人工抗原

关键词:

人工抗原(精选五篇)

人工抗原 篇1

泰地罗新在动物组织中的残留会威胁到食品安全, 对人类健康造成危害, 欧盟兽用药品委员会对泰地罗新在动物性食品中的残留也制定了最高残留限量[5,6,7]。目前, 检测泰地罗新残留量的方法主要是固相萃取-液/质联用技术 (SPE-HPLC-MS/MS) 。由于复杂的仪器设备和繁琐的操作过程以及对检验人员的高技能要求导致不适合现场监控和大量样本的筛查。免疫化学分析方法特别是酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术具有快速、操作简单、灵敏度高、适应性强等优点, 适合高通量样品筛选。因此, ELISA方法对于快速检测泰地罗新在动物组织中的残留更具优势。小分子化合物的抗体制备是小分子化合物ELISA检测方法建立的核心部分, 而设计合理的半抗原及相应的人工抗原又是关键。该研究介绍了一种泰地罗新半抗原、人工抗原及其合成与鉴定方法, 合成的半抗原既保留了泰地罗新的基本结构又有利于与载体蛋白偶联, 易于被动物机体识别, 可用于泰地罗新的ELISA残留检测[8,9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂与试剂

泰地罗新为自制, HPLC面积归一化法测其纯度为98.8%;牛血清白蛋白 (BSA) 购自Sigma公司, 其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.2仪器与设备

紫外分光光度计 (UV-2600型, 上海美天科学仪器有限公司) , 冻干机 (DF-3-550-MP) , 荧光光谱仪 (F-2500, 日本日立公司) , 核磁共振谱仪 (Bruker 500M) , 元素分析仪 (Elementar VARLO ELⅢ型, 德国) , 液-质联用仪 (Shimadzu LC-MS 2010EV System, 日本岛津) 。

1.2 方法

1.2.1 泰地罗新半抗原的合成

在干燥的N2条件下, 1 g泰地罗新溶解于10 ml丙酮中, 搅拌;滴加1.5 ml 20%丁二酸酐的丙酮溶液, 滴加完毕后25℃搅拌反应15 h, 得透明溶液;减压蒸除溶剂, 得淡黄色无定形粉末, 然后加入15 ml二氯甲烷溶解, 用1 mol/L氢氧化钠溶液调节p H至10, 分离二氯甲烷层, 水洗, 无水硫酸镁干燥, 过滤, 减压蒸除溶剂, 得粗品;过硅胶柱纯化, 洗脱液为体积比为2∶1的乙酸乙酯与石油醚的混合物, 将产物管合并, 减压蒸发至干, 得泰地罗新半抗原 (图2) 。

1.2.2 泰地罗新半抗原的结构鉴定

将合成的半抗原进行ESI质谱鉴定, 具有[M-1]-分子离子峰833.5。

元素分析 (C45H75N3O11) 实测值 (理论值, %) :C 64.82 (64.80) , H 9.05 (9.06) , N 5.06 (5.04) , O 21.07 (21.10) 。表明泰地罗新半抗原分子中含45个C, 75个H, 3个N, 11个O, 分子量为834.09。

1H-NMR (CDCl3) δ (ppm) :0.90 (t, 3H, CH2CH3) , 0.96 (d, 3H, 4-CH3) , 1.16 (d, 3H, 8-CH3) , 1.18 (d, 3H, 5-CH3) , 1.20 (d, 1H, CH) , 1.35 (d, 2H, CH) , 1.45 (d, 1H, CH) , 1.53 (m, 8H, CH2) , 1.57 (m, 2H, CH2) , 1.59 (m, 4H, CH2) , 1.79 (q, 1H, CH) , 2.05 (q, 1H, CH) , 2.21 (d, 3H, CH3) , 2.23 (s, 1H, CH) , 2.26 (s, 6H, N (CH3) 2) , 2.27 (s, 1H, CH) , 2.43 (t, 2H, CH2) , 2.45 (t, 8H, CH2) , 2.48 (d, 1H, CH) , 2.52 (d, 1H, CH) , 2.52 (t, 1H, CH) , 2.54 (t, 2H, CH2) , 2.81 (t, 1H, CH) , 2.83 (t, 2H, CH2) , 2.99 (t, 1H, CH) , 3.40 (t, 1H, CH) , 3.55 (t, 1H, CH) , 3.58 (s, 1H, OH) , 3.60 (s, 1H, OH) , 3.84 (t, 1H, CH) , 3.85 (d, 1H, CH) , 3.98 (t, 1H, CH) , 4.62 (t, 1H, CH) , 5.44 (t, 1H, CH=C) , 5.54 (d, 1H, CH) , 6.33 (d, 1H, CO-CH=CH) , 7.40 (d, 1H, CO-CH=CH) , 11.28 (s, 1H, COOH) 。

1.2.3 泰地罗新人工抗原的合成

将0.8 mmol的N, N-二环己基碳二亚胺 (DCC) 溶于20 ml 1, 4-二氧六环中, 搅拌状态下滴入等当量的上述泰地罗新半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺的1, 4-二氧六环溶液中, 室温搅拌反应24 h。然后, 离心, 取上清液滴加至50ml的10 mg/ml牛血清白蛋白的1, 4-二氧六环与磷酸盐缓冲液中, 5℃搅拌反应24 h。反应结束后, 将反应液于4℃用蒸馏水透析3 d, 每天换液4次, 冷冻干燥得泰地罗新人工抗原, -20℃保存。

