磷酸二酯酶

关键词：

磷酸二酯酶（精选四篇）

磷酸二酯酶 篇1

磷酸二酯酶 (Pde) 在植物病原菌G蛋白信号通路过程中发挥着重要作用, 其功能主要在于将c AMP转化为5’-AMP以及将c GMP转化为5’-GMP, 从而实现对于信号传递的调节。c AMP、c GMP均是生物体内普遍存在的感受外界激素和营养信号的第二信使[5], 在生物生命活动中发挥着重要的生化作用。现已明确酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中含有2个Pde[6]。另外, 在模式真菌盘基网柄菌[7]以及致病真菌稻瘟菌[8]、禾谷炭疽菌 (韩长志, 另文已发) 等诸多真菌中已见相关报道。通过深入探析该酶所具有的生物学, 有利于更加深入了解病菌信号传导以及致病机制。

本研究创新之处在于利用模式生物S.cerevisiae中已经报道的Pde, 通过在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对分析, 以及通过Pde关键词搜索, 获得与C.higginsanum中的Pde, 并通过对该蛋白的氨基酸序列进行保守结构域分析、理化性质、疏水性分析以及亚细胞定位等生物信息学分析, 同时, 基于上述发现的Pde氨基酸序列, NCBI在线进行同源序列搜索, 通过遗传关系分析, 以期为进一步开展同属于炭疽菌属但其基因组序列尚未公布的其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

根据S.cerevisiae S288c中含有的2个Pde氨基酸序列, 利用炭疽菌属蛋白质数据库在线Blastp比对[9], 所有参数均选择默认值, 获得C.higginsanum中所含有的典型Pde, 同时, 通过输入“Phosphodiesterases”、“PDEase”等关键词, 在上述数据库中进行Pde检索;另外, 利用NCBI明确该菌中Pde蛋白质登录号信息。

1.2 方法

1.2.1 保守结构域预测

利用SMART网站在线实现[10]。

1.2.2 蛋白质理化性质及疏水性预测

利用Ex Pa Sy在线进行预测[11]。

1.2.3 蛋白质转运肽及信号肽预测

利用Target P 1.1 Server、Signal P 3.0 Server在线分析分别实现转运肽的预测[12]、信号肽的预测[13]。

1.2.4 蛋白质二级结构及跨膜区结构预测

采用PHD、TMHMM 2.0 Server在线分析分别实现二级结构[14]、跨膜区结构预测[13]。

1.2.5 亚细胞定位分析

利用Prot Comp v9.0实现[15]。

1.2.6 系统进化树构建

通过在NCBI中Blastp同源搜索, 获得来自于不同物种的同源蛋白质序列, 并利用Clustal X[16]进行多种比对, 采用MEGA 5.2.2中邻近法构建系统进化树, 同时, 各分支之间的距离计算采用p-distance模型, 系统可信度检测采用自举法重复1 000次进行[17]。

2 结果与分析

2.1 C.higginsanum中存在2个Pde

结果显示, C.higginsanum中各存在一个与酿酒酵母Pde1、Pde2同源的序列, 其ID为CH063_03640.1、CH063_10269.1, 同时, 通过保守域分析, 结果显示, Sc Pde1与CH063_03640.1具有相似的保守结构域, Sc Pde2与CH063_10269.1具有相同的HDc保守结构域 (图1) , 基于此, 对CH063_03640.1、CH063_10269.1进行命名为Ch Pde1、Ch P-de2 (表1) 。此外, 利用NCBI保守结构域分析, 结果表明, Sc Pde1与Ch Pde1均含有PDEase_Ⅱsuperfamily保守结构域;Sc Pde2与Ch Pde2均含有HDc保守结构域 (结果未显示) , 这与通过SMART分析结果一致。

2.2 氨基酸组成情况

结果表明, S.cerevisiae与C.higginsanum中的Pde在不同类别的氨基酸数量以及所占比例方面均存在着较大的差异, 具体而言, S.cerevisiae中Sc P-de1、Sc Pde2所含最高比例的氨基酸均为Leu, 所占比例分别为11.70%、11.60%;所含最低比例的氨基酸为均为Trp, 所占比例分布为1.10%、1.50% (韩长志, 另文已发) ;C.higginsanum中Ch Pde1、Ch Pde2所含最高比例的氨基酸分别为Ala、Leu, 所占比例分别为9.90%、9.40%;所含最低比例的氨基酸分别为Met、Trp, 所占比例均为0.80% (表2) 。

2.3 理化性质分析

结果显示, C.higginsanum中Pde理论等电点范围在5.5~6.5, 属于酸性范围内 (表3) 。上述Pde在所预测的半衰期较为一致, 均为30 h, 其稳定性系数尽管不同, 但数值均大于40, 同时, 总平均亲水性 (GRAVY) 均为负值, 上述结果表明C.higginsanum中的Pde属于亲水性不稳定性蛋白 (表3) 。

2.4 转运肽和信号肽特征

结果表明, C.higginsanum中Pde1、Pde2均显示定位于分泌途径上, 其预测值分别为0.930、0.740, 而对于预测可靠性方面所处的概率有所不同 (表4) 。无论是根据经网络方法进行计算, 还是根据隐马可夫模型进行计算, 上述2个Pde均不含有信号肽 (结果未显示) 。

