关键词：
肠毒素蛋白（精选五篇）
肠毒素蛋白 篇1
关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素C2,删除突变体,超抗原活性,可溶性表达
0 引言
作为超抗原家族中的重要一员,SEC2不需要经过抗原递呈细胞(APC)的递呈作用便能与APC外侧的主要组织相容性复合物Ⅱ分子(MHCⅡ)结合,而后SEC2的另一端与T细胞受体(TCR)的结合,形成MHCⅡ -SEC2-TCR复合物,激活T细胞并释放大量细胞因子[1,2]。通过这种作用,SEC2可对MHCⅡ 呈阳性的肿瘤细胞产生强大的杀伤作用[3],现已经被广泛地应用于抗肿瘤的研究中,并且以SEC2为主要成分的抗肿瘤药物“高聚生”在中国已经用于临床,疗效明显[4,5,6]。
在此基础上,人们对SEC2结构与功能的关系也进行了大量研究:晶体结构衍射和定点突变结果显示,SEC2的主要功能区集中于其蛋白分子中部的α3至α5结构域中,而SEC2氨基末端的两个α-螺旋(α1、α2)以及羧基末端的两个β-折叠(β11、β12)并不直接参与和MHCⅡ、TCR的结合[7,8],因此这两个区域对SEC2的生物学活性是否必须,并且究竟具有怎样的影响,这正是本研究所关注的重点。而关于这方面的研究,国内外目前未见报导。
为达到以上研究目的,本研究通过基因工程技术分别对SEC2的C、N末端进行删除突变,并对删除突变体的超抗原活性和可溶性表达能力进行检测。结果表明,各删除突变蛋白的超抗原活性较野生型SEC2均有不同程度的降低,而且N端的删除突变蛋白其超抗原活性降低幅度更大;无论是N端还是C端的删除都不影响其基因工程菌的相对表达量,但所有删除突变蛋白的可溶性表达能力均较野生型SEC2有不同程度的降低,而且删除了C端的突变蛋白几乎丧失了可溶性表达能力。因此推测SEC2的α1、α2区域对SEC2的超抗原活性影响较大,C端的β11、β12区域对SEC2的可溶性表达具有决定性的作用,而完整的SEC2分子对于维持其最大的生物学活性是必要的。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
大肠杆菌E.coli BL(DE3)由作者实验室保存;pET-28a表达载体购自 Novagen 公司;pET-28a-sec2由作者实验室研究人员构建[9];小鼠肝癌细胞Hepa1-6购买自中国科学院上海细胞库;6～8w的SPF级BABL/c雌性小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1.1.2 试剂
卡那霉素、IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)、MTT(四甲基偶氮唑盐)、DMSO(二甲基亚砜)均为Sigma公司产品;Pyrobest DNA聚和酶、EcoRⅠ限制性内切酶、XhoⅠ限制性内切酶和DL2000 Marker均为Takara公司产品;T4 DNA连接酶为Promega公司产品;蛋白中分子量Marker购自MBI Fermentas;Ni-NTA 亲和层析柱材料购自 Novagen 公司;胰蛋白酶为Gibico公司产品;酵母提取物和胰蛋白胨购自OXOID公司、琼脂糖胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购于北京博大泰克生物技术有限公司;引物合成和DNA测序由北京华大技术服务公司完成;野生型SEC2蛋白纯品由作者实验室表达纯化[9];其他化学试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.3 仪器
Universal Hood SN-75S型紫外凝胶成像系统购自美国BIO-RAD 公司;PTC-200型PCR仪购自美国MJ Research公司;NJ-2100型酶标仪购自美国InterMed公司。
1.1.4 培养基
细胞培养基:RPMI-1640 (美国Gibco)加10%的胎牛血清FBS(美国Hyclone);细菌培养基:LB培养基。
1.2 方法
1.2.1 SEC2删除突变体的构建
根据已知的SEC2氨基酸序列及三维结构,结合文献报导,本研究对SEC2 分子的N端和C端的部分氨基酸残基进行了删除,构建三种删除突变蛋白。突变蛋白的构建如图1所示。
将含有重组质粒pET-28a-sec2的工程菌接种于含60μg/ml的卡那霉素LB液体培养基培养过夜,取适量的菌液提取质粒DNA。以提取好的质粒DNA为模板,采用PCR技术扩增获得各删除突变体的基因(引物见表1)。目的片段使用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切并与表达载体连接,所得连接产物转化感受态细胞BL21(DE3)。使用含有60μg/ml卡那霉素的LB平板对阳性克隆进行筛选,所得阳性克隆进行测序。
a SEC2 氨基酸序列的定点删除;b 引物序列中划线部分代表EcoRⅠ和Xho Ⅰ的识别位点。a Specific amino acids deletion;b The underlined parts are the recognizing spots of EcoRⅠand XhoⅠ.
