蛋白酶激活受体

关键词：

蛋白酶激活受体（精选九篇）

蛋白酶激活受体 篇1

关键词：脑出血,电针,百会,蛋白酶激活受体-1,血脑屏障

头针(scalp acupuncture,SA)是指利用毫针去穿刺刺激头皮的特定区域,是在传统针灸理论的基础上,结合现代解剖学、神经生理学和全息生物学发展起来的[1]。有相关系统评价表明,SA可以有效改善急性脑出血病人的神经功能缺损症状[2]。其中,百会穴是督脉上最重要的穴位之一,它位于人头顶的最高点,所有的阳经汇集于此。最新磁共振3D重建技术显示,百会穴位于额叶中央前沟前部[3]。针灸百会穴能提神醒脑,滋阴补阳,补肾固涩,祛除内风,促进复苏。因此,针灸百会穴特别适用于治疗脑中风等神经系统疾病,且已有研究表明,百会穴(GV20)是SA治疗急性脑出血非常关键的穴位[4]。

蛋白酶激活受体(protease activated receptors,PARs),是一种经典的七次跨膜G蛋白偶联受体,有7个疏水的螺旋状跨膜区域,从而形成3个胞外环状结构和3个胞内环状结构。目前已知的PARs有四种:PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4[5]。其中PAR-1、PAR-2、PAR-3由凝血酶激活,PAR-2由胰蛋白酶或胰岛素样蛋白酶激活。其中PAR-1主要分布在神经系统中,以神经元、星型胶质细胞为主[6]。PAR-1被作为第一信号分子凝血酶激活后,启动胞内信号转导发挥作用。有脑出血后早期脑水肿可能是凝血酶激活PAR-1引起神经的轴突、树突和胶质细胞的突起回缩,造成细胞损伤; 后期脑水肿主要是由于凝血酶通过激活PAR-1使毛细血管内皮细胞发生收缩,细胞间隙增大,紧密连接开放导致血脑屏障(BBB)破坏,BBB通透性明显增高可使脑水肿明显加重[7]。因此,本研究旨在探讨电针百会透曲鬓穴治疗急性期脑出血大鼠的疗效及对PAR-1表达的影响,以期为针灸治疗脑出血提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物

成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠108只,体重250 g~300 g。采用完全随机的方法分为3组:假手术组、模型组、电针组。除假手术组外,每组依据不同时间点分为4个亚组,即6 h、1 d、3 d、7 d组,每个亚组取12只大鼠。

1.2脑出血模型的制备

参照Rosenberg方法[8],将大鼠用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于立体定位仪上,头顶剪毛,常规消毒,正中切口,骨膜剥离器剥离骨膜,暴露前囟及冠状缝,以前囱为坐标原点,向右旁开2.9 mm,向后0.2 mm确定注射点坐标,用牙科钻在颅骨表面钻直径为0.8 mm的圆孔,穿透颅骨但不伤及脑组织,用固定在立体定向仪上的5μL微量注射器(针头直径0.7 mm)沿钻孔进针垂直插入脑组织6 mm,到达尾状核位置,10 min缓慢匀速注入含0.6 U/μL Ⅶ型胶原酶的生理盐水(nor-mal saline,NS)3μL,留针10 min,然后缓慢出针,用骨蜡封闭颅骨上的钻孔,缝合切口。假手术组:不注射胶原酶,其余操作同模型组。

1.3电针治疗方法

参照华兴帮等制定的《实验动物穴位图谱》,定位“百会”和“曲鬓”穴。将大鼠固定于实验架上,在百会穴位处常规消毒,选用30号2.5 cm不锈钢毫针,快速刺入皮下并斜向右下方达曲鬓穴,针刺方法参照《常用动物动物腧穴图谱》标准。将一块生理盐水湿润的纱布绑在大鼠尾巴根部,另一根毫针插在此纱布中。将G6805-2型电针治疗仪正极接百会穴毫针,负极接大鼠尾巴毫针,连续波,频率2 Hz,强度0.2mA,留针30 min。电针治疗组于造模后6 h开始治疗,每天进行电针治疗1次。模型组只是固定于实验架上30 min,不进行任何治疗。假手术组不进行任何电针处理。

1.4神经功能缺损评分

各组大鼠造模术后,待大鼠清醒,分别于术后6 h、1 d、3 d、7 d采用Longa五级评分法[9],进行神经功能缺损评分。术后6 h评分为1分~3分的视为成功模型。具体评分如下,0分:无神经功能缺损症状;1分:提尾时病灶对侧前肢不能完全伸展,为轻度缺损症状;2分:行走时向病灶对侧转圈,为中度缺损症状;3分:行走时向病灶对侧跌倒,为重度缺损症状;4分:无自发性活动,伴意识障碍。

1.5 伊文思蓝(evans blue,EB)测定血脑屏障通透性

在各个时间点处死的前90 min,进行腹腔麻醉大鼠,经股静脉注射2% EB生理盐水溶液(4 mL/kg),注射成功后可见大鼠眼睛及四肢迅速变蓝,90 min后开胸,分离心包膜,从左心室插管,插管成功后用动脉夹固定,进行生理盐水快速灌注,剪破右心耳,直到右心耳流出清亮的液体后停止灌注,每只模型需200 mL~250 mL生理盐水。迅速断头取脑,将脑组织分成左右两半,称重后分别放入3 mL的甲酰胺溶液中,60 ℃恒温水浴箱中放置24 h,脑组织显现为无色透明状,各管甲酰胺溶液为深浅不同蓝色,取出脑组织后5 000r/min离心甲酰胺溶液2 0 min,取上清液再1 0 0 0 0r/min离心10 min,取上清液用多功能酶标仪在632nm波长测甲酰胺中EB的OD值,用纯甲酰胺溶液作对照组。计算脑组织中EB含量公式:脑组织中EB含量(μg/g脑湿重)=标准品EB含量(μg/mL)×甲酰胺量(mL)÷脑湿重(g),其中标准品EB含量(μg/mL)用标准曲线直线回归方程求出。

1.6 PAR-1检测

1.6.1免疫组化

各组大鼠在出血后不同时间点给予水合氯醛深度麻醉,迅速打开胸腔,经左心室灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS 0.01 mol/L,pH7.4)50 mL冲洗血管,继之以200 mL磷酸缓冲液(PBS 0.01 mol/L,pH7.4)配制的含4% 多聚甲醛固定液灌注固定脑组织,断头取脑,置于中性甲醛溶液中固定。标本经脱水,石蜡包埋,在切片机上连续切片,片厚3μm,作免疫组化染色。按试剂公司推荐三步法操作。为确保实验结果的真实性和客观性,染色结果判定由专人单盲阅片。PBS代替一抗作空白对照,用已知阳性标本作阳性对照。在用OlympusCH2 型显微镜(10×20 倍)下,随机取每张脑片6 个不重叠视野,计数PAR-1 阳性细胞数。

1.6.2荧光实时定量PCR

采用Trizol一步法从血肿周围脑组织中提取总RNA,行琼脂糖凝胶电泳检测,用紫外分光光度仪检测RNA纯度。然后取4μL总RNA经反转录酶及随机引物等反应物混合配成20μL体系,42 ℃ 15 min,95 ℃ 2 min反转录成cDNA,随后进行实时荧光定量RCR反应,大鼠PAR-1 引物序列:上游引物5′-CTCAGCCTGTGCGGTCCT-3′,下游引物5′-AAGTAGACTGCCCTGCCCTC-3,扩增片段206 bp;以大鼠β-actin基因为内参照,引物序列为:上游:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,下游5′-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3′,扩增片段206 bp。实时荧光定量PCR产物利用公司自带的系统软件分析,可观察扩增曲线,并对cDNA的含量进行定量分析,计算样本的△△Ct值。