*:1~5, 数值越大可靠性越差。1表示其概率为大于0.8, 2表示其概率在0.6~0.8, 3表示其概率在0.4~0.6, 4表示其概率在0.2~0.4, 5表示其概率为小于0.2。

2.5 C.higginsanum中Pde均为亲水性蛋白

通过Protscale预测分析, S.cerevisiae和C.higginsanum不同物种间以及同一物种不同Pde间在亲水性最强氨基酸残基、位置以及疏水性最强氨基酸残基、位置方面均存在着较大差异, 有待于今后进一步进行试验验证。

对Ch Pde1、Ch Pde2进行疏水性、亲水性数值进行统计分析, 结果显示, 上述Pde均属于亲水性蛋白, 这与通过GRAVY计算所得结果一致 (表5、图2) 。

2.6 亚细胞定位特征

结果表明, S.cerevisiae与C.higginsanum中的Pde定位不尽相同, 前者中的Sc Pde1、Sc Pde2定位相同, 均定位于细胞质中 (韩长志, 另文已发) , 而后者中的Ch Pde1、Ch Pde2分别定位于细胞质、细胞核中 (表6) 。由于Pde作为G蛋白信号通路上重要的效应酶, 一般在细胞质中发挥作用, 这与Sc Pde1、Sc P-de2、Ch Pde1定位于细胞质中相一致, 然而, 预测Ch Pde2定位于细胞核, 其功能有待于后期进一步研究。

2.7 二级结构分析

结果显示, S.cerevisiae与C.higginsanum中的Pde在二级结构组成方面具有较大的差异性, 具体而言, Sc Pde1含有近乎相同比例的α螺旋, β折叠结构和无规则卷曲三种形式组成, Sc Pde2则具有较高比例的α螺旋, 所占比例为65.0%;Ch Pde1、Ch P-de2均具有较高比例的无规卷曲, 所占比例分别为44.0%、48.0%, Ch Pde2具有较高比例的α螺旋 (图3) 。

2.8 系统进化树分析

以Ch Pde1、Ch Pde2为基础序列, 通过在NCBI中Blastp同源性搜索, 获得与上述Pde具有一定同源性的不同物种的氨基酸序列, 根据其同源关系数值, 选择8条序列, 并结合Sc Pde1、Sc Pde2序列, 利用MEGA 5.2.2进行系统进化分析, 结果表明, Ch P-de1与禾谷炭疽菌 (Colletotrichum graminicola) Cg P-de1亲缘关系较近, 并与同属于炭疽菌属的其他真菌Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum gloeosporioides聚为一类;与此相同, Ch Pde2也与属于与Sc Pde1同源关系与Ch Pde2亲缘关系较近, 并与同属于炭疽菌属的真菌聚为一类 (数据未显示) 。

3 讨论

炭疽菌属真菌包括约600个种, 可以侵染超过3 200种单子叶植物和双子叶植物[18]。目前, 生产上对该属病菌的防治药剂主要有多菌灵、甲基托布津、苯菌灵等, 特别是与C.higginsanum同属的C.gloeosporioides对多菌灵的抗药性受到广泛关注[19—21], 而生产上尚未有新的有效药剂用于炭疽病的防治。

前人关于Pde的研究多见于对其进行抑制剂的筛选工作[22,23]、基因功能[8]等方面。随着对G蛋白信号通路众多效应酶研究的不断深入, 有关磷酸二酯酶的研究已在酵母、稻瘟病菌等诸多真菌中相关研究, 而对于危害十字花科植物造成严重损失的C.higginsanum的Pde研究尚不够深入, 有待于进一步开展以Pde亚细胞定位、基因功能等相关基础研究。

4 结论

磷酸二酯酶 篇2

磷酸二酯酶 (Phosphodiesterase, PDE) 是一类催化水解c AMP和c GMP, 使其转变为失去活性的单核苷酸的关键酶, 是c AMP和c GMP水解的唯一途径[7]。PDE的活性是调控细胞内信号转导的强度和持续时间的重要因素。至今已鉴定出PDE有11个家族, 共30余种。PDE4D是PDE中的大家族, 是保持c AMP稳态的重要调节者, 是炎症和免疫细胞的主要PDE同工酶, 是PDE家族中最大的一群, 其有四个亚型 (PDE4A、4B、4C、4D) , 各种亚型又有多种次亚型[8]。PDE4D在体内广泛表达, 主要分布于各种炎症细胞内, 包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞和上皮细胞等。PDE4D为c AMP特异性PDE, 其作用为水解细胞内c AMP水平, 而后者是一种有多种生物学作用的分子, 其作用之一是影响血管细胞的增殖和移行。因此, PDE4D可能通过其水平和活性的变化影响细胞内c AMP水平, 进而可能参与动脉粥样硬化进程[9]。为此, 本研究选取Gretarsdottir等[10]于2003年首次证实PDE4D基因单核苷酸多态性与IS相关的研究中关联显著的2个位点, 即SNP 83、SNP 87展开研究, 探讨PDE4D基因多态性与IS患者MRA结果的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例组:选取2010年10月~2012年11月间内蒙古医科大学附属医院 (以下简称“我院”) 神经内科住院的经MRI检查诊断为IS患者245例, 男135例, 女110例;年龄40~87岁, 平均 (62.88±8.75) 岁。进一步对IS患者颅外 (颈动脉及脊椎基底动脉) 及颅内动脉血管开展MRA检查, 将其分为MRA结果异常与MRA结果正常两组。患者间均无亲属关系。无脑卒中病史的对照组:选取同时期我院体检中心健康体检者, 共计208例, 男118例, 女90例;年龄43~85岁, 平均 (61.21±7.56) 岁。均行神经查体、头颅MRI/A及血管超声检查, 排除既往卒中、TIA、血管狭窄等症状。患者间均无亲属关系。