1.2.2 SEC2删除突变蛋白的表达与纯化
将测序结果正确的阳性克隆接种于含60μg/ml的卡那霉素LB液体培养基中,37℃震荡培养至菌液的OD 600到达0.6,加入终浓度为1mmol/L的诱导物IPTG,并30℃诱导表达4～5h。诱导表达结束后5 000g/10min离心收集的菌体,使用平衡缓冲液重悬并进行超声波破碎,所得破碎产物经12 000g/20min离心收集上清液。所得上清液经Ni离子亲和层析后得到各删除突变蛋白纯品,应用Brandford法对蛋白浓度进行测定。
1.2.3 SEC2删除突变蛋白免疫刺激活性的测定
无菌条件下使BABL/c小鼠脾脏过200目细胞筛,用红细胞裂解液处理和无血清RPMI1640清洗得到纯净的小鼠脾淋巴细胞,使用1640培养基(含10% FBS)调整细胞浓度为8×106细胞/mL,加入100μL/孔的细胞悬液至96孔细胞培养板中。各删除突变蛋白及野生型SEC2经梯度稀释后加入细胞悬液,使终浓度分别为1 000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml,并以空白培养基加入细胞悬液作为阴性对照,每个处理设3个复孔。37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养细胞72h后,在各处理中加入30μl/孔的5mg/ml的MTT溶液,培养4h后,2 000g/10min离心弃上清,使用120μl/孔DMSO溶解沉淀后,在酶标仪上以570nm测定波长和630nm的参比波长测定各实验孔的吸光值。以增殖指数(PI)表示刺激小鼠脾淋巴细胞增值能力。
PI=实验组吸光值/阴性对照组吸光值
1.2.4 SEC2删除突变蛋白体外抑瘤水平研究
将小鼠脾淋巴细胞经含10% FBS的1640培养基调整后,以5×105cells/well加到96孔细胞培养板中,将Hepa1-6肿瘤细胞以2.5×104cells/well加入各孔,各删除突变蛋白和野生型SEC2均以终浓度1 000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml加入各孔至终体积200μl。同时设淋巴细胞孔(加与实验孔等量的淋巴细胞和蛋白样品)、肿瘤细胞孔(仅加入与实验孔等量肿瘤细胞)及空白孔(仅加入200μl培养基)。以牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。各孔均设3个重复。37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养细胞72h后,在各处理中加入30μl/孔的5mg/ml的MTT溶液,培养4h后,2 000g/10min离心弃上清,使用120μl/孔DMSO溶解沉淀后,在酶标仪上以570nm测定波长和630nm的参比波长测定各实验孔的吸光值。各蛋白的抑瘤水平用抑瘤率表示。
抑瘤率(Tumor growth inhibition%)=100-[(实验孔-淋巴细胞孔)/(肿瘤细胞孔-空白孔)]×100
2 结果
2.1 SEC2删除突变蛋白的构建和表达
本研究采用PCR技术扩增获得了突变基因片段,最终构建了各删除突变蛋白重组表达载体,并经DNA测序确认构建成功。各突变基因PCR扩增结果如图2。
含有各删除突变体的工程菌经诱导表达后收集菌体,通过经超声波进行破碎,而后离心收集上清, 通过15%的SDS-PAGE电泳分析各突变蛋白的可溶性表达情况(图3), 使用BandScan软件进行灰度分析,结果见表2。蛋白总表达率计算公式为:突变蛋白表达总灰度/总蛋白表达灰度×100%;蛋白可溶性表达率计算公式为:突变蛋白可溶性表达灰度/突变蛋白表达总灰度×100%。该结果表明各删除突变体的总表达水平并无显著变化,但可溶性表达水平均较野生型有大幅度的降低。各删除突变蛋白的纯化使用亲和层析的方法。
M,蛋白质分子量标准;1、5、9、13分别为SEC1-220、SEC14-220、SEC2、SEC14-239经诱导前的总蛋白表达情况;2、6、10、14分别为SEC1-220、SEC14-220、SEC2、SEC14-239经诱导后的总蛋白表达情况;3、7、11、15分别为SEC1-220、SEC14-220、SEC2、SEC14-239包涵体蛋白的表达情况;4、8、12、16分别为SEC1-220、SEC14-220、SEC2、SEC14-239的可溶性蛋白表达情况。M,protein molecular marker;1,5,9,13:the total proteins of SEC1-220,SEC14-220,SEC2,SEC14-239 before induction;2,6,10,14:the total proteins of SEC1-220,SEC14-220,SEC2,SEC14-239 after induction;3,7,11,15:the inclusion expression of SEC1-220,SEC14-220,SEC2,SEC14-239;4,8,12,16:the soluble expression of SEC1-220,SEC14-220,SEC2,SEC14-239.
2.2 删除突变蛋白的体外免疫刺激活性检测
本研究使用MTT法检测不同浓度的各删除突变蛋白的体外免疫刺激活性。研究结果显示各删除突变蛋白体外刺激T细胞增殖活性均具有很好的剂量依赖性,但三种删除突变蛋白体外刺激T细胞增殖能力较野生型SEC2蛋白均有不同程度的降低(P<0.01),其中,删除N端的两种突变蛋白(SEC14-220、SEC14-239)的刺激T细胞增殖能力比只删除C端的SEC1-220有显著性降低(P<0.01)(图4)。
2.3 删除突变蛋白的体外抑瘤活性检测
