环磷酸腺苷葡胺

关键词： 心肌 新生儿

环磷酸腺苷葡胺（精选八篇）

环磷酸腺苷葡胺 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月至2012年1月我科收治的新生儿重度窒息, 生后即转入我科治疗, 住院期间出现青紫、呼吸困难、心律失常, 甚至出现心力衰竭, 心源性休克或低血容量性休克等, 符合新生儿缺氧缺血性心肌损伤的诊断标准[2], 共58例, 随机分成磷酸肌酸钠组34例和环磷腺苷葡胺组24例。根据临床表现及心电图、病情程度等又分为轻症心肌损伤和重症心肌损伤[1]。其中磷酸肌酸钠组平均孕周为 (36.5±2) 周, 入院时日龄为 (1.5±1) h, 男∶女比为1.2∶1, 其中轻症心肌损伤有21例, 重症心肌损伤有13例, 而环磷腺苷葡胺组平均孕周为 (36.7±1.8) 周, 入院时日龄为 (1.75±0.8) h, 男∶女比为1.18∶1, 其中轻症心肌损伤有15例, 重症心肌损伤有9例, 两组在治疗前CK-MB值分别为 (95.7±20.1) IU/L和 (96.5±19.5) IU/L、c Tn I值分别为 (2.21±0.22) µg/L和 (2.18±0.29) µg/L, 两组在孕周、日龄、性别、窒息程度、心肌损伤程度等无统计学差异 (P>0.05) 。

1.2 治疗方法

所有病例均按照新生儿窒息作综合处理, 包括防治感染, 呼吸支持, 维持水电解质酸碱平衡, 血压降低伴心率减慢者加用正性心肌收缩药物如多巴胺、多巴酚丁胺等。磷酸肌酸钠组加用磷酸肌酸钠 (海口奇力制药股份有限公司, 国药准字H20053431, 规格:0.5g/支) 静脉滴注, 剂量为0.5g/次, 1次/d, 7d为1疗程;而环磷腺苷葡胺组加用环磷腺苷葡胺 (江苏万邦生化制药有限公司, 国药准字:H20050478, 规格:30mg/支) 静脉滴注, 剂量为3~5mg/ (kg·次) , 1次/d, 7d为1疗程。

1.3 观察指标

两组均于治疗前及治疗7d后抽取静脉血查肌钙蛋白I (c Tn I) 及肌酸激酶同工酶CK-MB。

1.4 疗效评定

显效:治疗7d后临床症状消失, 心率、c Tn I及CK-MB指标均恢复正常;有效:治疗7d后临床症状、体征基本消失, c Tn I及CK-MB指标明显降低, 但末完全恢复正常;无效:治疗7d后病情仍无明显改善或病情加重, 自动出院、转院甚至死亡, c Tn I及CK-MB指标无明显降低甚至加重。

1.5 统计分析

采用SPSS16.0软件进行统计分析, 计量资料以均数±标准差表示, 组间比较采用t检验和直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效评价

磷酸肌酸钠组总有效率为94.1%, 环磷腺苷葡胺组为95.8%, 两组显效率及总有效率均无显著性差异 (P>0.05) , 两组治疗效果情况具体见表1。

注:两组显效率及总有效率比较P>0.05

2.2 治疗前后c Tn I及CK-MB指标测定

两组治疗7d后c Tn I及CK-MB指标均较治疗前明显好转 (P<0.05) , 但两组比较, 疗效无显著性差异 (P>0.05) , 两组治疗效果具体见表2。

注:同组治疗前后比较P<0.05;两组同时间比较P>0.05

3 讨论

新生儿窒息后通过缺氧缺血性低灌注、再灌注损伤、能量代谢障碍、细胞内酸中毒、钙离子内流、产生自由基和兴奋性神经介质等机制造成全身多器官损害, 由于心肌细胞对缺氧的易敏感性, 心肌极易受累。缺氧时有氧代谢受阻, 无氧代谢增加, 酸性代谢产物堆积, 细胞内酸中毒, 造成心肌细胞能量代谢障碍, 以及氧自由基的产生, 直接损害了心肌细胞[2]。另外能量代谢障碍使心肌细胞膜钙泵失效, 大量钙离子内流, 导致心肌收缩功能障碍[3]。

磷酸肌酸钠是一种细胞内的高效能量补充剂, 它通过维持细胞内高能磷酸酸盐水平而直接供能, 并可以将二磷酸腺苷 (ADP) 磷酸化生成三磷酸腺苷 (ATP) , 提高细胞内ATP浓度, 具有保护细胞结构, 稳定细胞膜及缺血心肌细胞的电生理状态功能, 使缺血心肌组织内含氧量增加, 从而改善心肌能量代谢, 促进心肌缺氧、缺血损伤的恢复, 使心肌收缩力增强, 对改善心肌功能具有积极的作用[4]。

环磷腺苷葡胺是葡甲胺作为配基与环磷酸腺苷 (c AMP) 结合的新一代环腺苷酸类药物。c AMP与Ca2+在心肌细胞舒缩过程中彼此协调, 是相互制约的两个“第二信使”, 心肌膜上的CAMP可以促使Ca2+进入心肌细胞内, 激活兴奋-收缩偶联。当窒息缺氧时, ATP合成减少, c AMP减少, Ca2+内流受阻, 从而导致心肌细胞舒缩功能障碍。而使用环磷腺苷葡胺可以补充外源性c AMP, 促使Ca2+内流, 同时环磷腺苷葡胺本身能够抑制磷酸二酯酶活性, 因此环磷腺苷葡胺能增强心肌收缩力, 降低心肌细胞代谢, 改善心脏泵血功能, 扩张血管, 改善心肌供血, 减轻心脏负荷, 保护缺氧缺血的心肌组织, 属非洋地黄类强心剂。

本研究表明磷酸肌酸钠和环磷腺苷葡胺作用于新生儿窒息后心肌损伤不同环节, 临床观察对改善心脏泵血功能、保护心肌细胞疗效相似, 预后相近, 但环磷腺苷葡胺价格不及磷酸肌酸钠的1/5, 能显著减轻患者负担, 有临床推广价值。

摘要：目的 观察环磷腺苷葡胺与磷酸肌酸钠治疗新生儿窒息后心肌损害的治疗效果。方法 将58例新生儿窒息后心肌损害的患儿随机分成磷酸肌酸钠 (34例) 与环磷腺苷葡胺组 (24例) , 两组病例均按照新生儿窒息作综合处理, 磷酸肌酸钠组加用磷酸肌酸钠静脉滴注, 剂量为0.5g/次, 1次/d, 环磷腺苷葡胺组加用环磷腺苷葡胺静脉滴注, 剂量为35mg/ (kg次) , 1次/d, 7d为1疗程。观察两组患儿治疗后症状、体征、肌酸激酶同工酶CK-MB和肌钙蛋白I (cTnI) 的改变。结果 环磷腺苷葡胺组与磷酸肌酸钠组在有效率、改善CK-MB和cTnI方面临床结果相近。结论 磷酸肌酸钠和环磷腺苷葡胺作用于新生儿窒息后心肌损伤的不同环节, 临床观察对改善心脏泵血功能、保护心肌细胞疗效相似, 其预后相近, 但环磷腺苷葡胺价格不及磷酸肌酸钠的1/5, 能显著减轻患者负担, 有临床推广价值。

关键词：环磷腺苷葡胺,磷酸肌酸钠,新生儿窒息,心肌损伤

参考文献

[1]金汉珍, 黄德珉, 官希吉.实用新生儿学[M].3版.北京:人民卫生出版社, 2002.

[2]虞人杰, 李黎, 汤泽中, 等.新生儿窒息多器官损害的临床研究[J].中华儿科杂志, 1997, 35 (3) :138.

