B细胞抗原表位

关键词：

B细胞抗原表位（精选五篇）

B细胞抗原表位 篇1

1材料与方法

1.1 SLT-IIeB蛋白序列

检索Genbank查找SLT-IIeB蛋白的氨基酸序列, 检索号为M21534。检索结果:SLT-IIeB蛋白共包含87个氨基酸。

1.2 SLT-IIeB蛋白的二级结构柔性区预测

利用分析软件DNAStar中的Garnier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法预测SLT-IIeB蛋白的二级结构柔性区域。1.3 SLT-IIeB蛋白的B细胞抗原表位预测采用分析软件DNAStar, 按Kyte-Doolittle的氨基酸亲水性标准, 预测其亲水性;按Emini方案预测蛋白质的表面可能性;按Jameson-Wolf方案预测其抗原性指数, 然后综合评定SLT-IIeB的B细胞抗原表位所在。

2结果与分析

2.1 SLT-IIeB蛋白二级结构柔性区域预测结果

按GarnierRobson、Chou-Fasman、KarplusSchulz方法预测的结果分别见图1、图2、图3, 综合3种预测方法分析得出:SLT-IIeB蛋白的二级结构柔性区域可能位于N端第31-35、43-45、49-52区段和第75-78区段。

2.2 SLT-IIeB蛋白的B细胞抗原表位预测

分别按KyteDoolittle、Emini、Jameson-Wolf方案对SLT-IIeB蛋白的氨基酸链的亲水性、表面可能性和抗原指数进行分析, 结果如图4、5、6所示。经过对抗原指数、亲水性指数和蛋白质表面可能性指数进行分析, 初步确定SLT-IIeB蛋白可能的B细胞抗原表位区域, 如果某区域内部或附近又具有柔性结构, 则该区域较有可能是B细胞表位。

综合分析以上预测结果, SLT-IIeB蛋白分子较有可能的B细胞表位区段位于N端第28-36区段和第43-53区段。

另外, 用BepiPred预测SLT-IIeB蛋白的B细胞表位的结果如表1所示。

综合以上两种分析软件的结果, 最终得出SLT-IIeB的B细胞表位优势区段为N端第31-36区段 (见表2) 。

3讨论

3.1猪水肿病由产类志贺毒素的大肠杆菌引起, 它主要产生F18ab菌毛和类志贺毒素II型变异体 (SLT-IIe) 两类毒力因子。SLT-IIe的保护性抗原SLT-IIeB蛋白具有很高的同源性, 可作为表位疫苗和基因工程疫苗的研制基础。然而, 目前国内外还没有利用SLT-IIeB蛋白研制表位疫苗和基因工程疫苗的报道。本实验对SLT-IIeB蛋白的B细胞抗原表位进行预测, 目的就在于为今后研制猪水肿病表位疫苗和基因工程疫苗奠定基础。

3.2正确而详细地绘制蛋白质表位图谱对猪水肿病的诊断及预后判定, 疫苗分子设计及免疫干预治疗等至关重要。根据B细胞表位的特征, 先预测抗原表位, 再对合成的肽段进行实验确认, 是一种省时、省力和经济的方法。目前预测B细胞表位的软件有很多, 但没有一个软件的准确性能达到100%, 目前大多数研究者使用DNAStar, 利用DNAStar中Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini的蛋白质表面可能性方案、Jameson-Wolf的抗原指数方案, 辅以GarnierRobson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法, 取得了很多成功的结果。另外, 国内外也有部分研究者使用在线软件BepiPred进行B细胞表位预测, 并取得了成功。

3.3为了准确预测SLT-IIeB蛋白的B细胞表位, 本研究首先使用DNAStar软件进行预测, 得出SLT-IIeB蛋白的可能B细胞抗原表位, 同时利用在线软件BepiPred进行SLT-IIeB蛋白可能的B细胞抗原表位预测, 通过比较两种预测方法, 发现两种方法得出的结果具有相重合的区段, 那么这些区段很可能就是我们要找的优势抗原表位。经过分析汇总, 推测SLT-IIeB蛋白最有可能的B细胞表位位于N端第31-36区段内。但这个区域仅仅是SLT-IIeB蛋白中的B细胞表位优势区段, 而不包括所有的抗原表位, 我们推测在其它区域也可能存在B细胞表位。