本研究以MTT法检测各删除突变对Hepa1-6肿瘤细胞的杀伤作用。研究结果显示,与体外刺激T细胞增殖结果相似,各删除突变蛋白的抑瘤率较野生型SEC2蛋白都有不同程度的降低,而且删除N端的两种突变蛋白(SEC14-220、SEC14-239)的抑瘤率降低幅度更为明显(P<0.01)(图5)。
3 讨论
晶体结构分析和点突变研究结果显示,SEC2的N端对其超抗原活性具有精细的调控作用。其中SEC2的20、22及26位氨基酸是重要的TCR结合位点[10,11],47位的组氨酸是重要的MHCⅡ结合位点[12],24位的甲硫氨酸对超抗原活性却无显著影响[13]。以上的研究主要集中于SEC2的18-220位氨基酸,属于α3-螺旋到α6-螺旋之间的区域,而关于SEC2的N末端和C末端的研究相对较少。王小刚等人利用基因工程技术分别删除了SEC2的α1和α2之前的氨基酸片段,以检测这两段区域对SEC2生物学活性的影响,结果显示删除α1之前的氨基酸片段(1-11位氨基酸残基)不降低SEC2的超抗原活性,而删除α2之前的氨基酸片段(1-18位氨基酸残基)会显著降低SEC2的超抗原活性[14],暗示在SEC2蛋白分子的11-18位中存在着决定SEC2活性的关键位点。此外,Hoffmann Marcy L.等人发现删除了9-13位氨基酸残基的SEC1蛋白的超抗原活性不受影响[15]。
由于SEC2与SEC1有较高的同源性,前13位中仅存在2个氨基酸残基的差别,我们设计了删除了SEC2的1-13位氨基酸得到删除突变蛋白SEC14-239,并将其生物学活性与野生型SEC2进行比较。分析结果显示,SEC14-239的超抗原活性较野生型SEC2 有显著降低。这可能是因为SEC2的1-13段氨基酸序列上虽然没有涉及与TCR和MHCⅡ分子的结合区域,但由于其所形成的α2-螺旋被删除,影响了与之相邻的α3-螺旋的构象,而α3-螺旋是TCR结合的关键区域,其构象的改变可能会降低SEC2与TCR的亲和力,从而大幅度降低其超抗原活性。同理,删除了221-239位氨基酸有可能改变了SEC2上209-220位的α6-螺旋的构象,该区域包含了SEC2 与MHCⅡ分子的结合位点,构象的改变可能影响SEC2与MHCⅡ分子的结合。而SEC2作为一种MHCⅡ依赖型的超抗原,对MHCⅡ结合能力的下降势必造成其超抗原活性的下降。
删除突变蛋白的可溶性表达能力较野生型SEC2有大幅度降低,这可能是由于删除部分序列影响了SEC2的亲水基团的暴露,降低了其水溶性。此外,生物信息学软件分析结果显示SEC2的C末端分布着大量的亲水氨基酸,是其主要的亲水区域,删除这段区域可能造成整个分子亲水性的变化,并可能间接影响其在体外实验系统中超抗原活性的表现。
后续研究中,我们将采用蛋白质结构模拟软件和蛋白质结构分析技术,包括X射线晶体衍射和CD圆二色谱方法,准确分析N、C端删除后其空间构象的变化,解释影响其生物学活性的确切机制。
4 结论
肠毒素蛋白 篇2
关键词：产肠毒素性大肠埃希菌,耐热肠毒素基因,双重PCR,猪
产肠毒素性大肠埃希菌 (ETEC) 是引起婴幼儿、哺乳动物腹泻的重要病原菌, 以发生肠炎、肠毒血症为特征。ETEC 的主要毒力因子为耐热肠毒素 (ST) 、不耐热肠毒素 (LT) 以及定居因子 (CFAs) , 其中ST 和LT 是导致幼龄动物腹泻的直接致病因子。大肠埃希菌耐热肠毒素根据其生物学特性及致病性可分为STa和STb两类, 检测ETEC肠毒素对大肠埃希菌性腹泻病的诊断具有重要意义。试验目的是在基因水平上建立检测ETEC耐热肠毒素基因的新方法。
1 材料与方法
1.1 菌株
大肠埃希菌标准菌株C83902 (STb+, LT+) 、987P (STa+) , 购自中国兽药监察所;肠出血性大肠埃希菌EHEC EDL933、猪链球菌 (Streptcoccus) 、鼠伤寒沙门杆菌 (Salmonella typhimrium) 和猪肺疫巴氏杆菌 (Pasteurella pneumotropic) , 佛山科技学院预防兽医学广东省重点实验室保存;11株待检大肠埃希菌分离株, 分离自广东省佛山市各大猪场的仔猪黄白痢病料。
1.2 主要试剂
rTaq酶、蛋白酶K、dNTPs、 DL-2 000 Marker, 购自广州美津有限公司。
1.3 细菌培养及DNA模板的制备
将标准菌株和各分离株分别接种于5 mL LB液体培养液中, 37 ℃振荡培养16～18 h;取2 mL菌液离心, 弃上清液, 加入TE缓冲液567 μL、10% SDS 30 μL和20 mg/mL蛋白酶K 3 μL, 彻底混匀, 37 ℃孵育1 h;加入5 mol/L NaCl 100 μL和CTAB/NaCl溶液80 μL, 65 ℃孵育10 min;加入等体积氯仿/异戊醇 (24∶1) , 10 000 r/min离心4 min;取上清液, 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇 (25∶24∶1) , 15 000 r/min离心5 min;取上清液, 加入异丙醇, 将沉淀转入装有70%乙醇的离心管中;离心沉淀DNA, 去除上清液;真空干燥2 min;在干燥后的DNA中加入100 μL TE缓冲液, 混匀, -20 ℃保存, 备用。
1.4 引物的设计和合成
根据已发表的ETEC STa和STb基因序列, 以结构基因内的保守区段为目的片段, 用Primer Premier 5.0 软件设计了2对特异性引物, 预期扩增出的目的片段分别为182 bp和108 bp, 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 引物及长度序列见表1。
1.5 双重PCR反应体系的优化