环磷酸腺苷cAMP的生理功能 篇2

激素类被称为细胞的“第一信使”，而cAMP则称其为“第二信使”。含氮类激素一般与细胞膜受体结合诱导生成第二信使，将信号转导入细胞内。固醇类甾体激素一般直接通过膜进入细胞与细胞质内的受体结合，然后进入细胞核发挥其作用。

【关键词】环磷酸腺苷cAMP信使含氮类激素甾体激素

【中图分类号】R284.2【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2015）01-0272-01

一、cAMP的分子作用机制

激素是一类微量的化学信息分子，由机体内一部分细胞产生，通过扩散、体液运送至另外一部分细胞，并起到代谢调节控制的作用。因此，被称为“第一信使”。而环腺苷酸（cAMP）是在细胞受到胞外化学信息分子刺激，如激素分子或神经递质分子并与细胞膜上的受体结合形成复合体，然后激活细胞膜上G蛋白，被激活的Gs-蛋白再激活细胞内膜上的腺苷酸环化酶（AC），催化ATP脱去两个磷酸分子，再经过环化反应生成cAMP。当细胞质中cAMP合成增多时，又激活细胞质内的其他蛋白酶而发挥作用。因此，cAMP被称为“第二信使”。

cAMP广泛而微量地分布于生物体细胞中，属于信号传导的第二信使。cAMP作为第二信使，通过激活激酶A（PKA——proteinkinaseA）（cAMP依赖性蛋白激酶），使靶细胞质内的蛋白酶磷酸化而被激活，从而调节控制细胞生物化学反应速率。cAMP最终又被磷酸二酯酶（PDE）水解成5-AMP而失活。cAMP在细胞内合成和分解过程都依赖Mg2+的存在。AC和PDE以两个不同的方向调节细胞内cAMP浓度，从而影响细胞、组织、器官的功能。当腺苷酸环化酶AC的活性升高时，cAMP浓度升高；当磷酸二酯酶PDE浓度增高时，cAMP浓度降低。PDE对cAMP的调控，不仅取决于PDE的活化、抑制因素，还取决于细胞内PDE的组成以及在亚细胞结构中分布。cAMP不光在神经细胞起作用，体内很多细胞的信号传导都以此作为调控机制。

二、cAMP对基因表达的调节作用

cAMP是一种基因表达调控的重要物质。在原核生物中cAMP被认为是直接活化RNA聚合酶以促进转录，即通过该酶的6因子的磷酸化来实现促进InRNA转录。近年来的研究表明，真核细胞中cAMP的作用与转录因子调节有关。Montndny等发现许多cAMP诱导转录的真核基因的启动子周围多含有一致或近乎一致的8个碱基对的回文序列5-TGACGTCA-3，并命名为cAMP反应序列（cAM-responsi、ele。nt，CRE），是这些基因识别cAMP信号的重要部位。同时，他们还发现cAMP诱导的靶基因表达还需要PKA的激活。cAMP水平增高激活PKA，PKA又可能通过使某些特异的转录因子进行磷酸化，介导cAMP引起的基因表达。许多试验表明，PKA可使组蛋白磷酸化，磷酸化的组蛋白由于带电状态及构象的改变，与DNA结合松弛而分离，从而解除了组蛋白对这段基因的抑制，使转录得以进行。另有试验发现，在体外PKA可使非组蛋白磷酸化，磷酸化的蛋白质酸性增强，带有较多的负电荷，与带正电荷的组蛋白有较强的亲和力而相互结合，使组蛋白与DNA分离，解除组蛋白对基因DNA的抑制而进行转录。

三、cAMP对激素分泌、神经递质合成和膜蛋白活性的影响

环磷酸腺苷cAMP对激素分泌的影响。大量试验表明，一些二级促激素，促进次级激素合成过程是通过cAMP途径调节的。促肾上腺皮质激素结合到肾上腺皮质细胞后，激活AC，增加cAMP浓度，激活PKA，PKA磷酸化又激活皮质酮、醛甾酮的合成酶。在卵巢细胞中，也有类似的情况，促滤泡激素通过cAMP途径增加雌二醇、孕酮的合成。cAMP还能诱导GH的释放，从而促进肝脏内蛋白质、DNA和RNA的合成，并能加强脂肪分解，刺激机体蛋白质的合成。

McAfee首先证明cAMP参与神经节突触传递的调节。当某些神经细胞兴奋时，突触前神经末梢释放神经递质分子，作用于突触膜上相应的受体并激活AC，在突触内膜合成cAMP，进而激活PKA，通过膜蛋白的磷酸化改变膜对离子的通透性，从而影响神经细胞的兴奋性。神经组织内含有高水平的cAMP及其代谢调节酶。在脑、脊髓、脑脊液和外周神经中都有大量cAMP存在。在脊椎动物脑中，cAMP含量最高，是非神经组织约高10倍，腺苷酸环化酶AC和磷酸二酯酶PDE含量也比其他组织高10～20倍。以上说明在神经组织中cAMP的合成和分解速度远远高于其他组织，cAMP在神经组织中起重要调节作用。

cAMP可促使非神经细胞膜上某些蛋白的磷酸化，使其构型发生改变，从而调节膜对一些物质的通透性。例如在红细胞中，cAMP激活细胞膜上的蛋白激酶，使膜上的Spectin蛋白磷酸化后，对红细胞膜的理化性质及红细胞的形态产生极为重要的调节作用。在血小板中，cAMP可通過PKA有效地刺激膜上的一种分子量为22000的蛋白磷酸化，并通过对钙摄入的影响，调节血小板聚集、收缩等功能。在心肌细胞中，cAMP可使心肌细胞钙通道发生磷酸化，使膜对Ca2﹢的通透性增强，导致Ca2﹢内流增加而使心肌收缩力增加，心率加快。在肾脏的试验中证明，加压素等通过cAMP使细胞膜物理性质改变，增加对水的吸收。

四、cAMP对细胞代谢和免疫功能的调节

环磷酸腺苷葡胺 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2006年6月～2009年6月住院治疗的慢性心力衰竭患者120例,其中,男79例,女41例;年龄38～92岁,平均66.4岁。原发病类型:冠心病45例、风湿性心脏病33例,高血压性心脏病25例,肺心病9例,扩张型心肌病8例。按NYHA心功能分级:Ⅱ级35例,Ⅲ级64例,Ⅳ级21例。随机分为治疗组和对照组,各60例,两组患者年龄、性别、原发病、心功能分级等无显著性差异,具有可比性。

1.2 治疗方法

两组患者均针对原发病及实际病情给予血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利,同时给予利尿剂、洋地黄及扩血管药物治疗,治疗组在此基础上加用环磷腺苷葡胺180 mg/d加入250 ml葡萄糖中静滴,每日1次,规律治疗2周为1个疗程,观察临床疗效及不良反应发生情况。

1.3 疗效评定标准

显效:心功能改善2级,临床症状显著减轻或消失;有效:心功能改善1级,临床症状减轻;无效:心功能无改善或症状、体征加重或死亡,总有效率为显效率与有效率之和。

1.4 统计学处理

计数资料进行χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的临床疗效

规律治疗1个疗程后,治疗组显效24例,有效33例,无效3例,总有效率为95.00%;对照组显效18例,有效37例,无效5例,总有效率为91.67%,治疗组显效率明显高于对照组(P<0.05),总有效率组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 不良反应

两组患者用药期间均有部分患者出现不同程度的咳嗽反应,给予阿司匹林得以缓解,未见消化道症状、肝肾损害及白细胞减少等其他不良反应。

3 讨论

慢性心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿,也是最主要的死亡原因,其病理生理机制是心肌重塑(remodelling),交感神经系统兴奋性增强、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活在此过程中起重要作用,应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)及β受体阻滞剂治疗可取得较满意的临床效果。然而对于存在心动过缓、低血压、房室传导阻滞、慢性阻塞性肺疾病的患者β受体阻滞剂的应用受到一定程度的限制。ACEI类药物是公认的、首选的治疗心力衰竭的基础药物,通过抑制RAAS系统从而抑制心肌重塑、抑制缓激肽降解等机制发挥扩张血管的作用,可以有效地提高患者生活质量,改善近期和远期预后[1]。卡托普利是ACEI类代表药物,临床应用广泛,最常见的不良反应为咳嗽,发生率为10%～12%,停药或加用阿司匹林可缓解[2]。环磷腺苷葡胺是一种人工合成的环磷腺苷(cAMP)的衍生物,属于非洋地黄类正性肌力药物,能增强cAMP的脂溶性,使细胞内第二信使cAMP的纯度增加,激活慢钙通道,增加钙离子内流,改善心肌及窦房结P细胞功能,参与ATP生成,改善能量代谢,加强心肌收缩力[3],降低心肌耗氧量,改善心泵功能,增加心肌排血量,降低心脏的前、后负荷,改善冠脉循环;通过糖原磷酸化激酶使1-磷酸葡萄糖发挥作用,抑制糖原合成,并催化1,-6二磷酸果糖生成,为心肌细胞提供能量;环磷腺苷葡胺还可增强心钠素、心房肽等心脏激素的作用,从而发挥稳定心肌细胞膜,保护心肌细胞功能的作用,同时还可以降低肺动脉压力,改善肺循环障碍和呼吸困难等症状[4,5,6]。本研究显示,卡托普利联合环磷腺苷葡胺治疗慢性心力衰竭临床疗效显著,患者临床症状及心功能明显改善,且不增加不良反应的发生率,是治疗各种原因引起的慢性心力衰竭的安全、有效的药物,值得临床推广。

摘要：目的:探讨卡托普利联合环磷腺苷葡胺治疗慢性心力衰竭的临床效果。方法:120例慢性心力衰竭患者平均分为治疗组和对照组,全部患者均给予卡托普利治疗,同时包括限盐、利尿、强心剂及扩血管药物综合治疗,治疗组在此基础上给予环磷腺苷葡胺,比较临床疗效。结果:规律治疗1个疗程后,两组患者治疗的总有效率差异无统计学意义(P>0.05),但是治疗组显效率明显高于对照组(P<0.05),两组患者的不良反应发生情况无差异。结论:卡托普利联合环磷腺苷葡胺治疗慢性心力衰竭是安全、有效、理想的临床治疗方案选择。

关键词：慢性心力衰竭,卡托普利,环磷腺苷葡胺

参考文献

[1]宋晓蓉,谢陈玲.卡托普利与环磷腺苷葡胺联用治疗慢性充血性心力衰竭疗效观察[J].临床和实验医学杂志,2007,6(1):59-60.