1.7统计学处理

计量资料以均数±标准差( ±s)表示,两组间均值的两两比较采用SNK法,多组间均值比较方差齐时进行单因素方差分析,方差不齐时采用秩和检验(Keuskal-Wallis法等)。

2 结果

2.1大鼠神经功能缺损评分

模型组大鼠神经功能缺损评分6 h即开始升高,1 d达到高峰,随后开始降低,在术后7 d仍高于正常水平。电针治疗组大鼠神经功能缺损评分与模型组呈相同的变化趋势,1 d神经功能缺损评分最高,随后开始降低,7 d稍高于正常水平。模型组与电针治疗组大鼠在脑出血后6 h、1 d、3d、7d比较,差异有统计学意义(P <0.0 5)。详见表1。

分

2.2脑出血后大鼠血脑屏障通透性

假手术组、电针治疗组与模型组大鼠相比,术侧脑组织EB含量在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d时间点差异均有统计学意义(P <0.05);电针治疗组与假手术组EB含量在脑出血后6 h、1 d时间点比较有统计学意义(P <0.05)。详见表2。

μg/g

2.3免疫组化检测PAR-1的表达

PAR-1蛋白的表达阳性细胞染色主要在胞膜、胞浆,可清楚分辨胞核的形态。 正常大鼠大脑PAR-1 蛋白表达轻度阳性,模型组6 h时PAR-1表达强度开始增强,24 h时PAR-1表达进一步增加,3 d时表达亦较为强烈,然后开始下降,7 d时明显下降,向假手术组水平靠近。在6 h、24 h、3 d及7 d各时间点,模型组和电针组的PAR-1阳性细胞数与假手术组比较差异均有统计学意义(P <0.05),电针治疗组与假手术组的PAR-1阳性细胞数比较差异有统计学意义(P <0.05)。详见表3。

2.4荧光实时定量PCR测定PAR-1mRNA的表达变化

PAR-1模型组在6 h表达开始上升,1 d时进一步表达增加,3 d仍处于较高水平随后又下降,7 d时仍高于正常水平。模型组与假手术组比较在各时间点比较差异有统计学意义(P <0.05),电针治疗组与模型组比较在各时间点比较差异有统计学意义(P <0.05)。详见表4。

3 讨论

1990年,Rosenberg等[8]第一次采用注入胶原酶方法在SD大鼠身上成功制成脑出血动物模型。胶原酶是一组可以特异降解基底膜和间质胶原成分的金属基质蛋白酶,分Ⅰ型~Ⅷ型,最常使用来制备脑出血动物模型的是Ⅳ型及Ⅶ型胶原酶。RoSenberg模型,利用脑立体定位仪,9 min内向大鼠尾状核内注入2μL含有0.01~0.1单位Ⅺ型或Ⅶ型胶原酶的生理盐水,注射10 min即可观察到脑出血及水肿的形成。此方法制造的模型很好地模拟了自发性脑实质内出血的发生和血肿的扩大,以及脑水肿的形成[10]。本实验研究中采用胶原酶诱导法制造脑出血大鼠模型,利用脑立体定位仪向模型大鼠脑尾壳核注入Ⅶ型胶原酶。大鼠脑内最大的核团是尾壳核,立体定位非常容易,尾壳核最容易发生自发性脑出血,因此选用尾壳核定位。术后的大鼠都出现了不同程度的神经功能缺损症状,证明动物模型成功。大鼠脑出血模型制作成功后,会出现病灶对侧肢体不同程度偏瘫、无力等神经功能缺损症状。本实验采用经典的Zea Longa五分制评分方法[9],结果显示:模型组在脑出血后6 h神经功能缺损评分即开始升高,在1 d达到高峰,随后开始下降。电针治疗组与模型组相比差异有统计学意义,说明电针百会透曲鬓穴在脑出血急性期能改善神经功能缺损症状,有明显的治疗效果。

BBB存在于脑组织与血液之间,是由无窗孔的毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞的足突和基底膜组成的复合体,结构复杂。生理情况下,BBB对水分子高度通透,使脑脊液以自由扩散方式与脑、脊髓进行持续交换,维持中枢神经系统内环境稳定和大脑功能的正常行使。伊文思蓝是一种偶氮基荧光染料,作为常用的BBB的示踪剂,分子量为960.81,可以结合血清蛋白,形成蛋白质复合物,在血脑屏障破坏时或通透性增加时,通过间隙渗入到组织。有研究报道[11],在组织间隙中EB的量与BBB通透性成正比,即BBB破坏越严重组织间隙中EB的量越多。因此,目前已有不少实验研究采用测量脑组织EB含量的方法来了解脑出血后BBB通透性改变的情况,且研究表明,脑组织EB含量在脑出血后明显升高,并在脑出血后1 d达到高峰期[12,13,14]。本课题用多功能酶标仪测脑组织中所含EB的OD值,从而算出EB的含量。实验结果显示,脑出血后6 h脑组织EB含量即明显升高,并在脑出血后1d达到高峰期。电针治疗组与模型组相比在各个时间点差异均有统计学意义,说明电针百会透曲鬓穴在脑出血急性期能降低BBB通透性,减轻BBB损伤。

层粘连蛋白受体研究进展 篇2

层粘连蛋白受体研究进展

层粘连蛋白受体(LR),是重要的细胞外基质成分层粘连蛋白的受体.它是一个多功能蛋白,与肿瘤细胞的转移密切相关,能够介导病毒和朊蛋白与宿主细胞的相互作用,并且参与细胞的.信号转导.本文就层粘连蛋白受体的生物学功能以及在疾病治疗方面的研究进展进行综述.

作 者：武瑞琴 朱旭东 黄培堂 WU Rui-Qin ZHU Xu-Dong HUANG Pei-Tang 作者单位：军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071刊 名：军事医学科学院院刊 ISTIC PKU英文刊名：BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES年，卷(期)：30(4)分类号：Q51关键词：受体,层粘连蛋白 肿瘤转移 病毒 朊蛋白 信号转导

蛋白酶激活受体 篇3

孕激素受体(PR),是核受体家族中的重要转录因子[1]。分A、B两种亚型,它们分别是由一条单基因通过两个不同的起始密码子转录而成,在乳腺的发生发展以及乳腺癌的增生过程中发挥重要作用[2]。相对于PRA而言,PRB转录活性更强[3],可以调控p21,c-myc,SOX 4等许多重要的靶基因[4]。1983年Horwitz等发现在T47D乳腺癌细胞系的细胞核存在两种分子量不同的人孕激素受体[5]。随后,1987年Misrahic等克隆出hPR的cDNA[6]。同年Law等发现hPR基因定位于11号染色体[7]。1990年Kastner等发现hPR的A、B亚型产生于转录水平[8,9]。有研究表明,缺失了PR基因的小鼠不仅不能自发排卵,而且还严重地影响乳腺的发育[10]。目前,孕激素受体亚型的结构与功能、表达和调控、在不同靶器官的分布及其与疾病的关系等问题已成为乳腺癌研究领域的热点。

1材料与方法

1.1细胞培养

乳腺癌细胞株T47D细胞采用RPM 1640培养液,人胚胎肾细胞293T细胞采用DMEM培养液,分别加入10%FBS,于37℃,5%CO2进行培养。

1.2质粒的构建

根据NCBI公布的PRB基因序列,设计PCR扩增引物,引物序列为:上游引物,5'-CCGCTCGAGATGACTGAGCTGAAGGCAAA-3';下游引物,5'-GGAAGATCT TCACTTTTTATGAAAGAGAAGG-3'。然后以乳腺文库为模板,利用PCR方法扩增PRB的cDNA序列。PCR扩增条件为:95℃预变性4min;94℃变性30s;58℃复性1min;72℃延伸2min,进行30次循环,最后72℃延伸10min,PCR扩增用的酶是pfu酶。回收PCR产物,分别用限制性内切酶XhoI和BglII双酶切目的片段及PXJ40-myc载体,将回收的片段与载体连接,转化E.coliDH 5α,筛选阳性克隆。将鉴定为阳性的克隆进行测序,然后转染细胞,westernblotting分析PXJ40-myc-PRB的表达。