入选标准:病例组患者经MRI/A检查, 证实颅内、外动脉存在狭窄≥50%或闭塞;存在与病变侧血管供应区明显相关的临床症状与体征特点;符合国际疾病分类第9版 (ICD 9) 的IS诊断标准, 均属于急性卒中治疗试验 (TOAST) 中的动脉血管粥样硬化引起的IS。

排除标准:存在与脑卒中相关的心源性栓塞及主动脉夹层、大动脉炎、心肌梗死、甲状腺功能紊乱、脑静脉窦血栓症等患者。

脑卒中的临床风险因素:包括高血压[收缩压≥140 mm Hg及舒张压≥90 mm Hg (1 mm Hg=0.133 k Pa) , 高血病史及药物治疗情况]、糖尿病 (空腹血糖≥106 mg/d L, 餐后2 h血糖≥200 mg/d L及药物治疗情况) 、血脂异常情况 (血脂指标、冠状动脉疾病) 、脑卒中病史、吸烟及饮酒情况。

所有研究对象均于研究课题开始前, 签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集及MRA检查

抽取受试对象空腹血液标本, 全自动生化分析仪进行血常规、血糖、血脂、肝肾功能等项目检测, 并且详细询问病史及临床相关危险因素。MRA检查内容如下:受试对象1周之内采用1.5 T磁共振扫描器对颅内及颅外动脉血管造影检查。扫描序列采用较厚3D层块容积 (颅内动脉3层块, 颅外6层块) , 26 ms脉冲重复时间 (TR) 、6.9 ms回波时间 (TE) 和20°反转角 (FA) 。由课题组外的资深神经系统放射专家, 依据MRA最大信号强度投影计算血管狭窄程度, 若血管狭窄程度﹤50%, 即认为血管病变程度没有临床意义;若血管狭窄程度≥50%即认为MRA结果异常, 临床上有重要意义;若血管狭窄程度为50%~<80%, 认为中等程度狭窄;若血管狭窄程度为80%~<90%, 认为严重狭窄;若血管狭窄程度为90%~100%, 认为完全闭塞。

1.2.2 基因多态性分析

基因组DNA采用血液基因组柱式小量提取试剂盒 (0.1~1.0 m L) (北京康为世纪生物科技有限公司) 提取。SNP83位点序列上游引物:5′-TTGTTTCTAGTTAGCCTTG-3′;下游引物:5′-ATTTG-GCCTTGCAATATAC-3′;SNP87位点序列上游引物:5′-AAGATGAGGAAGAATAATCC-3′;下游引物:5′-AT-GAAGACACCTGAAAGATC-3′。PCR扩增体系25μL (Mastermix 12.5μL;模板DNA 250 ng;上下游引物各1.0μL, 不足体积用无酶水补足) 。PCR扩增条件:95℃5 min;95℃30 s, 62℃30 s, 72℃30 s, 41个循环;72℃延伸5 min。取5μL扩增产物进行酶切 (酶切体系15μL) 。内切酶分别为TaiⅠ (New England Biolabs) 及SSP1 (New England Biolabs) 限制性内切酶。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 于凝腔图像分析系统下分析基因型。

1.2.3 酶切结果判定

SNP83缺乏相应酶切位点为T/T型纯合子 (359 bp, 1条带) , 存在相应酶切位点为C/C型纯合子 (264 bp、95 bp, 2条带) , 若为C/T杂合子型 (359 bp、264 bp、95 bp, 3条带) ;SNP87缺乏相应酶切位点为T/T型纯合子 (264 bp、222 bp, 2条带) , 存在相应酶切位点为C/C型纯合子 (486 bp, 1条带) , 若为C/T杂合子型 (486 bp、264 bp、222 bp, 3条带) 。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.00统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 两组间比较采用t检验;等位基因计数采用直接计数法, 并计算基因型频率, 不同基因型及等位基因分布频率比较采用χ2检验, 多因素分析采用Logistic回归。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料

245例IS患者中, 193例 (77.78%) 患者MRA结果异常, 52例 (22.22%) 患者MRA结果正常。两组患者在年龄、性别、合并症、脑卒中家族史、吸烟史、饮酒史及部分生化指标方面差异均无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。

注:MRA:磁共振血管造影;IS:缺血性脑卒中;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇

2.2 MRA检查结果

245例病例组患者MRA结果如下:215例 (87.76%) 患者进行颅外MRA (extracranial MR angiography, ECMRA) , 188例 (76.73%) 患者进行颅内MRA (intracranial MR angiography, ICMRA) , 208例 (84.9%) 患者接受两种方式检查。在193例 (78.78%) MRA结果异常患者当中, ECMRA结果异常的103例 (53.37%) , ICMRA结果异常的127例 (65.80%) , 两者兼异常的81例 (41.97%) 。

