单克隆抗体（精选十篇）
单克隆抗体 篇1
1 鼠源单克隆抗体技术 (杂交瘤技术)
1.1 杂交瘤技术的基本原理
小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白, 而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力, 但不能无限增殖。采用融合剂聚乙二醇 (PEG) 等将这两种细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特征。既能在人工培养下无限增殖, 又能产生特异性的抗体。由于每一个被免疫的淋巴细胞只能对某个单一的抗原决定簇产生特异性抗体, 因而在将其克隆化后产生的单克隆细胞系, 就能产生大量单一的高纯度抗体, 即“单克隆抗体”。
细胞融合培养时加入HAT (H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶) 选择系统, 目的是保证只有杂交瘤细胞的生长。融合细胞能在HAT选择性培养基上生长的原理是:在HAT系统中, A阻断了核酸合成的主要途径, 这时正常细胞可以通过“补救途径”, 由胸腺嘧啶激酶 (TK) 和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 利用T和H合成核酸。骨髓瘤细胞, 因缺乏HGPRT不能利用“补救途径”, 所以在HAT系统中不能存活。而骨髓瘤细胞和脾细胞的杂交细胞, 从正常的脾细胞获得了HGPRT, 能够存活。正常脾细胞没有在体外长期生长的能力。
1.2 杂交瘤技术的的优、缺点由于单克隆抗体是单细胞
繁殖的细胞所产生的抗体, 具有特异性强, 纯度高, 可以大规模工厂化生产等优点, 从而使免疫分析技术准确性高, 重复性好, 方法简便。
但Mc Ab技术所需仪器设备昂贵, 加之实验程序较为复杂, 又因单克隆抗体针对某一抗原决定簇, 抗原化合价常常不能与抗原形成网络沉淀, 不能用于沉淀衍生出来的免疫技术。
1.3 杂交瘤技术的拓展
随着杂交瘤技术在生命学科各个领域中应用的不断深入, 杂交瘤技术生产单克隆抗体的方法得到了很多改进, 人们不断发现单克隆抗体的新用途。
1.3.1 其它动物的杂交瘤技术
由于人或动物不同类间抗体有排斥反应, 80年代以来, 人们在鼠杂交瘤技术的基础上, 发展了人源杂交瘤技术, 鼠与其他动物包括兔、牛、猪和绵羊的种间杂交瘤。其它动物源的杂交瘤分泌的单克隆抗体特别适合于兽医和食品检验领域中使用。如80年代中期用EB病毒转化体外培养的人B淋巴细胞建立分泌单克隆抗体的细胞系获得成功, 为人源单克隆抗体的生产开辟了新的途径。
1.3.2 抗体酶技术
1986年, Schultz等和Tramontano等发现某些单克隆抗体具有酶的催化作用, 从而为人工设计和生产具有特定催化活性的抗体酶开辟了道路。目前已制备出具有变位酶活性的抗体酶和水解羟基酯、羧基酯、碳酸酯和香豆素酯的酯酶活性的多种抗体酶。
1.3.3 抗独特型抗体的单克隆抗体
独特型是指存在于抗体分子可变区及淋巴细胞受体上的抗原决定簇, 由独特型抗体 (第一抗体) 刺激机体产生的抗体 (第二抗体) 能识别抗原位点的独特型抗体的抗原决定簇, 由抗独特型抗体的抗体 (第二抗体) 刺激机体产生的抗体 (第三抗体) 能与抗原结合, 即与独特型抗体 (第一抗体) 具有类似性。抗独特型抗体作为一种探针已广泛应用于受体结构和功能的研究, 还可用于鉴别和比较特异性抗体分子上的独特型抗体决定簇。
1.3.4 杂交—杂交瘤技术
杂交—杂交瘤技术是分泌不同特异性抗体的细胞进行融合而产生既分别分泌两个亲代细胞的抗体分子, 又分泌同时表现两个亲代细胞抗体结合特异性的杂交分子的杂交瘤技术。其分泌的分子嵌合体就是双特异性单克隆抗体。杂交-杂交瘤的产生可以是杂交瘤和脾细胞间的融合, 也可以是已建立的分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞间的融合, 即四交瘤技术。这种双特异性单克隆抗体适用于抗原的定位观察和定量测定。
2 人源单克隆抗体的研制
2.1 噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术是将噬菌体展示技术应用于抗体库技术所取得的一大进展, 是把人淋巴细胞谱中的VH和VL基因片段, 通过RT-PCR技术进行克隆和扩增, 并随机组合到表达载体上, 构建出大容量的人源性抗体库。同时, 利用噬菌体展示技术能将特定分子的基因型和表型相统一的特点, 即噬菌体表面表达了特定的蛋白质, 则噬菌体的DNA中必然含有该蛋白质相应的结构基因, 通过多次的“吸附-洗脱-扩增”的筛选富集过程, 就可以有效地筛选出特异性的人源性抗体的可变区基因, 从而制备出人源性单克隆抗体。初次用噬菌体抗体库技术所获得的人源性单抗其亲和力往往比较低, 难以达到实用要求, 随着近几年体外亲和力成熟技术的进步, 可筛选出亲和力提高103倍的抗体, 接近甚至超过杂交瘤技术所能达到的亲和力水平。
2.2 核糖体展示技术
1997年, Hanes和Plukthun建立了核糖体展示技术: (1) 先构建一个sc Fv文库, 并采用一定的方法, 即同时引入T7启动子、核糖体结合位点和茎环结构, 使文库中的基因片断能与核糖体相结合, 然后转录成m R-NA; (2) 纯化后, 在大肠杆菌S30系统中进行体外翻译, 形成“m RNA-核糖体-sc Fv”复合物; (3) 用固相化抗原从中筛选出相应的展示天然sc Fv的核糖体复合物; (4) 以EDTA解离结合的核糖体复合物 (4b) , 或以抗原特异性洗脱整个复合物 (4a) ; (5) 从复合物中分离获得相应的m RNA; (6) 再反转录成c DNA并以PCR加以扩增, 所得的DNA进入下一轮富集筛选。它是第一个完全在体外进行进化和筛选折叠蛋白质的系统, 其中的每一步包括所有的复制、扩增、转录、筛选的全过程均在体外完成。此种方法可以很容易地构建超大容量的抗体库, 库容可达1014~1015;另外又可以非常方便地联合使用一些特殊的PCR技术, 使抗体获得更大、更广的遗传多样性, 且抗体亲和力也很高, 其亲和常数可达10~11mol/L。
2.3 转基因/转染色体小鼠技术
利用转基因小鼠技术制备人源性单抗就是通过转基因技术, 包括Ig基因小位点法、PI噬菌体载体法及酵母人工染色体法, 将人的抗体基因座转入小鼠体内, 并使人的抗体可变区基因在小鼠淋巴细胞进行重排和表达, 具有表达人抗体的B淋巴细胞在抗原的驱动下进行不断的克隆和分化, 最后形成具有携带高度亲人抗体的浆细胞, 再利用传统的鼠杂交瘤的方法制备人源性单抗。其本质就是将鼠部分人源化, 是对杂交瘤技术的一种改进。
3 基因工程单克隆抗体的发展
随着DNA重组技术的成熟和抗体基因结构及抗体多样性产生机理的阐明, 多种基因工程抗体已经问世。
3.1 嵌合抗体
从杂交瘤细胞中获得抗体V区c DNA, 克隆到重组了人抗体C区的载体中, 转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体。改造后的抗体保留了原单抗特异结合抗原的V区, 去除了非人源序列 (C区) ;但由于其整个V区都是异源的, 所以嵌合抗体的异源性还很明显。嵌合抗体完整地保留了异源单抗的V区, 最大限度地保持了其亲和活性, 可作进一步改造的亲和力参照体, 也是进一步提高补体活化及细胞毒作用等的基础对照。
3.2 重构抗体
重构抗体是在嵌合抗体基础上进一步发展而成, 也是通过DNA重组方法将人源抗体的互补决定区, 用特异性异源抗体CDR替换所得到的抗体;即由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的。包括抗原结合位点的重构和框架区 (FR) 重构。