[2]余静,阎伟,张缤,等.卡托普利相关的咳嗽及阿司匹林对其影响[J].高血压杂志,2005,13(3):137-141.

[3]廖玉巍,吴秀英.环磷腺苷葡胺对非体外循环冠状动脉旁路移植术患者术中血液动力学的影响[J].中国医师进修杂志:综合版,2007,30(8):8-10.

[4]张恒先,高明河,苏长江.葡甲胺环腺苷酸注射液佐治充血性心力衰竭[J].新医学,2002,33(11):671.

[5]张巧玲,安巍.环磷腺苷葡胺治疗充血性心力衰竭的疗效观察[J].国外医学:心血管疾病分册,2003,30(3):186-187.

环磷酸腺苷葡胺 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料 2008年12月—2011年3月我院住院治疗的CHF患者68例,其中男41例,女27例,年龄60岁~77岁。将病例随机分为治疗组和对照组各34例。两组年龄、性别、病程、病因构成及心功能分级差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 诊断标准 入选患者均符合1995年世界卫生组织(WHO)/世界心脏病协会(ISFC)的标准[2];心功能分级根据美国纽约心脏病协会(NYHA)的标准[3];中医诊断依照卫生部《中药新药治疗充血性心力衰竭的临床研究指导原则》[4]。

1.3 治疗方法 两组患者入院后均卧床休息,低钠饮食,吸氧,给予心力衰竭常规治疗,包括洋地黄类制剂、利尿剂、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)及硝酸酯类等药物。治疗组加用参附注射液(雅安三九药业有限公司生产)30 mL 加入葡萄糖注射液或生理盐水250 mL缓慢静脉输注,每日1次;心先安 90 mg(万邦制药)加入葡萄糖注射液250 mL静脉输注,每日 1 次。20 d为1个疗程。

1.4 观察指标 观察两组治疗前后临床症状、心率、血压、心脏体征、心功能分级;心脏彩色多普勒超声仪检测左室收缩功能,包括左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)和左室射血分数(LVEF)。同时观察及记录有无不良反应。

1.5 疗效判定标准 显效:治疗后临床症状、体征明显改善,心功能恢复正常或改善2级以上;有效:治疗后临床症状、体征有改善,心功能改善1级;无效:治疗后主要症状、体征无变化或恶化,心功能无改善。

1.6 统计学处理 应用 SPSS 13.0软件进行统计分析, 计量资料用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 组间比较采用t检验;率的比较用χ2检验。

2 结 果

2.1 两组临床疗效比较(见表1)

2.2 两组治疗前后心功能改善情况(见表2)

2.3 不良反应 两组治疗过程中均未发现明显不良反应。

3 讨 论

充血性心力衰竭是指心脏收缩和(或)舒张功能受损时,心肌收缩力下降使心排血量不能满足机体代谢的需要,器官、组织血液灌注不足,导致肺循环和(或)体循环淤血的一组临床综合征。目前西医治疗已从传统的强心、利尿、扩张血管转变为利尿剂、ACEI和β受体阻滞剂为主,辅以强心剂,但疗效仍不理想。而中医药治疗心力衰竭有毒副反应少、疗效持久等优点。祖国医学认为心力衰竭乃本虚标实之证,心气、心阳亏虚为其病理基础,血脉瘀滞为其中病理环节,痰浊、水饮、瘀血乃标实之候,属于“心悸”“喘证”“胸痹”“水肿”“痰饮”等范畴。故临床上强调扶正固本、益气活血。

现代药理研究证明,参附注射液有效成分为人参皂苷和去甲乌头碱。人参皂苷可抑制心肌细胞膜Na+-K+ATP酶,促Na+-Ca2+交换,使Ca2+内流增加,提高心肌收缩力,还可抑制内皮细胞血栓素A2(TXA2)的产生和增加前列环素的生成,从而降低小血管阻力,增加心脑肾灌注[5]。去甲乌头碱具有受体兴奋作用,可增加心肌细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平,提高心肌收缩力,还可兴奋α受体,扩张血管,减轻心脏前后负荷。与人参皂苷一起保留正性肌力作用,而无正性频率作用,不增加心肌耗氧量。实验及临床研究表明[6,7],心先安注射液具有正性肌力、扩张血管、降低心肌耗氧、改善心肌细胞代谢、保护缺血缺氧的心肌、抑制血小板活性、抗心律失常等作用。因此,可用于治疗慢性充血性心力衰竭。

本研究临床疗效观察显示,参附注射液联合心先安治疗充血性心力衰竭可显著改善临床症状,改善左室收缩功能,减少左室收缩末期容积。与常规单纯西医治疗比较,其疗效更佳,且无明显不良反应。

摘要：目的 观察参附注射液联合环磷腺苷葡胺(心先安)治疗充血性心力衰竭(CHF)的临床疗效。方法 将68例CHF患者随机分为治疗组和对照组,各34例。对照组给予常规治疗,治疗组在常规治疗基础上联合应用参附注射液及心先安,以20d为1个疗程,测定治疗前后心功能指标:左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)和左室射血分数(LVEF),同时观察两组患者用药期间的不良反应。结果 治疗组总有效率为91.18%,对照组为70.59%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。两组治疗后心功能均有明显改善(P<0.05),但治疗组改善优于对照组(P<0.05)。两组均未发现明显不良反应。结论 参附注射液联合心先安治疗CHF疗效优于常规治疗。

关键词：充血性心力衰竭,参附注射液,环磷腺苷葡胺

参考文献

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[2]叶任高.内科学[M].第5版.北京:人民卫生出版社,2000:345-347.

[3]陈灏珠.实用内科学[M].第11版.北京:人民卫生出版社,2001:1236-1255.

[4]中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则(第1辑)[S].1993:57-60.

[5]贺泽龙,袁卫红,邹晓珍.参附注射液对充血性心力衰竭病人血液动力学的影响及机理探讨[J].中国中西医结合杂志,2001,21(1):386-387.

[6]赵升皓.心先安作用的分子基础[J].徐州医学院学报,1984(4):3.

环磷酸腺苷葡胺 篇5

关键词：环磷腺苷葡胺,心宝丸,病态窦房结综合征,心率

病态窦房结综合征(Sick Sinus Syndrome,SSS )是由于窦房结的器质性或功能性障碍,导致心脏起搏和传导功能失常,引起一系列的心律紊乱和血流动力学障碍,临床表现为心脏供血不足所致的头晕乏力、心绞痛等,严重者可致阿斯综合征发作,甚至引起猝死。临床药物治疗效果较差,常需要安装心脏起搏器治疗,但因价格昂贵,受经济和技术条件的限制,给患者带来精神及经济上的负担,故人们在不断的探索新的治疗方案。自2009年3月—2011年12月, 我院应用环磷腺苷葡胺(心先安, MAC)联合心宝丸治疗SSS患者32例,取得了一定疗效,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 63例患者均符合SSS的诊断标准[1],随机分为两组。治疗组32例,男21例,女11例;年龄30岁~87岁(63.4岁±4.6岁);病程2年~3年;严重窦性心动过缓16例,慢-快综合征11例,Ⅱ度房室传导阻滞4例,窦性停搏1例;病因:冠心病12例,高血压心脏病9例,病毒性心肌炎3例,扩张型心肌病2例,老年退行性心脏病6例。对照组 31例,男22例,女9例;年龄31岁~89岁(64.2岁±4.8岁);病程3年~5年;严重窦性心动过缓15例,慢-快综合征10例,Ⅱ度房室传导阻滞3例,窦性停搏3例;病因:冠心病13例,高血压心脏病10例,病毒性心肌炎2例,扩张型心肌病2例,老年退行性心脏病4例。两组性别、年龄、病程差异均无统计学意义。

1.2 治疗方法 所有患者停用一切影响心率、心律的药物3 d,常规给予疏血管或营养心肌药物,并给予控制血压、血糖等对症治疗。治疗组给予MAC(瑞阳制药有限公司生产) 120 mg加入葡萄糖注射液或生理盐水250 mL静脉输注,每日1次,28 d为一疗程,同时给予心宝丸(广东心宝制药有限公司生产)口服,每次3粒,3次/日,每粒60 mg。对照组仅予MAC,用量、用法同治疗组。两组均不使用抗胆碱能、拟肾上腺能及其他抗心律失常药物。观察两组治疗前后动态心电图(Holter)24 h总的心率、平均心率、最小心率的变化和临床症状及心电图(ECG)改善情况。