1.2.4 泰地罗新人工抗原的鉴定

1.2.4. 1 UV鉴定

用磷酸盐缓冲液溶解半抗原、牛血清白蛋白 (BSA) 、人工抗原, 分别稀释至适宜浓度, 分别进行紫外光谱 (200~400 nm) 扫描, 对照三者的UV图谱。

1.2.4. 2 荧光光谱鉴定

分别取半抗原、牛血清白蛋白及人工抗原适量, 加50%甲醇水溶液配制成适宜浓度的试液, 将各试液分别置于1 cm石英比色池中, 设置空白溶剂为50%甲醇水溶液, 激发波长为278 nm, 激发和发射单色仪的狭缝宽度均为5 nm, 扫描速度为240 nm/min, 扫描范围为320~500nm, 进行荧光发射光谱扫描。

2 结果与分析

2.1 UV鉴定结果

UV鉴定结果表明, 人工抗原与BSA的紫外光谱相比发生了显著变化, 说明半抗原与BSA成功偶联制得人工抗原。通过三者在同一波长下的吸光度值计算其偶联比率, 经计算, 泰地罗新半抗原分子与BSA分子的偶联比率为18∶1 (图3) 。

2.2 荧光光谱鉴定

在人工抗原的制备过程中, 半抗原以特定的基团 (如氨基-NH2、羧基-COOH等) , 通过相应的反应连接到载体蛋白BSA上。BSA上色氨酸、酪氨酸、组氨酸的存在使其具有内源荧光。该研究中通过活性酯法使泰地罗新半抗原与BSA上的氨基酸残基偶联, 由于BSA产生荧光主要是这些氨基酸的贡献, 一旦有其他基团连接上后必然改变其荧光光谱特性。图4是泰地罗新人工抗原的荧光光谱图, 从图中可看出, 泰地罗新人工抗原的最大发射波长与牛血清白蛋白BSA相比发生了明显位移, 表明泰地罗新人工抗原已经成功合成。

3 结论与讨论

抗体在药学免疫分析研究中占有重要地位, 为了得到抗体, 需将药物分子与大分子 (如牛血清蛋白) 偶联制备成人工抗原。泰地罗新为小分子药物, 首先根据分子结构特点设计并合成具有连接臂的半抗原, 再采用活性酯法与大分子蛋白偶联制得相应的人工抗原。杨利国[10]报道, 通过IR、SDS-PAGE鉴定人工抗原是否合成成功, 但该试验结果表明, 此2种方法不能有效用于该试验制得的人工抗原的鉴定。利用IR鉴定人工抗原在理论上可能, 但是一些药物因分子量较小, 相对于大分子量的载体蛋白, 其结构信息被掩埋在大分子的结构信息中, 造成无法辨认人工抗原是否合成。SDS-PAGE在该试验中鉴定效果差可能与药物本身特性及试验中电泳用胶及人工抗原的偶联比率有关。与IR、SDS-PSGE相比, 紫外光谱法与荧光光谱法更适宜于该试验中人工抗原的鉴定。综上所述, 该研究根据泰地罗新的分子结构特点, 进行半抗原的合成与结构鉴定, 采用活性酯法成功合成其人工抗原, 为下一步泰地罗新免疫化学分析方法的建立奠定了基础。

注:A为泰地罗新半抗原;B为泰地罗新人工抗原;C为牛血清白蛋白BSA。

注:Val为泰地罗新半抗原;Val-BSA为泰地罗新人工抗原;BSA为牛血清白蛋白。

参考文献

[1]EMA.Committee for Medicinal Products for Veterinary Us (EMA/CVMP/91406/2011) [DB/OL].[2014-01-22].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Summary_of_opinion_-_Initial_authori-sation/veteri1nary/002009/WC500103295.pdf.

[2]李伟岭, 杨芳, 于振梅, 等.泰地罗新研究进展[J].中国兽药杂志, 2012, 46 (10) :50-53.

[3]JACOB P, NIELS M A, RALF W, et al.Visualizing the 16-Membered Ring Macrolides Tildipirosin and Tilmicosin Bound to Their Ribosomal Site[J].ACS Chem Biol, 2012, 7:1351-1355.

[4]MENGE M, ROSE M, BOHLAND C, et al.Pharma cokinetics of tildipirosin in bovine plasma, lung tissue, and bronchial fluid (from live, nonanesthetized cattle) [J/OL].Vet Pharmacol Therap, 2012, 35 (6) :550-559.

[5]GAY E, BARNOUIN J.A nation-wide epidemiological study of acute bovine respiratory disease in France[J].Preventive Veterinary Medicine, 2009, 89:265–271.

[6]ROSE M, MENGE M, BOHLAND C, et al.Pharmacokinetics of tildipirosin in porcine plasma, lung tissue, and bronchial fluid and effects of test conditions on in vitro activity against reference strains and field isolates of Actinobacillus pleuropneumoniae[J].Vet Pharmacolo Therap, 2012, 36 (2) :140-153.

