18/20),而肾透明细胞癌中Pdcd4蛋白阳性率为37.5%(15/40),肾透明细胞癌中Pdcd4蛋白表达水平显著低于癌旁正常组织(P<0.05)。见图2~4。
M:marker(700 bp)C:肾癌组织N:癌旁正常组织
2.3 Pdcd4蛋白表达与临床病理参数的关系
Pdcd4蛋白表达与肾癌恶性分化程度相关,G1~G2期Pdcd4蛋白表达阳性率56.5%(13/23),G3~G4期Pdcd4蛋白表达阳性率11.7%(2/17),Pdcd4蛋白在高分化肾脏透明癌表达率低于低分化癌,两者差异有显著性(χ2=8.35 P<0.05)。见附表。
3 讨论
程序性细胞死亡因子Pdcd4基因是1995年Shibahara等在小鼠体内发现的凋亡基因,定位于10q 24染色体,正常情况下Pdcd4蛋白表达于IL-12介导的NK细胞和T细胞,神经组织,肺脏,乳腺上皮细胞等。近来研究发现Pdcd4蛋白在多种肿瘤细胞中表达下降或缺失如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及胶质瘤等[1,2,3,4,5],并且与肿瘤的恶性程度及预后相关,CHEN等[5]研究了124例肺癌组织中Pdcd4蛋白的表达情况,其中84例存在不同程度的下降及缺失,提示Pdcd4蛋白的低表达与肿瘤的高恶性程度及预后不良密切相关,WEI等[3]研究发现Pdcd4在卵巢癌中的高表达与术后生存期的延长相关。目前对Pdcd4蛋白作用机制还不是很清楚,另外关于Pdcd4基因在肾癌中的表达情况国内外还未见有系统的报道。
Pdcd4蛋白可以通过作用于多种靶分子抑制肿瘤的生长,并且受多种上游基因的调节。包括白细胞介素,Mir-21、AKT、V-myb及TGF-1等。其中IL-12可以在转录水平使Pdcd4表达上调而IL-2,IL-15使其表达下调,YONG等[6]通过在宫颈癌里面转染Mir-21抑制剂后,发现Pdcd4蛋白表达上调,细胞凋亡增加,提示Mir-21可以促进肿瘤的发生并且抑制Pdcd4蛋白的表达。最近研究发现Pdcd4作用于多种下游基因,可以与翻译起始因子EIF4A竞争结合EIF4G,从而抑制翻译的起始,还可以阻断JNK激酶的磷酸化从而抑制C-JUN末端的磷酸化,继而抑制C-JUN的活化及依赖AP-1转录[7]。Pdcd4蛋白在抑制肿瘤的转移过程中可能发挥作用,YANG等[8]发现Pdcd4通过抑制MAKP1导致其下游基因C-JUN活化的抑制,可以抑制肿瘤的转移。另外Pdcd4的表达与MMP-2存在负相关,可能在侵袭和血管通透性中发挥重要的作用。
本实验研究发现Pdcd4 mRNA及蛋白在肾脏透明细胞癌中表达水平均低于癌旁正常组织,在蛋白水平差异更为显著。Pdcd4蛋白在癌旁正常组织中表达率为90%(18/20),而在肾脏组织中表达率只有37.5%(15/40),G1~G2期Pdcd4蛋白表达阳性率为56.5%(13/23)高于G3~G4期Pdcd4蛋白表达阳性率11.7%(2/17),低分化的肾透明细胞癌几乎未见Pdcd4蛋白的表达,以上结果提示Pdcd4蛋白可能参与了肾肿瘤的分化,Pdcd4蛋白的表达水平可以反映肾脏肿瘤恶性程度。PALAMARCHUK等[9]研究发现AKT是PI3信号传导通路中重要的抑制因子,能够调节Pdcd4蛋白的细胞亚定位,正常情况下Pdcd4蛋白主要表达于胞核,当周围环境改变或细胞恶性增值时,可以通过核输出信号转移到胞浆。本研究发现正常肾脏透明细胞癌组织中Pdcd4蛋白主要表达在胞浆,少部分位于胞核,大部分胞核染色深的细胞未见胞浆着色,这些结果与YONG等[6]在乳腺癌里检测Pdcd4蛋白的亚定位结果基本一致,进一步提示Pdcd4蛋白的亚细胞定位可能与肾癌的发生有密切的关系,笔者推测肾癌中Pdcd4蛋白的减少可能通过某种信号途径输入胞核,从而引起转录水平的代谢增强,增加Pdcd4蛋白的表达从而发挥肿瘤抑制的功能。研究亚细胞定位的调节将有助于进一步揭示Pdcd4基因的调控机制。JANSEN等[10]研究发现Pdcd4的高表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。通过向低表达Pdcd4的肾癌细胞系中转染正义Pdcd4使肿瘤细胞高表达Pdcd4蛋白后,可显著增强肿瘤细胞对化疗药物格尔德霉素的敏感性。针对肾癌对化疗药物的不敏感性,Pdcd4抑癌基因为肾癌的化疗提供了一个新的思路。本研究发现Pdcd4蛋白的表达水平跟肾透明细胞癌分化恶性程度相关,而与临床分期未见明显相关性,不排除跟样本量小,未得出阳性结果的可能性。
综上所述Pdcd4是一个与肾癌相关的抑癌基因。在肾癌中存在不同程度的表达下降或缺失。并与肾癌的恶性分化程度相关,Pdcd4不仅可以抑制肿瘤的发生发展,更有可能成为肿瘤治疗的新靶点,因此进一步研究Pdcd4基因的确切作用及其作用机制将有着重要的意义。
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