ECMRA结果异常患者的动脉粥样硬化发生部位主要集中于颈内动脉 (internal carotid artery, ICA) , 有62例 (60.19%) , 其次为颈总动脉 (common carotid artery, CCA) 联合ICA部位, 有25例 (24.27%) 。而ICMRA结果异常的患者动脉粥样硬化发生部位主要集中于大脑中动脉69例 (54.33%) , 其次为ICA 57例 (44.88%) , 大脑后动脉42例 (33.07%) 。见表2。

注:ECMRA:颅外磁共振血管造影;ICMRA:颅内磁共振血管造影;CCA:颈总动脉;ICA:颈内动脉

2.3 基因型分析

2.3.1 PDE4D基因及其等位基因频率在病例组及对照组中的分布情况

与正常对照组患者相比较, 病例组患者PDE4D83 CC基因型频率差异有统计学意义 (OR为3.57, 95%CI 1.39~6.52, P<0.01) 。而PDE4D87 TT基因型频率 (OR 1.35, 95%CI 0.61~3.12, P=0.41) 与对照组差异无统计学意义。脑卒中患者PDE4D基因的等位基因频率与对照组差异无统计学意义 (OR为1.07, 95%CI 0.81~3.64, P=0.35) 。见表3。

2.3.2 PDE4D基因及其等位基因频率在MRA结果异常及正常患者中的分布情况

病例组ICMRA结果异常患者的PDE4D87 TT基因型频率显著升高 (OR为0.57, 95%CI 0.01~0.43, P=0.01) , TT基因型频率约占ICMRA异常患者的19.7%, 而其在ICMRA结果正常的患者中仅仅占到2%。见表4、5。

当调整年龄、性别、吸烟史、饮酒史、胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、脑卒中家族史、高血压、糖尿病等风险因素后, PDE4D87与PDE4D83基因及等位基因频率与ECMRA或者ICMRA结果异常不相关。

注:ICMRA:颅内磁共振血管造影

注:ECMRA:颅外磁共振血管造影

3 讨论

人体解剖学结构表明, 脑动脉与其他动脉解剖结构存在差异。虽然其内弹力层发育比其他动脉完善, 但在易感因素诱发下, 颈内动脉、椎动脉、基底动脉、大脑中动脉等颅内大中型动脉较易发生动脉粥样硬化。研究表明, 动脉粥样硬化症状在白种人群好发于颅外动脉, 而亚洲人及黑人常发于颅内动脉[11]。而本研究的245例IS患者的MRA结果表明, 193例IS患者 (78.78%) MRA结果异常, 其中, ECMRA结果异常的103例 (53.37%) , ICMRA结果异常的127例 (65.8%) , 颅内外联合病变为的81例 (41.97%) , 与以往研究强调中国人好发颅内病变结果相一致[12]。此外, 对MRA结果进一步分析得出, ECMRA结果异常患者的动脉粥样硬化发生部位主要集中于ICA (60.19%) , 其次为CCA联合ICA部位 (24.27%) 。而ICMRA结果异常的患者动脉粥样硬化发生部位主要集中于大脑中动脉69例 (54.33%) , 其次为颈内动脉57例 (44.88%) , 大脑后动脉42例 (33.07%) 。后续研究将继续扩大样本量进行深入研究。

之前许多研究都是依据冰岛研究团队的结果开展的, 但是结果却不尽一致。究其原因为: (1) 每项研究所涉及的研究样本量相对较少; (2) 不同的研究选取的研究对象种族不同; (3) 研究对象的地理分布不同, 所以造成不同研究人群等位基因差异及单倍型差异。而本研究所选取PDE4D基因中的SNP87、SNP83是依据Gretarsdottir等[10]研究团队结果, 与脑卒中关联最显著的SNP位点进行研究。

本研究结果表明, 与对照组患者相比较, PDE4D83基因多肽性与脑卒中患者显著相关, PDE4D83 TT基因型的频率在ICMRA结果异常患者显著高于ICMRA结果正常的患者。但当调整脑卒中风险因素后分析, PDE4D基因及等位基因与MRA结果异常与否没有任何关联。这与冰岛研究团队结果, 即PDE4D83基因与脑卒中不相关的结果相一致[13,14]。此外, 当调整脑卒中风险因素, 如高血压、糖尿病、年龄、吸烟、高血脂、脑卒中家族史等后进行分析, 与ICMRA结果正常的患者相比较, ICMRA结果异常患者的PDE4D87 TT基因型频率显著升高。但是这些结果不能断定PDE4D基因多态性与动脉粥样硬化相关联, 因为动脉粥样硬化症状是由多种因素共同影响所导致的。

尽管PDE4D基因多态性在一些特定人群中表现为与脑卒中相关联, 但是具体机制还是不十分清楚。目前, 人们认为PDE4D基因参与c AMP与c GMP体内合成与代谢的信号通路。c GMP能够调节与血管内皮细胞产物NO联系紧密的磷酸二酯酶水平[15]。NO-c GMP信号通路被公认为在脑卒中患者功能失调过程中发挥重要作用[16]。有研究表明, 假若c GMP合成受抑制, 则PDE4D抑制剂活性在很大程度上受到抑制。而PDE4D抑制剂被认为在预防脑卒中过程中起到重要作用[17,18]。本研究结果显示, 脑卒中患者PDE4D83基因多态性在MRA结果异常与否的患者中, 没有任何差异。而与颅内MRA结果正常的患者相比, PDE4D87 TT基因型频率的分布在颅内动脉粥样硬化患者显著升高。