1.3孕激素受体PRB转录活性系统的建立

首先,外源孕激素受体PRB转录活性的测定,将293T细胞接种到12孔板中,等到细胞密度达到80%左右时进行细胞转染,分别在每孔中转染报告基因pMMTV-Luc(200ng)和海肾(50ng),然后同时转染或不转染50ng的myc-PRB质粒,转染完6h后进行换液同时加入或不加入10nm的孕激素(P,Sigma公司)处理24h。处理完毕后收细胞,利用荧光素酶分析系统(promega公司)测定孕激素受体PRB的转录活性。其次,内源孕激素受体PRB转录活性的测定(方法同外源实验,只不过PRB质粒是利用内源的PRB)。

1.4孕激素受体对乳腺癌细胞周期的影响

将T47D细胞接种到6孔板内,等到细胞密度达80%～90%时,用相应的激素进行处理。向所种细胞中分别加入1nm孕激素,10nm孕激素,100nm孕激素,1nm雌激素(Sigma公司),10nm雌激素,激素处理24h后收细胞,然后用70%乙醇进行固定,去除RNA并进行PI(Sigma公司)染色,最后用流式细胞仪分析细胞周期的变化。

2结果

2.1孕激素受体PRB真核表达载体构建及表达

通过XhoI/BglII双酶切,发现PRB已成功构建到了真核表达载体PXJ40-myc上(图1),通过转染293T细胞,发现孕激素受体PRB已表达(图2)。

2.2转录激活活性系统的建立

以荧光素酶基因作为报告基因,通过检测荧光素酶活性成功测定出孕激素受体的转录激活活性(图3,图4),说明转录激活系统构建成功。

2.3细胞周期的分析

研究表明通过加入不同浓度的孕激素/雌激素,发现它们可以通过与其受体结合或调控其表达而影响细胞周期,孕激素可以增加细胞的S期比例,而且呈剂量相关性(图5)。

3 讨论

1 ethanol,2 10nmE2,3 1nmE2,4 1nm P,5 10nm P,6 100nm P

PRB作为甾体类激素受体,是核内的一种重要转录因子,孕激素通过与PRB结合从而调控细胞的生长,分化和恶性肿瘤细胞的转移等[11,12]。目前世界上众多的科学家在对PRB调控机制的研究中取得了许多重大发现和突破。实验运用双荧光报告系统成功地建立了孕激素受体的转录激活系统,研究表明孕激素受体的转录激活活性是孕激素依赖性的,在孕激素存在时,孕激素受体的活性显著提高,当加入孕激素拮抗剂RU486时,增加的活性又降低到本底值。同时,实验还发现孕激素可以通过其受体增加肿瘤细胞的S期比例,促进肿瘤细胞的增殖。与此相反,雌激素降低了肿瘤细胞的S期,抑制细胞的生长,虽然文献报道,雌激素受体是孕激素受体的上游调控因子[9],但可能是加入雌激素后会促进PRB的表达,过量表达的PRB通过负反馈来抑制雌激素受体的功能,因而导致加入雌激素会抑制细胞的生长。综上,由于孕激素受体在多种乳腺肿瘤组织中发挥重要作用,因而对其深入研究将会对乳腺癌等肿瘤的发生机理以及治疗产生深远的影响。

参考文献

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蛋白酶激活受体 篇4

骨形态发生蛋白及其受体在哺乳动物繁殖中的作用

骨形态发生蛋白(BMPs)属于转化生长因子-β超家族的成员,最初因其能诱导异位骨形成而得名.随着研究的`深入,发现BMPs的功能不限于骨的发育和形成,而是涉及几乎全身所有系统,包括调节哺乳动物生长、细胞分化和细胞凋亡,而且越来越多的研究结果表明,BMP系统在调节雌性和雄性哺乳动物的繁殖中具有至关重要的功能.作者简要介绍了BMPs及其受体的结构与作用机制,并具体介绍了几种BMPs在哺乳动物繁殖中的功能.

作 者：肖朝庭 储明星 傅衍 XIAO Chao-ting CHU Ming-xing FU Yan  作者单位：肖朝庭,傅衍,XIAO Chao-ting,FU Yan(浙江大学动物科学学院,杭州,310029)

储明星,CHU Ming-xing(中国农业科学院畜牧研究所,北京,100094)

刊 名：中国畜牧兽医  ISTIC PKU英文刊名：CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)： 33(7) 分类号：Q75 关键词：骨形态发生蛋白   骨形态发生蛋白受体   哺乳动物繁殖  

蛋白酶激活受体 篇5

1 PPARs概述

PPARs属于Ⅱ型核激素受体超家族, 主要包括3种亚型, 即PPAR-α、PPAR-δ和PPAR-γ。PPAR-α主要表达于肝细胞、心肌细胞等;PPAR-γ主要在大肠和脂肪组织中表达;PPAR-δ表达较广泛, 在脑、结肠和皮肤中表达较高。PPARs是人类代谢相关性疾病防治药物的重要靶点, 参与调节过氧化物酶体增殖、能量代谢、细胞分化以及炎症反应等, 与许多病理生理过程如肥胖、胰岛素抵抗、高血压、T2DM、AS及肿瘤等相关。PPAR-α激动剂贝特类药和PPAR-γ激动剂噻唑烷二酮类 (TZD) 已广泛应用于临床。PPAR-δ是抗T2DM药物作用的靶点, 随着T2DM形成机制研究的不断深入, PPARs双重或多重激动剂已成为近年来研发的热点。

1.1 PPAR-α激动剂的相关研究

PPAR-α激动剂激活后可降低三酰甘油 (TG) 和极低密度脂蛋白 (VLDL-C) 水平, 升高高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 和载脂蛋白A-Ⅰ水平, 促进细胞内胆固醇流出及体内胆固醇逆向转运, 抑制氧化应激和炎性反应[3]。贝特类调脂药是最早的PPAR-α人工合成激动剂, 以贝特药物为代表, 是全身性脂质调节剂。贝特类药物能激活主要分布在肝脏、骨骼肌、心肌中的PPAR-α, 延缓AS进展[4]。VA-HIT研究表明吉非贝齐可降低合并T2DM患者的CHD死亡率及脑卒中发生率[5]。BIP试验结果显示苯扎贝特可使HDL-C上升1 8%, TG降低21%, 非致死性心肌梗死和猝死减少9.4%, 当基线TG≥2.26 mmol/L时, 苯扎贝特使患者主要心血管终点事件累计减少39.5%。该研究还发现, 苯扎贝特可显著减少代谢综合征患者主要心血管终点死亡[6,7]。非诺贝特是新一代苯氧芳酸衍生物类调脂药物, 广泛应用于临床。FIELD研究显示, 在既往无心血管疾病的亚组中非诺贝特使主要CHD终点事件减少19% (P=0.01) 。同时该研究还提示贝特类药物可使TG水平升高的患者更多获益[8]。然而ACCORD血脂控制试验中并未获得明显心血管益处, 故不建议在T2DM患者中常规使用他汀加贝特类药物治疗[9]。

贝特类药物不仅有效调节血脂水平, 同时还具有抗炎、抗AS等多重作用, 但由于该类药物缺乏疗效和安全性的大型临床数据等原因, PPAR-α激动剂临床应用一直不理想。