B细胞抗原表位 篇2

目的 对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spike, S)S1段进行原核重组表达,并检测表达产物的抗原性.方法 对S1中的HLA抗原表位进行预测分析,根据分析结果选定用于重组表达的区段,利用pET21b载体进行原核表达,将产物纯化后利用SARS抗血清进行抗原性检测.结果 抗原表位分析表明,S1中包含有多个能够被HLA分子有效提呈的抗原表位,综合考虑表位肽的.分布、重组表达的效率、重组蛋白的空间构象以及引物设计的优化等因素,选取S1中的关键区域259～565 aa进行原核重组表达,得到了包涵体形式的重组蛋白,经过纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性S1蛋白;用SARS抗血清对此重组蛋白进行免疫学鉴定,表明该蛋白具有SARS特异的抗原性.结论 重组表达的S1蛋白具有较强的抗原性,为进一步的疫苗研究和抗体筛选奠定了基础.

作 者：邵红伟 蓝东明 陈尚武 刘泽寰 黄树林 SHAO Hong-wei LAN Dong-ming CHEN Shang-wu LIU Ze-huan HUANG Shu-lin  作者单位：邵红伟,黄树林,SHAO Hong-wei,HUANG Shu-lin(广东药学院,生命科学与生物制药学院/生物制药研究所,广东,广州,510006)

蓝东明,陈尚武,LAN Dong-ming,CHEN Shang-wu(中山大学,生命科学学院,广东,广州,510275)

B细胞抗原表位 篇3

关键词：坦布苏病毒；囊膜蛋白；二级结构；B细胞表位

中图分类号： S858.335.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0166-03

收稿日期：2013-09-13

基金项目：国家自然科学基金（编号：31172345）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）5048]。

作者简介：韩凯凯（1983—），男，河南新乡人，博士，助理研究员，主要从事家禽病毒分子生物学研究。E-mail：hankk0917@126.com。

通信作者：李银，博士，研究员，主要从事家禽疫病流行病学和防治相关的研究。E-mail：muziyin08@163.com。2010年春季以来，上海、浙江、江苏等地相继暴发了一种導致鸭鹅产蛋量急剧下降的新发疾病，发病鸭鹅主要表现为高热、运动障碍、食欲下降甚至废绝、产蛋下降甚至停止，死亡率可达 5%～10%[1]。其典型病理变化表现为鸭鹅的卵巢先发生出血、萎缩、破裂，患病后期出现神经症状，倒地震颤，最终衰竭死亡。该病传播迅速、波及面广，几乎席卷了整个水禽养殖密集地区，给我国鸭鹅养殖业造成了巨大损失[2]。目前已证实，引起该病的病原为坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）[3]。坦布苏病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）不分节段的单股正链 RNA 病毒，含有单一的开放读码框，编码 结 构 蛋 白（C、 PrM、E）和 非 结 构 蛋 白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），其中E蛋白是坦布苏病毒的囊膜蛋白，由 500个氨基酸组成，在病毒的吸附、融合、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用[4]。测定E蛋白的晶体结构发现，它在空间上可以形成3个不同的结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区）。在乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位研究中，Kolaskar等认为，E蛋白的三维结构域Ⅲ（292～402 aa）集中许多抗原中和表位[5]。Seif等通过分段表达E蛋白，证明了中和表位存在于 E373-399位的27个氨基酸序列内[6]。Wu等研究发现，JEV的中和位点主要集中在EⅢ的E307-309、E327-333、E386-390这3个区域内[7]。由于该病毒的发现时间不长，其主要蛋白抗原表位研究尚未见报道。有学者提出，蛋白质的二级结构、亲水性、柔韧性、抗原性、表面可及性等特性与B细胞抗原的表位分布存在密切联系[8]。本试验首次应用生物信息技术对鹅坦布苏病毒（goose Tembusu virus，GTMUV）E蛋白基因推导的肽链进行蛋白质二级结构和B细胞表位的预测分析，旨在为坦布苏病毒E蛋白功能的研究、抗体的制备及分子疫苗的设计等提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

预测所使用的坦布苏病毒毒株来自鹅源JS804株，其病毒开放阅读框氨基酸序列由笔者所在实验室测定，共有500个氨基酸残基，GeneBank登录号为JF895923。