3.3 小分子抗体
抗体分子的抗原结合部位局限在可变区组成的Fv段, 从而可以构建分子量较小的具有抗原结合功能的分子片段, 称为小分子抗体。常见的小分子抗体包括:Fab、Fv及单链抗体, 单区抗体和最小识别单位。
3.3.1 Fab
Fab由重链Fd段和完整的轻链组成, 两者通过一个链间二硫键连接, 形成异二聚体, 是完整抗体分子的三分之一, 仅有一个抗原结合位点。Fab段由于有二硫键连接轻链和Fd段, 分子结构比较稳定, 且较好地保持了天然抗体分子的Fv段结构, 主要用作实验室研究工具。
3.3.2 FV
Fv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片断, 它由轻链可变区和重链可变区组成, 两者以非共价键结合在一起。
3.3.3 单链抗体
单链抗体是目前报道最多的基因工程抗体, 是一种新型重组蛋白, 它是把抗体可变区重链 (VH) 与轻链 (VL) 通过一段约15~25个氨基酸残基构成的弹性短肽 (Linker) 相连而成, 通过正确折叠, 两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的Fv段, 此单一肽链的结构既有利于在大肠杆菌的表达和进行基因重组操作, 也增加了Fv的稳定性。
3.3.4 单区抗体
Ward等 (1989) 发现有些抗体分子的单独VH具有与抗原结合的亲和力, 并保持完整抗体的特异性。将单独VH基因导入表达载体所得到的表达抗体即所谓单区抗体 (single domain antibody) , 仅为完整Ig G分子的1/12, 很易穿透细胞膜。
3.4 抗体融合蛋白
抗体分子片断与其它蛋白融合, 可得到具有多种生物学功能的融合蛋白, 这种抗体融合蛋白有多种不同的构建方式, 可将其分为两大类。一类是将含Fv段的抗体片断与其它生物活性蛋白融合, 利用抗体的特异性识别功能将某些生物学活性引导于特定部位, 靶向治疗是其主要应用领域。另一类是含Fc段的抗体融合蛋白, 利用Fc段所特有的生物学功能与某些具有粘附或结合功能的蛋白融合, 又称为免疫粘附素。
3.5 噬菌体抗体
噬菌体抗体的主要特点是它即可以识别相应抗原并与其结合, 又能够在感染宿主菌中扩增。将B淋巴细胞全套可变区基因克隆出来, 组装成噬菌体抗体群体, 即成为噬菌体库。构建抗体库过程中采用较多的噬菌体载体是Barbas和Clackson构建的载体———p Comb3。
(参考文献从略)
摘要：抗体分子是生物及医学领域中用途最为广泛的蛋白质分子。本世纪30～60年代对抗体的理化性质以及对免疫球蛋白分子结构与功能的研究取得了突破性进展。1976年德国学者Kohler和英国学者Milstein创建杂交瘤技术, 首次成功地制备了小鼠单克隆抗体 (McAb) 即第二代抗体。80年代早期开始了基因工程抗体即第三代抗体的研究。基因工程抗体指通过基因工程方法改造和制备抗体, 它兴起于对鼠单抗的人源化改造, 至90年代初产生的抗体库技术将基因工程抗体的发展推向了高潮, 使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
抗克百威单克隆抗体的研制 篇2
用与牛血清蛋白(BSA)交联的克百威人工抗原(BFNB-BSA)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,得到1株能稳定分泌克百威抗体的.单克隆细胞株(1E8).鉴定结果表明,1E8的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.制备单克隆抗体腹水,腹水的间接ELISA酶联免疫吸附分析)效价在1×10-6以上.直接ELISA线性回归方程为y=15.701g(x)-5.879 5,产=0.990 4,抑制中浓度IC5o=35.1μg・-1,最低检测限IC20=5.2μg・L-1.该单克隆抗体与克百威特异性结合反应的50%抑制质量浓度为35.1μg・L-1.除丁硫克百威以外与其他克百威结构类似物无交叉反应.
作 者：金仁耀 吴建祥 朱国念 陈则利 寿林飞 JIN Ren-yao WU Jian-xiang ZHU Guo-nian CHEN Ze-li SHOU Lin-fei 作者单位：金仁耀,朱国念,陈则利,寿林飞,JIN Ren-yao,ZHU Guo-nian,CHEN Ze-li,SHOU Lin-fei(浙江大学农药与环境毒理研究所,浙江,杭州,310029)
吴建祥,WU Jian-xiang(浙江大学生物技术研究所,浙江,杭州,310029)
单克隆抗体制备例谈 篇3
在弄清什么是单克隆抗体之前，先让我们了解一下传统的抗体生产方法及缺陷是什么？传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种方法生产的抗体产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差、灵敏度低。如何克服这一缺陷呢？科学家们进行了多年的研究和探索。他们发现哺乳动物感染抗原后，体内会形成相应的B淋巴细胞（浆细胞）。B淋巴细胞能分泌特异性抗体，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。正是由于B淋巴细胞的这个特点，所以要想获得大量的单一抗体，必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是通过克隆形成细胞群，这样的单克隆细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强、灵敏度高的抗体，即单克隆抗体。然而在体外培养条件下，单个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，那么科学家又是怎样解决这一难题的呢？
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒设计了一个极富创造性的实验方案：把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行细胞融合，获得既能产生特异性抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞，并以此进行克隆化培养，生产出单克隆抗体。由于他们的杰出贡献，于1984年获得了诺贝尔生物医学奖。
例1 下列哪一项属于克隆（ ）
A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中
B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内
C．将小鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞
D．将某一肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系
解析 克隆是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同遗传信息的一群细胞或者生物的个体。现在还包括个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。
答案 D
二、单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备过程主要有以下基本步骤：
1．注射特定的抗原使小鼠产生免疫反应，从而能够从小鼠脾脏细胞获得能分泌相应抗体的B淋巴细胞；