1.2 PPAR-γ激动剂的相关研究

PPAR-γ是高水平表达于脂肪组织的转录因子, 在糖脂代谢、脂肪细胞分化过程中起重要作用, 且与炎症反应密切相关[10]。PPAR-γ最受关注的生物学作用是其对胰岛素敏感性的调节, 活化的PPAR-γ可抑制脂肪细胞表达肿瘤坏死因子-A, 减轻后者诱发的IR, 并通过增加胰岛素受体底物-2的水平, 增强胰岛素的信号传导[11]。常见PPAR-γ激动剂主要包括罗格列酮、吡格列酮等。

罗格列酮对PPAR-γ具有很强的激动能力, 后者激活后可调控参与糖代谢的胰岛素反应基因的转录, 近年来研究发现其尚可治疗冠状动脉粥样硬化和防治心肌缺血后再灌注损伤的作用[12]。STARR研究显示, 罗格列酮可对颈动脉内膜中层厚度 (IMT) 产生有益的影响[13];而采用血管内超声对自身冠状动脉和冠脉桥血管的结构特点进行评价显示, 罗格列酮对AS的进展没有产生有益的影响[14]。RECORD研究早期分析结果显示[15], 罗格列酮并没有增加心源性死亡率及住院率, 但心衰事件和骨折的发生率增加。一些小样本研究将罗格列酮的代谢作用直接与安慰剂或其他药物比较, 汇总分析显示罗格列酮引起高达1.8倍的缺血性心血管事件[16]。一项纳入227 571病例患者 (年龄≥65岁) 的研究显示, 与吡格列酮治疗组相比, 罗格列酮组T2DM患者心脏病发作、中风、心脏衰竭以及死亡风险升高18%[17]。基于多项研究结果, 2010年美国食品药品监督局 (FDA) 宣布对罗格列酮的临床应用进行限制, 仅限于其他药物无法控制血糖的T2DM患者使用。经对RECORD临床试验数据再分析, FDA审查后认定, 与标准的T2DM药物二甲双胍和磺脲类药物相比, 罗格列酮不会增加心脏病发作的风险。FDA此次还同时宣布罗格列酮 (文迪雅) 在心血管方面的安全性的后续研究不必继续进行。因此取消对这类药物在处方和配药方面的限制[18]。

吡格列酮可有效降低血糖, 提高血管壁HDL-C水平, 延缓T2DM患者IMT和冠状动脉粥样硬化进展速度[19]。吡格列酮临床研究的荟萃分析显示, 吡格列酮可降低死亡、心肌梗死、中风事件发生[20]。然而在一项大型临床研究中并没有证实患者从吡格列酮中获得更多益处。该研究显示, 心血管事件只是非显著性下降了10%, 缺血硬终点事件 (死亡、心肌梗死、中风) 发生率减少15%和既往发生过心肌梗死高危患者的复合心血管终点事件减少19%, 此研究推测吡格列酮缺乏临床获益[21]。

美国糖尿病学会 (ADA) 2014年会公布的一项研究表明, 与二甲双胍相比, 口服降糖药噻唑烷二酮 (TZD) 和磺脲类降糖药可升高骨折风险, 危险比分别为1.40 (P<0.0001) 和1.09 (P=0.0054) 。临床上处方该类降糖药时应考虑这一风险, 尤其对骨折高危的患者[22]。

PPAR-γ激动剂在某些方面作用不同甚至相反, 第一代的曲格列酮由于严重的肝脏毒性被撤市;吡格列酮可能对心血管起保护作用, 但证据不足;罗格列酮曾报道潜在的心血管危害。这些差异可能与其作用机制不同有关, 如对PPAR-γ受体亲和力不同。PPAR-γ激动剂不良反应较多, 如骨折、黄斑水肿、血浆体积膨胀和膀胱癌发病风险, 在临床应用时应引起更多关注。尽管基础研究显示PPAR-γ激动剂具有多种生物学作用, 但由于其临床研究所得结果差异较大, 近期相关临床研究报道的不良反应, 同样限制了PPAR-γ激动剂临床中的广泛应用。

1.3 PPAR-δ

激动剂的相关研究PPAR-δ在糖脂代谢、炎症反应、细胞存活、创伤愈合、胚胎移植和中枢神经系统的发育等多方面都有重要作用[23]。PPAR-δ激动剂GW501516, GW0742已被证实可降低T2DM动物模型血糖、血脂, 改善IR, 并使鼠骨骼肌游离脂肪酸的氧化明显增加[24]。研发PPAR-δ激动剂已成为预防和治疗以脂代谢紊乱和IR为主要特征的代谢性疾病的新方向。目前多种PPAR-δ激动剂尚处于研究阶段, 我们期待该类药物在改善糖脂代谢方面有更突出的表现, 早日应用于临床。

2 PPAR-α/γ双重激动剂相关研究

PPAR-α/γ双重激动剂结合了PPAR-α激动剂和PPAR-γ激动剂的双重作用。理论上讲, 该类PPAR双重激动剂不但能有效控制血糖水平, 还能有效调节脂代谢, 从而对T2DM患者的心血管并发症具有防治作用。目前所知的PPARα/γ双重激动剂主要包括Tesaglitazar、Naveglitazar、Muraglitazar、Aleglitazar。Tesaglitazar因在Ⅲ期临床试验中发现其可能引起肾功能不全被终止研发[25];Naveglitazar因在基础研究中发现有致膀胱癌风险, 而被终止进一步研究[26];Muraglitazar具有较好的降脂作用, 可使TG水平降低27%、HDL-C水平升高16%;然而, 汇总分析显示Muraglitazar可增加主要心血管事件发生风险而被停止研发[27]。

Aleglitazar是近期新研发的PPARα/γ双重激动剂, 其发展备受关注。Aleglitazar可显著降低TG、LDL-C和LDL-C, 升高HDL-C, 减轻体重, 改善胰岛素敏感性, 降低空腹血糖而不导致低血糖, 不引起外周水肿, 具有较好的心血管安全性, 提示其可能对T2DM患者血糖、血脂及心血管并发症的综合管理有益[28]。AleglitazarⅠ期临床研究显示, Aleglitazar可降低T2DM患者的TG、LDL-C、血压和血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1) , 升高HDL-C, 改善IR, 且与暴露量呈剂量依赖关系。研究中未发现严重不良事件, 无药物体内积累现象[29]。AleglitazarⅡ期临床研究 (SYN-CHRONY) 显示, Aleglitazar可显著降低T2DM患者异常升高的空腹血糖而不导致低血糖, 有效降低糖化血红蛋白 (HbA1c) , 改善胰岛素敏感性, 降低TG、LDL-C和LDL-C, 升高HDL-C;此外Aleglitazar还可降低C反应蛋白、PAI-1和纤维蛋白原, 并可轻微降低收缩压及舒张压;研究还发现, Aleglitazar (150μg/d) 降低HbA1c的效应与吡咯列酮 (45 mg/d) 相当, 但改善血脂谱的效应则更强, 而引起双下肢水肿的概率与安慰剂组相当, 促进体重增加的几率低于吡咯列酮;研究还提示Aleglitazar是一种安全有效的PPARα/γ双重激动剂, 并具有良好的心血管安全性, 可能对T2DM患者的心血管并发症的防治有益[30]。AleCardio研究旨在探讨T2DM患者在标准治疗的基础上联用Aleglitazar是否可降低急性冠脉综合征后再发心血管事件风险。结果显示:尽管Aleglitazar可降低HbA1c, 改善血清HDL-C和TG水平, 但它并未显著降低心血管事件、心肌梗死及卒中死亡率。Aleglitazar组出现外周性水肿 (P<0.0 0 1) , 体重增加 (P<0.001) 的风险也更高, 心衰发生率略高, 但无统计学意义;胃肠道出血 (HR=1.44, P=0.03) 和可逆性肾损害 (肌酐水平升高) (HR=2.85, P<0.001) 发生率显著增高;低血糖发生率显著高于安慰剂组 (HR=1.60, P<0.001) [31]。因此该研究被提前终止。