1.3 疗效判断标准 显效:临床症状消失,ECG心率≥55次/min,Holter平均心率≥50次/min,或提高10次/min以上;有效:临床症状减轻,ECG心率≥45次/min,Holter平均心率提高5次/min~10次/min,无窦性或停搏及快-慢综合征发生;无效:临床症状无改善,ECG、Holter心率无变化或加重。

1.4 统计学处理 采用SPSS进行统计处理,计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,治疗前后采用配对t检验,率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组治疗前后Holter变化

治疗后,治疗组总心率、平均心率和最小心率较对照组均有明显提高,差异有统计学意义。详见表1。

2.2 两组治疗后临床症状改善情况(见表2)

2.3 两组治疗后ECG改善情况(见表3)

3 讨 论

SSS是心血管比较常见的严重疾患,主要由于窦房结的器质性或功能性障碍造成起搏和传导功能异常,以致产生一系列心律失常、血流动力学障碍和心功能失常,严重者可引起黑蒙、晕厥及阿-斯综合征而危及生命,目前临床药物治疗主要包括:阿托品、山莨菪碱、氨茶碱、异丙肾上腺素或烟酰胺等,但由于副反应大,长期运用患者往往难以耐受,进一步治疗是心脏起搏器植入[2],但由于价格昂贵,操作有一定难度,所以在中小医院实施有一定难度。近年来,人们采用中西医结合的办法治疗SSS取得了可喜成绩[3,4]。本研究在应用MAC治疗SSS患者的基础上,加用中成药心宝丸取得了明显疗效,临床疗效及ECG改善明显好于对照组,24 h心率提高也明显优于对照组。SSS发生机制目前多数学者认为,当窦性心律缓慢时,极易发生心房各部位不应期不均匀变化,而产生心房肌复极时间不一致,致使复极的心房肌再兴奋,最终导致折返性房性早搏、房速、房颤发生。治疗中常常遇到快速性心律失常与缓慢性心律失常用药的矛盾和顾虑,往往难以决策。MAC可兴奋窦房结功能,提高自律性,改善窦房结P细胞的功能和改善传导功能,发挥抗心律失常作用,且副反应少,疗效确切。MAC是非洋地黄类强心剂,是唯一用于临床的第二信使药,极易通过细胞膜进入细胞内发挥作用[5],可促进Ca2+内流,提高心肌细胞内钙离子浓度,钙离子使心脏传导系统的心肌细胞动作电位零相上升速度加快,舒张期自动除极加速,并有促进心肌细胞生长作用,使窦房结功能改善、窦性频率增加,窦房和房室传导速度加快。另MAC可使血管平滑肌降低结合Ca2+的能力,从而可产生正性肌力和扩张外周血管的作用,发挥强心和降低心脏前后负荷的效应,降低冠状动脉阻力,增加心肌供血供氧,抑制血小板活化,改善心肌代谢,纠正心功能。以上功能均利于窦房结和房室交界区起搏和传导功能的恢复。

中成药治疗SSS有诸多报道,心宝丸是这一领域的代表药物[6],它是由洋金花、附子、人参、肉桂、鹿茸、三七、冰片、麝香、蟾酥等组成,其中洋金花含有莨菪碱、东莨菪碱和阿托品,具有兴奋交感神经、提高心率的作用;附子具有温中回阳救逆之功效;肉桂、鹿茸、麝香、洋金花也有温补心肾阳的作用;人参具有益气助阳强心作用;药理研究表明附子含有消旋甲基乌药碱,对β肾上腺能受体的亲和力,与异丙基肾上腺素相似,可增加交感神经的兴奋性,增强心肌收缩力,提高心率,促进窦房结和房室传导功能,增加冠脉血流,达到提高心室率的作用,扩张外周血管,促进侧支循环等,冰片、麝香、蟾酥具有芳香、开窍醒神作用;三七具有活血通脉、扩张血管、抗心肌缺血之功效,并且随剂量的增加对血压无明显影响,可从不同角度改善窦房结功能。

介于MAC和心宝丸的药理特性,二者联用治疗SSS患者,具有互补及增加临床疗效功能,本研究结果表明,MAC联合心宝丸可有效提高SSS患者的窦房结和房室的传导功能,改善临床症状,提高生活质量,延长患者生存率,对于有些SSS患者,因经济条件差,患者不愿意,或合并其他疾病,不能行使起搏器治疗时,应用MAC联合心宝丸治疗,可达到提高心率、改善临床症状的目的,可以起到推迟或免于起搏器治疗[7]。

参考文献

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[2]齐平,田福利,郭继红,等.心先安治疗病态窦房结综合征疗效观察[J].实用心电学杂志,2007,16(1):21-22.

[3]欧阳璠.中西医结合治疗窦性心动过缓56例[J].现代中医药,2010,30(4):13.

[4]徐爱莲.心先安联合生脉注射液治疗病态窦房结综合征[J].浙江中西医结合杂志,2008,18(7):428-429.

[5]周洪富.环磷腺苷葡胺治疗病窦综合征的临床观察[J].疑难病杂志,2003,2(6):349-350.

[6]赵建红.心宝丸治疗病态窦房结综合征31例[J].陕西中医,2012,33(1):46-47.

环磷酸腺苷葡胺 篇6

关键词：天麻,最细粉,普通粉,帕金森病大鼠

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种老年神经系统退变性疾病,主要的病理特征不仅包括引起核心的运动障碍症状的黑质-纹状体多巴胺能系统变性,而且包括中枢、外周和自主神经系统的多靶点侵犯,并伴有广泛的路易小体和路易轴突的形成,从而引起基底神经节的功能失调[1]。 临床上以静止性震颤、 运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍四大核心症状为主要表现,病程呈慢性进展性[2]。 据统计全球65岁以上老年人中,有1%的人患有PD,而到了80岁,患病率将增加5倍。在我国,PD的发病率更高。目前,我国有200万PD患者,且年增10万新患者 。 该病的治疗目前无论药物或手术,只能改善其症状,不能阻止病情的发展,更无法治愈,给患者以及全社会都造成十分严重的负担。 对PD的治疗和研究工作刻不容缓。

在PD发生发展过程中,由于中脑多巴胺(dopamine, DA)产生的减少引起全身多部位的神经递质发生紊乱,如去甲肾上腺素(noradrenaline,NE)和5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine,5-HT)。 这些神经递质的合成、 分泌发生紊乱,引发了基底神经节网络调控功能失调,导致运动不能症状的出现。 在之前的实验中,笔者采用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)建立了PD大鼠模型,发现经过天麻普通粉和最细粉的治疗后,无论是在改善PD大鼠的神经行为学方面,还是在减轻PD大鼠氧化应激损伤和神经炎性反应方面,天麻最细粉的治疗效果均要优于普通粉[3]。 为了进一步确证天麻最细粉对于PD大鼠的治疗作用,本文探讨了天麻最细粉和普通粉对PD大鼠学习记忆能力的改善作用,以及对PD大鼠脑内3种神经递质———DA 、 NE和5 - HT的影响 。 此外 ,环磷酸腺苷 (cyclic adenosine monophosphate,c AMP)和环磷酸鸟苷 (cyclic guanosine monoph-osphate,c GMP)是细胞功能的重要调节物质,在细胞代谢及多种生理效应的体现中具有关键的作用[4]。 笔者继而测定了PD大鼠经过天麻最细粉和普通粉治疗后血清中c AMP、c GMP的含量,为天麻最细粉的临床应用提供科学依据。

1材料与方法

1.1药物

天麻(Gastrodia elata)原产地贵州,普通粉(D50= 157.10 μm)和最细粉(D50=27.44 μm)均由四川金岁方药业有限公司提供。 两种粉体的电镜照片见图1。

1.2动物

健康Wistar雄性大鼠,体重195~210 g,由军事医学科学 院实验动 物中心提 供 ,许可证号 为医动字SCXK-(军)2002-2001。

1.3试剂与仪器

盐酸氯胺酮注射液(北京双鹤药业股份有限公司, 0.1 g/2 m L );6-OHDA 、 盐酸去水吗啡 、DA盐酸盐 、 NE盐酸盐和5 -HT盐均购自 美国Sigma公司 ; 大鼠c AMP酶免试剂盒、大鼠c GMP酶免试剂盒均由成都光海科技有限公司提供;Waters高效液相色谱仪 (Millennium 32色谱工作站,Waters460电化学检测器 , 美国Waters公司 ); 色谱柱为AlltimaTMC18(250 mm×4.6 mm,5 μm, 美国Alltech公司 );AE163天平(瑞士Mettler公司);大鼠脑立体定位仪(轩泰仪北京科技有限公司);微量进样器(上海安亭微量进样器厂)。