2．诱导小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；
3．杂交瘤细胞的筛选、抗体的检测及克隆化培养；
4．将获得足够数量的能够分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行体外培养或体内培养，并从培养液或小鼠腹水中，提取出大量的单克隆抗体。
在上述基本步骤中，最关键的是筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。该步骤主要是进行两次筛选：第一次筛选是选择出杂交瘤细胞，并克隆杂交瘤细胞；第二次筛选是选择出能够产生所需抗体的杂交瘤细胞，并克隆能够产生所需抗体的杂交瘤细胞。
下面，我们通过一道例题来了解这两次筛选：
例2 已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。小鼠B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但细胞一般不分裂增殖。小鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合，并用灭活的仙台病毒诱导融合，获得杂种细胞。请根据上述内容分析回答：
（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。
（2）为了从培养基中筛选出杂种细胞，可在培养基中加入氨基喋呤，这是因为①B淋巴细胞本身 ；②小鼠骨髓瘤细胞及其融合细胞 ；③小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用 途径合成DNA而不断分裂增殖。
解析 在诱导小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合的过程中，会出现B细胞—B细胞、B细胞—瘤细胞、瘤细胞—瘤细胞的融合细胞和未融合的B淋巴细胞、瘤细胞。要将其中B细胞—瘤细胞融合的杂种细胞筛选出来，就要利用小鼠B淋巴细胞中有D和S两种DNA的合成途径，但细胞不分裂增殖；小鼠骨髓瘤细胞中没有S途径只有D途径，但能不断分裂增殖的特点。根据氨基喋呤可以阻断D途径的特性，在培养基中加入氨基喋呤阻断D途径，这样就使瘤细胞和瘤细胞—瘤细胞的融合细胞因无法合成DNA而不能增殖，B细胞和B细胞—B细胞的融合细胞本来就不能增殖，只有B细胞—瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用B细胞内的S途径合成DNA而不断分裂增殖，在培养基中存活下来。
答案 （1）2 （2）不增殖 由于氨基喋呤阻断了D途径，也不增殖 小鼠B淋巴细胞的S
从上面的例题可以看出在单克隆抗体的制备中对杂交瘤细胞的筛选是根据B淋巴细胞和瘤细胞各自的代谢特点，用特定的选择性培养基进行筛选。简单地说就是在这种培养基上只有B淋巴细胞—瘤细胞融合的杂交瘤细胞才能生长、增殖。
我们知道动物在免疫反应的过程中体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，而每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，因此筛选出的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，这就需要进行第二次筛选，将分泌所需抗体的杂交瘤细胞筛选出来。通常用“有限稀释法”来选择。这种方法是将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使一个培养孔中仅有一个杂交瘤细胞﹐这一个细胞经无性繁殖而生成一个纯系的细胞群（克隆）。然后检测（常用酶联免疫吸附试验法）各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。这一筛选过程就是教材中所说的对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测。
单克隆抗体技术的成功不仅在生物学基础理论的研究中具有重要意义，而且在实践上有很高的实用价值。单克隆抗体主要用于诊断试剂、治疗疾病和运载药物等许多方面。
【练习】
1．制备单克隆抗体时，在培养基中加入某种试剂能筛选出杂交瘤细胞，该试剂的作用是（ ）
A．能选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制
B．能激活淋巴细胞的原癌基因
C．能抑制淋巴细胞的DNA复制
D．能阻止杂交瘤细胞的核糖体上蛋白质的合成
2．单克隆抗体目前应用于下列临床检测中，错误的是（ ）
A．识别癌变细胞 B．识别病变细胞
C．识别病原体 D．识别致病基因
3．单克隆抗体与血清抗体相比，优越之处在于（ ）
A．单克隆抗体能够制成“生物导弹”
B．单克隆抗体可以在体外制备
C．单克隆抗体的特异性强、灵敏度高，产量也大大高于血清抗体
D．单克隆抗体的制备过程简单
4．下面是关于单克隆抗体制备的有关叙述，错误的是（ ）
A．首先向小鼠体内注射特定的抗原使小鼠产生免疫反应，然后从小鼠脾脏中获取能够产生相应抗体的B淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒的诱导下融合
B．在特定的鉴别培养基上筛选出杂交瘤细胞并培养
C．在体外条件下将杂交瘤细胞进行大规模培养或注射到小鼠腹腔里增殖
D．从细胞培养液或小鼠的腹水中，提取大量的单克隆抗体
【参考答案】
单克隆抗体纯化技术研究进展 篇4
关键词：单克隆抗体,单抗,沉淀法,色谱法
单克隆抗体,简称单抗,主要来源于免疫动物的腹水和杂交瘤细胞培养上清液[1]。单抗主要被应用于疾病的诊断和治疗,不论来源方式是那种,都要经过纯化才能被使用。单克隆抗体的纯化主要有沉淀法和色谱法两类方式。随着单克隆抗体生产的批量化、规模化,单克隆抗体的纯化技术也向大体积、短时间、低成本方向发展。
1沉淀技术
沉淀技术是根据蛋白质疏水性的不同,通过提高盐浓度,改变蛋白质的疏水性,使蛋白质沉淀从而达到蛋白质分离目的的一种纯化技术[2]。目前应用于单克隆抗体纯化方面的沉淀技术主要有辛酸沉淀法、硫酸铵沉淀法、辛酸硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、优球蛋白沉淀法五种方法。
1.1辛酸沉淀法。辛酸可以使腹水中的白蛋白和β、α球蛋白等杂蛋白沉淀下来。辛酸沉淀法就是利用辛酸这一特点,将保留于上清液中的抗体与杂蛋白分离开来。利用辛酸沉淀法纯化单克隆抗体可以减少抗体聚合,充分保留抗体活性。但是此种纯化方法也有其局限性,通过这种方法获得的抗体需要通过其他途径进行浓缩,回收率底,而且辛酸有使Ig G3和Ig A类抗体产生不可逆沉淀而失活的特点,不可用于此类抗体的纯化。目前,这种纯化技术常被用于Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig M亚类的纯化[3]。
1.2硫酸铵沉淀法30%-50%浓度范围内的硫酸铵能与免疫球蛋白形成沉淀。硫酸铵沉淀法就是利用这一特点将免疫球蛋白与其他杂蛋白分离开来的。该方法可稳定抗体,保持抗体活性,可以浓缩样本,并可以去除白蛋白、转铁蛋白等杂蛋白,但是由于通过硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体获得的纯度较低,因此,在实践中通常都会结合其他的方法进一步纯化。通过硫酸铵沉淀法纯化单抗时要注意经过硫酸铵沉淀后某些m Ab的活性会丧失,另外,硫酸铵沉淀法还会引起其他杂蛋白产生共沉淀,降低抗体的纯度。