曾被寄予厚望的PPAR-α、γ双重激动剂再次因AleCardio研究结果而终止研发, 或许也预示着PPARs双重激动剂干预T2DM心血管风险理念的失败。AleglitazarⅢ期临床试验的提前终止, 将在很大程度上挫伤临床医生以及药品研发机构对于PPAR双重或多重激动剂的热情, 但控制心血管多重危险因素的降糖新药的研发不会停止脚步。

3 总结

蛋白酶激活受体 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2014年12月~2015年7月我院皮肤科收治的36例过敏性皮肤病患者及同期来我院体检的36例健康体检者为研究对象,过敏性皮肤病患者纳入标准:(1)入院经检查及相关诊断确诊为特应性皮炎、湿疹、荨麻疹等过敏性皮肤病者;(2)检测相关指标前3d停用抗组胺药者;(3)研究前1w内未使用糖皮质激素类药物及免疫抑制剂者;(4)近期无感染史、无免疫缺陷病及系统性疾病史;(5)患者及家属对本次研究知情并签署知情同意书。排除标准:(1)合并有严重免疫系统疾病者;(2)不能停止服用对本次研究有影响的药物;(3)妊娠期及哺乳期妇女;(4)对本次研究依从性不高者。观察组36例,男16例,女20例,年龄8~55(36.13±1.42)岁,特应性皮炎2例,湿疹16例,荨麻疹18例;健康体检组36例,男17例,女19例,年龄8~54(35.78±1.22)岁,两组研究对象性别、年龄基线资料无显著差异(P>0.05),具有均衡性。

1.2 检测方法

(1)主要仪器及试剂,由Sigma公司提供的血小板激活因子标准品,由晶美生物公司代理的Cay2man产品鼠抗人PAF-R Ig G,Ig G流式细胞仪、FITC标记的兔抗鼠等。(2)①血小板激活因子测定:取研究对象1ml全血,分别加入10μl醋酐及无水吡啶至4ml甲醇中,旋锅混合,离心后吸取上清液分别加入1ml氯仿及双蒸馏水中,采用生物法检测血小板激活因子含量;②外周血单个核细胞上血小板激活因子受体的表达:采集研究对象1ml静脉血,将单个核细胞分离出,取1×105细胞悬液,加40μl鼠抗人PAF-R单抗及FITC标记的兔抗鼠单抗,对照管中加入FITC标记的正常兔Ig G40μl,混匀后置4℃环境中3min后利用PBS洗3次,弃去上清液,加入固定液0.5ml,利用尼龙网过滤后采用流式细胞仪进行分析。

1.3 观察指标

(1)比较两组血浆中血小板激活因子含量,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行血小板激活因子含量测定;(2)观察单个核细胞上血小板激活因子受体的表达,利用流式细胞仪进行检测。

1.4 统计学方法

选用统计学软件SPSS 19.0对研究数据进行分析和处理,计量资料(±s)表示,组间对比进行t值检验,以P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆中血小板激活因子含量比较

观察组血浆中血小板激活因子含量较健康体检者显著高,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 两组单个核细胞上血小板激活因子受体的表达

观察组PAF-R阳性细胞比例、PAF-R表达荧光道数分别均较健康体检组显著大,具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

过敏性皮肤病是临床中一种较为常见的变态反应,是由抗原物质作用于机体后致使机体的反应性发生改变,严重影响患者的正常生活[4]。

皮肤是一个组成较为复杂的多功能器官,包含真皮、表皮和皮下组织,由于其结构及功能的特异性,其主要担负着机体化学、物理屏障及对外界环境的刺激反应[5]。其中表皮细胞约有90%为角质形成细胞,不仅组成体表屏障,也是一种主动参与介导皮肤炎症反应的重要免疫细胞,而角质形成细胞产生的炎症性介质是T淋巴细胞及整个免疫系统与表皮之间相互关联及相互作用的媒介[5]。其中血小板激活因子是一种高生理活性的磷脂介质,具有较广泛的生物学作用,可参与体内大多数疾病的发病机理,而血小板激活因子的生物学效应主要是通过细胞膜上的特异性受体活化实现[6];血小板激活因子受体是一种G-蛋白偶联受体,广泛存在于多种细胞及组织表面。近年来,随着过敏性皮肤病发病率逐年增高,医学工作人员对过敏性皮肤病的研究逐渐深入,并发现血小板激活因子参与皮肤炎性反应,与特应性皮炎、湿疹、荨麻疹等过敏性皮肤病等皮肤炎症有着密切关联[7]。血小板激活因子受体通过与强力炎症介质血小板激活因子特异性结合,并介导一系列的生物效应,参与诱导表皮细胞因子网络中,可与其他炎症介质相互作用,使皮肤炎症反应不断加强,可见考察过敏性皮肤病中血小板激活因子的含量及血小板激活因子受体在单个核细胞上的表达临床意义显著[8]。本次研究结果显示,观察组血浆中血小板激活因子含量较健康体检者显著高,提示过敏性皮肤病患者血浆中血浆中血小板激活因子含量较高,血小板激活因子具有引起血小板、单核细胞及中性粒细胞的聚集,并促使炎性细胞分泌炎症介质如溶酶体酶、氧自由基等,同时增加血管通透性并调节免疫功能主要是抑制淋巴细胞及淋巴细胞增生,观察组PAF-R阳性细胞比例、PAF-R表达荧光道数分别均较对照组显著大,血小板激活因子主要是通过与细胞表面的血小板激活因子受体结合,并与IP3、Ca2+、Zn2+、TNF、丝氨酸蛋白酶等参与介导生物学反应,血小板激活因子受体主要存在于中性粒细胞、血小板、T淋巴细胞及肺组织上,而皮肤中角质形成细胞由于处于皮肤最外层,极易受各种外界因素影响,它主要通过分泌各种炎症因子及免疫因子,参与局部免疫反应中,可见过敏性皮肤病患者单个核细胞上PAF-R阳性细胞比例、PAF-R表达荧光道数分别均较对照组显著大[9]。

综上,目前人们对血小板激活因子及其受体与过敏性皮肤病的相关性的研究较少,相信随着医疗水平的发展及人类对过敏性皮肤病状态下血小板激活因子及其受体表达特点的不断深入研究,将会为临床治疗过敏性皮肤病提供更多药理学理论基础,将极大推动医疗事业的发展。

摘要：目的 探讨血小板激活因子(PAF)及其受体(PAF-R)在过敏性皮肤病中的表达特点。方法 以2014年12月~2015年7月我院皮肤科收治的36例过敏性皮肤病患者(记为观察组)及同期来我院体检的36例健康体检者(记为健康体检组)为研究对象,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测研究对象血浆中血小板激活因子含量,同时利用流式细胞仪检测单个核细胞上血小板激活因子受体的表达,并比较两组差异。结果 通过双抗体夹心酶联免疫吸附法检测发现,观察组血浆中血小板激活因子含量(111.03±3.76)μg/l较健康体检者(76.98±1.42)μg/l显著高,差异具有统计学意义(P<0.05);利用流式细胞仪检测发现,观察组单个核细胞上PAF-R阳性细胞比例(42.56±5.32)%、PAF-R表达荧光道数(212.12±10.38)分别均较健康体检组(16.89±3.45)%、(135.18±8.89)显著大,具有统计学意义(P<0.05)。结论 过敏性皮肤病患者血浆中血小板激活因子含量较健康体检者显著高,在单个核细胞上血小板激活因子阳性细胞比例及其受体表达荧光道数较健康体检者均显著高。

关键词：过敏性皮肤病,血小板激活因子,血小板激活因子受体

参考文献

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[2]董芳,薛长江,王宇,等.红花黄色素抑制血小板激活因子诱导的内皮细胞炎性因子蛋白表达升高作用的研究[J].心肺血管病杂志,2014,33(2):281-285.