优化后的双重PCR反应体系 (50 μL) 各成分分别为10×PCR Buffer 5 μL, dNTPs (0.2 mmol/L) 5 μL, 混合引物 (每种引物终浓度为0.5 μmol/L) 6 μL, DNA模板2 μL, rTaq酶 (2.5 U) 0.5 μL, 加dd H2O至50 μL。将以上PCR优化组分离心, 混合均匀后置PCR仪进行扩增。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s, 54 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共30个循环;72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。以灭菌超纯水为阴性对照。
1.6 双重PCR特异性试验
以C83902、987P标准菌株为阳性对照, 对EHEC EDL933、猪链球菌、鼠伤寒沙门杆菌和猪肺疫巴氏杆菌按上述优化条件进行双重PCR扩增, 鉴定其特异性。
1.7 双重PCR敏感性试验
将标准菌株C83902、987P于37 ℃振荡 (140 r/min) 培养15 h, 取培养菌液进行倍比稀释, 分别对10～1×105 cfu/mL不同稀释度的菌液按1.5条件进行PCR扩增, 测定双重PCR反应的敏感性。
1.8 双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定
采用常规琼脂糖凝胶电泳法进行电泳, PCR反应结束后取9 μL反应液, 加1 μL 10×Loading Buffer混匀后上样于1.6%琼脂糖凝胶 (120V、90 mA) 电泳20～25 min, 用凝胶成像系统记录结果。
1.9 ETEC标准菌株PCR产物的测序
取50 μL PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化及测序。
1.10 待检菌株的PCR检测
按照1.5优化的PCR方法对11株分离自广东省佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行双重PCR检测。
2 结果
2.1 双重PCR特异性试验结果 (见图1)
M.DL-2 000 Marker;1.C83902、987P标准菌株阳性对照组;2.EHEC EDL933;3.猪链球菌;4.鼠伤寒沙门杆菌;5.猪肺疫巴氏杆菌。
由图1可见, 除了标准菌株阳性对照组扩增出2条目的条带外, 其他均无条带。
2.2 双重PCR敏感性试验结果 (见图2)
M.DL-2 000 Marker; 1～5.菌液浓度为 1×105, 1×104, 1×103, 1×102, 10 cfu/mL。
对不同稀释度的标准菌株培养物按以上方法进行双重PCR检测, 结果该方法能检测到1×102cfu/mL的标准菌。
2.3 ETEC标准菌PCR产物的测序结果
PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序, 结果与GenBank报道的ETEC STa、STb基因的保守区序列 (M25607、M35586) 的相符度分别为98.3%和97.6%。
2.4 待检菌株双重PCR检测结果 (见图3)
M.DL-2 000 Marker;1, 3, 5, 6, 9. STa+; 2, 3. STb+; 3. STa+STb+;4, 7, 8, 10, 11. STa-STb-。
经双重PCR检测, 11个待检菌株中含有STa基因的5株、STb基因的2株, 其中同时含有STa、STb的基因1株。
3 讨论
ETEC是引起腹泻的主要致病菌, 它和一般大肠埃希菌用细菌培养和生化反应难以区分, 血清鉴定不够敏感和特异, 故主要依据检测肠毒素的有无来鉴定ETEC。目前, 常规检测猪源大肠埃希菌毒素的方法有兔回肠或仔猪小肠结扎试验、平板免疫溶血试验、Vero细胞测定法和ELISA法等, 但上述方法操作繁琐, 检测时间长。随着大肠埃希菌分子生物学研究的不断深入, 该菌的主要毒素基因相继被克隆和测序, 在此基础上应用许多分子生物学方法鉴定菌型和判定致病性, 如质粒分析方法、DNA指纹图谱法和聚合酶链式反应 (PCR) 等。应用该研究建立的PCR扩增系统, 通过检测毒素基因来检测ETEC, 不仅有较高特异性、敏感性, 而且操作简便, 为临床提供了一个更为快速、灵敏的测定大肠埃希菌耐热肠毒素基因的方法, 此法也可用于该病的流行病学调查。
肠毒素蛋白 篇3
由于以菌毛黏附素为抗原的疫苗不能预防带有其他菌毛或无菌毛ETEC的感染,预防效果并不理想[5]。目前,在养猪生产中对猪大肠杆菌性腹泻的防治方法主要是药物防治。由于抗菌药物的不合理使用,导致耐药菌株不断出现,临床疗效下降,同时还带来了诸如药物残留以及耐药菌对人的潜在危害等公共卫生问题;因此,生产中需要无残留、长期使用不会产生耐药菌株的抗毒素生物制剂用于该病的防治。卵黄抗体作为生物制剂已用于多种动物传染病的防治,许多学者对仔猪大肠杆菌腹泻卵黄抗体进行了有益的探索,但免疫原多选用菌毛,而不是直接引起仔猪腹泻的肠毒素[6,7,8]。
研究以LT和STa为抗原制备鸡卵黄抗体,旨在为研制仔猪大肠杆菌性腹泻的有效生物制剂提供科学的试验依据。
1 材料
1.1 菌株、质粒、试验动物
产肠毒素性大肠杆菌C83903(O141,LT+)、C83915(O9,STa+),购自中国兽医药品监察所;大肠杆菌DH5α、Rosetta,质粒p Cold I、p ET-28a-sumo,重组大肠杆菌Rosetta/p Mal-c4x-4esta,由东北农业大学动物医学学院传染病教研室保存;p MD18-T Simple载体,购自Ta KaRa公司;健康产蛋母鸡为8月龄海兰蛋鸡,由哈尔滨市郊区某养殖户常规饲养;昆明鼠、家兔,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
1.2 主要试剂
限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ、Bam HⅠ和DNA分子质量标准Trans2K DNA Marker、DNA聚合酶Easy Taq、2.5 mmol/L d NTPs、T4连接酶、蛋白质分子质量标准(Unstained Protein Molecular Weight Marker)、胶回收试剂盒,购自北京全式金生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鸡Ig G,购自北京博奥森生物技术有限公司。