1.3辛酸硫酸铵法沉淀法。在偏酸条件下,用辛酸硫酸铵沉淀法可以沉淀腹水或血清中除Ig G外的蛋白质,一般此法不用于Ig A和Ig M的纯化。辛酸硫酸铵沉淀法因其具有操作简单,抗体回收率高,产率高以及能够保持良好活性等优点被广泛应用于Ig G1和Ig G2b的纯化。
1.4聚乙二醇沉淀法,聚乙二醇沉淀法是利用聚乙二醇极强的吸水性将抗体分子析出。此方法用于Ig M的纯化时可以达到较高的纯度和回收率。
1.5优球蛋白沉淀法,此法用于Ig G3和Ig M的纯化可以保证良好的活性,同时保证较高的回收率。
2色谱技术
利用混合物各组分理化性质的不同,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中,由于在流动相中的各组分通过固定相的速度不同。来达到分离各组分的目的,此种方法即为色谱法。
2.1离子交换色谱。通过改变洗脱液PH值或盐离子的浓度将通过带有相反电荷与介质表面结合的抗体蛋白洗脱下来,从而达到抗体蛋白与杂蛋白分离的目的。利用此原理的离子交换色谱法主要有阳离子交换层析法、阴离子交换层析法、阴阳双层交换离子法,都可用于单抗的纯化,但要注意选择合适的PH值才能保证较高的抗体回收率。其中阴离子交换层析法主要用于Ig G的纯化。
2.2蛋白质A亲和色谱法蛋白质A因其与不同种属抗体间的亲和力不同,而被用于Ig G亚类的分离纯化。用蛋白质A亲和色谱法纯化抗体因其具有所得的纯度可以达到99%以上[4,5,6],对于抗体的浓缩浓度可达10g/L,适用范围广等优势,成为目前应用最普遍的单克隆抗体纯化方法之一。但是蛋白质A亲和色谱法作为纯化的一种方式也有它的劣势存在,比如抗体在低PH值下会有高分子聚合物和沉淀形成[7,8,9];会有杂质被一并洗脱,影响抗体的安全使用;蛋白质A使用周期短,价格高昂等等。针对存在的问题,蛋白质A亲和色谱法也在不断改进中。
2.3蛋白质G亲和色谱。使用蛋白质G亲和色谱法纯化抗体,无法将体系中的白蛋白和巨球蛋白除去[10,11],但是采用基因修饰改进后的蛋白质G可以解决这个问题。
2.4免疫亲和色谱。免疫亲和色谱法是利用抗原与抗体可特异性结合成抗原-抗体复合物的特性而形成的一种单克隆抗体纯化法。这是一种非常有效的抗体分开发,但是由于抗原的价格昂贵,对于这种纯化方法的大规模使用形成了限制。
除以上所述的方法外,常用的色谱分离法还有组氨酸亲和色谱法、凝胶过滤色谱法、疏水作用色谱法、亲硫吸附色谱法、疏水电荷诱导色谱法等方法[12],由于篇幅的问题,在这里无法一一阐述。
纯化方法虽多,但是要在使用时根据具体情况,找到最适合的纯化方法才能取得好的分离效果。
单克隆抗体技术在植物中的研究应用 篇5
单克隆抗体技术在植物中的研究应用
介绍了单克隆抗体技术及其基本原理,综述了单克隆抗体技术在植物病原菌、植物病毒及植物其他方面的`应用研究.
作 者：李亚璞 LI Ya-pu 作者单位：河北省生物研究所细胞生化研究室,河北,石家庄,050081刊 名：河北农业科学英文刊名：JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：13(4)分类号：Q813.2关键词：植物 单克隆抗体 病原菌 病毒
单克隆抗体 篇6
【关键词】 单克隆抗体；消化道出血；诊断意义
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.806 文章编号：1004-7484（2013）-11-6787-01
粪便隐血试验对消化道肿物和消化道溃疡及药物性消化道出血等出血性疾病的早期发现和诊断具有重要价值[1]。本文回顾性分析我院850例住院及健康查体患者粪便隐血检测的结果，现将结果报道如下：
1 资料与方法
1.1 研究对象 对我院2013年1月至2013年7月住院治疗机健康查体的850例患者，其中年龄1-75岁之间，男性450人，女性400人。所有患者分别采用两种方法对粪便标本进行检测，观察组使用单克隆抗体检测和对照组使用匹拉米洞法进行检测。
1.2 材料 ①本院850例住院患者随机粪便标本；②已知Hb浓度的抗凝全血1mL；试剂：胶体金单克隆抗体法采用万华消康保便潜血检测试剂标测试剂盒；匹拉米洞法采用BASO公司的检测试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 两种检测方法均严格按照各自的试剂盒说明书进行操作 分别用两种方法对本院850例住院患者的粪便标本进行隐血对照实验。单克隆抗体检测法特异性地针对粪便样品中的人血红蛋白（Hb），是一种高灵敏度的双抗体夹心免疫检验方法。具体操作为临床常规留取粪便标本，交代患者注意避免经血、尿血等污染并多点采集，以试剂盒配套的采便棒多点采取粪便配成粪便悬液，试纸条插入悬液。匹拉米洞法是利用血红蛋白中的含铁色有类过氧化酶作用，能催化过氧化氢，分解释出新生态的原子氧，在酸性环境中，可使白色匹拉米洞氧化产生紫蓝色，具体操作是取适量大便涂在检测窗口，滴加显色剂，根据有没有显色判断结果。
1.3.2 最低检测限检测 将已知Hb浓度的人抗凝全血用生理盐水稀释成浓度为10000、5000、2500、500、100、20、10、1.0、0.4、0.2、0.1μg/mL的红细胞悬液，用上述两种方法进行检测。
2 结 果
单克隆抗体法的阳性率为35%，匹拉米洞法为22%，其中黄褐色软便10例用单克隆抗体检测阳性而匹拉米洞法只有3例弱阳性，两组比较，P<0.05，差异具有统计学意义；胶体金单克隆抗体法可检测到的最低Hb浓度为0.2μg/ml，匹拉米洞法可检测到的Hb浓度不小于10μg/ml。
3 结 论
消化道出血是消化道疾病（无论肿瘤和非肿瘤）的主要症状之一，大便隐血试验（FOBT）是临床诊断和监测消化道出血是一个重要指标。也是检测消化道出血的最有效和最实用的方法之一，对早期发现和诊断恶性消化道肿瘤具有十分重要的意义。临床研究已经证实，粪便中有微量出血是早发现结、直肠癌症的唯一异常现象，所以对粪便中微量Hb的检出具有十分重要的意义，这就要求大便隐血试验必须具有高度的灵敏度及特异性[2]。粪便潜血试验方法主要是基于过氧化物酶反应或血色素-卟啉检测的化学反应法和基于特异性检测人血红蛋白的免疫法，粪便隐血的化学法主要有邻甲苯胺法、还原酚酞法、匹拉米洞法等，其原理基本相同，都是基于Hb中的亚铁血红素有类似过氧化酶活性，能催化H2O2作为电子受体使色原氧化呈色，呈色的深浅与Hb含量呈正比。化学法检测粪便潜血干扰因素较多，易受食物（肉、蔬菜、药材、铁等）、药物的影响[3]。免疫法粪便隐血试验和联苯胺等化学方法比较，胶体金单克隆抗体法采用特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，通过双抗体夹心法检测原理来定性检测人粪便标本中出现的人血红蛋白（Hb），检测结果不会因非甾体类消炎药物或维生素C等抗氧化剂及铁剂、动物血、辣根过氧化物酶等干扰，假阳性率低，能够较真实地反映消化道出血与否，不受饮食的限制具有简单、快速，较高的灵敏度和特异性，抗干扰能力强等特点[4]，而在临床得到广泛使用。本实验过程中其中黄褐色软便10例用单克隆抗体检测阳性而匹拉米洞法只有3例弱阳性。胶体金单克隆抗体法可检测到的最低Hb浓度为0.2/ml，而匹拉米洞法可检测到的Hb浓度则不小于10ug/ml，明显高于前者。由此可知，在消化道微量出血时，匹拉米洞法的检测灵敏度不及胶体金法，容易造成漏诊。对于粪便隐血试验来说，能否及早提示是否存在消化道出血对医生和患者的意义更大。综上所述，免疫法检测粪便隐血不易受饮食影响，具有快速、准确、灵敏度和特异性高的特点，因此早期消化道出血患者应用免疫法为主，化学法为辅，两者同时进行，可提高检测结果的准确性。
参考文献
[1] 杨玲，李连弟，陈育德，等.中国2000年及2005年恶性肿瘤发病死亡的估计与预测[J].中国卫生统计，2005，22（4）：218-221，231.