[7]WATTS J L, SWEENEY M T.Antimicrobial resistance in bovine respiratory disease pathogens:measures, trends, and impact on efficacy[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract, 2010, 26 (1) :79-88.

[8]吴定, 张羽航, 姚汝华.ELISA测定乳中磺胺甲基嘧啶残留[J].中国兽医学报, 1999, 19 (2) :175-177.

[9]冯仁青, 郭振泉, 宓捷波.现代抗体技术及其应用[M].北京:北京大学出版社, 2006:108-109.

人工抗原 篇2

对玉米赤霉醇(ZER)16-OH进行改造,设计合成了模拟玉米赤霉醇特征结构的半抗原--ZER-16-羧丙基丁醚.用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA连接,用于免疫新西兰大白兔,制备的抗血清效价达1:102 400.基于活性酯法合成的包被抗原建立了CI-ELISA检测方法,该法对玉米赤霉醇检测的`线性范围为18.39~1744.70 ng/mL,检出限为8.61 ng/mL.

作 者:刘媛 刘贤进 余向阳 张存政 陈育如 龚振明 周全 LIU Yuan LIU Xian-jin YU Xiang-yang ZHANG Cun-zheng CHEN Yu-ru GONG Zhen-ming ZHOU Quan 作者单位:刘媛,LIU Yuan(江苏省农业科学院,食品质量检测与研究中心,南京,210014;南京师范大学生命科学学院,微生物工程重点实验室,南京,210097)

刘贤进,余向阳,张存政,LIU Xian-jin,YU Xiang-yang,ZHANG Cun-zheng(江苏省农业科学院,食品质量检测与研究中心,南京,210014)

陈育如,CHEN Yu-ru(南京师范大学生命科学学院,微生物工程重点实验室,南京,210097)

龚振明,GONG Zhen-ming(上海交通大学,上海,200030)

周全,ZHOU Quan(上海市兽医卫生监督管理所,上海,32)

人工抗原 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与器材

链霉素 (Streptomycin, SM) 购自Sigma公司;牛血清白蛋白 (BSA) 购自中国医药 (集团) 上海化学试剂公司 (批号F030405) ;卵清蛋白 (OVA) 购自Sigma公司 (批号BP0123) HRP标记羊抗鼠Ig G购自北京鼎国生物公司;U-1800型紫外分光光度计由日本日立公司生产;SUNRISE型酶标仪由瑞士TECAN公司生产;96孔可拆式酶标板由浙江省临海市华威分析仪器有限公司生产。

1.1.2 试验动物

SPF级BALB/C纯系小鼠4只, 由临沂师范学院实验中心提供。

1.1.3 主要溶液

p H9.6碳酸盐缓冲液:1.7g Na2CO3, 2.8g Na HCO3定容于1000ml超纯水中, 4℃冰箱保存。Na OH试液:取Na OH4.3g, 加入双蒸水至100ml。硫酸铁胺试液:取硫酸铁胺0.1g, 加入0.5mol/L的硫酸溶液至5ml, 使之溶解完全。包被缓冲液 (p H 9.6) :准确称取Na CO30.85g, Na HCO3 1.4g, 双蒸水定容至500m L, 4℃冰箱保存备用。p H7.4 0.01mol/L的PBS:准确称取KH2PO40.2g、KCL 0.1g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、Na Cl 8.0g, 加双蒸水溶解, 定容至1000m, 4℃冰箱保存。洗涤液:每100ml p H7.4 PBS中加入50µl的Tween-20, 摇匀即可, 4℃冰箱保存。封闭液 (5%脱脂乳) :称取5g脱脂奶粉溶于100ml p H7.4PBS中, 4℃冰箱保存。抗体稀释液:p H7.40.01mol/L的PBS, 4℃冰箱保存备用。底物缓冲液:枸橼酸-磷酸缓冲液 (枸橼酸0.51g, 1.84g Na2HPO4·12H2O定容于100ml纯水中) , 4℃冰箱保存。显色液:准确称取OPD (邻苯二胺) 5mg, 溶于10ml底物缓冲液中, 再加入30%H2O 15µl, 混匀即可, 现配现用。终止液 (10%硫酸) :量取浓硫酸10ml, 逐滴加入到90ml双蒸水中, 混匀, 室温保存备用。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的制备

制备方法采用直接化学交联法, 链霉素可以利用分子中的醛基和蛋白质的氨基直接缩合, 反应路线见图1[5]:

具体合成路线: (1) 称取BSA 50mg, 溶解于6ml的p H为9.6的碳酸盐缓冲液中。 (2) 称取链霉素82.5mg溶解于4ml的p H为9.6的碳酸盐缓冲液中。 (3) 将上述两种溶液混合, 并于37℃轻微搅拌反应12h。 (4) 将反应液收集用p H7.2 0.01mol/L的磷酸缓冲液透析48h。并收集12h、24h、48h的透析液。 (5) 将透析后的反应物小量分装-20℃冻存备用。