[3]路雪艳,李邻峰.过敏性皮肤病的在体实验室诊断方法及其注意事项[J].实用皮肤病学杂志,2014,30(5):357-360.

[4]杜锦霞,陈萍,冯欣伟,等.过敏性皮肤病患者心理状况分析及护理干预[J].解放军护理杂志,2014,25(6):75-76.

[5]胡斌,李平立,文东菁,等.过敏性皮肤病血清总Ig E和过敏原特异性Ig E检测分析[J].医学综述,2015,26(8):1531-1532.

[6]孙婧.自身抗原TG参与特应性皮炎发病的自身免疫机制研究[D].北京协和医学院中国医学科学院,2015.

[7]金鸣,裴崇强,臧宝霞,等.羟基红花黄色素A缓解血小板激活因子诱导的内皮细胞炎症因子表达升高作用的研究[J].心肺血管病杂志,2011,30(5):429-432.

[8]李承新.常见过敏性皮肤病的种类和治疗[J].中国临床医生,2014,28(12):1-2.

蛋白酶激活受体 篇7

注:正常子宫内膜、子宫内膜癌LN阳性表达 (P<0.001) ;LN-R阳性表达 (P<0.001)

1 材料与方法

1.1研究资料:收集2003年~2009年兖矿集团总医院子宫内膜癌妇科手术标本40例, 分成正常子宫组10例, 子宫内膜癌组30例。用10%福尔马林固定, 常规石蜡包埋, 所有标本均经过病理组织学检查并确定, 全部病例术前未行任何放化疗。

1.2方法。免疫组化法:试剂盒购自武汉博士德公司, 操作严格按照说明书进行。结果判定为盲法观察和计数。

1.3结果判定:LN阳性标准为子宫内膜基底膜出现棕黄色染色, 根据阳性染色积数积分:无细胞显色为0;<25%细胞显色1分;25%~50%细胞显色2分;>50%细胞显色3分;根据细胞染色积数积分:不显色或显色不清0分;浅黄色1分;棕黄色2分;深褐色3分。二项乘积0~1分阴性 (-) ;2~3分弱阳性 (+) ;4~5分中度阳性 (++) ;>5分强阳性 (+++) 。LN-R阳性标准:染色阳性为棕黄色, 细胞数<30%阴性, 细胞数≥30%阳性。

1.4统计方法:用SPSS17.0软件进行统计学分析, 采用多个独立样本比较的秩和检验, Spearman相关分析, 以P<0.05有统计学意义。

2 结果

子宫内膜癌LN及67LR表达关系的实验结果表明:腺癌细胞 (EC) 中LN及67LR阴性, 间质细胞 (SC) 中LN阳性常以正常及良性病变为主;而基底膜 (BM) 缺损, LN及67LR在EC中呈阳性, SC中LN阴性以恶性病变为主。推测67LR表达与子宫内膜癌有正相关性, LN表达与子宫内膜癌有负相关性;LN和LN-R的表达间存在内源性的相互调节关系。见表1。

3 讨论

3.1 LN生物学特性:

LN是基底膜的非胶原性糖蛋白, 由不同的多肽链构成不对称的“+”字形结构, 包括3条短臂和1条长臂, 各臂的末端均呈球状。LN的四臂结构能使分子的4个末端在较大距离外伸展开, 便于同大分子物质及不同方向的细胞表面和基质成分接触, 具有重要的生物学意义。LN的生物学功能主要有3个方面:细胞与基质黏着的介质;连接基质中大分子成分, 与LN型胶原结合形成基膜骨架;调节细胞的黏附、生长、分化和移动。

3.2 LN与肿瘤的关系:

许多实验证明高度转移的肿瘤细胞对LN具有高度亲和力, LN能特异性介导肿瘤细胞黏附于基质上并促进蛋白水解酶的分泌, 造成基膜的崩解、破坏。LN表达降低的肿瘤浸润力和转移力强于LN表达正常的肿瘤。体内实验研究表明, LN表达的降低与肿瘤恶性表型有很大的相关性。癌细胞分化好的LN表达水平较高, 低分化或末分化的LN表达水平较低或完全缺如。综上所述肿瘤基膜LN表达可视为肿瘤恶性程度的判断指标之一, 尤其是在上皮性肿瘤。

3.3 LN-R的生物学特性:

层粘连蛋白受体是存在于许多不同细胞表面的跨膜糖蛋白。又称层粘连蛋白结合蛋白 (laminin-binding proteins, LBPs) 目前分为3类, 即糖蛋白类、糖类、整合素类。67LR是最早发现且研究得最多的一种LN-R, 广泛存在于上皮细胞、内皮细胞、周围神经细胞、巨噬细胞及大部分肿瘤细胞表面。LN-R不仅促进细胞在LN基质上黏附、趋化性迁移及分泌, 同时还参与细胞间相互识别及细胞内外信息的传递。各种不同类型的细胞中, LN-R的信使核糖核酸 (m RNA) 的含量同细胞表面LN-R的数量呈正相关性。LN-R的表达调节可能在转录、转录后加工、翻译和翻译后加工、修饰等多个水平上发挥作用。

3.4 层粘连蛋白受体在妇科肿瘤转移中的作用:

层粘连蛋白受体是存在于细胞表面的跨膜糖蛋白, 不同层粘连蛋白受体在肿瘤组织的表达不同, 是肿瘤细胞与基膜中层粘连蛋白黏附的桥梁, 在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用。此外LN-R对于肿瘤的血管形成以及促进肿瘤的转移意义重大。大量的实验证明LN-R的表达水平与肿瘤细胞的转移能力密切相关, 特别是上皮细胞肿瘤。如乳腺癌、肠癌、卵巢癌等都被发现67LR的存在与肿瘤的阶段有关。其表达还与癌的预后有关。

3.5 LN与其受体LN-R (67LR) 与子宫内膜癌的关系:

子宫内膜癌浸润和转移能力构成了恶性行为的基础, 是严重并发症以至死亡的主要原因。现代分子生物学的发展己明确肿瘤的演进是由多步骤组成的复杂过程。层粘连蛋白是细胞外基质 (ECM) 中的一种非胶原糖蛋白, 它通过与上皮细胞表面的多种受体相结合使上皮细胞在基底膜上定向附着, 是细胞外基质基膜的主要构成成分。具有调节细胞分化、生长、黏附和移行等多种功能, 而这些正是肿瘤细胞实现浸润、转移所需的生物学特性[2,3,4,5,6,7,8]。层粘连蛋白受体是存在于细胞表面的跨膜糖蛋白, 不同层粘连蛋白受体在肿瘤组织的表达不同, 是肿瘤细胞与基膜中层粘连蛋白黏附的桥梁, 在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用。

摘要：目的 检测层粘连蛋白 (laminin, LN) 及其受体 (laminin receptor, LN-R) (选择受体67LR) 在早期子宫内膜癌组织中的表达的相关性。方法 用免疫组织化学技术和图像分析法检测40例早期子宫内膜癌 (其中包括子宫内膜癌30例 (75.0%) 、10例正常内膜例 (15.0%) 组织中LN和其LN-R的表达。结果 LN及LN-R的阳性表达在正常子宫内膜、子宫内膜癌中有显著的统计学差异 (P<0.001) 。结论67LR表达与子宫内膜癌有正相关性, LN表达与子宫内膜癌有负相关性。层粘连蛋白LN和层粘连蛋白受体LN-R在子宫内膜癌中有望作为判断子宫内膜癌预后的参考指标之一。

关键词：子宫内膜癌,预后,层粘连蛋白,层粘连蛋白受体

参考文献

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[7]冉晓敏.子宫内膜癌患者围手术期血清肿瘤标志物的变化研究[J].中外医疗, 2012, 31 (34) :77-78.