2 方法
2.1 融合基因的构建
参照Gen Bank上发表的STa基因序列(登录号为M25607.1)和LTB基因序列(登录号为M17873.1)设计合成引物,序列见表1。
1)以大肠杆菌C83903的DNA为模板,P1/P2为引物,扩增elt B片段,51℃退火15 s,72℃延伸20 s。2)以1)中的扩增产物为模板,P1/A1为引物,扩增elt B-linker片段,51℃退火15 s,72℃延伸25 s。3)以2)中的扩增产物为模板,P1/A2为引物,扩增elt B-linker-esta片段,52℃退火15 s,72℃延伸30 s。反应体系(50μL)为:5×PS Buffer 10.0μL,dd H2O 32.5μL,d NTP 4.0μL,上、下游引物各1.0μL,模板1.0μL,Primer Star聚合酶0.5μL。4)以大肠杆菌C83903的DNA为模板,P3/P4为引物,扩增elt B-HA-TAA片段,59.4℃退火1 min,72℃延伸30 s,反应体系同上。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
参照参考文献[9]将3)和4)中的扩增产物分别插入p MD18-T中,转化感受态细胞DH5α,提取Amp抗性菌株的质粒进行PCR和双酶切鉴定,将阳性质粒送生工生物工程(上海)有限公司进行核苷酸序列的测定。
2.2 重组蛋白的表达
参照参考文献[9]将正确克隆elt B-esta融合基因的质粒与p ColdⅠ载体分别用Bam HⅠ和EcoRⅠ进行双酶切,回收酶切产物连接、转化感受态细胞Rosetta。将正确克隆elt B-HA融合基因的质粒与p ET-28a-sumo载体分别用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切,回收酶切产物连接、转化感受态细胞Rosetta。经PCR鉴定后选取阳性重组菌用IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。将鉴定正确的重组菌分别命名为Rosetta/p ColdⅠ-elt B-esta和Rossetta/p ET-28a-sumo-elt B-HA,表达的目的蛋白分别命名为重组蛋白LTB-STa和重组蛋白LTB-HA。
复苏重组大肠杆菌Rosetta/p Mal-c4x-4esta,用IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定,将鉴定正确的重组蛋白命名为重组蛋白4STa。以上重组蛋白的Western-blot分析均使用His标签单克隆抗体为第一抗体,HRP标记的羊抗鼠Ig G为第二抗体。
2.3 卵黄抗体的制备及提取
免疫原:将表达的重组蛋白LTB-STa切胶纯化后,调整蛋白浓度,以白油为佐剂充分乳化,用于免疫产蛋鸡[10]。
免疫:随机选取8只8月龄海兰蛋鸡,胸肌分点注射免疫,第1次免疫重组蛋白0.4 mg/只,第2次免疫0.6 mg/只,第3次免疫0.8 mg/只,每次免疫间隔2周,第2次免疫后2天收蛋。
卵黄抗体的提取:参照参考文献[10]采用氯仿法提取卵黄抗体。
2.4 卵黄抗体效价的检测
参照参考文献[11],分别以重组蛋白LTB-HA和重组蛋白4STa为包被抗原,以HRP标记的羊抗鸡Ig G为第二抗体,采用间接ELISA法测定卵黄抗体中抗LTB和STa的抗体效价。
2.5 中和试验
取大肠杆菌C83903和C83915分别接种于Honda产毒培养基中,37℃培养48 h,离心取上清液,为LT和STa。
参照参考文献[12]的方法,将3只家兔经外科手术取出小肠,自回肠末端开始结扎,每只兔肠管结扎5段,每段长5 cm,第1段注射含LT的大肠杆菌培养物上清液(阳性对照)1 m L,第2段注射含LT的大肠杆菌培养物上清液与卵黄抗体等体积混合液1 m L,第3段注射含LT的大肠杆菌培养物上清液与2倍稀释的卵黄抗体等体积混合液1 m L,第4段注射含LT的大肠杆菌培养物上清液与4倍稀释的卵黄抗体等体积混合液1 m L,第5段(阴性对照)注射灭菌生理盐水1 m L,然后将小肠放回纳腹腔,缝合腹壁。待家兔恢复知觉后,将其放回笼子,不喂食,24 h后麻醉处死,测量各肠段内肠液的体积(m L)和肠段的长度(cm),计算两者的比值,当比值大于或等于1.0时,判断为阳性。
选取4月龄性成熟昆明鼠,按雌雄比例为2∶1合笼饲养,7 d后取出雄鼠。待母鼠产仔后,随机选取9只3日龄的乳鼠分为3组,每组3只,进行灌胃试验,每只灌入量为100μL。第1组用含STa的大肠杆菌培养物上清液与10倍浓缩的卵黄抗体等体积混合液灌胃(试验组),第2组用含STa的大肠杆菌培养物上清液灌胃(阳性组),第3组用灭菌生理盐水灌胃(阴性组),室温放置4 h后麻醉处死,分别称量肠管与剩余尸体的重量,计算乳鼠的肠重/剩余尸重(用G/C值表示)。当G/C值≥0.09时,判断为STa阳性;G/C值≤0.083时,判断为STa阴性;当G/C值在0.83~0.09之间为可疑[13]。
3 结果
3.1 融合基因的构建结果
按2.1所述方法进行融合基因的扩增,PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,分别扩增出与预期大小相符的基因片段,见图1。测序结果表明,最后扩增出的融合基因序列与设计序列相同,完成了融合基因elt B-linker-esta和elt B-HA-TAA的构建。
3.2 重组大肠杆菌的鉴定结果