1.2试验方法

先用单参数对毒株E蛋白的结构及性质进行预测，再采用不同的参数对E蛋白的二级结构及B细胞表位进行综合预测和分析。

1.2.1GTMUV E蛋白二级结构预测应用DNAStar软件的protean模块进行二级结构预测。采用Chou-Fasman法从氨基酸残基的晶体结构来预测蛋白质的二级结构；用Garnier-Robson法计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性；用Karplus-Schultz法预测蛋白质骨架区的柔韧性。其中各参数的意义见相关文献[9-10]。

1.2.2GTMUV E蛋白B细胞抗原表位预测用DNA Star软件Protean程序预测B细胞抗原表位；用Kyte-Doolittle方法，同时依据氨基酸组成预测蛋白的亲水区和疏水区；用Emini方法预测特定区域于蛋白质表面的可及性；用Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数，同时根据http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input网址中的Kolaskar-Tongaonkar法预测蛋白的平均抗原表位指数。结合蛋白的亲水性、表面可及性、柔韧性、抗原指数等对测定结果进行综合分析。综合预测结果，预测鹅坦布苏病毒E蛋白的潜在优势B细胞抗原表位，其中各参数的意义参考相关文献[11-13]。

2结果与分析

2.1GTMUV E蛋白的氨基酸序列

鹅坦布苏病毒E蛋白基因编码500个氨基酸，其理论分子量为54.38 kDa，理论等电点pI为7.32，存在跨膜区域。通过http：//prosite.expasy.org/scanprosite/在线服务器预测表明，该蛋白有N_糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点。

2.2GTMUV E蛋白二级结构的预测

采用DNAStar软件的Chou-Fasman法、Garnier-Robson法以及Karplus-Schultz法对E蛋白的二级结构进行预测，结果见图1。

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Garnier-Robson法预测结果显示，E蛋白有14个α-螺旋，32个β-折叠区域。Chou-Fasman法预测结果显示，E蛋白有16个α-螺旋，23个β-折叠区域。2种方法预测出的α-螺旋均较β-折叠数量少；2种方法预测的α-螺旋共有12个，分别位于41～57、79～81、87～92、117～120、133～144、157～165、179～181、239～252、261～267、285～296、412～417、468～478区段上；2种方法预测的β-折叠区域共有20个，分别位于1～4、20～25、31～36、62～38、166～170、186～189、201～205、270～274、299～302、310～314、322～328、338～341、254～359、381～386、391～397、423～425、435～438、443～448、482～486、491～496区段上。同时发现，Garnier-Robson法预测的β-转角区域远远少于Chou-Fasman法，Gamier-Robson法预测的无规则卷曲分布区段相对集中，主要位于15～17、145～148、226～239、456～461区段上。

2.3柔韧性区域分析

利用Karplus-Schultz法预测E蛋白骨架区的柔韧性，由结果可知，E蛋白骨架区含有分布较均匀的柔韧性区域，肽链中具有较高表面可及性的区域主要在62～78、92～104、225～239、273～286、313～322、362～370和399～416区段上（图2）。由于这些蛋白肽段的柔韧性较大，发生扭曲、折叠的概率较高，因此形成表位的可能性较大，容易与抗体进行嵌合。

2.4E蛋白的B细胞抗原表位预測分析

2.4.1E蛋白的亲水性预测分析利用Kyte-Doolittle方法预测E蛋白的亲水性，结果显示，E蛋白具有较高的亲水性，亲水性区域的分布较均匀，主要分布在E蛋白肽链的36～45、60～104、119～137、147～165、174～199、207～251、275～309、310～320、391～405和475～483区段上（图3）。B细胞抗原表位多位于蛋白外侧，而亲水氨基酸残基多位于蛋白表面，因此该区段位于蛋白表面的可能性最大，作为抗原表位的概率也最高。

2.4.2E蛋白的表面可及性预测分析利用Emini方法进行E蛋白的表面可及性分析，结果表明，E蛋白肽链中具有较高表面可及性的区域在7～12、34～41、80～89、123～126、130～136、148～163、233～239、245～250、315～319、392～402和476～481区段上（图4）。由于这些区域可能位于蛋白分子表面，因此有可能形成表位。