蛋白酶激活受体 篇8

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集甘肃省肿瘤医院头颈外科2014年10月~2016年1月临床病理确诊的分化型甲状腺癌219例,包括206例乳头状甲状腺癌(PTC)、13例滤泡状甲状腺癌(FTC)[男62例,女157例;年龄14~81岁,平均(45.6±12.9)岁]。按照美国癌症联合委员会(AJCC)第7版DTC的TNM分期系统,Ⅰ期107例,Ⅱ期28例,Ⅲ~Ⅳ期84例;并取正常甲状腺组织31例作为对照。所有患者均按照统一方案进行诊断和治疗[7]。根据《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》[8]提出的复发危险度分层将所有标本划分为低危组和中、高危组,其中低危组98例,中、高危组121例。本次研究已获医院伦理委员会的审批和认可,且所有标本均获患者及家属知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂

一抗PPAR-γ兔抗人多克隆抗体(1∶200)、SP-9000试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 PPAR-γ免疫组织化学染色

所有标本经4%中性甲醛固定,脱水后石蜡包埋,将石蜡包埋标本行4μm厚的连续切片,60℃烘烤过夜。严格按照SP法免疫组织化学染色操作说明进行:切片脱蜡至水;高压修复抗原5 min;PBS冲洗3次,每次3 min,擦干;使用二抗同种动物血清15 min擦干后,直接滴加一抗(1∶200),放于37℃恒温箱2 h;PBS冲洗3次,每次3 min,擦干;滴加生物素化二抗,室温,15 min;PBS冲洗3次,每次3 min,擦干;滴加三抗辣根酶复合物15 min;PBS冲洗3次,每次3 min,擦干。DAB显色5 min,显微镜下控制;水洗终止染色;酸分化水洗、碱返蓝水洗、梯度乙醇脱水;中性树胶封固,显微镜下观察;PBS代替一抗作为空白对照。在进行免疫组化切片后,另切5~10μm厚的蜡片放于EP管送基因突变检测实验室进行BRAFV600E突变检测,根据检测结果,将全部标本分为BRAFV600E突变组和BRAFV600E野生组。

1.3 结果判定

PPAR-γ定位于细胞质和/或细胞核。免疫组织化学染色结果判断参照文献[9]采用半定量分析法:依照细胞阳性着色程度(抗原含量)可分为:弱阳性(+)计1分;中等阳性(++)计2分;强阳性(+++)计3分,无着色直接计0分。依照阳性细胞数量可分为:弱阳性(+),阳性细胞数在25%以下计1分;中等阳性(++),阳性细胞数在25%~<50%计2分;强阳性(+++),阳性细胞数≥50%计3分;阳性细胞数在5%以下直接计0分。随机选取5个视野,200倍光学显微镜计数100个细胞,阳性细胞数为这5个视野的平均数。将每张片子着色程度得分和着色细胞百分率得分相乘,最后得分0分为阴性,≥1分为阳性(1~2分为+;3~4分为++;≥5分为+++)。

1.4 统计学方法

本文所有数据均借助于SPSS 22.0统计软件进行分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,率的比较采用交叉表格Pearsonchi-square(χ2)检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPAR-γ在分化型甲状腺癌组织以及正常甲状腺组织中的表达

PPAR-γ免疫组化阳性产物主要定位于细胞浆和/或细胞核周(图1,封四),PTC、FTC、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织PPAR-γ阳性率分别为48.5%、53.9%、46.2%和64.5%,PPAR-γ在甲状腺恶性肿瘤、良性肿瘤及正常甲状腺组织中均有表达,统计结果显示差异无统计学意义(χ2=3.172,P=0.366>0.05)。见表1。

注:PPAR-γ:过氧化物酶增殖物激活受体γ

2.2 PPAR-γ表达与分化型甲状腺癌临床病理特征及分子特征之间的关系

统计结果显示PPAR-γ表达与分化型甲状腺癌性别(P=0.266)、年龄(P=0.187)、肿块大小(P=0.323)、淋巴结转移(P=0.558)、TNM分期(P=0.146)及复发危险度分层(P=0.974)均无相关性。而BRAFV600E突变组PPAR-γ阳性率[54.1%(85/157)]高于BRAFV600E野生组[35.5%(22/62)],差异有统计学意义(P=0.013<0.05)。见表2。

注:PPAR-γ:过氧化物酶增殖物激活受体γ

3 讨论

近年来,甲状腺癌的发病率日渐上升,而DTC占所有甲状腺癌的90%以上。DTC治疗以手术为主,包括131I和TSH抑制治疗在内的综合治疗,10年生存率达95%以上[10],但DTC复发率高达30%[11],将会影响其生存率。因此,寻找特异性的分子标志对DTC的预后进行评估极其重要。

PPAR-γ基因位于染色体3p25,编码一种细胞核内受体转录因子亚型的PPAR-γ,属于核内受体超家族成员,PPAR-γ活化后通过与靶基因启动子区的过氧化酶增殖物反应原件(PPRE)相互作用进而调控相关基因的表达。在甲状腺中,PPAR-γ在良性及不同病理分类的恶性肿瘤组织中均有不同程度的表达[12,13]。本研究发现,PTC中PPAR-γ阳性率为48.5%,FTC中为53.9%,结节性甲状腺肿中为46.2%,正常甲状腺组织中为64.5%,PPAR-γ在甲状腺良性与恶性组织中均有表达且差异不大,与以前研究结果相似[14]。因此本研究结果提示PPAR-γ免疫组化染色并不能作为诊断甲状腺肿瘤的特异性分子标志。本研究发现PPAR-γ表达与DTC性别、年龄、肿块大小、淋巴结转移、TNM分期及复发危险度分层也均无相关性。出现这种结果可能由于PPAR-γ在甲状腺癌致癌机制中的作用极其复杂所造成的。一部分研究认为PPAR-γ可作为肿瘤抑制因子,PPAR-γ激动剂能阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡,从而有效抑制癌细胞增殖[14],Kato等[15]研究认为PTC中PPAR-γ表达不足,通过激活核内NF-κB信号通路促进肿瘤形成。而另一部分研究认为PPAR-γ可作为肿瘤促进因子,Wood等[16]研究认为PPAR-γ被敲除后,降低了甲状腺未分化癌的侵袭性;PPAR-γ在DTC细胞中高水平表达,并且缺乏任何配体,也促进癌细胞生长。Kroll等[17]报道,在FTC中,PPAR-γ与Pax8发生基因重排,表达一种包括PAX8前9个外显子及全长PPAR-γ1在内的融合蛋白PPFP。Giordano等[18]研究认为PPAR-γ与Pax8发生重排后产生的融合蛋白PPFP是一种转录因子,在相应的基因启动子和细胞环境下,使一些蛋白的基因表达增加,如通过上调表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,导致下游相关基如BRAF等的激活,致使下游信号通路被持续性激活,从而使细胞发生癌变,并且基因报告分析证明PPAR-γ与PPFP功能相似,说明PPAR-γ确实能促进细胞癌变。另外,部分研究认为PPAR-γ激动剂可以抑制癌细胞生长[14],但这并不能确定PPAR-γ激动剂是受体依赖性的还是独立性的,更不能说明是PPAR-γ自身产生了抑癌效应。产生这种争议也可能是由于许多体外的试验研究并不能与体内肿瘤所处的微环境完全一致所造成。然而,本研究在分析PPAR-γ在BRAFV600E突变组和未突变组中的表达情况时发现,BRAFV600E突变组PPAR-γ阳性率(54.1%)高于BRAFV600E未突变组(35.5%),差异有统计学意义(P<0.05)。该结果似乎也支持PPAR-γ作为促癌因子的观点。笔者推测可能是由于PPAR-γ活化后通过与过氧化酶增殖物反应原件PPRE相互作用进而调控相关基因的表达,一些生长调控基因如RAS、C-myc等就含有PPRE原件[19],而BRAF是RAS癌基因下游的效应器,PPAR-γ过表达与RAS基因内的PPRE原件相结合,引起RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的紊乱,由于BRAFV600E的突变更是加剧了这一过程,导致癌的发生。因此,PPAR-γ在甲状腺肿瘤中的作用是极其复杂的,再一个可能也与PPAR-γ/PAX-8重排相关,该重排不仅发生于FTC也发生于PTC及良性甲状腺组织[20],当进行免疫组化染色时,阳性部位具体是PPAR-γ基因编码的PPAR-γ蛋白还是由PPAR-γ/PAX-8重排后表达的融合蛋白的PPAR-γ所表达的部分,其中的机制并不十分明确,所以关于PPAR-γ在甲状腺癌发生、发展中的作用以及是否可作为诊断或预后评估指标还需进一步研究确认。