取按2.2所述方法构建的重组大肠杆菌PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明,分别扩增出与预期大小相符的片段(见图2),证明重组菌Rosetta/p ColdⅠ-elt B-esta和Rossetta/p ET-28a-sumo-elt B-HA的构建成功。
3.3 重组蛋白的表达与鉴定结果
将重组菌Rosetta/p ColdⅠ-elt B-esta、Rossetta/p ET-28a-sumo-elt B-HA和Rosetta/p Malc4x-4esta的诱导表达产物分别超声后离心,取上清液和沉淀用10%蛋白胶进行SDS-PAGE分析,结果表明,Rosetta/p ColdⅠ-elt B-esta和Rossetta/p ET-28a-sumo-elt B-HA表达产物以包涵体的形式存在,Rosetta/p Mal-c4x-4esta表达产物以上清液形式存在,分子质量与预期大小相符;Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白均与相应抗体发生免疫反应,证明重组蛋白得到了表达。见图3。
1.以大肠杆菌C83903为模板,P1/P2为引物扩增的elt B片段(309 bp);2.以elt B片段为模板,P1/A1为引物扩增的elt B-linker片段(332 bp);3.以elt B-linker为模板,P1/A2为引物扩增的elt B-linker-esta片段(393 bp);M.DNA分子质量标准。4.以大肠杆菌C83903为模板,P3/P4为引物扩增的elt B-HA-TAA片段(365 bp)。
M.DNA分子质量标准;1,2.以重组菌Rosetta/p Cold I-elt B-esta为模板,P1/A2为引物扩增的elt B-linker-esta片段(393bp);3.以重组菌Rossetta/p ET-28a-sumo-elt B-HA为模板,P3/P4为引物扩增的elt B-HA-TAA片段(365 bp)。
3.4 卵黄抗体效价的检测结果
分别以0.375μg/m L纯化的重组蛋白LTB-HA、0.75μg/m L纯化的重组蛋白4STa作为包被抗原,采用间接ELISA方法测定卵黄抗体中抗LTB和STa的抗体效价,结果表明,三免后4天抗LTB的抗体效价达到1∶8 647,抗STa的抗体效价达到1∶768,三免10天后抗LTB和抗STa抗体效价逐渐下降,见图4。
3.5 中和试验结果
3.5.1 兔肠袢试验结果
结果表明:第1段(阳性对照)的积液体积/肠段长度值为2.420±0.047(>1.0);第5段(阴性对照)的积液体积/肠段长度比值为0.230±0.058(<1.0);第2段积液体积/肠段长度比值为0.880±0.047(<1.0),说明卵黄抗体可以中和LT毒素的毒性作用;第3段积液体积/肠段长度比值为1.310±0.025(>1.0,<2.420±0.047),第4段积液体积/肠段长度值为1.980±0.081(>1.0,<2.42±0.047),说明稀释后的卵黄抗体不能完全中和毒素。
A1(SDS-PAGE):1.蛋白质分子质量标准;2.未经IPTG诱导的Rosetta/p Cold I-elt B-esta菌液;3.IPTG诱导后p Cold I空载体菌液;4.IPTG诱导后重组蛋白LTB-STa(上清液);5.IPTG诱导后重组蛋白LTB-STa(包涵体)(18.0 ku)。A2(Westernblot):1.重组蛋白LTB-STa(18.0 ku),His单抗为一抗,HRP-羊抗鼠Ig G为二抗。B1(SDS-PAGE):1.蛋白质分子质量标准;2.未经IPTG诱导的Rossetta/p ET-28a-sumo-elt B-HA菌液;3.IPTG诱导后p ET-28a-sumo空载体菌液;4.IPTG诱导后重组蛋白LTB-HA(上清液);5.IPTG诱导后重组蛋白LTB-HA(包涵体)(13.1 ku)。B2(Western-blot):1,2.重组蛋白LTB-HA(13.1 ku),HA单抗为一抗,HRP-羊抗鼠Ig G为二抗。C1(SDS-PAGE):1.蛋白质分子质量标准;2.未经IPTG诱导的Rosetta/p Mal-c4x-4esta菌液;3.IPTG诱导后p Malc4x空载体菌液;4.IPTG诱导后重组蛋白4STa(上清液)(57.1 ku);5.IPTG诱导后重组蛋白4STa(包涵体)。C2(Western-blot):1.重组蛋白4STa(57.1 ku),His单抗为一抗,HRP-羊抗鼠Ig G为二抗。
3.5.2 乳鼠灌胃试验结果
乳鼠灌胃4 h后处死,计算出了每组乳鼠的G/C平均值,见表2。
结果表明,卵黄抗体能够中和STa的毒力作用。
4 讨论
由于长期在动物生产中不合理使用抗生素而导致的畜产品药物残留和细菌耐药性已在许多研究中得到证实[14,15,16]。2006年1月份,欧盟全面禁止食品动物使用抗生素促生长饲料添加剂。鉴于上述情况,探索抗生素替代物用于疾病的预防和治疗显得尤为重要。在诸如无机酸、有机酸、低聚糖、益生菌、中草药提取物和抗体作为替代物的研究中,由于抗体的高特异性而被认可,其中卵黄抗体因其生产成本低、易提取和产量高等优势而在抗人和牛轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌、牛冠状病毒等肠道病原感染的预防和治疗上进行了研究[17]。
LT和STa是ETEC的主要致病因子,而STa缺乏免疫原性[18],不能单独用作免疫原制备特异性抗体。LTB具有良好的免疫原性,其抗体可阻断与GM1受体结合。同时,ELTB基因与外源基因融合表达后可发挥分子内佐剂作用[19]。本研究从用elt B和esta融合表达的重组蛋白LTB-STa免疫产蛋鸡所制备的卵黄抗体中不仅获得了抗LTB抗体,而且还获得了抗STa抗体,进一步证明了LTB在重组蛋白中的分子内佐剂作用。动物试验证明,所制备的卵黄抗体对LT和STa具有中和作用,为应用抗肠毒素卵黄抗体防治幼龄动物ETEC性腹泻提供了科学的试验依据。然而,抗体检测结果表明,LTB的免疫效价很高,而STa的免疫效价较低,这可能与STa本身缺乏免疫原性有关。如何进一步增强STa的免疫原性,提高卵黄抗体中抗STa抗体效价和中和作用,使抗肠毒素卵黄抗体制剂真正替代抗生素还需更加深入的研究。