[2] 吳鹏，李艳，陈进，等.联合免疫法和化学法检测粪便隐血的临床应用评价[J].检验医学，2010，25（3）：176-178.
[3] 于培霞，便隐血试验免疫学方法的临床应用效果评价[J].临床医药实践，2013，1（22）：39.
单克隆抗体 篇7
随着分子生物学理论和实验技术的进一步发展,单克隆抗体血型鉴定方法在检测、鉴定ABO血型方面将有更广阔的应用前景。ABO血型鉴定除应用于临床医疗输血、器官移植、法医鉴定等领域外,在医学教育和科学研究领域以及出入境卫生检验检疫工作中也较为重要。传统的血型鉴定方法较多,其均对实验室的设备条件和技术要求高、检验程序繁杂、时间亦较长,相比之下新型的单克隆抗体血型鉴定试剂加平板法(玻片法)则明显优于传统鉴定方法,新型单克隆抗体鉴定A、B标准血清内血型抗体特异性强,其优势为操作简便、血型判定快速、鉴定效率高,准确率达100%,经济效益好,且不受设备、环境、条件的限制,具有可到现场检测的优点,适合于医院、机场、港口、学校和科研院所、教学单位、法医鉴定及抢救现场等实施快速血型鉴定,是一种新型的血型鉴定方法,无需仪器设备,只需一台低倍显微镜(偶遇假阳性凝集者在镜下做血型判定之用)。现将此方法及应用效果介绍如下,与同行交流探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
一次性采血针;2~5 mm厚度平板载玻片;消毒棉签;低倍显微镜;ABO单克隆抗体血型鉴定试剂[内含A、B标准血清各1瓶(10 ml)],长春生物制品厂生产;碘消毒液;75%酒精。
1.2 方法
鉴定过程中按教材要求和临床规定严格遵守操作规程。(1)取载玻片1张,用玻璃笔于载玻片两端标出A、B端;(2)将A、B标准血清分别滴于A、B端中央部位各1滴;(3)持棉签蘸取碘消毒液用于消毒采血部位(耳垂或手指尖择其一),之后再用75%酒精棉签脱碘;(4)持采血针垂直刺入皮肤,进针深度为1~2 mm,待血自然流出形成血滴;(5)取另一张载玻片用其2个角各采血一滴分别加入到A、B标准血清中顺时针混匀;(6)静置数秒至数分钟后肉眼观察,根据红细胞凝集反应现象和鉴定原理及血型的分型依据判定血型结果,如果有用肉眼不能确定(假阳性凝集者)的情况可在低倍显微镜下观察凝集反应,根据结果判定血型。
2 应用效果
此方法应用于临床输血和疾病治疗以及上述现场快速鉴定血型以来,检测效率大为提高,血型鉴定结果准确,凝集强度高,无一例定型错误,准确率达100%;鉴定快速,数分钟即可得出鉴定结果;经济效益好,每组试剂可鉴定数十人次;此方法所需采血量少(2滴左右);采血部位浅表(耳垂或手指尖),无痛感或微痛,易于被被检者接受。单克隆抗体血型鉴定法操作简便,结果判定准确,在ABO血型鉴定中具有很高的临床应用价值和社会价值。
3 讨论
应用效果表明,单克隆抗体血型鉴定法适用于医疗检验、法医鉴定、教学科研、出入境旅行等人群体检和急救现场的血型鉴定,此方法的最大优点是不受条件、设备等因素的限制,可到现场快速检测,对快速鉴定上述人群的血型具有实际意义,且操作便捷,深受检验和被检双方的欢迎。建议可在旅行医学、临床医学(医疗输血、器官移植中的交叉配血和配型试验等需做进一步的血清学检测)、教学科研、法医鉴定等领域推广应用,它不失为一种简便、快速、高效的血型鉴定方法,是提高检测效率的首选方法,单克隆抗体血型鉴定方法在鉴定ABO血型方面将有更广阔的应用前景。蒉
摘要：单克隆抗体血型鉴定方法用于人体ABO血型鉴定优势明显,其操作简便、经济实用,鉴定快速、高效,准确率达100%,且不受设备、环境、条件的限制,可克服传统方法操作繁杂、技术要求高、鉴定时间长的缺点,是提高检测效率的首选方法。
单克隆抗体 篇8
本节内容为人教版高中生物选修三《现代生物技术》中细胞工程的内容, 课标要求为“举例说出动物细胞融合与单克隆抗体”, 而高考考纲中为较高的Ⅱ级“理解”要求。单克隆抗体的制备和应用是近几年生物科学和医学发展的热点之一, 也是高考的常考题型, 比如2012江苏卷第22题、2011年江苏卷第14题、2010福建理综第32题、2010广东理综第24题、2010江苏卷第17题中都曾涉及。
高二理科学生有较强的自主学习、归纳知识能力, 可以要求学生在课前利用教辅资料和学案进行预习, 完成植物体细胞杂交技术和动物细胞融合的比较表格, 并思考单克隆抗体制备过程的相关问题, 以锻炼学生的自主学习和思考能力。学生在前一节已经学习了植物体细胞杂交技术, 为动物细胞融合的学习做了知识铺垫。单克隆抗体的制备是本节的重点难点, 学生在必修一第6章知道了癌细胞的特点、必修三第2章学习了免疫的相关知识, 这些将有助于对单克隆抗体的理解。制备过程中多次实验操作的原因及结果是学生较难理解的内容, 笔者设计了小组合作进行细胞模型模拟操作的探究活动突破这一难点。
二、教学目标
1.知识与能力
举例说出动物细胞融合与单克隆抗体技术及应用。
2.过程与方法
(1) 运用必修一中细胞的知识分析动物细胞融合与单克隆抗体的理论基础; (2) 小组合作探究活动中培养合作学习、探究式学习的能力; (3) 搜集有关单克隆抗体应用的资料, 进行整理、分析和交流。
3.情感态度和价值观
(1) 感受科学探究的魅力, 受到创新精神的教育; (2) 关注动物细胞融合与单克隆抗体的发展和应用前景。
三、教学重点和教学难点
1.教学重点
动物细胞融合、单克隆抗体的制备和应用。
2.教学难点
单克隆抗体的制备过程。
四、教学策略
通过填写比较表格培养学生的自主学习、知识迁移能力; 通过一段关于“蓝猫———单克隆抗体及生物导弹”视频激发学生兴趣, 让学生获得感性认识;通过利用纸质细胞模型模拟单克隆抗体制备过程的小组探究活动, 培养学生的合作精神和探究学习能力;通过两位学生利用PPT讲解单克隆抗体的应用锻炼学生搜集整理信息的能力、语言表达能力等。
五、教学过程
1.情景引入
(1) 教师行为
课件展示番茄—马铃薯杂交植物图片和必修一中“小鼠细胞和人细胞融合实验示意图”。两幅图片利用了什么生物技 术呢? (细胞融合) 动物细胞是否也能进行融合呢?展示教材中动物细胞融合的图片, 指出这就是要学习的内容:“动物细胞融合与单克隆抗体” (板书) 。
(2) 学生行为
回顾思考上一节课中植物体细胞杂交的知识, 积极思考、回答, 自然过渡到新知识的学习。
(3) 设计意图
温故知新, 体现新旧知识的联系、必修知识和选修知识的联系。
2.动物细胞融合
(1) 动物细胞融合概念、与植物体细胞杂交的比较
①教师行为
课件展示教材中动物细胞融合的概念, 并强调关键词:两个或多个、杂交细胞。