蛋白酶激活受体 篇9

宿主细胞膜是研究流感病毒受体结合特性的良好材料。本研究以改良的病毒覆盖蛋白印迹分析方法(Virus overlay protein blot assay,VOPBA)鉴定鸡胚成纤维细胞膜上禽流感病毒的受体,为揭示流感病毒感染鸡的分子机制提供了初步证据。

1 材料与方法

1.1 材料

禽流感病毒A/Ty/WI/66株,由本教研室保存;SPF鸡胚购自哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂和仪器

DMEM培养液(GIBCO公司),优质胎牛血清(杭州四季青公司),胰酶(AMRESCO公司),MemPER真核生物膜蛋白提取试剂盒(PIERCE公司),丽春红S(Ponceau S)贮存液(Sigma公司),抗流感病毒一抗(北京博奥森生物公司),辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(ZSBIO公司),DAB显示剂(上海博士德公司),预染蛋白Marker(NEB公司),PVDF膜(Bio公司);CO2培养箱,Kodak EDAS 290凝胶成像分析系统,电泳仪,半干电转印仪。

1.3 方法

1.3.1 病毒增殖

取禽流感病毒A/Ty/WI/66株,经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚,72 h后无菌收集尿囊液,进行效价测定后置于80℃保存备用。

1.3.2 细胞培养

取9日龄SPF鸡胚,按常规方法制备原代细胞,置37℃,5%CO2培养箱中培养。待原代细胞长成单层后收集细胞。

1.3.3 细胞膜蛋白的制备

利用Mem-PER真核生物膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白后,加等量SDS-PAGE 2×上样缓冲液,煮沸5 min,备用。

1.3.4 VOPBA分析

根据文献方法[2]略加改进,具体操作步骤如下。

1.3.4. 1 SDS-PAGE电泳

分离胶为12%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=29∶1),浓缩胶为5%聚丙烯酰胺凝胶。每泳道加细胞膜溶解物18 L。电泳样本包括鸡胚成纤维细胞膜蛋白以及标准蛋白Marker。

1.3.4. 2 半干转印法进行蛋白转印

剪6张比凝胶稍大的Whatman滤纸和1张PVDF膜,PVDF膜用甲醇浸泡10 min,再用二馏水洗10 min,滤纸和PVDF膜置于转印缓冲液中浸泡10 min。由负极到正极按滤纸(3张)、凝胶、PVDF膜、滤纸(3张)的顺序做成“三明治”结构,保证精确对齐,并排出“三明治”内的气泡。置半干转印仪中恒流17m A转印1.5 h。

1.3.4. 3 丽春红染色

将PVDF膜转移至丽春红S工作液中染色2～5 min,待蛋白条带出现后,将PVDF膜置于PBST溶液中脱色。

1.3.4. 4 封闭PVDF膜

将PVDF膜转移至含5%BSA的PBST溶液中封闭,37℃作用2 h。PBST 5×5′洗涤。

1.3.4. 5 叠加病毒液

加入18 m L含有60 L纯化病毒液的PBS,4℃2 h。PBST 5×5′洗涤。

1.3.4. 6 孵育一抗

加入15 m L含有15 L单抗的抗体稀释液(5%脱脂奶粉配制),37℃作用2 h。PBST 5×5′洗涤。

1.3.4. 7 孵育二抗

将PVDF膜置1 000倍稀释的羊抗鼠酶标二抗中,37℃作用1 h。PBST 5×5′洗涤。

1.3.4. 8 DAB显色

显色液配制按说明书操作进行。将膜置于显色液中避光孵育,待显色完全后用蒸馏水终止反应,取出晾干。

1.3.4. 9 记录结果

图片照相,分析结果。

2 结果

2.1 鸡胚成纤维细胞膜蛋白SDS-PAGE电泳结果

2.2 VOPBA结果

VOPBA结果显示,在鸡胚成纤维细胞膜上有8条疑似禽流感病毒受体结合条带,而阴性对照组没有出现结合条带。初步鉴定出禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞膜上的受体蛋白。

3 讨论

3.1 病毒侵染细胞首先要与细胞膜上受体结合才能启动其增殖周期。为了研究病毒与受体之间的相互作用,经常需要培养相应的细胞作为实验材料。但是,实验结果会因为细胞批次和培养时期不同而发生偏差。另外,还有很多细胞不容易培养或者不能传代,此时用培养细胞做材料来研究病毒与受体的相互作用是不理想的。有鉴于此,直接从组织、原代细胞或传代细胞分离纯化细胞膜作为实验材料是可取的途径。实验证明,分离纯化出的离体细胞膜在许多与病毒有关的实验中可以取代甚至优于活体细胞。破裂的细胞膜会因为膜骨架的作用很快卷曲成囊泡状,称之为细胞膜微囊。这些细胞膜微囊形状规则,大小较均一,直径大约在100～600 nm之间[3]。形态学观察、生化和血清学实验证明,细胞膜微囊在蛋白质、脂类组成和酶活性方面与活体细胞的细胞膜几乎完全相同[4,5,6]。这说明细胞膜微囊在提取过程中受损并不大,其抗原性与活体细胞膜抗原具有高度一致性。而且细胞膜微囊便于储存,在20℃存放3个月其抗原性不发生明显改变[7]。此外,这些细胞膜微囊不具有活体细胞膜所具备的吞噬作用和物质运输功能。因此,病毒只能与敏感细胞来源的细胞膜微囊结合而不会被吞噬,这就解决了用培养细胞做结合实验时结合作用与内吞作用不易区分的问题。另外,分离纯化的细胞膜微囊不含有细胞质和细胞核的组分,因此,从细胞膜微囊中分离病毒受体相对容易,这也是细胞膜微囊应用于病毒研究的优势所在。有些报道直接用细胞总蛋白研究病毒受体,但是由于细胞总蛋白种类繁多复杂,容易与病毒发生非特异性结合。因此,首先分离纯化细胞膜然后进行VOPBA操作是很有必要的。

3.2 VOPBA技术是一种鉴定病毒受体的常用方法。登革热病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、牛病毒性腹泻病病毒、新城疫病毒等病毒受体的鉴定都应用了VOPBA方法[2,7,8,.9]。然而,VOPBA方法与其他免疫学方法一样,可能存在蛋白之间的非特性相互作用。因此,本方法只能说明鉴定出病毒在宿主细胞膜上的疑似受体,究竟哪些才是病毒的受体还需要分离纯化疑似受体蛋白来加以进一步验证。

参考文献

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