1.4分组及给药

PD模型的制备如前所述[3]。 挑选造模成功的PD大鼠随机分为模型组、天麻普通粉组(1.8 g/kg)、天麻最细粉组(1.8 g/kg),每组10只,另纳入10只正常大鼠为正常组。 将天麻普通粉和最细粉分别加入适量蒸馏水配制成2 g/m L的混悬液,临用现配,摇匀取用灌胃给药。 天麻普通粉和最细粉在造模成功后分别以相应的粉体混悬液灌胃给药,每天1次,连续3周。 正常组和模型组以蒸馏水代替药材,其他均相同。

连续给药3周后,用Morris水迷宫测试大鼠的学习记忆能力。之后,各组大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射20%乌拉坦溶液(10 m L/kg)麻醉,于枕骨大孔处断头处死,腹主动脉取血,制血浆,待测c AMP和c GMP含量。 在冰皿上迅速分离双侧脑组织,取脑组织块0.3~0.4 g,在4℃的生理盐水中漂洗 ,除去血液 ,滤纸拭干,电子天平称重,再加入4℃生理盐水后匀浆。 将匀浆液以4000 r/min离心15 min。 将上清液置-80℃冰箱中备用,测定脑组织中神经递质的含量。

1.5学习记忆能力检测

采用Morris水迷宫测试其学习记忆能力。 前4 d为训练时间,第5天为测试时间。 训练每天上午进行, 训练5次,每次间隔15 min,每次将大鼠面向池壁分别从4个象限的4个入水点入水,记录其在60 s内寻找平台的时间,即逃避潜伏期。 如果达60 s仍未找到平台,则引导其到达平台,停留30 s,本次成绩计为60 s,然后进行下次训练。 测试时取消平台,同法观察各组大鼠逃避潜伏期[6]。

1.6脑组织中神经递质含量的测定

神经递质含量的测定采用高效液相色谱-电化学检测法[7]。 取脑组织匀浆,加正丁醇5 m L,混匀,于4℃下离心(5000 r/min)15 min。 取上清液,加HCl O4(0.1 mol/L) 0.15 m L , 正庚烷0 . 2 m L , 旋涡振荡3 min后离心 (3000 r/min)。除去有机相,在下层的水相中加入1 m L CHCl3,经旋涡振荡3 min、低速离心3 min后 ,取水相直接进样,进样量20 μL。 流动相为缓冲液(0.1 mol/L柠檬酸三钠和0.1 mol/L磷酸氢二钠) ∶甲醇=90∶10的溶液,经0.45 μm滤膜过滤并超声脱气后使用,流速为1 m L/min。 电化学监测器设定电压为+650 m V。 洗脱顺序依次为NE、DA、5-HT。

1.7血清中cAMP和cGMP含量的测定

取血浆2 m L,静置30 min后,3000 r/min离心10 min,取上层血清,4℃保存待测 。 按酶联免疫检测试剂盒使用说明书操作,即在96孔板中加入准备好的样品和对照品,生物素标记二抗和酶标试剂,37℃ 反应60 min,洗板5次,加入显色液A、B,37℃显色10 min,加入终止液。 在酶标仪450 nm波长下读测量各孔的吸光度并计算。

1.8统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠学习记忆能力比较

正常组、模型组、天麻普通粉组和天麻最细粉组大鼠的逃避潜伏期分别为(14.5±1.1)、(37.4±3.3)、(29.8± 3.3)和 (23.6±2.2)s。 与正常组比较 ,模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P < 0.01)。 与模型组比较,天麻普通粉组和天麻最细粉组大鼠的逃避潜伏期明显缩短 (P < 0.05),且天麻最细粉组对大鼠学习记忆能力的改善作用优于天麻普通粉组(P < 0.05)。 见图2。

2.2各组大鼠脑组织神经递质含量比较

模型组大鼠脑组织DA、NE、5-HT含量均显著低于正常组大鼠(P < 0.01);经治疗后,天麻普通粉组和天麻最细粉组的DA、NE、5-HT含量均有所增加,且天麻最细粉组的改善作用优于天麻普通粉组 (P < 0.05)。 见表1。

注:与正常组比较,*P < 0.01; 与模型组比较 ,aP < 0.05; 与天麻普通,bP < 0.05;DA:多巴胺 ;NE:去甲肾上腺素 ;5-HT:5-羟色胺

2.3各组大鼠血清中cAMP和cGMP含量比较

较之正常组,模型组c AMP显著下降,c GMP显著升高,c AMP/c GMP值显著降低(P < 0.01)。 经过天麻普通粉和最细粉的3周治疗后, 较之PD模型大鼠, 大鼠血清中的c AMP显著上升(P < 0.05),c GMP显著降低(P < 0.05),进而二者的比值显著升高(P < 0.05), 趋于正常,而且天麻最细粉的疗效明显优于天麻普通粉(P < 0.05)。 见表2。

注:与正常组比较,*P < 0.01; 与模型组比较 ,aP < 0.05; 与天麻普通,bP < 0.05;c AMP:环磷酸腺苷 ;c GMP:环磷酸鸟苷

3讨论

PD多发于中老年人,男性略多于女性,是中老年人致残的主要原因之一。 其发病机制迄今尚不十分清楚,可能与环境因素、免疫学异常、线粒体功能障碍和氧化应激过度、年龄老化、细胞凋亡等诸多因素有关,是多种机制协同作用的结果。 随着人口老龄化的加剧和人们生活节奏的增快,以PD为代表的中枢神经退行性疾病已经成为仅次于心血管疾病、恶性肿瘤以及中风之后的主要致死性疾病,该病的治疗是神经内科面临的世界性难题。

目前尚无治疗PD的特效药物,常用西药只能控制症状,以左旋多巴为代表的药物替代疗法仍是西医治疗帕金森病的金标准,但是随着用药时间的延长和用量的加大,毒副作用也越来越大,严重影响患者的生活质量。 中医中药以其毒副作用小、协同作用强和整体调节等优势,为PD的中药防治提供了良好前景。 现代药理学研究亦表明,在保护神经细胞、抑制氧化应激、抗兴奋性毒性、抑制细胞凋亡等方面,中医药的作用明显。 进一步深入挖掘中医中药的潜力,对于提高PD患者的生存质量意义重大[8]。 有多种中药复方、单味药、有效部位及单体均可在动物模型上对PD有防治作用,其主要机制涉及保护黑质细胞、改善神经递质含量、抗氧化和调节免疫、提高化疗疗效、减轻毒副作用等,并可能延缓疾病进程。 尤其是中药复方通过多种有效成分对人体有多环节、多层次、多靶点的整合调节作用,可能对PD神经保护治疗有一定的优势[9]。

天麻为兰科天麻属植物天麻(Gastrodia elata)的干燥块茎,又名赤箭、定风草、独摇兰,为我国传统名贵中药,主治头昏、眩晕、肢体麻木、抽搐、中风等中枢神经系统疾病,被《神农本草经》列为上品。 从天麻干燥块茎中提取出的化学成份主要有酚类、有机酸类及植物中常见的甾醇等,其中活性成分含量最高的有效单体成分是天麻素,又称天麻苷,常作为衡量天麻药材和制剂质量的指标成分。 现代医学已经证实,天麻具有抗惊厥、镇静、镇痛及抗感染等作用,并对大脑的学习和保护功能也有不同程度的作用[10]。 实验证实 , 天麻对PD模型大鼠具有DA神经元保护作用,能够改善PD大鼠的运动功能,恢复纹状体的DA含量,减缓PD病程的进展[11,12,13]。 作为常用中药,天麻经常出现在中医治疗PD的方药之中[14]。

采用超微粉碎的方式可以将中药粉碎成最细粉。 由于超微粉碎减少了细胞壁的屏障作用,因而比表面积大幅提高,改善了口感,减少了药材用量,可以大幅提高细胞内有效成分的释放速度及释放量,显著提高中药的生物利用度[15]。 在前期的研究中,笔者发现天麻经过超微粉碎后,随着粒径的减小(D50由157.10 μm减小到27.44 μm),中药粉体的比表面积显著增加 (由0.403 m2/g增加到0.626 m2/g),中药粉体的醇溶性浸出物和有效成分的提取效率也显著改善,天麻醇溶性浸出物的量由普通粉的10.83%提高到最细粉的12.23%,天麻有效成分(天麻素)的量由普通粉的0.31% 提高到最细粉的0.43%[16]。 在随后的常温留样实验考察中,比较了不同时间的天麻最细粉的形貌结构、粒径、 比表面积、堆密度、休止角等粉体学特征以及有效成分(天麻素)的量和体外溶出曲线的变化,发现经过12个月的常温留样实验 , 天麻最细粉的粉体学特征没有发生显著性改变,有效成分(天麻素)的量基本保持不变,体外溶出曲线的差异性很小,具有等价性,表明天麻制成最细粉后,质量稳定性良好,可以保证临床用药的安全[17]。 动物实验研究亦肯定了天麻在制成最细粉后,药理效应显著增强[3]。