注:-表示G/C值小于0.083,小肠没有发生毒素引起的病理反应;+表示G/C值大于0.083,小肠发生了毒素引起的病理反应。
摘要：为了研究用不耐热肠毒素B亚基(LTB)和耐热肠毒素(STa)的融合蛋白制备鸡卵黄抗体的方法及其中和作用,试验将LTB和STa的编码基因串联并在大肠杆菌中表达获得了重组蛋白,以重组蛋白为免疫原免疫8月龄海兰蛋鸡制备了卵黄抗体,分别用兔肠段结扎试验和乳鼠灌胃试验进行了卵黄抗体对不耐热肠毒素(LT)和STa的体内中和试验。结果表明:用LTB和STa融合蛋白免疫产蛋鸡可诱导产生抗LTB和STa的卵黄抗体,其中抗LTB效价最高可达1∶8 647,抗STa效价最高可达1∶768;卵黄抗体对LT和STa均有中和作用。说明用融合蛋白作为免疫原制备的卵黄抗体具有抗LT和STa的生物学活性,对仔猪大肠杆菌性腹泻的临床治疗有潜在的应用价值。
肠毒素蛋白 篇4
1 材料与方法
标本为剩余食物(凉拌菜、炒米饭、鱼香肉丝、火腿肠)共8份,患者呕吐物10份,厨房操作间菜刀、案板及厨师手涂抹物10份、粪便10份,合计38份。7.5%NaCI肉汤、甘露醇高盐琼脂、B-P琼脂培养基及肠道培养基由路桥公司购置。BioMerieuX Vitek生化系统购自法国生物梅里埃中国有限公司。肠毒素鉴定分型ELISA试剂盒由R—BiopharmGmbh,Darmstadt,Germany生产。药物敏感纸片系路桥公司购置。
按送检要求,依照中华人民共和国国家标准,食品安全国家标准—检验方法(微生物学部分)GB 4789-2010进行分离与鉴定。药敏试验采用世界卫生组织推荐的改良Kirby-Bauer(K-B)法,用MH培养基,按美国NCKLS药敏试验纸片扩散法法规判定结果[1]。
2 现场环境调查及病人临床表现
现场调查该餐店内外卫生状况极差。无餐具洗涤、消毒设施,无冷藏设备。店主是一外来人口,食品卫生知识缺乏,属无卫生许可证经营。食材分别装在露天的不锈钢盛器里,现场苍蝇很多,无防蝇设施。
中毒者表现剧烈恶心呕吐,并伴有腹泻、腹痛,体温略升高。潜伏期最短的1 h,最长的5 h,平均2.5 h。经对症治疗后,均较快恢复,无死亡病例。据潜伏期短且剧烈恶心呕吐等临床表现,重点检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。
3 实验室检查及结果
在38份标本中,从剩余食品凉拌菜、炒米饭、火腿肠及5份呕吐物、5份粪便和案板样品中共检出金黄色葡萄球菌8份和A、C 2种混合型肠毒素。其他肠道致病菌均未检出。分离菌在7.5%NaC1肉汤中呈浑浊生长,血平板上菌落呈金黄色,略大、突起,表面光滑不透明,周围有溶血环。在B-P琼脂平板上,菌落为圆形,中间呈黑色,凸起,挑起时有黏液感,湿润,外层有一透明环,菌落周围有浑浊薄带。将商品冻干血浆,每安瓶中加0.5 ml灭菌生理盐水,完全溶解后,加入0.3 ml 24 h肉汤培养物混匀,于37 ℃培养,结果均在6 h内凝固,血浆凝固酶试验为阳性。分离菌生化特征:甘露醇(+)、触酶(+)、氧化酶(-)、卵黄反应(+)、硝酸盐还原(-)、动力(-)、血浆凝固酶(+)、VP(-)。葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)鉴定结果见表1。经ELISA试剂盒检验,结果为A、C 2种型别肠毒素,呈现阳性反应。幼猫试验:以分离的菌株肉汤培养物转种血平板,36 ℃烛缸培养72 h,取该菌用灭菌NS制成浓菌液,离心5 min(离心半径=15 cm)后取上清液置沸水浴中煮沸30 min。按幼猫体重1 ml/100 g量,注入幼猫(事先喂过少量食物)腹腔。同时用灭菌NS接种另一只幼猫作对照。4 h左右实验猫出现呕吐、竖毛等中毒症状,对照猫无症状。即幼猫肠毒素试验阳性。
用MH琼脂做15种抗生素敏感试验。结果对头孢唑啉、头孢哌酮、妥布霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素、氟嗪酸敏感。对头胞他啶、头孢噻肟、头孢西丁、头孢三嗪、氨苄青霉素、羧噻吩青霉素、棒酸、四环素、氨曲南耐药。从药敏试验结果分析认为,当金黄色葡萄球菌对头孢菌素类的体外药敏试验为“敏感”时,应引起注意,因为已证实体内活性试验头孢菌素类对金黄色葡萄球菌无效[2]。
我们从标本中检出8株金黄色葡萄球菌。其形态、染色、培养特征、生化结果完全相同,且肠毒素试验阳性。可判定本次食物中事由产肠毒素的金黄色葡萄球菌引起。
注:GPI—人葡萄糖6磷酸异构酶。
4 讨论
食物中毒事件时间紧迫,影响面广,为争取时间,我们根据经验对食物中毒样品先直接涂片G染色镜检找占每个视野半数以上优势菌为检测提供思路。无需大范围增菌及分离,对节省时间、减轻压力、选择用药、节约试验耗材等都起到积极作用。本法针对呕吐物、可疑食物等杂菌较少的检样更有实际意义。
在现代化大都市飞速发展的今天,城市流动人口已经占据相当大的比重,无证小餐馆也数不胜数,给我们管理造成很大困难。一旦其食品原材料受到污染,就可能引起食物中毒事件。在此,我们提醒各级卫生行政监管部门,要建立健全卫生管理制度,不断完善基层卫生监督网络,加强对食品行业的监管力度,把好食品卫生质量关,加强对街头摊点的卫生监督、监测力度。要加强食品安全、卫生知识的培训与宣传工作,提高从业人员对食品安全与食品卫生的重视程度,特别要进一步提高农村群众及外来人口的卫生知识,减少食物中毒事件的发生。
关键词：金黄色葡萄球菌,肠毒素,食物中毒,检测
参考文献
[1]陈民钧.美国临床实验室标准化研究所2005年版有关药敏试验标准化更新要点[J],中华检验医学杂志,2005,9(4):612-614.