2.4.3E蛋白的抗原指数及抗原表位指数预测分析应用DNAStar软件，采用Jameson-Wolf方法对E蛋白的抗原性进行预测。从图5的分析可见，E蛋白存在有多个潜在的抗原表位位点，具有较高抗原指数的区域在6～19、26～31、33～44、61～89、92～105、108～115、118～137、144～159、172～177、179～186、189～199、226～251、257～262、273～301、312～322、330～339、344～355、376～383、388～395、397～418和475～484区段上。Kolaskar-Tongaonkar法预测的E蛋白平均抗原表位指数为1. 027，详见图6。

2.5E蛋白B细胞抗原表位综合预测

通过对鹅坦布苏病毒E蛋白的二级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数、表面可及性等参数分析显示，若抗原表位指数≥1.027，亲水性指数≥0，氨基酸的抗原表位可及性指数≥1，且区段内部或附近具有柔韧性结构，则这一区段为抗原表位的可能性较大。按照如上方法筛选表明，在E蛋白肽链的第35～41、80～89、148～159、245～251、314～320、392～402和475～482区段上，各种方案预测的结果基本一致，且在蛋白二级结构上含有较易形成抗原表位的转角和无规则卷曲结构。因此可以推测，E蛋白的B细胞抗原表位可能在以上区域内或附近。

3结论与讨论

B细胞识别蛋白抗原时，是以其表面的B细胞抗原受体（BCR）与蛋白抗原表位结合，此过程与抗原抗体的结合类似。作为B细胞的抗原表位，应位于或易于移动到蛋白抗原表面，有利于与B细胞抗原受体或抗体结合；同时还要有一定柔韧性，因为抗原与抗原受体或抗体的结合是一个相互嵌合的过程。因此，预测B细胞抗原表位时主要从蛋白质的二级结构、柔韧性、表面可及性和亲水性等几个方面入手。蛋白质二级结构与表位分布关系密切，在蛋白质结构中作为骨架起稳定作用的主要是α-螺旋和β-折叠，而决定蛋白质功能与抗原表位分布的则多是β-转角和无规则卷曲[14]。

由于螺旋区段和折叠区段的化学键能较高，主要维持蛋白的高级结构，且经常位于蛋白质内部，很难较好地与抗体嵌合，不易形成抗原表位；而转角区域和无规则卷曲区域的结构是比较松散的结构，易于发生扭曲、盘旋，并多位于蛋白质分子表面，有利于与抗体嵌合，成为抗原表位的可能性较大。蛋白质的柔韧性是指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽骨架有一定程度的活动性；亲水性分析结合二级结构预测已被广泛应用于抗原表位分析[15]。

本研究采用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法预测鹅坦布苏病毒蛋白的二级结构，利用Karplus-Schulz法预测其柔性区域，利用Kyte-Doolittle方法预测E蛋白的亲水区和疏水区。结果显示，鹅坦布苏病毒E蛋白的二级结构较为复杂，且α-螺旋和β-折叠分布相对均匀，含有较多的转角和无规则卷曲等柔性区域，这些柔性区域的存在为抗原表位的确定提供了有力的证据。同时，与这些区域相对应的亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可及性等参数也较高，因此预测这些区段应是潜在优势B细胞抗原表位所在区段。需要注意的是，一个蛋白质中某段氨基酸序列能否诱导体内产生抗体是多种复杂因素共同作用的结果。B细胞抗原表位，尤其是其构象表位，主要是通过三维立体结构来展现其抗原性，而生物信息学分析软件主要是对其二级结构进行预测，因此用于预测构象依赖型表位有一定的局限性。本试验的预测结果只能作为鉴定鹅坦布苏病毒E蛋白潜在表位的参考，预测结果正确与否还有待于科学研究证实。即便如此，通过生物信息学的方法对E蛋白进行预测，不仅可以了解坦布苏病毒E蛋白抗原的结构、功能、抗原抗体反应等有关免疫反应的诸多信息，而且对诊断试剂研发、药物制备和核酸疫苗设计等也具有指导意义。

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参考文献：

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[14]Doolittle R F. The roots of bioinformatics in protein evolution[J]. PLOS Computational Biology，2010，6（7）：e1000875.