将卵清蛋白与链霉素的偶联也采用同样方法, 将偶联物作为包被原, 用于间接ELISA法。

1.2.2 人工抗原的鉴定

(1) 显色反应。链霉素在碱性溶液中, 分子发生重排, 使环扩大形成六元环, 然后消除N-甲基葡萄糖胺和链霉胍, 生成麦芽酚 (α-甲基-β-羧基-γ-吡喃酮) , 麦芽酚与硫酸铁铵溶液形成紫红色配位化合物[6]。根据链霉素所特有的性质可以通过麦芽酚反应进行鉴别试验, 通过对透析后产物进行麦芽酚反应初步鉴定链霉素是否联结成功, 同样对透析外液进此反应可以初步鉴定反应物是否透析完全。透析产物最终通过紫外分光光度计来进一步确定是否连接成功, 并估算人工抗原的浓度, 为下一步实验奠定基础。具体作法:将不同时段收集的透析液分别取1ml, 然后加入0.3m L Na OH试液。37℃水浴3min后, 加入0.5ml硫酸铁胺试液显色, 如果有紫红色, 则说明含有链霉素, 如果没有则透析干净了。确定透析外液不含链霉素后, 则取透析后的反应物1ml, 然后加入0.3ml Na OH试液。37℃水浴3min后, 冷却至室温后, 加入0.5ml硫酸铁胺试液显色, 如果有紫红色, 则说明含有链霉素, 联结成功。 (2) 紫外扫描。用PBS配制好标准溶液 (SM、BSA和OVA) 及人工抗原 (SM-BSA和SM-OVA) 溶液, 通过紫外分光光度计扫描, 比较透析产物的特征峰是否是链霉素和蛋白载体特征峰的叠加, 且出现了偏移。透析产物通过紫外分光光度计来初步确定是否交联成功, 参考杨利国[7], OD280/OD260<1.5时, 蛋白质含量 (mg/ml) = (1.45×OD280-0.74×OD260) ×稀释倍数, 粗略估算结合蛋白的浓度, 以确定小鼠的免疫剂量。

1.2.3 动物免疫

将小鼠编号, 并做好标记, 取一定量制备成功的免疫原 (SM-BSA) 与等体积的弗氏完全佐剂乳化, 依据估算浓度保证每只BALB/C小鼠的剂量100µg/只, 0.2ml/只[8], 腹腔注射。第14、35d将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂同法进行加强免役, 自二免后的每免7~10d断尾采血, 2 000rpm离心5min分离得到多抗血清。

1.2.4 多抗血清的检测

对标记小鼠, 断尾采血, 将包被原1:40稀释, 抗血清1:100稀释, 二抗采用1:1000稀释, 按照表1间接ELISA流程表[9]测定抗血清效价, 用P表示测定值, N表示阴性对照值, 结果以P/N﹥2.1且P-N﹥0.2为临界判定值。

1.2.5 多抗血清的特异性分析

参考文献[10]将链霉素用0.01mol/l p H7.4的PBS稀释成一系列浓度 (10 000、1 000、100、10、1、0.1ng/ml) , 分别取100µl与浓度为1:100的多抗100µl在离心管中混匀, 置37℃温箱中孵育30min。分别取100µl加入预先用最适抗原包被浓度包被好的酶标板中, 同种浓度的SM作2个重复, 其他操作同上表1。B/B0%=OD490实验组/OD490对照组×100%, 以链霉素浓度的对数值为横坐标, B/B0%为纵坐标作标准曲线, 求出回归方程和IC50 (B/B0%=50%) 值。抗体特异性试验:将链霉素、庆大霉素、卡那霉素、双氢链霉素、硫酸新霉素配制成系列药物浓度, 作竞争抑制实验, 求出各自的IC50, 根据交叉反应率=IC50链霉素/IC50试验组药物×100%, 求出各自的交叉反应率。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的鉴定

2.1.1 显色反应

链霉素麦芽酚显色反应结果表明:12h后的透析外液有颜色反应, 24h后的没有颜色反应, 则表明透析外液基本不含链霉素, 透析基本完全。收集48h后透析产物, 经过麦芽酚反应显色 (紫红色) 明显, 这说明透析产物存在且联结在蛋白质上, 初步确定链霉素与蛋白质联结成功。

2.1.2 UV鉴定

BSA、OVA、SM、SM-BSA和SM-OVA五个样品经紫外分光光度计扫描, 结果 (见图2) 显示SM无明显紫外吸收峰与资料[11]吻合, BSA和OVA分别在278.5nm和279nm波长处有最大吸收峰, SM-BSA和SM-OVA的最大吸收峰分别在278nm和279.5nm波长处。根据UV吸收的合加性原理可知, 整合后的特征峰与半抗原和载体没有重合, 出现了偏移, 说明半抗原SM已分别与载体BSA和OVA交联成功。

扫描SM-BSA, OD (280) 值为0.64, OD (260) 值为0.44, 估算SM-BSA结合蛋白含量为1.65mg/ml;扫描SM-OVA, OD (280) 值为0.54, OD (260) 为0.33, 估算SM-OVA结合蛋白含量为0.54mg/ml。