图片展示两个实例:受精作用、鸡血细胞融合。同一张课件中展示植物体细胞杂交和动物细胞融合的图片, 让学生说出两者的相同点和不同点。点评学生的回答。引导学生思考细胞两两融合后可产生几种杂交细胞并讲解。请同学们拿出预 习学案中的比较表格来, 根据PPT中的答案进行更正。
(答案 :全能、增殖、聚乙二醇PEG、灭活的病毒、果胶酶、胶原酶、杂种植物、细胞产品、遗传物质)
②学生行为
理解动物细胞融合的概念, 利用实例加深对概念的认识。填写植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较表格。
③设计意图
通过强调关键词、举例等方法加深学生对概念的理解。学生通过填写与植物体细胞杂交的比较表格培养知识迁移、构建知识网络的能力。 通过让学生思考细胞两两融合后会产生三种杂交细胞为单克隆抗体的知识做好铺垫。
(2) 动物细胞融合的意义与应用
①教师行为
请学生结合植物体细胞杂交的意义思考动物细胞融合的意义。在实际应用中, 多数动物细胞融合都是为了制备单克隆抗体。那么什么是单克隆抗体? 有何作用? 如何制备呢? 播放视频:“蓝猫———单克隆抗体及生物导弹”。请同学们观看的同时思考两个问题:制备单克隆抗体运用了什么技术? 单克隆抗体的优点?
②学生行为
动物细胞融合突破了有性杂交方法的局限, 使远缘杂交成为可能。观看视频, 思考问题。
③设计意图
由动物细胞融合的应用自然引入单克隆抗体的知识, 然后以一段视频展示单克隆抗体的概念、制备, 视频中幽默的语言激发了学生的学习兴趣。
3.单克隆抗体
(1) 传统抗体与单克隆抗体
①教师行为
利用问题串引出单克隆抗体。问题1:获得抗体的传统方法是什么? 有何缺陷? 问题2:抗体由什么细胞产生的? (课件展示:必修三免疫调节一节中的图片, 说明一种B淋巴细胞只能产生一种抗体。) 问题3:如何才能让B淋巴细胞产生单一大量抗体? (课件展示:一个B淋巴细胞→细胞群→抗体, 即为单克隆抗体。) 问题4:什么细胞是可以无限增殖的? (课件展示: 骨髓瘤细胞是一种癌细胞) 问题5:如何才能将两种细胞的特点结合起来? (课件展示:如果将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合, 那么融合后的细胞就可能既能迅速大量繁殖, 又能产生专一抗体。 ) 很好, 同学们都想到了利用动物细胞融合的方法, 其实早在1975年两位科学家成功制备了单克隆抗体, 并因此获得了1984年的诺贝尔奖。PPT展示两位科学家的照片。
②学生行为
依次回答。问题1:向动物体内反复注射某种抗原, 然后从血清中提取。缺陷是产量低, 纯度低, 特异性差。问题2:由B淋巴细胞分化来的浆细胞分泌。问题3:一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群, 就能生产种类单一、特异性强的抗体。问题4:癌细胞。问题5:动物细胞融合。
③设计意图
通过环环相扣、层层递进的问题串引发认知冲突, 引导学生联想到只有将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合才能获得单克隆抗体。充分调动学生的旧知识构建新知识, 体现必修与选修知识的联系, 帮助学生构建单克隆抗体的概念。
(2) 单克隆抗体的制备过程
①教师行为
下面同学们认真理解教材图2-24, 阅读P54, 思考学案上制备过程的8个小问题, 然后分4人一个小组用纸质细胞模型模拟单克隆抗体的制备过程。此时向每个学生小组提供纸质细胞模型和剪刀、双面胶等工具。模型由一张细胞模型和一个流 程示意图组成, 均由一张A4纸打印而成。 (8个问题为:为什么向小鼠注射羊红细胞? 从小鼠脾脏中获到的B淋巴细胞有哪些类型?细胞两两融合后, 产生几种融合细胞?如何把杂交瘤细胞筛选出来?杂交瘤细胞有何特点?如何得到大量杂交瘤细胞?如何挑选出分泌羊抗红细胞抗体的细胞群?利用抗体阳性的杂交瘤细胞得到大量单克隆抗体的两种途径是什么? ) 教师在学生活动期间了解各小组的活动过程, 不时加以指导。随后让某个小组代表展示完成的流程图。教师按照8个问题的顺序讲解单克隆抗体的制备过程, 同时点评学生做的流程图。注意强调三种融合细胞、两次筛选、克隆化培养、抗体检测等知识要点。总 结归纳单克隆抗体的优点, 注意与传统抗体的特点相比较。
②学生行为
学生先自主学习, 阅读教材。再组成探究小组集体讨论每一个实验操作的原理和结果, 以及流程示意图中每个位置应该贴哪些细胞。最后进行粘贴纸质细胞模型的操作, 在操作中体验单克隆抗体制备中的每一个实验步骤的操作及原理。得出单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、可大量制备的特点。
③设计意图
这一部分是本节课的核心环节, 能否有效充分地实施这一环节直接关系到本节课的教学效果。此环节大约需要15分钟。学生在之前的视频中已经对单克隆抗体的制备有了感性认识, 在这一探究活动的开始阶段再结合教师给出的8个问题进行自主学习, 加深了理解。随后小组成员在讨论如何粘贴细胞模型的过程中必然会有观点的交流碰撞, 这种交流又一次加深了学生的认识。学生在探究活动中培养了自主学习能力、小组合作探究和交流能力及动手实践能力, 等等。教师点评一个小组探究结果的同时讲解单克隆抗体制备过程, 强调科学实验的严谨性, 使学生感受科学探究的魅力, 受到创新精神教育。
(3) 单克隆抗体的应用
①教师行为
下面请两位同学与大家分享单克隆抗体的应用。 (点评)
②学生行为
两位学生利用PPT讲解单克隆抗体在诊断试剂、治疗疾病方面的应用。在讲解诊断试剂时, 学生以淘宝店主的身份介绍了验孕棒的原理和使用方法, 其搞笑幽默的语言、夸张的表情博得了学生的阵阵掌声。其后举例说明了生物导弹的原理。
③设计意图
学生对单克隆抗体应用的内容比较感兴趣, 且易于理解, 因此课前让学生小组合作搜集整理信息, 然后在课堂上与全班同学进行分享交流, 培养学生获取整合信息的能力、语言表达能力。学生了解了单克隆抗体的应用的同时体会科学、技术、社会三者的联系, 受到了STS教育思想的影响。
4.课堂小结
(1) 教师行为
以流程图的形式对本节内容进行归纳、总结。
(2) 学生行为
学生随着老师的思路集体回答问题, 总结、归纳、反刍知识。
(3) 设计意图
有利于学生的知识构建, 达到了巩固升华的目的。
参考文献
[1]杜永娟, 樵福奎.小纸片、大用处.中学生物学, 2012 (2) :33-34.