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B细胞抗原表位 篇4

关键词：人IL-38,二级结构,B细胞表位

0 引言

白细胞介素(interleukin,IL)-38在皮肤、扁桃体、心脏、胎盘、胎儿肝、脾、胸腺等组织中都存在表达，但其在人心脏和胎盘等无免疫功能的组织中呈现低表达[1]。IL-38属于IL-1家族(IL-1 family,IL-1F)细胞因子的新成员，即为IL-1F10，也曾被称IL-1HY2[2]。人IL-38的基因位于2号染色体上，与IL-1家族其他成员相接近，且其基因序列与IL-1Ra(IL-1受体拮抗剂)、IL-36Ra有较高的同源性[1]。它是IL-36R的部分受体拮抗剂，与牛皮癣、关节炎、强直性脊柱炎等多种炎症性疾病的发病机制有密切关联[3,4,5,6,7,8,9,10,11]。目前，国内外对IL-38的研究较少，关于其具体的生物学特征及功能等都欠缺了解。本研究将从基因库中人IL-38的基因序列出发，推导其氨基酸序列，再利用多种分子生物学软件对其蛋白进行生物信息学分析，以便从分子水平了解IL-38蛋白的生物学特征及功能，并对其B细胞抗原表位进行分析与预测，从而为以后对IL-38基因及其表达产物进行深入研究奠定基础，并将为制备IL-38的单克隆抗体提供重要理论依据。

1 材料与方法

1.1 序列来源

人IL-38基因序列来源于Gen Bank(序列号AY029413.1)。

1.2 生物信息学分析

从NCBI提供的蛋白数据库中获得人IL-38蛋白的一级氨基酸序列(Protein ID:ENSP00000376893)。组成及理化特性应用Prot Param tool程序(http://web.expasy.org/protparam/)进行预测[12,13]。应用SOPMA网上在线程序(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl?page=npsasopma.html)对IL-38的二级结构进行预测[14]。应用Prot Scale程序预测IL-38的亲水性、柔韧性(http://web.expasy.org/protscale/)Swiss Prot:Q8WWZ1。应用Emini程序对IL-38的可及性的进行分析(www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred)[15]。抗原位点按Kolaskar方案进行分析(http://www.imtech.res.in/cgibin/bcepred/bcepred.pl)。最后，对各个分析方案的结果进行综合评估，取其重叠的肽段区域，这些公共的重叠区域即为潜在的B细胞优势抗原表位。

2 结果与分析

2.1 人IL-38基因及其编码产物序列

人IL-38基因序列长459 bp。其编码产物约为152个氨基酸，序列如下:

2.2 IL-38的组成及理化特性分析

应用Prot Param tool程序进行编码产物氨基酸的组成分析，结果如图1。分析发现，编码产物由19种氨基酸组成，含量最多的为A(丙氨酸)、E(谷氨酸)、L(亮氨酸)，且比例均达到了9.2%。其次为G(甘氨酸)，所占比例为7.9%。而P(脯氨酸)和S(丝氨酸)的含量也都达到了6.6%。但该编码产物无H(组氨酸)。同时，软件预测此表达产物的分子量约为16.9 k Da，半衰期约为30 h，理论等电点约为5.0，分子简式为C757H1164N198O226S9。

2.3 IL-38的二级结构分析

应用SOPMA在线程序对IL-38的二级结构进行分析，结果显示，IL-38蛋白质分子的二级结构主要由无规则卷曲(44.08%)、β-折叠(39.47%)、β-转角(9.21%)和α-螺旋(7.24%)组成(图2)。其中β-转角和无规卷曲在序列中主要位于1-7、14-17、23-25、30-36、45-55、62-65、72-78、92-98、104-109、115-119、124-131、136-143和150-152位氨基酸区域，无规则卷曲和β-折叠的分布则较为均匀。

c:无规则卷曲;e:β-折叠;t:β-转角;h:α-螺旋。

c:Random coil;e:Extended strand;t:β-turn;h:α-helix.