2.2 多抗血清效价测定与特异性分析

对三免后的标记小鼠断尾采血, 间接ELISA测定OD值, 3只小鼠均出现了阳性结果见表2, 效价1:51200。

2.3 多抗血清特异性分析

间接竞争ELISA阻断试验结果见图3, 链霉素浓度在1ng/ml~100ng/ml范围内, 小鼠多抗抑制曲线呈良好的线性关系, 其中鼠3抑制性最好, 其抑制曲线回归方程为y=-19.96x+77.42 R2=0.9695, 鼠3的IC50为23.62ng/ml, 低于鼠2和鼠3。交叉试验结果 (见表3) 表明链霉素多抗与双氢链霉素交叉达107%, 而与同类的其他药物无交叉反应。

3 讨论

3.1 人工抗原的合成

链霉素属于不含伯胺基的氨基糖苷类抗生素, 可采用两种方法制备免疫原。 (1) 利用醛基可以采用O- (羧甲基) 羟基胺法, 将其生成含有带羧基的半抗原衍生物, 然后采用碳化二亚胺法, 将带有羧基的半抗原与载体蛋白的胺基或者羧基结合[11]。 (2) 利用链霉素其醛基直接与载体蛋白的胺基缩和[5]。本试验采用了方法 (2) 。此法试验条件容易控制, 且所需试剂常用价廉, 抗原的合成易于实现。

3.2 人工抗原的鉴定

链霉素以PBS配制进行UV扫描, 由于PBS自身的干扰使SM的紫外吸收峰不明显, 但同浓度偶联物与链霉素的紫外吸收峰, 并没有重合, 说明偶联成功, 因链霉素特有的麦芽酚显色试验更充分证明偶联物含有链霉素成分, 说明人工抗原制备成功。

3.3 动物免疫

在免疫动物时, 笔者曾采用尾静脉对小鼠加强免疫, 但免疫效果不好, 小鼠会在免疫后出现严重的副反应, 分析原因是免疫原直接进入小鼠循环系统, 造成不良应激所致, 因此建议采用腹腔或背部皮下注射, 此法易于操作, 对小鼠的应激小, 免疫效果较好。

参考文献

[1]高岩.链霉素引起前庭神经损坏1例[J].医用放射技术杂志, 2005, (5) :75.

[2]王燕, 陶泽璋.氨基糖苷类抗生素耳毒性的机理及防治措施[J].国外医学耳鼻喉科分册, 2005, 29 (6) :392-395.

[3]杨智洪, 杜根成, 乔宏兴等.链霉素残留检测方法的研究进展[J].上海畜牧兽医通讯, 2005, (5) :2-3.

[4]吕青, 朱咏梅, 刘勇等.食品中链霉素检测方法研究进展[J].安徽农业科学, 2009:37 (17) :7850-7851.

[5]何华, 焦庆才.生物药物分析[M].第1版.北京:化学工业出版社, 2003, 116.

[6]张兰桐.药物分析[M].北京:中央广播电视大学出版社, 2002, 322.

[7]杨利国, 胡少旭, 魏平华等.酶免疫测定技术[M].南京:南京大学出版社, 1998, 272.

[8]李志勇.细胞工程[M].北京:科学出版社, 2003:139.

[9]李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京:人民军医出版社.2005:11-87.

[10]周斌, 石德时, 覃雅丽等.氯霉素间接竞争ELISA (Ielisa) 检测方法的建立[J].中国兽医学报, 2002, 22 (1) :77-79.

人工抗原 篇4

目前, 利用免疫预防的方法使家畜安全利用疯草已成为国内研究的热点[4]。SW分子质量小, 属于半抗原, 不具有免疫原性。需要将SW与大分子载体蛋白偶联合成人工抗原, 用合成的人工抗原免疫动物, 可诱导动物机体产生抗SW的特异性抗体, 从而获得对疯草的免疫力。本试验用苦马豆素人工抗原卵清蛋白 (ovalbumin, OVA) 免疫昆明种小鼠, 从而为制备SW高效价抗体、构建SW噬菌体单链抗体库、免疫学检测SW及防治家畜疯草中毒奠定基础。

1 材料

1.1 主要试剂

SW-OVA, 由新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室自行制备;弗氏完全佐剂 (FAC) 、弗氏不完全佐剂 (FAI) 、HRP-羊抗鼠IgG, Sigma公司生产;3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺 (TMB) , Amresco公司生产;其余常规试剂均为国产分析纯。

1.2 试验动物

昆明种小鼠54只, 雌雄各半, 体重为 (22±2) g, 购自塔里木大学动物科学学院实验站。

1.3 主要仪器

全波长酶标仪 (型号为PowerWave XS) , 美国Bio-tek生产;高速冷冻离心机 (型号为MR231) , 法国Jouan公司生产;超纯水系统 (型号为Direct-Q3) , 美国Millipore公司生产;冰箱 (型号为BCD-223GB) , 广东科龙电器公司生产;电子天平 (型号为FA/4A) , 上海精密电子仪器有限公司生产。

2 方法

2.1 试验分组

采用完全随机分组的方法, 将54只昆明种小鼠分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组, 每组18只。

2.2 抗原液的制备

精确称取SW-OVA溶解于一定体积的生理盐水中, 加入等量佐剂混匀, 至完全形成白色油包水型乳浊液。首免时佐剂使用弗氏完全佐剂, 第1次和第2次加强免疫使用弗氏不完全佐剂, 第3次加强免疫不使用佐剂, 完全用生理盐水溶解。