综上所述, PDE4D83基因多态性与脑卒中相关, ICMRA结果异常的患者较ICMRA结果正常的患者PDE4D87 TT基因型频率升高。但当调整脑卒中相关风险因素后, 这些相关性将不存在, 可能与脑卒中是多因素导致有关。

摘要：目的 探讨磷酸二酯酶4D (PDE4D) 基因多态性与缺血性脑卒中 (IS) 患者磁共振血管造影 (MRA) 结果的相关性。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP) 方法检测245例IS患者和208例正常对照组PDE 4D基因SNP83及SNP87酶切多态性。同时开展MRA检查结果与PDE 4D基因SNP83及SNP87多态性相关性分析。结果 245例IS患者中, 77.78%患者MRA结果异常, 其中, 颅外血管 (ECMRA) 异常占53.37%, 颅内 (ICMRA) 异常占65.80%, 两者兼有占41.97%。脑卒中患者的PDE 4D基因SNP 83的CC基因型频率较正常对照组高 (OR为3.57, 95%CI 1.39~6.52, P<0.01) ;与ICMRA结果正常的患者相比较, ICMRA结果异常的脑卒中患者的PDE 4D基因SNP 87的TT基因型频率增高 (OR为0.57, 95%CI 0.01~0.43, P=0.01) 。PDE 4D基因SNP 83的基因型及等位基因频率与MRA异常结果无显著相关 (P>0.05) 。结论 PDE 4D基因SNP 87多态性与MRA结果异常相关。PDE 4D基因SNP 83与IS相关, 与MRA结果异常无显著性相关。

磷酸二酯酶 篇3

1 低磷酸酯酶症的发病机制

正常情况下, 软骨和骨组织中富含碱性磷酸酶 (ALP) , 它可水解体内天然底物, 使磷酸根离子释放到软骨液和骨组织中, 与钙结合形成羟基磷灰石, 从而促进骨骼的矿化和牙齿发育[5]。而低磷酸酯酶症患者编码组织非特异碱性磷酸酶 (TNSALP) 的基因发生突变, 造成TNSALP功能异常, 从而使钙、磷向硬组织中的沉积减少[4]。

编码人类TNSALP的基因为ALPL (ALPL-liver) , 位于1p36, 包含12个外显子, 长度超过50kb[5]。该基因片段已报道的明确的致病突变至少有210种, 而基因多态性致病 (polymorphism) 至少有12种[6], 据统计[7], 基因突变类型中79%为错义突变, 10%为部分缺失, 3%为无义突变、4%为剪接位点突变以及少部分其他复杂类型的突变。

2 低磷酸酯酶症的分型及其临床表现

2.1 分型及临床特点

低磷酸酯酶症按照最早出现症状的年龄及临床和放射学检查表现分为围产期型、 婴儿型、 儿童型和成人型、牙型等几大类。

2.1.1 围产期致命型

是低磷酸酯酶症最严重的类型, 其首发症状出现在宫内或生后几天内, 有些婴儿几乎无骨形成, 多在产前或出生后几天即死亡。出生后可出现颅骨软化, 四肢短粗畸形, 易因胸廓无力和呼吸困难导致死亡。放射学检查对该型有诊断价值, 表现为几乎完全性的骨骼矿化低下、干骺端不规则的透光区延伸等[5]。

2.1.2 围产期良性型[6]:

该型在胎儿期可有明显的长骨弯曲畸形, 但没有重型的骨骼矿化缺陷的表现, 肢体的畸形在孕31+5周后可有显著减轻。出生后也可发生多处肢体畸形, 但不发生骨折, 骨骼的矿化和成骨正常, 骨骼畸形可自然痊愈, 因而被认为是良性的[5]。

2.1.3 婴儿型

其骨骼形成不良也是致命的, 严重性稍低于围产期型, 多在出生后6个月内发病。患儿表现为厌食、生长障碍, 亦可出现漏斗胸等佝偻病样表现及肺炎, 还可有眼部病变, 包括:青色巩膜、花斑眼眶和病理性睑退缩等。颅骨可观察到宽囟门和宽颅缝等现象, 在小颅畸形患儿身上可见囟门消失现象[8]。

2.1.4 儿童型

可表现为佝偻病:漏斗胸、前囟闭合延迟、骨软化、骨痛及应力性骨折, 身材矮小, 步履不稳等;也可由于牙骨质部分形成不全或无牙骨质, 导致不能形成牙周膜而引起牙齿早失[8,9], 因此常最先被口腔科医生诊断。用组织学的方法检查未发育成熟而松动的乳牙是一个重要的诊断手段。

2.1.5 成人型

可有足部疼痛、跖骨的应力性骨折等[6], 颅缝的过早融合, 可导致颅内压增高性突眼和脑损伤。关节内的焦磷酸钙沉积可导致软骨钙质沉着病或焦磷酸钙沉积 (或假痛风) [8]。未发育成熟的上下前牙脱落, 有乳牙早失病史。在未发育成熟而脱落的牙上, 可观察到釉质发育不全[8]。