2.4 IL-38亲水性、柔韧性、可及性等单参数的预测

2.4.1 亲水性

根据Hopp&Woods方案，按照其氨基酸的亲水性分析标准，我们对人IL-38蛋白质分子的亲水性进行分析，结果显示，亲水性较高的区域主要集中于15-29、32-52、68-98、106-112、126-147等氨基酸区段(图3)。

2.4.2 柔韧性

根据Average flexibility的氨基酸柔韧性标准，分析IL-38的柔韧性，结果如图4。其中12-34、45-69、74-98、105-116和126-145等肽段为柔韧性较高的区域。

2.4.3 可及性

按Emini可及性标准，获取IL-38的可及性，结果如图5。可及性较高的区域为6-25、49-55、74-101和126-149肽段。

2.5 B细胞表位的预测

按Kolaskar方案进行分析显示，B细胞抗原表位可能为26-33、40-48、53-61、78-84和128-135等位点。在对抗原表位进行选择时需满足以下几个条件[16]:第一，最理想的抗原性识别区域一般应具备亲水性、且位于蛋白表面和结构上具备易变形性等特点;第二，抗原要连续;第三，应具有β-转角二级结构;第四，序列的长度建议在13～20个氨基酸残基之间为宜。各参数分析的结果汇总如表1。

虽然根据不同参数预测的可能作为潜在B细胞表位的肽段区域在位置上并不完全一致，但根据以上条件综合分析得到了26-36、45-55、78-98和124-143等基本符合条件的四个肽段，这些肽段具有较高的亲水性，同时都位于(或富含)β-转角和无规则卷曲的二级结构区段，并且与具较高柔韧性、可及性的肽段也有重叠。因此，IL-38的B细胞表位可能为上述四个肽段。

3 讨论

B细胞抗原表位的预测基于对B细胞表位结构的研究，是通过对蛋白质的理化性质和二级结构的分析，利用其理化性质或二级结构与B细胞表位的相关性，进行综合分析而达到预测目的方法[17]。30多年前Michael Sela的经典实验[18]证实:蛋白质的B细胞表位通常位于空间构象上能够被相应抗体及B细胞(BcR)所触及的蛋白质表面。蛋白质的二级结构很大程度上决定了蛋白质表位的分布。α-螺旋、β-折叠通常处于蛋白质内部，空间上不易被接触。β-转角、无规则卷曲多位于蛋白质表面，为突出结构，结构上易变形性强，利于与抗体及BcR嵌合，因此它们所处肽段为抗原表位的可能性较大。目前为止，在预测蛋白质分子B细胞表位中最常用和最有效的方法是先对蛋白质分子的亲水性和可及性进行分析，然后进行综合评估。蛋白质的亲水性和可及性区域是形成抗原表位的前提，也是作为B细胞表位判定的首要条件。

抗原表位的形成是一个在多因素共同作用下而产生的复杂结果，所以仅凭某个相关单参数进行的预测结果，其准确率往往较低。因此，本研究应用Pro Scal等服务器上的相应软件和SOPMA软件，通过对二级结构与亲水性、柔韧性和可及性等多参数的综合分析来预测IL-38的B细胞表位，克服了单参数预测的局限性，提高了预测的准确性和可靠性[19]。经过结合上述多参数分析等结果和抗原表位选择的基本条件的综合考虑，人IL-38的B细胞表位可能位于26-36、45-55、78-98和124-143这四个肽段区域内或其附近。

B细胞抗原表位 篇5

1 材料

大鲵虹彩病毒贵州分离株,贵州重大疫病监测防制重点实验室保存;鲤上皮瘤细胞,购自上海拜力生物科技有限公司。

MIX PCR酶、核酸染料、电泳缓冲液、病毒基因组DNA提取试剂盒,DL-2 000 Marker,购自北京天根生物科技有限公司。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

2 方法

2.1 引物的设计

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因序列设计1对引物,序列为:上游引物5'-ATGTCTTCTGTAACTGGT-3',下游引物5'-TTA-CAAGATTGGGAATCC-3'。

2.2 病毒核酸的提取

将大鲵虹彩病毒液接种于鲤上皮瘤细胞,待细胞出现病变后收集细胞毒液,将其放入-70℃冰箱反复冻融3次,5 000 r/min离心10 min,取上清液200μL用病毒基因组DNA试剂盒提取基因组。

2.3 PCR扩增条件的优化

对PCR的退火温度(50,55,60℃)和引物浓度(5,10,20μmol/L)进行优化。在100μL体系中加入上、下游引物各4μL(5,10,20μmol/L)、MIX PCR酶12.5μL、模板4μL,加dd H2O至100μL。反应条件为:94℃5 min;94℃30 s,50℃(55℃、60℃)1 min,72℃1 min,共30个循环;72℃延伸10 min。取10μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳。将序列送宝生物(大连)有限公司进行测序。