2.3 小鼠免疫试验

参考李立等[5]的研究方法进行免疫试验, 对各试验组应用弗氏完全佐剂进行基础免疫, 再以相同免疫途径进行首免和加强免疫。各试验组免疫剂量和次数见表1。对照组每次注射等体积的抗原乳化液。第3次加强免疫后每组随机取3只小鼠, 眼眶取血, 分离血清用于抗SW抗体和E-玫瑰花环率的测定, 然后每隔7 d每组取3只小鼠采血1次, 共采血 6次。

2.4 试验小鼠血清抗体效价的测定

应用间接血凝试验 (IHA) 和间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测试验小鼠血清抗体效价的变化。

IHA的条件参考李立等[5]的研究, 红细胞用30 μg/L的SW致敏。间接ELISA的条件参考H.Watanabe等[6]的研究, 测量样品OD450值 (P) 与阴性对照孔OD450值 (N) , 以P/N>2.1判定样品为阳性。

2.5 E-玫瑰花环试验

参考杨合生等[7]的研究, 计数200个淋巴细胞, 凡1个淋巴细胞结合3个红细胞或以上者为1个玫瑰花环阳性细胞, 计算E-玫瑰花环率。

2.6 数据分析

试验数据用Excel 2007进行处理, 采用SPSS 11.5中One-way ANOVA软件对试验数据进行单因素方差分析, 差异显著时采用LSD法进行多重比较。

3 结果与分析

3.1 IHA试验 (结果见图1)

所有免疫小鼠都产生了抗SW抗体, 首次采血时试验Ⅰ组和试验Ⅱ组免疫小鼠的血清抗体效价分别为6 lb和7 lb, 抗体效价在第3次加强免疫后14 天达到最高值, 分别为7 lb和9 lb。2个试验组小鼠血清抗体变化趋势较为一致, 试验Ⅱ组的抗体效价值始终高于试验Ⅰ组。对照组未检测到抗SW抗体。

3.2 间接ELISA试验 (结果见图2)

所有免疫小鼠在首次采血时检测到了抗SW抗体, 其血清抗体效价的变化趋势与IHA检测结果基本相同。只有第5, 6次采血时试验Ⅰ组小鼠血清抗体效价低于IHA检测结果;第6次采血时试验Ⅱ组小鼠抗体效价低于IHA检测结果。对照组仍未检测到抗SW抗体。

3.3 E-玫瑰花环试验 (结果见图3)

由图3可知, 在整个免疫试验期内, 2个试验组小鼠血清E-玫瑰花环率先呈上升趋势, 并在第4次采血时达到最高值, 然后试验组E-玫瑰花环率的变化趋势趋于平缓。从第1次采血开始, 试验Ⅱ组小鼠E-玫瑰花环率即显著高于试验Ⅰ组 (P<0.05) 。对照组E-玫瑰花环率波动较为平缓, 且均显著低于试验组。

4 讨论

SW分子质量低, 不具有免疫原性[4], 需要与大分子蛋白偶联合成人工抗原后才能诱导动物机体产生特异性抗体。李立等[5]、税媛媛[8]、宋毓民等[9]用SW-BSA制成疫苗免疫小鼠, 均检测到抗SW抗体。本试验将SW-OVA与适宜佐剂配合, 对小鼠进行免疫接种, 通过IHA和间接ELISA检测发现, 小鼠机体产生了抗SW抗体, 其中小剂量组 (试验Ⅰ组) 小鼠血清抗体效价>5 lb的时间为28 d, 大剂量组 (试验Ⅱ组) 小鼠血清抗体效价>5 lb的时间为35 d。说明本试验应用的SW-OVA对小鼠具有较好的免疫原性。

目前, 放牧家畜采食疯草中毒甚至死亡的现象十分严重, 为了有效防治家畜疯草中毒, 需要特异、简便的 SW 和抗 SW 抗体分析方法。 IHA 和间接 ELISA技术具有灵敏性高、特异性强、检测迅速、成本低等特点, 目前在抗SW抗体的检测方面应用较多[7,9]。本试验中IHA的条件参考李立等[5]的研究, 将SW结合在绵羊红细胞上以检测小鼠血清中的SW抗体效价, 结果显示SW直接致敏绵羊红细胞是可行的;另外, 本试验采用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价, 结果表明其与IHA方法的检测结果基本一致, 均可用于SW的免疫学检测。

E-玫瑰花环率的变化反映了动物机体免疫力的变化[7], 其中主要受T淋巴细胞的影响。试验组免疫后E-玫瑰花环率上升, 可能是由于人工抗原刺激动物机体细胞免疫表达, 从而产生了大量高活性的T淋巴细胞, 导致E-玫瑰花环率的升高, 说明该免疫反应可以有效阻止进入机体的SW侵害动物免疫系统。在试验中, 虽然检测到小鼠机体有抗SW抗体产生, 但该抗体能否保护动物在采食疯草时免于中毒, 还有待于进一步研究证实。

摘要:为了检验苦马豆素 (SW) 人工抗原卵清蛋白 (SW-OVA) 对小鼠的免疫原性, 试验采用完全随机分组方法, 将54只昆明种小鼠分为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组, 每组18只, 试验组依次进行首免和加强免疫, 然后通过IHA和间接ELISA法分析血清抗体的变化规律, 同时检测试验小鼠E-玫瑰花环率的变化。结果表明:SW-OVA可诱导小鼠机体产生高效价的抗SW抗体, 而且这种高效价保持的时间较长, 机体E-玫瑰花环率也有所上升。说明SW-OVA具有较好的免疫原性。

关键词:苦马豆素,人工抗原,免疫原性,小鼠

参考文献

[1]刘志滨.疯草中苦马豆素提取方法研究[D].杨凌:西北农林科技大学, 2006.