2.1.6 牙型

该型患者可仅有牙骨质发育不全、牙齿早失等口腔表现, 血清碱性磷酸酶水平也仅有轻度降低[10]。

除上述分型外, 1969年, SCRIVER还首先报道了假低磷酸酯酶型, 这种类型很罕见, 其机制尚不清楚, 该型患者有类似于婴儿型的临床及放射学表现, 但不伴有典型的生化指标异常, 因此, 要作出正确的诊断更为困难[5]。

2.2 低磷酸酯酶症的口腔表现

一般认为该病的口腔表现主要为:牙齿早失, 根面牙骨质形成不全或发育不良;牙本质钙化不规则, 牙髓腔扩大;边缘牙槽骨的改变。其中牙根牙骨质形成不全或发育不良被认为是其主要表现。

EL-LABBAN等[11]发现低磷酸酯酶症患儿乳恒牙根表面结构的改变相似, 表现为根面牙骨质缺失, 牙本质表面存在深的吸收区, 吸收窝内有大量的细菌, 牙根表面存在一层厚的菌斑。T. VAN DEN BOS等[12]通过电子显微镜观察了7名患者早失乳牙的牙骨质及牙本质结构, 发现患者细胞性及非细胞性牙骨质形成均严重受损, 牙根面牙周膜附着较正常对照组明显减少, 且牙根表面有菌斑覆盖, 牙周膜胶原纤维在牙本质处被一约5nm厚的高电子密度层阻断, 但两组间牙本质的矿化组织无明显差异。该研究还通过实时PCR发现与焦磷酸盐代谢相关的酶NPP1在牙髓内的活力较牙周膜减少, 焦磷酸盐浓度也较牙周膜低, 而焦磷酸盐可抑制矿化, 因此认为牙本质的矿化受碱性磷酸酶活性的影响较小。秦满等[13]通过光镜及扫描电镜观察低磷酸酯酶症患者的早失乳牙, 发现牙根表面未见确定的细菌构成的膜性结构, 认为牙根牙骨质形成不全或发育不良是该病患儿乳牙过早脱落的根本原因, 但也有学者提出异议, 认为牙槽骨早期形成不全或发育不良, 而后细菌侵入造成其吸收才是牙齿过早脱落的根本原因[8]。

有学者认为低磷酸酯酶症与牙周病变有关, WATANABE等[14]对一名16岁男性低磷酸酯酶症患者的观察发现, 尽管患者保持相当良好的口腔卫生状况, 但仍有明显的牙齿松动、牙槽骨吸收等与局限性青少年牙周炎相似的表现。作者认为, 因为低磷酸酯酶症患者的牙骨质发育不良, 引起牙周组织异常, 其对细菌感染的敏感性增加, 导致这种相似于局限性青少年牙周炎的病理改变。GIUSEPPE VALENZA等[15]对7名男性儿童型低磷酸酯酶症患者研究发现, 患儿的牙周探诊深度 (PPD) 及探诊出血指数 (BOP) 较对照组高, 但差异无显著性, 除韦荣氏菌及侵蚀艾肯菌外, 两组间龈下菌斑的细菌组成也无明显差异, 而附着丧失可能是由于牙骨质发育不全造成的。

3 低磷酸酯酶症的诊断及鉴别诊断

一般认为, 低磷酸酯酶症最可靠的诊断指标是:临床和X线发现腿骨异常, 未成熟的乳、恒牙早失, 实验室检查主要包括以下几项: (1) 血清中钙浓度及碱性磷酸酶活性; (2) 磷酰乙醇氨 (PEA) :是针对该病使用时间最长的一项生化指标, 低磷酸酯酶症患者的血浆和尿液中PEA水平均很高, 尤其是尿中, PEA是正常值的10～50倍; (3) 无机焦磷酸 (inorganic pyrophosphate, PPi) :血中PPi水平不易被一般实验技术检出。高浓度的无机焦磷酸可抑制钙-磷结晶的生成, 从而影响骨骼的正常矿化, 但并不影响成骨细胞的功能[16]。 (4) 吡哆醛-5'-磷酸 (pyridoxal 5'-phos.phate, PLP) :是维生素B6的形式之一, 其水平在低磷酸酯酶症患者生长发育的各时期均很稳定, 可反映疾病的严重程度[4]。PEA、PPi、PLP均为ALP在人体内的天然底物, 其生化指标可用作低磷酸酯酶症的诊断依据, 也可用于诊断隐性基因的携带者。

鉴别诊断:围产期型低磷酸酯酶症应与围产期成骨不全、颅骨-锁骨发育不全及软骨发育障碍等鉴别, 影像学检查对低磷酸酯酶症和软骨发育不全有鉴别价值, 二者均有严重的椎骨骨化延迟, 前者神经弓骨化不良但锥体可见, 可形成发育不良的管状骨, 而后者的锥体骨化延迟并呈拉链状, 形成无规则的团状骨组织, 使手臂和腿呈鳍肢状[5]。