[2]孔爱华.“单克隆抗体的制备”的教学设计.生物学教学, 2010 (2) :14-15.
单克隆抗体 篇9
1 材料和方法
1.1 研究对象
选取某幼儿园2～4 岁 (平均年龄3.8 岁) 儿童84 人, 取得幼儿家长和幼儿园的同意, 临床取样前2 周未服用广谱抗生素。
1.2 实验方法
1.2.1 临床检查及采样
人工光源下采用CPI探针和一次性口镜检查实验儿童的龋补牙数 (dft) , 龋补牙面数 (dfs) , 龋齿诊断采用WHO口腔健康调查基本方法第4 版标准[6]。取样时间为上午9～10 点之间。嘱幼儿将1 ml非刺激性唾液吐入到容积约3 ml的无菌试管中, 立即置于冰中保存, 2 h内送回实验室样本处理。
1.2.2 唾液标本变形链球菌的检测
1.2.2.1 变形链球菌标准株
将SM (c型, 首都医科大学微生物研究所) 于BHI液中增菌备用 (复苏、增殖等) 。
1.2.2.2 制作标准曲线
将SM标准株菌液序列稀释 (10、 100、 1 000) , 用白细胞计数板计算序列稀释液的变形链球菌密度 (/ml) ;取各稀释密度的菌液10 μl, 加入10 μl浓度为10 μg/ml的变形链球菌特异性单克隆抗体 (SWLA, Shi) , 常温下孵育30 min, 后加入1 μl FITC (1∶50, 中杉金桥) , 常温下避光孵育30 min;取5 μl上述反应液于荧光显微镜 (BX- 60, Olympus) 下观察。变形链球菌判断标准:高亮, 形态为链状 (图 1) 。根据此标准40 倍下观察10 个视野并计数, 计算每个视野内平均变形链球菌数。将已知密度的标准菌液的密度和视野内平均变形链球菌数进行回归分析, 得回归曲线, 用于下一步唾液中的变形链球菌密度的计算。
1.2.2.3 唾液标本染色和观察
观察方法同标准株。唾液变形链球菌镜下判断标准:荧光显微镜下发亮, 普通光学显微镜下对应有细菌形态 (图 2、3) 。得出视野内平均变形链球菌个数, 通过上述标准曲线得出唾液中的变形链球菌密度。每次染色观察唾液标本时, 单独绘制标准曲线, 保持实验条件和观察条件的一致。
注:右下角为放大图像
1.2.3 治疗后唾液SM检测
选取25 名患龋儿童给予充填治疗, 充填1 周后按以上步骤再次检测唾液变形链球菌水平。
1.2.4 PCR 检测
1.2.4.1 提取DNA
随机挑选26 份唾液标本, 采用Bacteria DNA Mini Kit (50) 试剂盒 (上海华舜生物工程有限公司) 提取DNA。
1.2.4.2 PCR鉴定SM
PCR扩增的方法如下:2 μl的DNA模板, 25 μl的PCR Master Mix (Promega) , 13 μl的去离子水, 5 μl的primer1 (CP28:GGT CAG GAA AGT CTG GAG TAA AAG GCT A) (赛百盛) , 5 μl的primer2 (CP29:GCG T[A GCT CCG GCA CTA AGC C]) (赛百盛) 。反应条件为: 95 ℃ 1 min, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 个反应循环, 95 ℃预变性5 min, 72 ℃延伸5 min。然后于1.2%琼脂电泳 (电压100 V, 50 min) , EB (溴化已锭) 染色观察。
1.2.5 统计分析
运用SPSS录入数据, 并进行统计分析。对样本人群的变形链球菌水平进行描述性分析;运用独立样本t检验比较无龋组和有龋组唾液变形链球菌水平的差异;运用配对t检验比较受试儿童治疗前后变形链球菌水平的差异。
2 结 果
受试儿童的患龋率为51.2%, 龋补牙均数 (dft) 为1.65, 龋补牙面均数 (dfs) 为3.61; 标本中变形链球菌最大密度为3.2×106/ml, 最小浓度为1.2×105/ml, 平均密度为1.0×106/ml, 变形链球菌的检出率为100%;无龋组 (dft、dfs=0) 和有龋组 (dft、dfs>0) 间变形链球菌水平差异均无显著性 (表 1) 。
独立样本t检验
25 名受试儿童治疗后唾液变形链球菌水平低于治疗前, 有统计学差异 (表 2) 。
PCR检测的26名儿童的唾液变形链球菌检出率为100%。结果见图 4 (1- 4#标本) 。
配对t检验
3 讨 论
目前用于检测口腔中变形链球菌的方法很多, 如传统培养方法, 以及后来依据培养法原理设计的Dentocult- SM试剂盒[7]等, 到上世纪90 年代开始的PCR技术, 都是目前变形链球菌检测的常用方法。本实验采用变形链球菌特异性单克隆抗体检测3 岁左右幼儿园儿童唾液中的变形链球菌水平, 其中用PCR鉴定为变形链球菌感染阳性的26 份唾液标本, 使用单克隆抗体技术检测阳性率达100%, 灵敏度达100%。每个样本的检测只需数分钟, 缩短了操作时间;每个样本消耗的成本低;同时该方法对于实验设备的要求不高, 普通的荧光显微镜即可满足实验要求。
本实验中变形链球菌特异性单克隆抗体能够显示患龋儿童干预前后变形链球菌水平的变化, 提示该技术可以为幼儿患龋人群唾液变形链球菌水平的监测提供一种可行的方法。
目前还没有应用单克隆抗体技术检测变形链球菌来评价其和患龋状况关系的研究报道, 本实验中变形链球菌特异性单克隆抗体计数唾液变形链球菌水平未能反映试验人群患龋状况, 同以往的研究结果不一致[8,9,10], 提示临床应用该技术评价变形链球菌水平和患龋状况的相关性方面仍需做进一步研究。
单克隆抗体技术检测唾液变形链球菌, 样本来源简单, 灵敏度高, 试验操作快捷, 适合临床监测以及大样本的流行病学研究和调查。本研究初步探讨其和患龋状况之间的相关关系, 为促进其在临床应用提供基本理论依据与经验。
(致谢:感谢UCLA施文元教授提供变形链球菌特异性单克隆抗体SWLA, 感谢首都医科大学微生物研究所提供变形链球菌标准株!)