[2]高木木.新疆棘豆属植物研究[D].石河子:石河子大学, 2008.

[3]王帅, 胡建军, 阿里木别克, 等.南疆地区小花棘豆的营养成分分析[J].草业科学, 2010, 27 (5) :136-139.

[4]税媛媛.SW-HSA的合成及其对小鼠免疫原性的研究[D].杨凌:西北农林科技大学, 2007.

[5]李立, 赵俊, 刘文明, 等.苦马豆素-HSA对小鼠免疫原性研究[J].西北农林科技大学学报:自然科学版, 2008, 36 (1) :23-27.

[6]WATANABE H, SATAKE A, KIDO Y, et al.Monoclonal-based-enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographicassay for enrofloxacin in biological matrices[J].Analyst, 2002, 127:98-103.

[7]杨合生, 童德文, 赵红妮, 等.苦马豆素抗血清治疗山羊甘肃棘豆中毒的血清学和免疫学指标评价[J].西北农业学报, 2008, 17 (6) :6-11.

[8]税媛媛, 刘文明, 赵献军, 等.4种偶联率的苦马豆素-HSA合成及其对小鼠免疫原性研究[J].西北农业学报, 2007, 16 (6) :1-7.

人工抗原 篇5

随着人们对IVM残留的毒性及环境风险的日益关注, 迫切需要简单、快速、高效的IVM残留检测方法, 但目前常用的HPLC法检测的灵敏度较低, 无法满足农产品中IVM及其有毒代谢物的残留分析要求。为此, 笔者根据IVM的结构特点, 采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法将伊维菌素与载体蛋白偶联, 成功地制备了伊维菌素完全抗原, 为畜禽产品中伊维菌素残留的ELISA检测奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 伊维菌素

白色粉末, 有效成分含量>98% (其中B1a含量约为92%, B1b含量约为18%) , 浙江海正药业有限公司提供。

1.1.2 主要试剂

牛血清白蛋白 (BSA) 、卵清蛋白 (OVA) 、多聚-L-赖氨酸 (PLL) 、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐 (EDC) , Sigma公司产品;二甲基甲酰胺 (DMF) 、咪唑、琥珀酸酐、吡啶, 北京化工厂生产;N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 、叔丁基二甲基氯硅烷 (t-BuMe2Si-Cl) , 天津化学试剂公司生产;硅胶GF254 (200~400目) , 青岛海洋化工厂生产;羊抗兔IgG-HRP, 北京鼎国生物公司生产。

1.1.3 主要仪器

透析膜 (Sigma) 、Sartorious 电子天平、95-1型磁力恒温搅拌器、DDY-6B型电泳仪、凝胶成像系统及分析软件 (Syngene公司) 。

1.1.4 试验动物

新西兰成年白兔, 体重1.7~2.0 kg, 购自中牧集团兰州生物制药厂。

1.2 试验方法

1.2.1 半抗原5-O- (单) 琥珀酰IVM的合成

以C5-OH为反应位点, 在无水吡啶的催化下进行反应。取0.1 g IVM加2.0 mL无水吡啶溶解, 加入0.05 g琥珀酸酐, 45 ℃、磁力搅拌下避光反应12 h, 反应物在3.6%HCl和乙酸乙酯间分配, 收集酯层减压浓缩;用二氯甲烷复溶残留物, TLC分离产物 (GF254, 展开剂CH2C12∶THF∶HAC (90∶9.5∶0.5) , 共有4个条带, Rf分别为1.0, 0.5, 0.3, 0.2;分别刮取4条带, 以乙酸乙酯淋洗, 收集洗脱液, 减压浓缩, 真空干燥。

1.2.2 人工抗原的合成

免疫抗原5-O- (单) 琥珀酰IVM-PLL 的合成 ( NHS法) :取12 mg半抗原5-O- (单) 琥珀酰IVM, 加0.4 mL DMF溶解, 再依次加入2.7 mg NHS和4.7 mg EDC-HCl混合, 20 ℃避光搅拌10 h, 将上述反应液逐滴加至6 mL含20 mg PLL的硼酸盐缓冲液 (0.2 mmol/L, pH值为9.4) -10%DMF;溶液开始略显混浊, 最后有少量沉淀出现, 继续搅拌1 h, 再转至4 ℃条件下搅拌12 h, 产物经PBS (0.01 mol/L, pH值为7.2) 透析72 h, Sephdex G-200纯化。