环磷酸腺苷葡胺 篇7

1 材料与方法

1.1动物

SD大鼠,雄性,由山西医科大学实验动物中心提供,体重200 g~270 g。

1.2试剂

胶原酶P、BSA(瑞士Roche);IBMX;R0-201724;HEPES、葡萄糖、D-多聚赖氨酸(美国Sigma);SQ22536、Forskolin(美国Cayman Chemical公司);1640培养基(武汉博士德公司);澳洲胎牛血清;青链霉素(北京索莱宝公司);DispaseⅡ(美国Amresco);胰岛素检测试剂盒(北京北方生物技术研究所)[5];c AMP放免试剂盒(北京北方生物技术研究所)。

1.3主要仪器

体式显微镜(上海中恒仪器有限公司);电子天平(上海精密仪器有限公司);水浴锅(江苏金坛市恒丰仪器制造有限公司);超净工作台(北京世安科技林净化技术有限公司);倒置显微镜(日本O-LYMPUS);细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技有限公司)[5];台式离心机(长沙湘仪仪器有限公司);Narishige MODEL PP-830电极拉制仪、MIRO FORGE MF830抛光仪(日本Narishige);EPC 10全自动膜片钳(德国HEKA)。

1. 4 方法

1.4.1大鼠胰岛、细胞的分离与培养

将雄性SD大鼠断头处死后,用75%酒精对其腹部消毒,打开胸腹腔,将胶原酶P溶液(1 mg/m L,1640培养基溶解)缓慢注入胰腺中,加入Histopaque 1077离心液分离胰岛于含10%胎牛血清,100 U/m L青霉素,100μg/m L链霉素的1640培养基中,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养[5]。在分细胞时,将胰岛脱钙,加入DispaseⅡ酶液100μL(5 mg/m L)消化,将细胞悬浮液接种在含多聚赖氨酸的盖玻片上,加培养液于培养箱中培养[6,7]。

1.4.2胰岛素分泌实验

配制葡萄糖浓度分别是2.8 mmol/L、8.3 mmol/L、16.7 mmol/L的KRBH孵育液。每组6个管,每管放入5个胰岛,先用含2.8mmol/L葡萄糖的KRBH孵育液于孵箱中孵育30 min,弃上清,然后加入2.8 mmol/L、8.3 mmol/L、16.7mmol/L葡萄糖的孵育液孵育30 min,将上清收集,用放免法测胰岛素含量,加入酸乙醇(酒精∶乙醇∶盐酸=150∶47∶3)超声粉碎胰岛,检测胰岛素的总含量[5,7]。

1.4.3 c AMP检测实验

准备好葡萄糖浓度分别是2.8 mmol/L、8.3 mmol/L的KRBH孵育液。每组6个管,每管放入10个胰岛,先用含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH孵育液37℃孵育30 min,弃上清,后加入2.8mmol/L、8.3 mmol/L葡萄糖的孵育液孵育30 min,收集上清,加入KRBH孵育液将胰岛超声粉碎,放免法检测c AMP的总含量。

1.4.4膜片钳技术记录KV电流

实验结果表明:分离的细胞培养2 d后便于进行膜片钳实验。使用的细胞外液:氯化钠141.90 mmol/L,氯化钾5.60 mmol/L,氯化镁1.20 mmol/L,HEPES5.00 mmol/L,葡萄糖11.00 mmol/L,p H=7.4。细胞内液:氯化钾140.00mmol/L,氯化镁1.00 mmol/L,EGTA 0.05 mmol/L,氯化钠10.00 mmol/L和HEPES10.00 mmol/L,p H=7.3[7]。使用的电极电阻大于5 MΩ,当封接电阻应大于1 GΩ,破膜时串联电阻小于20 MΩ时说明细胞破膜完全。细胞电容大于4p F的细胞认为是β细胞,将细胞钳制在-70 m V,并给予-70 m V~80 m V的电压刺激,记录400 ms内每递增10 m V的KV电流[8]。

1.5统计学处理

用Sigmaplot 12.0软件分析,数据以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。以P<0.05有统计学意义;膜片钳的数据用PULSEFIT软件进行分析。

2 结果

2.1大鼠胰岛活性、功能良好

胰岛分别在葡萄糖浓度为2.80 mmol/L(2.8 G)、8.30 mmol/L(8.3 G)、16.70 mmol/L(16.7 G)的KRBH溶液中孵育30 min后,所测胰岛素分泌量随葡萄糖浓度增加而增加(P<0.05)。详见表1。

μIU/mL

2.2胰岛素分泌实验

在8.3 mmol/L葡萄糖基础上加入SQ22536(10μmol)、Forskolin(10μmol)、SQ22536(10μmol)+Forskolin(10μmol),孵育胰岛30min后,检测上清液及胰岛粉碎液内的胰岛素含量。结果显示,8.3 G与2.8 G比较差异有统计学意义(P<0.05);8.3G+SQ22536与8.3G比较差异无统计学意义(P>0.05);8.3G+Forskolin、8.3G+SQ22536+Forskolin与8.3 G比较差异有统计学意义(P<0.05);8.3G+Forskolin与8.3G+SQ22536+Forskolin比较差异有统计学意义(P<0.0 5)。详见表2。

μIU/m L

2.3 c AMP检测实验

8.3 mmol/L葡萄糖的KRBH孵育液中加入SQ22536(10μmol)、Forskolin(10μmol),孵育胰岛30 min后,测上清液及胰岛粉碎液内的c AMP含量,结果上显示,c AMP值8.3 G与8.3G+SQ22536比较差异无统计学意义(P>0.05);8.3G与8.3 G+Forskolin比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

μIU/m L

2.4全细胞膜片钳技术检测KV电流

使用全细胞膜片钳技术,检测了在胰岛β细胞上,SQ22536(10μmol)、Forskolin(10μmol)、SQ22536(10μmol)+Forskolin(10μmol)对KV电流的影响。当细胞外液为11.10 mmol/L的葡萄糖时,可以阻断了KATP通道的电流,排除了对KV电流的影响。结果显示,在80 m V电流刺激时,Forskolin加药组、SQ22536+Forskolin加药组与对照组相比明显地抑制了KV电流;Forskolin加药组与SQ22536+Forskolin加药组相比差异有统计学意义。详见表4。

3 讨论

胰岛素分泌实验结果显示,在2. 8 mmol/L、8. 3mmol / L、16. 7 mmol / L的葡萄糖作用下,胰岛素分泌量是随着葡萄糖的浓度递增而增加的,具有葡萄糖浓度依赖性,说明大鼠胰岛的功能良好。

腺苷酸环化酶是一个广泛存在于细胞的膜整合蛋白,在多种类型的细胞中通过调节c AMP的合成来调控细胞诸多功能。AC /c AMP信号通路在胰岛 β 细胞中非常重要,它可以调节细胞的生长和分泌。在AC / c AMP的信号转导通路的研究中,用来调节AC活性的工具药有很多,AC激动剂Forskolin有不经过鸟苷酸蛋白的调节就直接增强AC活性的作用,激活AC增加细胞内在的c AMP的生物合成,进而加强糖诱导的胰岛素分泌［9］,而SQ22536 作为一个被广泛应用的AC特定抑制剂,可抑制AC的活性［10］。本研究表明,在8. 3 mmol/L葡萄糖的基础上,Forskolin增加胰岛素分泌,在相同条件下SQ22536 对胰岛素分泌没有影响,而Forskolin+SQ22536 可以部分阻断Forskolin对胰岛素分泌的促进作用。在c AMP检测实验中,Forskolin增加了胰岛 β 细胞内生物合成的c AMP,在相同条件下SQ22536 对 β 细胞内c AMP的量没有影响。全细胞膜片钳检测KV电流结果表明,Forskolin极大地抑制了KV通道开放,减小KV电流,同样的情况下SQ22536 对KV电流没有影响,而给予Forskolin +SQ22536,则可以部分阻断Forskolin抑制KV通道开放的作用。以上实验数据表明,在胰岛 β 细胞上通过使用AC激动剂Forskolin增加细胞内在c AMP的生物合成,极大地抑制KV通道的开放,增加大鼠胰岛素的分泌; 使用AC抑制剂SQ22536,其本身对胰岛素分泌及KV电流没有影响,但削弱了Forskolin对胰岛素分泌及KV电流的作用,提示Forskolin促进胰岛素分泌作用与Kv通道有关。当处于高糖环境时,胰岛 β 细胞内的ATP/ADP比值升高,从而关闭 β 细胞KATP通道,引起细胞膜的去极化和Ca2+通道的开放,细胞内的钙离子浓度升高。Ca2+在细胞信号转导中发挥重要的作用,胰岛 β 细胞内的钙离子浓度的升高最终会促进胰岛素的分泌［11］。Mac Donald等的研究表明,KV通道在胰岛素分泌中亦发挥重要作用: 抑制KV通道可延长胰岛 β 细胞动作电位时程,导致细胞膜上的钙离子通道开放时间延长,增加细胞内的钙离子浓度,促进胰岛素的分泌［12］。