肠毒素蛋白 篇5
关键词：肠脂肪酸结合蛋白,肠破裂,高龄
肠破裂是腹部外科最常见的急腹症,也是严重影响患者生命的急危重症之一[1,2]。肠破裂发生后,由于肠腔内容物进入无菌腹腔,引发腹膜化学性腹膜炎发生。临床多见严重腹痛、腹胀,查体见典型的腹膜刺激征及移动性浊音发生。但对于老年、高龄患者,由于患者刺激阈值提高以及神经感觉功能减退,患者多缺乏典型的症状及体征。肠破裂一旦发生,发病诱因不明显,临床症状不典型,严重影响患者的诊断与治疗,提高老年肠破裂患者临床早期诊断发现率一直是临床研究目标[3]。肠脂肪酸结合蛋白是敏感反应肠壁粘膜缺血坏死的生物学指标之一[4]。课题研究目的试分析血清肠脂肪酸结合蛋白在高龄肠破裂患者中临床诊断价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象:
选择2011年10月至2015年2月疑诊为肠破裂患者80例,男42例,女38例,年龄(69.03±10.28)岁。入组标准:①患者存在急腹症临床症状;②患者拟诊断肠破裂,临床查体或者影像学检查结果有阳性体征或可以患者;③患者年龄>60岁。排除标准:①入院6h内即确诊肠破裂行手术治疗者;②严重肝、肾功能不全;③严重心衰及急性心脑血管疾病者。本研究得到我院医教科批准,治疗获得患者或者家属的知情同意。
1.2 研究方法:
入组患者依据手术结果分为肠破裂组29例,男15例,女14例,年龄(68.37±11.26)岁。非肠破裂组51例,男26例,女25例,年龄(69.46±11.58)岁。患者入院后分别于0h、6h、12h、18h、24h、36h利用酶联免疫吸附法检测血清肠脂肪酸结合蛋白水平。比较2组患者血清脂肪酸结合蛋白水平动态变化差异。分析肠脂肪酸结合蛋白水平对于高龄肠破裂患者临床诊断价值。
1.3 检验指标:
血清肠脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,IFABP)水平检查采用酶联免疫吸附试验,检查当日晨空腹抽取肘静脉血5mL,3000r/min离心沉淀,弃上清液,-20℃冰箱保存备检。将稀释后的标准样品及血清加样,按试剂盒操作流程进行,紫外分光光度计测量各孔吸光度,计算对应样品浓度,试剂盒购自美国麦迪公司。
1.4 统计学分析:
应用SPSS 20.0软件进行分析,计量资料采用()表示,比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 2组患者临床基础资料比较:
2组患者性别、年龄、基础病史、肠破裂原因资料差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
2.2 不同时间点血清脂肪酸结合蛋白水平动态比较:
肠破裂组患者血清肠脂肪酸结合蛋白水平0h、6h、12h、18h、24h、36h分别为[(117.93±32.56) ng/mL)、(165.84±34.69) ng/mL)、(238.57±41.23) ng/mL)、(254.27±36.3) ng/mL)、(288.90±33.27) ng/mL)、(308.45±49.17) ng/mL)];非肠破裂组患者血清肠脂肪酸结合蛋白水平0、6、12、18、24、36h分别为[(87.43±23.16) ng/mL)、(89.04±14.28) ng/mL)、(93.06±13.27) ng/mL)、(99.05±16.35) ng/mL)、(104.25±16.49) ng/mL)、(97.35±17.64)ng/mL)]。肠破裂组患者血清肠脂肪酸结合蛋白水平呈逐渐上升变化,而非肠破裂组患者血清肠脂肪酸结合蛋白水平同时间点比较,明显降低,水平变化平缓,呈缓慢下降趋势。以血清肠脂肪酸结合蛋白等于286 ng/mL为截断值,诊断肠破裂的灵敏度、特异度为56.7%;69.2%,ROC曲线下面积分别0.74(95%CI为54%～81%),见图1,2。
3 讨论
肠腔是营养吸收器官,也是腹腔内最大脏器。肠黏膜是营养物质吸收的主要部位,肠腔内生长各种菌群,为体内天然,最大菌库。肠道内寄生细菌影响患者食欲、消化、吸收能力以及对于抵抗感染及自身免疫平衡具有重要作用。其肠腔内菌群的平衡依赖于肠壁完整性屏障保护[5]。肠破裂后,肠壁天然结构屏障破坏,患者肠腔内容物外溢,进入无菌腹腔内,毒素的迅速吸收,引发机体多脏器功能衰竭[6]。目前肠破裂已成为腹部外科最棘手的并发症之一。特别对于老年、高龄患者,由于患者肠破裂症状以及诱因不明显,患者对于疼痛等刺激阈提高,造成临床发病隐匿,发病时间过长,临床多以重症感染性休克等症状被发现。一旦临床症状典型,患者多迅速进入危重状态。对于可疑患者,如何早期发现肠破裂线索,提高早期诊断时间成为救治肠破裂的主要方向之一[7,8]。肠脂肪酸结合蛋白是肠黏膜缺血坏死的早期生物学标志物。有研究表明其水平高低与肠壁黏膜缺血坏死关系密切[9,10]。
研究结果发现肠破裂组患者血清肠脂肪酸结合蛋白水平呈逐渐上升变化,而非肠破裂组患者血清肠脂肪酸结合蛋白水平同时间点比较,明显降低,水平变化平缓,呈缓慢下降趋势。以血清肠脂肪酸结合蛋白等于286 ng/mL为截断值,诊断肠破裂的灵敏度、特异度为56.7%;69.2%,ROC曲线下面积分别0.74 (95%CI为54%～81%)。相关资料研究表明[11]血清肠脂肪酸结合蛋白是低分子胞液蛋白,正常情况下,外周血清内检测不出。当肠壁黏膜缺血坏死时,肠上皮黏膜细胞完整性及通透性破坏,胞液内肠脂肪酸结合蛋白释出,通过周围肠壁毛细血管以及乳糜管吸收进入血液循环。肠破裂是是以肠黏膜损伤为基础的“结构性诊断名称”。其临床诊断标准具有延迟性以及滞后性,肠黏膜的缺血损伤发展至肠壁坏死、穿孔需要一定的时间。血清肠脂肪酸结合蛋白水平与肠壁黏膜损伤程度的相关性有助于肠破裂处于功能性损伤状态即给予临床及早提示与处理依据,有助于避免患者病情进一步发展。
课题研究结果表明动态观察肠脂肪酸结合蛋白水平变化有助于高龄肠破裂患者临床诊断。由于课题研究目标主要患者人群集中在各种诱因促发的自发性肠破裂患者中,其发病病理过程符合肠黏膜慢性缺血-缺氧-损伤-穿孔-破裂的过程。其研究成果应用于其他原因导致的肠破裂损伤中是否适用,还待研究进一步证实[12]。
参考文献
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