包被原5-O- (单) 琥珀酰IVM-OVA的合成 (混合酸酐法) :取10 mg 5-O- (单) 琥珀酰IVM, 用1 mL DMF溶解, 加入15 μL氯甲酸异丁酯, 20 ℃搅拌45 min, 制成A液;称取30 mg的OVA溶于10 mL 0.2 mol/mL硼酸盐缓冲液 (pH值为 9.4) 中制成B液。将A液逐滴加入B液, 边加边搅拌, 之后在4 ℃搅拌反应12 h, 然后将混合物装入事先处理并在0.01 mol/mL PBS (pH值为7.4) 中浸泡过夜的透析袋中, 在4 ℃、0.01 mol/mL PBS (pH值 7.4) 中透析3 d, 每天换2次透析液。

1.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定

半抗原的结构鉴定:采用薄层色谱法点样, 以IVM的标准品作为对照, 采用质谱法确证。

人工抗原的SDS-PAGE鉴定:SDS-PAGE所用浓缩胶浓度为5%, 分离胶浓度为15%, 浓缩胶电压为80 V, 分离胶电压为120 V;电泳完毕后用考马斯亮蓝R-250 2.5 g/L染色5 h, 用脱色液脱色至背景清晰为止, 然后用凝胶成像系统软件计算载体蛋白与半抗原的结合比。

2 结果

2.1 半抗原的合成与鉴定

合成产物共有4条带, Rf分别为1.0, 0.5, 0.3, 0.2, 进行质谱鉴定, Rf 0.3的分子质量 (976 bp) 与目标产物分子质量 (976.6 bp) 一致, 见图1。质谱分析结果从分子质量上说明了反应产物为目标产物。

目标产物干燥后称重, 最终得到75 mg白色粉末, 计算其收率为67.63%。

2.2 人工抗原的SDS-PAGE鉴定

1.5-O- (单) 琥珀酰IVM-OVA;2.5-O- (单) 琥珀酰IVM-PLL;3.载体OVA;4.载体PLL;M.低分子蛋白质量标准。

人工抗原及其载体的SDS-PAGE结果显示, 合成的人工抗原SDS-PAGE条带的迁移率均比各自载体的迁移率略小 (见图2) , 表明人工抗原的分子质量大于相应载体的分子质量, 证明人工抗原合成成功。用凝胶成像系统软件分析得出5-O- (单) 琥珀酰IVM-PLL的分子质量为79.6 ku , 载体PLL的分子质量为55.0 ku, PLL与5-O- (单) 琥珀酰IVM的分子结合比为1∶25.3。5-O- (单) 琥珀酰IVM-OVA的分子质量为58.0 ku, 载体OVA的分子质量为40.0 ku, OVA与5-O- (单) 琥珀酰IVM的分子结合比为1∶18.6。

3 讨论

目前, 用于检测动物性食品IVM残留的检测方法主要是HPLC法, 样品前处理复杂、耗时且设备昂贵, 不适用于大批量样品的快速筛选、检测。而ELISA法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点, 甚至可以制成试纸用于现场快速检测, 已广泛应用于农药、激素、兽药及其他化学残留物的检测。

笔者以NHS法合成了5-O- (单) 琥珀酰IVM-PLL人工免疫原, 以混合酸酐法合成了5-O- (单) 琥珀酰IVM-OVA人工包被原, 经SDS-PAGE鉴定, 表明人工抗原合成成功, 经计算PLL与5-O- (单) 琥珀酰IVM的偶联比为1∶25.3。

制备小分子化合物的人工抗原需要与载体进行交联, 但小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基团 (氨基、羧基、重氮盐等) 才能与载体交联。对于羟基的半抗原, 需要将其羟基衍生为羧基后才能与载体交联合成人工抗原。IVM分子结构中有3 个羟基, 即C4″-OH、C5-OH和C7-OH, 但7位羟基由于空间阻碍作用较难反应, 本试验选用5位羟基与琥珀酸酐反应生成其衍生物IVM的半琥珀酸酯, 从而在5位羟基上引入了1个羧基, 进而与载体交联合成了IVM的人工抗原。

对于含有羧基半抗原与载体蛋白质偶联的方法有混合酸酐法、碳化二亚胺法和NHS法。其中NHS法首先利用NHS和半抗原合成酯, 在EDC的作用下使产物与蛋白失水产生稳定的连接, 偶联的效果较好, 所以采用该方法制备免疫抗原。半抗原和载体蛋白连接免疫动物后, 不可避免地会产生针对免疫部位的抗体, 为了避免此现象, 选用混合酸酐法制备包被原, 以利于血清的筛选。

本文来自 古文书网(www.gwbook.cn),转载请保留网址和出处

相关文章:

免疫保护性抗原01-07

抗原分析01-07

免疫抗原01-07

乙型肝炎病毒核心抗原01-07

乙肝表面抗原01-07

大豆抗原蛋白01-07

抗原血清学01-07

人糖类抗原12501-07

人类白细胞抗原01-07

艺术与生命的灵性01-07

注:本文为网友上传,旨在传播知识,不代表本站观点,与本站立场无关。若有侵权等问题请及时与本网联系,我们将在第一时间删除处理。E-MAIL:66553826@qq.com

上一篇:免疫保护性抗原 下一篇:大豆抗原蛋白