因此,结合本研究的结果提示胰岛 β 细胞内c AMP升高促进胰岛素分泌的机制与其抑制KV电流,进而延长动作电位时程,最终升高细胞内钙离子浓度有关。c AMP作为广泛存在于细胞内的第二信使也是调节一些促胰岛素分泌激素功能的关键因素,如胰高血糖素样肽-1( GLP-1) 和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽( GIP)［13］。许多促进胰岛素分泌的药物可以增加c AMP的合成,但是具体的机制还不清楚,本实验可以为研究促进胰岛素分泌的药物提供理论依据。

摘要：目的 研究环磷酸腺苷(cAMP)在大鼠胰岛素分泌中发挥的作用及机制,为研究促胰岛素分泌药物提供理论依据。方法 雄性SD大鼠的胰腺经过胶原酶P消化,使用Histopaque 1077梯度离心后,分离纯化取得胰岛。用胰岛素分泌实验来验证胰岛活性与功能,并且通过cAMP检测实验、膜片钳技术记录电压依赖性钾通道(KV)电流,研究c AMP促进大鼠胰岛素分泌的作用机制。结果 经过分离纯化得到的胰岛在2.8 mmol/L、8.3 mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖情况下胰岛素分泌的标化值分别为(1.00±0.38)μIU/m L、(2.33±0.52)μIU/m L、(5.55±0.12)μIU/m L。在8.3 mmol/L葡萄糖作用的基础上,Forskolin进一步促进了cAMP的生成,胰岛素的分泌,抑制了KV电流,在同样条件下,SQ22536对cAMP的生成、胰岛素分泌、KV电流均没有影响,但是相同条件下,应用Forskolin+SQ22536,则可以减少Forskolin促进cAMP生成的作用、削弱了Forskolin对KV电流的抑制作用。结论 采用胶原酶P消化法及Histopaque 1077分离液离心分得的胰岛活性、功能良好。在胰岛β细胞内,cAMP合成增加可促进胰岛素分泌,其机制与抑制KV电流相关。

环磷酸腺苷葡胺 篇8

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用出生1~3 d的新生Sprague Dawley乳鼠,动物标准为清洁级,雌雄不拘,新疆自治区疾病控制中心动物饲养科提供,许可证编号:SCXK新2003-0001。动物使用遵守医院伦理委员会要求。

1.2 主要实验材料及仪器

达尔伯克必需基本培养基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)/F12培养基、0.25%胰酶、Ⅰ型胶原酶、胎牛血清、青链霉素、B27神经细胞生长添加剂(B27 Neuro Mix)购自美国Gibco公司,环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,c GMP)的酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒为美国Bio Vison公司产品,其余试剂均为国产分析纯试剂。Axon700B放大器购自美国Axon公司,P-97拉制仪购自美国Sutter公司,生物电信号记录计算机(Axoscope10.2软件)购自美国Axon公司。

1.3 SGNs的分离与培养

取出生0~3 d的新生Sprague Dawley乳鼠,75%酒精浸泡消毒3~5 min,麻醉后断头处死,沿正中线矢状剪开皮肤及颅骨,去除顶骨及脑组织,分离双侧颞骨,浸入预冷(4℃)的D-Hanks液(含100 u/ml青霉素+100 u/ml链霉素)中。从耳蜗底部开始,用显微镊轻轻拨开蜗底还未骨化的组织,充分暴露听泡。取出膜迷路,仔细剥除螺旋韧带及基底膜后,将含有螺旋神经节的蜗轴螺旋管组织迅速移入1 ml含有0.125%Ⅰ型胶原酶和0.125%胰酶的已高压的Eppendorf离心管中。在37℃温箱内温育17 min,超净台上用移液枪移除部分消化液上清,加入300μl种植培养液(90%DMEM/F12,10%胎牛血清,100 u/ml青霉素,已复温)3 min终止消化。将终止消化的细胞悬液轻轻吹打20次,放入离心机,1 000 r/min离心8 min。弃上清液,加入1 ml细胞种植培养液轻轻吹打50次制成细胞混悬液。取一小滴SGNs混悬液,用细胞计数板在光学显微镜下进行单位面积内神经元计数。以密度为1×106/ml种植在预先用0.05%多聚赖氨酸包被过爬片的6孔板中。将培养皿置于37℃、5%二氧化碳CO2细胞培养箱中培养。实验时选取培养8 h的SGNs,此时细胞活性最好。用神经Ⅲ类β-微管蛋白单克隆抗体(neuronal classⅢβ-tubulin,TUJ1)为特异性标记物鉴别神经元。

1.4 急性缺氧模型制备

在室温条件下(22~25℃)对培养的SGNs标本,使用多管灌流给药系统持续灌注无糖低氧的生理盐溶液(physiological saline solution,PSS)(20%CO2和80%氮气N2混合气体充分饱和,p H值=6.5)5~15 min。

1.5 全细胞膜片钳记录

在室温条件下(22~25℃)使用Axon 700B放大器进行全细胞膜片钳实验。记录电极尖端直径约为1μm,电极阻抗约为3~5 MΩ。电极内液成分是:氯化钾KCl 140.0 mmol/L,二水氯化镁Mg Cl2·2H2O2.0 mmol/L,氯化钙Ca Cl21.2 mmol/L,乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸10.0 mmol/L,4-羟乙基哌嗪乙磺酸10.0 mmol/L,以氢氧化钾(KOH)将p H值调至7.3,渗透压300 m Osm/L。细胞外液成分:氯化钠Na Cl137.0 mmol/L,磷酸氢二钠Na2HPO40.2 mmol/L,氯化钾KCl 5.4 mmol/L,磷酸二氢钾KH2PO40.4 mmol/L,氯化镁Mg Cl21.0 mmol/L,氯化钙Ca Cl21.2 mmol/L,4-羟乙基哌嗪乙磺酸10.0 mmol/L。通过微操纵器使记录电极的尖端接触到神经元后,给予负压形成G欧封接。补偿电极电容后,给予瞬时较强负压或者电刺激击破细胞膜形成全细胞膜片钳记录模式。待电流稳定5 min后开始记录。膜电流用5或10 k Hz(3 d B)低频滤过。生物电信号通过PC计算机记录。采样间隔为10、20或100μs。

1.6 酶联免疫吸附法

用缺氧外液灌流培养细胞造成缺氧模型,在不同时间点,用胰酶消化,离心收集细胞。取适量磷酸缓冲盐溶液重悬细胞,超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,再将细胞置入-20℃冰箱冷冻,反复3次,使细胞进一步破碎。将标本置于2~8℃温度下1 500 r/min离心10 min,收集上清液备用。按照c AMP和c GMP的ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用方差分析,若方差齐则两两比较用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SGNs培养与免疫荧光鉴定

大约在接种8 h后耳蜗SGNs贴壁。镜下可见形态不一的细胞,贴壁的SGNs细胞胞体多呈椭圆形,有的呈球形,边缘清晰光滑,折光性好,周边可见明显光晕,胞体两侧未见突起生长。培养至24 h后,大部分细胞长出突起,背景细胞中可见神经胶质细胞和成纤维细胞等。但是其形态却大不一样,SGNs由之前的椭圆形延伸出突起,突起长度仅有胞体的1~2倍。神经胶质细胞的突起伸出较短一些,胞体呈梭形,突起伸出后靠近胞体部分稍宽,进而逐渐变细。另一些为成纤维细胞,胞体稍大,多呈不规则形,多边形或者星型,且分裂速度较快,光泽度不高。TUJ1免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见神经元胞体和突起均呈绿色,背景下可见少许非特异性染色,未见其他背景细胞着色(见图1)。

2.2 SGNs外向电流随缺氧时间的变化

钳制电压-60 m V,随着缺氧时间的延长,激活的SGNs外向电流先增强后逐渐减弱。其中缺氧致5 min时,外向电流幅度增强最大,+60 m V电流幅度与对照组基础电流比较由(971.2±50.3)p A增加到(2361.0±207.4)p A,差异有统计学意义(n=6,t=4.430,P=0.007)。5 min以后增强幅度呈下降趋势,缺氧11~15 min,缺氧对外向电流的增强作用基本消失。+60 m V电流幅度为(1024.6±232.2)p A,与正常对照组比较差异无统计学意义(n=6,t=1.030,P=0.350)。随着缺氧时间的延长,SGNs外向电流逐渐增大,5 min时外向电流最大。(见图2)。

A:培养8 h后光镜下可见边缘清晰光滑、折光度好的SGNs;B:TUJ1免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见着绿色SGNs