某些轻症型的低磷酸酯酶症患者也可无乳牙早失病史, 但可因细微骨折导致骨痛, 易误诊为骨质疏松、多灶性骨髓炎等[17]。

儿童型及成人型低磷酸酯酶症应与佝偻病、干骺端软骨发育不良症等鉴别, 低磷酸酯酶症的血清钙、磷水平均正常, 而血清ALP降低, 维生素D治疗无效[5]。

4 低磷酸酯酶症的治疗及预后

一般认为发病越早, 病情越重, 预后也越差。重症型患者常于出生后不久即死亡, 一些轻症型患者的骨改变可随生长发育逐渐恢复, 临床症状可减轻, 血、尿的生化指标也可有所改善, 但仍不正常。

高磷酸盐制剂 (中性磷酸钠) 持续治疗可使血磷轻度升高, 增加尿焦磷酸盐的排泄, x线显示骨钙化明显改善[5], 但也有学者提出患者血中无机磷水平偏高, 可抑制TNSALP活性, 应控制磷摄入[18]。对高钙血症可给低钙饮食或加用可的松治疗。骨骼畸形严重和颅缝早期愈合的病例可考虑采用外科手术治疗[5]。

WHYTE MP等[19]对一名婴儿型患儿行骨髓移植后, 患儿的骨表现型明显改善。MIKA TADOKORO等[20]在治疗一名围产期型患儿时, 进行了常规骨髓移植后, 还将间叶组织干细胞及其体外培养后分化形成的成骨细胞和骨样结构进行了移植, 改善了患儿的骨骼结构及呼吸功能。

但移植手术仍无法从根本上改变患者体内磷酸酯酶活性。M.D MCKEE等[10]应用基因敲除小鼠作为婴儿型低磷酸酯酶症的动物模型, 采用酶替代疗法, 从出生后即开始每日注射人组织非特异性碱性磷酸酶TNSALP (sALP-FcD10) , 显著改善了骨及牙骨质的矿化。此外, 早期即有科学家进行酶替代疗法的人体试验, 结果发现, 婴儿型患者的血循环中TNSALP水平有明显提高, 漏斗胸、干骺端骨矿化不良等症状也有明显改善, 但尿中PEA、PPi等生化指标并无明显改变[21], 也有的患者采用该疗法后除血循环中TNSALP水平提高外, 临床症状并未见明显的改善[22]。

目前大多数治疗方法只能缓解疾病的症状, 基因疗法才能从根本上治疗该病, 随着科学技术的发展, 该病在基因治疗方面也有了新的进展。SEIKO YAMAMOTO等[23]对基因敲除小鼠注射携带TNSALP基因的病毒载体, 直接针对变异基因进行治疗, 使小鼠血清TNSALP 维持在较高的水平, 临床症状如癫痫发作、骨骼矿化不良等均有明显的改善。

磷酸二酯酶 篇4

传统的用来评估ALP酶催化PPi水解能力的方法主要是依据对水解所得磷酸根(Pi)的比色分析或者是对PPi中的磷(P)进行放射性标记以充当检测所需的信号标记[12,13]。这些方法大多操作起来比较复杂,而且有的方法还需要标记,获得的信号的灵敏度还比较低。因此,目前急需发展一些简单快速、灵敏度高、选择性好的非标记的光学检测方法用来研究ALP酶对底物PPi的水解作用。但是这些已有的报道[14]主要是通过溶液中电解质的共轭作用产生的,溶液中带电荷的物质对其的干扰比较大, 得到的信号也比较弱。

近年来,纳米技术发展飞速,采用纳米材料作为分子探针对生物分子进行定量和定性的分析越来越引起研究者们的关注。随着聚T链可以作为合成荧光铜纳米颗粒的模板这一文献的报道[15],这种新型的材料可以用来作为荧光指示探针,应用于生物传感器中。本文中基于焦磷酸(PPi)对以聚T链为模板的荧光铜纳米颗粒的形成具有很强的抑制作用, 发展了一种非标记的荧光增强的方法,用于碱性磷酸酯酶活性的检测。相比其他传统的检测ALP酶活性的方法,该方法不仅直接在均相溶液中就可进行,而且该方法选择性好,所需时间短,成本低廉,灵敏度高。其检测下限达到0.5U·L-1。

1实验原理

本章中报道了一种利用聚T链模板合成的荧光Cu NPs作为信号转换的指标协助焦磷酸(PPi)对Cu NPs合成的抑制作用,发展了一种非标记的光学检测方法用于ALP酶活性的检测。如图1所示,该方法旨在利用焦磷酸与二价铜离子之间很强的络合作用来抑制单链DNA与二价铜离子的相互作用,进而不能够合成铜纳米颗粒,导致荧光信号降低。但当ALP酶存在的条件下,ALP酶可以使PPi水解, 进而PPi就不能与二价铜离子发生络合作用。在聚T模板链的存在下,二价铜离子被抗坏血酸还原,形成具有荧光的铜纳米颗粒,进而荧光恢复,并且荧光的恢复程度和ALP酶的浓度密切相关。

