纳豆激酶液体发酵条件的优化和调控

关键词： 药品

1 材料和方法

1.1 菌种

纳豆枯草芽孢杆菌, 本实验室保存。

1.2 材料

牛纤维蛋白原和凝血酶:均为中国药品生物制品检定所制备, 其它药品均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

上海欣蕊自动化设备有限公司生产HYG2Ⅲ回转式恒温调速摇瓶柜。

1.4 纳豆激酶活力的测定

采用纤维蛋白平板法进行。

1.5 生物量的测定

将发酵液6000r/min离心10min, 收集菌体, 蒸馏水洗涤, 收集菌体, 80℃烘干至恒重。

1.6 残糖含量的测定

采用3, 5--二硝基水杨酸比色定糖法进行。

1.7 液体种子培养基

蛋白胨1%, 葡萄糖2%, 磷酸氢二钾0.1%, 硫酸镁0.05%, pH7.0～7.2。

2 结果与分析

2.1 适宜氮源的选择

以2%葡萄糖为碳源, 分别以浓度均为2%的豆粕、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、硫酸铵为氮源, 其它条件相同, 通过不同氮源对产酶的影响分析得到, 以2%酵母膏为氮源产酶最高, 发酵48h达产酶高峰2036U/mL, 故采用2%酵母膏为氮源。

2.2 适宜碳源的选择

以2%酵母膏为氮源, 分别以浓度均为2%的木糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖及可溶性淀粉为碳源, 其它条件相同, 比较不同碳源对产酶的影响, 由试验结果分析得到, 以麦芽糖为碳源产酶最高, 发酵48h达产酶值峰2360U/mL, 故采用2%麦芽糖为碳源。

2.3 适宜碳氮比的选择

以2%麦芽糖为碳源, 浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%的酵母膏为氮源, 其它条件相同, 考察不同碳氮比对产酶的影响。由结果分析得到, 当酵母膏浓度为4%, 即碳氮比为2/4时, 产酶最高达到2750U/mL, 故以下实验均采用2/4的碳氮比。

2.4 pH对产酶的影响

pH分别为6.8、7.0、7.2, 其他条件相同, 分析PH对产酶的影响, 发现当培养基pH7.0时, 酶产量最高达到3290U/mL。pH高于或低于7.0均会导致酶合成的降低, 故培养基的最适pH确定为7.0。

2.5 添加离子对产酶的影响

分析MgSO4、Na2HPO4、NaH2PO4、CaCl2等几种离子对产酶的影响。通过试验得到, 培养基中加入M g S O4、Na2H P O4、N a H2P O4后, 产酶活力降低, 且所加试剂浓度越高, 产酶活力下降越多, 说明培养基中加入以上几种试剂均不利于NK的生产。然而添加适量的CaCl2有利于NK产量的提高, 且当CaCl2浓度为0.03%时酶产量达最高。

2.6 发酵温度对产酶的影响

在以上优化实验的基础上, 选取31℃、35℃、37℃个温度, 其它条件相同, 由不同温度对产酶的影响结果得到NK在34℃产量最高, 温度高于或低于34℃产量均降低, 故NK的最适发酵温度为34℃。

2.7 摇床转速对产酶的影响

测试以每分钟150r、200r、250r不同的转速对产酶的影响。NK在200r/min产量最高, 故200r/min为最适转速。

2.8 装液量对产酶的影响

在5 0 0 m L挡板瓶中分别加入5 0 m L、100mL、150mL培养基, 比较不同装液量对产酶的影响, 结果显示NK在100mL装液量时产量最高。

2.9 接种量对产酶的影响

测试0.5%、1%、1.5%不同接种量对产酶的影响。测得NK在1%接种量时产量最高, 达到4340U/mL。

2.1 0 正交实验

单因素发酵实验结果表明, 发酵温度、摇床转速和接种量对纳豆枯草芽孢杆菌液态发酵产生纳豆激酶有很大的影响, 故设计正交实验来确定适宜的温度转速和接种量。表一为正交实验安排及实验结果。正交实验结果表明, 发酵最优条件是A2B2C2, 即发酵温度34℃, 摇床转速200r/min, 接种量1%。

如表1所示。

综合以上实验结果, 确定NK的最适发酵条件为:培养基组成麦芽糖2%, 酵母膏4%, CaCl20.03%, pH7.0, 接种量1%, 装液量100mL/500mL挡板瓶, 发酵温度35℃, 转速200r/min, 发酵48h达产酶最高峰。

3 结语

本实验通过NK液态发酵条件的优化, 以麦芽糖代替木糖作碳源, 以酵母膏代替胰蛋白胨作氮源, 大大降低培养基的成本。与以前的培养基相比, 新的培养基中不需添MgSO4、Na2HPO4、NaH2PO4等成分, 只需加入0.03%CaCl2, 这样就大大简化了培养基配方, 进而在一定程度上降低了操作的工作强度。应用优化后发酵条件生产NK, 在降低生产成本, 降低工作强度的同时, 单位产量提高了, 酶活发酵液提高到4 3 6 0 U/m L。

摘要：1987年日本学者须见洋行首先在日本传统食品纳豆中发现一种具有高效溶栓活性的酶, 并将其命名为纳豆激酶 (简称NK) 。纳豆激酶可以降低血液中的脂肪和胆固醇, 可以溶解血栓、净化血液。更重要的是, 纳豆激酶等活性能物质可以渗透到毛细血管发挥作用, 调节微循环, 因而有祛斑美容、治疗顽固性过敏引起的皮肤病的效果。目前已经掀起了开发以纳豆激酶为主要原料的保健品热潮。本文通过对纳豆激酶液态发酵条件进行优化, 改善发酵条件, 在提高NK产量的同时, 降低了生产成本, 为工业化生产奠定了基础。

关键词：纳豆激酶,发酵,优化,调控