2.3 酶联免疫吸附法

使用自制灌流系统,将预充20%CO2和80%N2混合气体充分饱和的PSS持续灌流培养的SGNs。缺氧5、15和20 min时,SGNs中c AMP的浓度分别为(278.39±0.69)、(220.37±1.05)和(174.40±0.26)pg/ml(见表1)。缺氧5 min时,SGNs内c AMP浓度明显升高,20 min后明显下降(见图3)。缺氧5、15和20 min时c GMP的浓度分别为(2.49±0.05)、(2.30±0.09)和(3.83±0.15)pmol/ml(见表2);缺氧后SGNs内c GMP浓度总体呈下降趋势,20 min时,其浓度有部分回升(见图4)。缺氧5 min时,c AMP浓度出现增加(缺氧5 min vs对照组,t=57.533,P=0.000),15 min时c AMP浓度与对照组水平比较,差异无统计学意义(t=0.441,P=0.865),20 min后继续下降(缺氧20 min vs对照组,t=44.584,P=0.000)。5和15 min时,c GMP浓度下降(缺氧5和15 min vs对照组,t=21.698和23.302,P=0.000),20 min时又出现升高现象(缺氧15 min vs缺氧20 min,t=17.816,P=0.000)。

1:对照组;2:1 min组;3:3 min组;4:5 min组;5:7 min组;6:9min组;7:11 min组;8:13 min组;9:15 min组。1)与对照组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P<0.01

(n=6,pg/ml,±s)

注:方差分析F=1 249.126,P=0.000;t、P值:与对照组比较

†与对照组比较,P<0.01

(n=6,pmol/ml,±s)

注:方差分析F=210.937,P=0.000;1)与对照组比较;2)与缺氧15 min比较

1)与对照组比较,P<0.01;2)与缺氧15 min比较,P<0.01

3 讨论

在听觉系统中,很多听力丧失都与缺血、缺氧有关。新生儿缺氧,包括新生儿窒息、呼吸暂停、难产、持续机械通气史等,子宫内缺氧和分娩时间过长都会影响新生儿的听觉器官,引起耳蜗,脑干或者皮质可逆或不可逆的变化[6]。研究表明,缺氧是导致听力障碍的一个相当明确的危险因素[7]。本研究利用免疫荧光技术、电生理膜片钳全细胞记录技术、酶联免疫吸附法等研究缺氧对耳蜗SGNs电流的影响。研究结果显示,本实验中分离培养的SGNs生长状态良好,经免疫荧光检测确定为SGNs,能满足后续实验要求。膜片钳实验证实急性缺氧增加SGNs的外向电流,且该外向电流的增强作用随缺氧时间变化而改变。胞内第二信使c AMP和c GMP水平在急性缺氧过程中发生变化,c AMP的浓度随着缺氧时间的延长,出现先升高后降低的趋势。c GMP浓度随着缺氧时间的延长,总体呈下降趋势,但在20 min后有部分回升,可能与钾离子通道的开放有关,从离子通道方面进一步阐释缺氧对听力的影响。

由于耳蜗特殊的生理结构和位置,SGNs位于耳蜗骨螺旋板与蜗轴相接处的Rosenthal隧道中,位置较深,分离难度较大。因此,笔者选用出生后1~3 d的乳鼠进行培养。此时的乳鼠颞骨尚未骨化,在镜下用显微镊即可从分离出的基底膜上剥离SGNs。如果大鼠>5 d,其颞骨开始部分骨化,在分离SGNs时可能会将蜗轴螺旋管遗留在蜗轴螺旋管内,影响取材的数量[8]。所以原代培养耳蜗SGNs是有一定难度的。培养的SGNs一般4~6 h即可贴壁,8 h贴壁较牢固。同时本实验中应用细胞免疫荧光技术进行细胞的鉴定。鉴定结果表明,荧光显色可见胞体呈圆形或者椭圆形,核着蓝色且较大。本实验成功培养出原代SGNs,且培养的神经元能满足后续细胞实验的基本需要。

本研究中的电生理实验结果显示,急性缺氧时,外向电流发生一个时间相关性变化,缺氧5 min时,外向电流增强幅度最大,10~15 min时逐渐回降至基础水平。本实验前期研究结果初步分析该增强的电流成分可能主要是BKCa电流[9]。有研究证实,BKCa通道参与细胞的氧化应激过程[10]。缺氧对不同种属、不同部位、不同种类细胞的BKCa电流影响不尽相同。在豚鼠耳蜗螺旋动脉[11]、大鼠大脑皮层神经元[12]中缺氧增强BKCa电流,但是在小鼠前庭核神经元[13]、大鼠颈动脉体细胞[14]及足细胞[15]中抑制BKCa电流。LIU等[16]应用内面向外式膜片钳技术,证实缺氧引起BKCa电流变化是通过胞内机制完成的。BKCa通道除可以被胞内Ca2+和去极化电压激活以外,还可以通过胞内磷酸化调节。有研究显示,围产期缺氧可增强成年小鼠肺动脉中c AMP介导的BKCa通道电流[17]。另外,腺苷可以增大海马神经元BKCa电流幅值[18]。缺氧早期Ca2+内流,随着缺氧的时间增加,更多的Ca2+流向细胞内,加上内质网内钙的释放,造成钙离子超载[19],一些兴奋性神经递质产生,通过与神经元胞外G蛋白偶联受体结合,激活胞内第二信使通路,进而激活下游的蛋白激酶,使BKCa通道发生磷酸化,通道开放。

实验结果表明,BKCa通道受细胞内腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、三磷酸鸟苷调控[20,21]。本实验为从胞内机制进一步观察和解释SGNs外向电流变化的原因,分别检测胞内第二信使c AMP和c GMP的含量。c AMP由ATP经腺苷酸环化酶(Adenylatecvclase,Ac)转化而来,又在磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDE)的催化下不断水解成AMP。其含量的稳定主要依靠Ac与PDE之间的平衡。本实验中c AMP浓度变化的可能机制为:糖氧剥夺时,细胞产生应激反应,Ac等迅速合成c AMP致其增高,随后ATP耗竭,酶系统受抑等因素使Ac下降[22]。另一方面,由于缺氧导致细胞内环境改变,使ATP合成原料不足,影响c AMP的浓度。随着c AMP浓度的下降,对BKCa通道的磷酸化程度降低,出现该电流先升后降的现象。有研究显示,缺氧时间可影响神经元钾通道的开放频率,进而使神经元的兴奋性产生变化[11]。通道开放频率的改变与第二信使密切相关。c AMP与其他两种第二信使c GMP、Ca2+密切相关,其相互间错综复杂的关系有助于扩大细胞内信号通路激活路径[23,24]。本实验结果中,c GMP与c AMP的浓度变化不尽相同,随着缺氧时间的延长,先出现一个明显的下降,随后在缺氧20 min时回升,虽然c GMP也与BKCa通道的开放相关,但是其浓度变化与c AMP的浓度变化相反。有资料表明,c AMP和c GMP在细胞内的浓度常互相消长[25],其引起的生物学效应也常常相反[26]。该过程是胞内复杂的信号通路的联系变化,需要笔者进一步研究。但是可以推测,缺氧可以通过胞内第二信使影响通道的开放,进而影响神经细胞的兴奋性。加快细胞受损凋亡的过程,进一步使SGNs损伤,造成永久性听力丧失。

摘要：目的 观察缺氧时间对体外培养的耳蜗螺旋神经节神经元(SGNs)外向电流的影响及其细胞内第二信使环磷酸腺苷(c AMP)、环磷酸鸟苷(c GMP)含量变化。方法 体外原代培养新生1~3 d SD大鼠SGNs并进行免疫荧光鉴定。用膜片钳全细胞记录模式观察缺氧外液灌流SGNs时,外向电流的变化趋势和特点。用酶联免疫吸附实验检测缺氧5、15和20 min时SGNs内c AMP和c GMP的浓度变化。结果 1酶解分离可获得生存状态良好的神经元,经免疫荧光鉴定为SGNs。2当电压钳制在-60 m V时,急性缺氧增强SGNs外向电流,主要增强0~+60 m V电压区间的激活电流幅度。缺氧5 min时,+60 m V激活电流幅度从(971.2±50.3)p A增强到(2361.0±207.4)p A,差异有统计学意义(P<0.01)。随后出现下降趋势,11~15 min时,增强的电流幅度与对照组基础电流比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3分别检测缺氧5、15和20 min后SGNs中c AMP和c GMP的含量变化。缺氧5 min组与正常对照组比较,c AMP浓度升高,差异有统计学意义(P<0.01)。缺氧15 min组与正常对照组比较,c AMP浓度变化差异无统计学意义;缺氧20 min组与正常组对照组比较,c AMP浓度水平下降(P<0.01)。c GMP浓度随着缺氧时间的延长,总体呈下降趋势,但在20 min后有部分回升(缺氧15 min vs缺氧20 min,P<0.01)。结论 在SGNs急性缺氧损伤过程中,外向电流增强,增强幅度随缺氧时间变化先升后降,推测在短期缺氧时细胞通过降低兴奋性,影响听觉信息的传导,且该过程与胞内第二信使c AMP和c GMP浓度的改变相关。