2实验部分

2.1聚T链和PPi对Cu2+竞争反应

Cu2+不仅能够与聚T链模板合成Cu NPs,而且还可以与焦磷酸发生络合反应形成络合物,所以我们要首先研究哪种作用力比较强。在10m M Tris-HCl(p H 7.4,100m M Na Cl)的缓冲溶液中加入40μL的Cu2+和不同浓度的焦磷酸(PPi)于37℃下水浴50min。然后,加入事先制备好的含有40μL抗坏血酸钠和1μM的聚T模板链的混合溶液。避光反应10min后,进行荧光测定。

2.2测定ALP酶的活性

在10m M Tris-HCl(p H 7.4,100m M Na Cl)的缓冲溶液中加入40μL的Cu2+、固定浓度的焦磷酸(PPi) 和不同浓度的ALP酶,37℃下水浴50min。再加入事先制备好的含有40μL抗坏血酸钠和1μM的聚T模板链的混合溶液。避光反应10min后,进行荧光测定。

2.3荧光光谱检测

本章实验中的光谱测量均在Fluoro Max-4荧光光谱仪上测定,采用最大容量为400μL的比色皿盛放待测液,激发波长为350nm,发射峰的扫描范围从540nm到680nm。通过荧光光谱仪测定得到的结果, 均是从大于3次的重复实验中获得。

3结果与讨论

3.1实验的可行性分析

图2是不同反应条件下的荧光光谱图。由图2可知,当体系中焦磷酸和磷酸根离子都不存在时,在350nm的激发波长下,可以观测到在625nm处有一个很强的荧光吸收峰。当加入500μM的磷酸一氢根离子或500μM的磷酸二氢根离子时,荧光强度几乎不变。但当有焦磷酸存在时,所观测的荧光信号明显减弱。这说明了只有焦磷酸可以抑制二价铜离子在聚T链上被抗坏血酸还原。同时可观测到,当200μM的焦磷酸和30U·L-1的碱性磷酸酯酶同时存在时,荧光信号得到了部分恢复。这些结果都说明了焦磷酸抑制聚T模板链合成的铜纳米粒子作为荧光探针用于检测碱性磷酸酯酶的活性这一方法是可行的。

从上到下的反应条件是:1)PPi和磷酸根离子都不 存在时;2)500μM的HPO42-存在时;3) 500μM的H2PO4-存在时;4)200μM的焦磷酸 和30U·L-1的碱性磷酸酯酶同时存在时;5)只有200μM的焦磷酸存在。其他反应条件都一样。

3.2实验条件的优化

图3是有无焦磷酸存在的条件下,焦磷酸的抑制作用对二价铜离子浓度的影响。由图3可知,随着二价铜离子浓度的增加,荧光强度逐渐增加,并且在二价铜离子的浓度达到100μM时,有最大的荧光强度差。图4是碱性磷酸酯酶的反应时间的优化。由图4可知,随着水浴时间的加长,测得的荧光强度逐渐增强。在水浴时间为50min的时候,荧光强度达到最强,并且再增加水浴时间发现荧光强度不再发生变化。由图5、图6可知,随着焦磷酸浓度逐渐增加,荧光强度逐渐减弱,当焦磷酸的浓度达到200μM时,荧光强度趋于平稳。所以,最佳铜离子浓度、焦磷酸的浓度、酶反应时间分别为100μM、 200μM、50min。

( 实验中焦磷酸的浓度为 200μM)

3.3ALP酶活性的研究

如图7所示,在最佳的实验条件下观察在不同的ALP浓度条件下测得的荧光光谱图,发现,在625nm位置的荧光强度随着ALP浓度的增加而增加。所得的校准曲线如图8、9所示,当ALP的含量在0.5~20U·L-1之间时,荧光强度与ALP的浓度成正比。检测到的最低下限为0.5U·L-1。与其他同样的检测ALP的方法相比[16,17],该方法的检测限要低些,重现性也比较好些。

4结论

碱性磷酸酯酶(ALP)是人体多种组织中的一种重要的酶,对多种疾病的临床诊断具有重要的意义。因此,本文中基于焦磷酸(PPi)对以聚T链为模板的荧光铜纳米颗粒的形成具有很强的抑制作用,发展了一种非标记的荧光增强的方法用于碱性磷酸酯酶活性的检测。

该方法旨在利用焦磷酸与二价铜离子之间的强络合作用来抑制单链DNA与二价铜离子之间的结合作用,进而不能够合成铜纳米颗粒,导致荧光信号降低。但当ALP存在的条件下,ALP可以使PPi水解,进而PPi就不能与二价铜离子发生络合作用。 在聚T模板链的存在下,二价铜离子被抗坏血酸还原,形成具有荧光的铜纳米颗粒,进而荧光恢复。

该方法不仅直接在均相溶液中就可进行,而且该方法选择性好,所需时间短,成本低廉,灵敏度高。 其检测下限达到0.5U∙L-1。

摘要：近年来,作为非标记的荧光探针,以DNA为模板制备的荧光纳米材料因其具有光稳定性、生物相容性、无毒性等优点,被广泛应用于生物分析领域。针对一些检测生物酶存在的成本高、灵敏度低、操作复杂等问题,本文基于焦磷酸(PPi)对聚T链为模板的荧光铜纳米颗粒的形成具有很强的抑制作用,发展了一种非标记的荧光增强的方法用来检测碱性磷酸酯酶活性。该方法不仅直接在均相溶液中就可进行,而且所需时间短,成本低廉。其检测下限达到0.5U·L-1。