参考文献
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单克隆抗体 篇10
关键词：三聚氰胺,单克隆抗体,鉴定
三聚氰胺又名蜜胺、三胺、三胺三嗪、氰尿三酰胺,分子式C3H6N6,相对分子量126.15。可溶于热水、热醇、吡啶、甘油,也溶于氢氧化钠和氢氧化钾水溶液。加热易升华,急剧加热则分解,放出氰化物、氮氧化物和氨等有毒物质,是一种重要的氮杂环有机化工原料。目前认为,三聚氰胺单独摄入毒性轻微,然而动物长期摄入则会造成生殖、泌尿系统的损伤、膀胱和肾脏结石,甚至可进一步诱发膀胱癌。
目前用于检测食品、饲料、乳制品中三聚氰胺的方法主要是高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法,但这些方法所需仪器试剂昂贵,对样品前处理和检测操作要求非常严格,无法满足日常大批量检测三聚氰胺的要求,因此研制操作简单,敏感性高,建立特异性强的检测方法成为科研人员关注的焦点。本实验建立的高亲和力抗三聚氰胺单克隆抗体为研制高敏感的ELISA试剂盒提供了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SPF级BALB/C小鼠,购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心;SP2/0骨髓瘤细胞由哈尔滨兽医研究所相文华研究员惠赠。99.0%三聚氰胺标准品,德国Simon Aldrich公司产品;BSA,为上海华舜生物工程有限公司产品;OVA和PEG3350为Solarbio公司产品;弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FI A)、HAT、HT、HRP标记山羊抗鼠二抗均为Sigma公司产品;DMEM细胞培养基为HyClone公司产品;胎牛血清为GiBco公司产品;单克隆抗体分型试剂盒为SouthernBiotech公司产品,其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 MAb的制备及鉴定
1.2.1 三聚氰胺偶联大分子抗原的制备及鉴定
对Fleeker和Lovett所研究的重氮法加以改进,进行三聚氰胺免疫抗原(三聚氰胺-BSA)和三聚氰胺包被抗原(三聚氰胺-OVA)的偶联,合成路线如图1。将偶联反应产物于4℃下用10倍体积的PBS透析72h,每隔6～8h换液一次,除去未反应的小分子物质。将透析后得到的偶联产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,将偶联产物分装存放于-20℃。
1.2.2 动物免疫及MAb的制备
以蛋白含量100μg的三聚氰胺-BSA与等量弗氏完全佐剂乳化后,免疫5周龄雌性BALB/c小鼠;在首免后第21天和第42天后用100μg的三聚氰胺-BSA与等量弗氏不完全佐剂乳化后免疫小鼠;第63天四免。四免后第14天以半量免疫剂量攻脾加强免疫,加强免疫后3d,无菌取免疫小鼠脾细胞,常规方法细胞融合,融合后第7天对融合细胞进行半量换液。
1.2.3 间接ELISA方法检测效价
融合后第14天,以2.5μg/mL三聚氰胺/OVA作为抗原包被ELISA板,取融合上清液采用间接ELISA方法检测效价,并以SP2/0细胞培养上清和免疫小鼠阳性血清分别做阴阳性对照,初步建立筛选MAb的间接ELISA方法,判定标准为阳性血清的OD492nm值在1.0左右,阴性血清OD492nm<0.2且P/N≥2.1。
1.2.4 腹水的制备及纯化
按照常规方法收集制备腹水,收集到的腹水3000rpm低温离心10min,去除脂肪和其他残渣,收集中间澄清层采用辛酸～硫酸铵法或过蛋白层析柱纯化腹水,分装-20℃冻存备用。纯化后的腹水利用紫外分光光度计测定其蛋白含量,SDS-PAGE测定轻、重链分子量及纯度,免疫印记法鉴定免疫学活性,并用间接ELISA方法测定其效价。
1.3 MAb的鉴定
1.3.1 杂交瘤细胞的克隆化培养及稳定性检测
对冻存的杂交瘤细胞分别在第3月,第6月复苏,连续传4代,并收集细胞培养上清做ELISA和Western-blotting鉴定,确定其仍为单克隆细胞株,没有发生突变和丢失。
1.3.2 单克隆抗体与包被抗原的交叉反应
用纯化后适当稀释的单抗,通过间接ELISA法测定单抗与OVA、三聚氰胺-OVA、BSA、三聚氰胺-BSA的交叉性,包被浓度各为5μg/mL。
1.3.3 单抗分型鉴定
按照SouthernBiotech的SBA Clonotyping System/HRP试剂盒说明书进行。
1.3.4 杂交瘤细胞染色体数目分析
采用唐建设所述的方法,进行杂交瘤细胞染色体数目分析。
2 结果
2.1 抗原偶联效果
将三聚氰胺-OVA、OVA、三聚氰胺-BSA、BSA进行12%SDS-PAGE电泳,见图2。
2.2 杂交瘤细胞株的建立
经筛选和克隆化得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为3G4将其扩大培养并冻存,连续传代,反复冻存、复苏,仍能稳定分泌抗三聚氰胺抗体,且细胞上清效价均在1:1600以上,生长状态良好,无污染情况。
2.3 纯化后腹水单抗基本特性测定
经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,紫外可见分光光度计测定腹水蛋白含量为5.67mg/mL。经SDS-PAGE电泳(见图3),对照Marker位置得到轻链分子质量约32KD,重链分子质量约54KD,分子质量约为172KD,纯度可达80%以上,间接ELISA测定腹水效价1:2.048×106。
2.4 单抗免疫印记鉴定
实验结果如图4所示,第三道三聚氰胺-OVA位置出现条带,而阴性对照OVA位置无条带出现,说明单抗对相应抗原的特异性结合。
2.5 单克隆抗体与包被抗原交叉反应性测定结果
通过间接ELISA法测定单抗与OVA、三聚氰胺-OVA、BSA、三聚氰胺-BSA的交叉性试验结果见表1,从表中得到如下结果:3G4单抗腹水与三聚氰胺-OVA和三聚氰胺-BSA反应,而与OVA和BSA不反应。
2.6 单抗亚型鉴定结果
鉴定结果表明,单克隆抗体3G4的亚型为IgG2b,轻链为κ链。
2.7 杂交瘤细胞染色体数目分析结果
染色体数目分析结果为本研究获得杂交瘤细胞的染色体数目为93条,该数值接近脾细胞与骨髓瘤细胞的染色体数目之和,表明该株杂交瘤细胞为脾细胞和骨髓瘤细胞融合的细胞。
3 讨论
半抗原的分子量是影响抗体亲和力、灵敏度和特异性的重要因素,Chappey等发现半抗原的分子量在334～374Da之间时,制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时,产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。三聚氰胺分子量为126.15,需要与大分子载体蛋白共价偶联形成“半抗原-载体蛋白”偶联物才具有免疫原性,但其结构导致在与载体蛋白连接的部位很容易受到屏蔽,所以最好选用简单的偶联方法,并且连接间隔臂,充分暴露三聚氰胺的重要抗原表位。
由于免疫抗原为蛋白偶联物,其诱生抗体比正常蛋白质和病毒抗原慢且少,故在免疫过程中采用4次免疫,每次间隔3周,加强免疫时采用攻脾的方法,达到最大程度的提高抗体效价。
对单抗进行亚型和特异性等鉴定,表明本研究得到的单抗具有较强的特异性,为下一步竞争ELISA方法的建立和胶体金试纸条的研制奠定了基础。
参考文献
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