2.4 序列同源性的分析及系统发育进化树的比较

利用DNAStar软件将大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因与Gen Bank中其他蛙病毒属MCP基因序列进行同源性及系统发育进化树分析。研究引用的其他MCP基因序列在Gen Bank中的序列号分别是:博勒蛙病毒(Bohle iridovirus,FJ358613.1)、中国大鲵虹彩病毒(CGSIV,KC465189.2)、蛙病毒3型(Frog virus 3,AY548484.1)、林蛙病毒KRV-1株(Ranavirus KRV-1,HM133594.1)、鳖虹彩病毒(Softshelled iridovirus,DQ335253.1)、流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis,AY187045.1)、牛蛙病毒(Rana catesbeiana virus,AB474588.1)、日本小鲵鲷病毒(Hynobius nebulosus virus,AB500273.1)。

2.5 生物信息学分析

应用DNAStar Protean软件进行大鲵虹彩病毒MCP蛋白二级结构预测,利用Chou-Fasman法[6]预测该蛋白质的二级结构,利用Garnier-Robson法[7]计算MCP蛋白结构,利用Karplus-Schultz法[8]预测其柔韧性,利用Kyte-Doolittle法[9]预测其疏水区和亲水区,利用Emini法[10]预测其蛋白质表面的可能性,利用Jameson-Wolf法[11]综合预测蛋白的抗原指数。

3 结果

3.1 PCR产物的鉴定结果

PCR扩增产物经切胶回收,送宝生物工程(大连)有限公司测序,结果表明,扩增片段为大鲵虹彩病毒MCP基因的特异性条带,大小为1 392 bp,见图1。

3.2 同源性分析及系统发育进化树比较结果

M.DL-2 000 Marker;1.大鲵虹彩病毒MCP基因PCR产物;2.阴性对照。

与Gen Bank登录的其他蛙病毒属序列进行同源性分析,结果表明,与中国分离株核苷酸相似性为99.8%,与蛙病毒3型核苷酸相似性为98.1%,见图2。该序列系统发育进化树比较见图3。

3.3 大鲵虹彩病毒MCP蛋白的二级结构预测结果

Garnier-Robson法预测结果表明,大鲵虹彩病毒MCP蛋白有17个α-螺旋中心,36个β-折叠区段;Chou-Fasman法预测结果表明,该蛋白有13个α-螺旋中心,21个β-折叠区段;Garnier-Robson法预测结果表明,该蛋白含有25个无规则卷曲区域。见图4。两种方法预测出的α-螺旋相同区域有12处,β-折叠相同区域有21处。说明Garnier-Robson法和Garnier-Robson法预测的α-螺旋中心和β-折叠相同区域较多。

3.4 大鲵虹彩病毒MCP蛋白亲水性预测结果

A.α-螺旋区段;B.β-折叠区段;T.转角区域;C.无规则卷曲区域。

利用Kyte-Doolittle预测MCP蛋白的亲水性,结果表明,MCP蛋白亲水性区域的分布广泛且比较分散,亲水氨基酸残基多位于蛋白表面,该区段作为抗原表位的可能性较高。Emini法预测结果表明,此蛋白亲水性区域为该蛋白质的表面,见图5。

3.5 大鲵虹彩病毒MCP蛋白柔韧性区域分析结果

利用Karplus-Schulz法预测大鲵虹彩病毒MCP蛋白柔韧性区域,结果表明,该蛋白柔韧区域较多。这些柔韧区域发生扭曲、折叠,可形成B细胞抗原表位,容易与抗体进行结合,见图6。

3.6 大鲵虹彩病毒MCP蛋白的抗原指数预测结果

利用Jameson-Wolf法预测MCP蛋白的抗原指数,结果表明,MCP蛋白有多个抗原表位位点,抗原性指数较高,而这些区域可能是B细胞抗原表位区域,见图7。

4 讨论

大鲵虹彩病毒MCP基因编码463个氨基酸,该蛋白大小约为49 ku,具有良好的免疫原性,在病毒的装配和感染过程中发挥重要作用[12,13]。本研究将克隆的大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,核苷酸序列相似性为99.8%,与蛙病毒3型核苷酸相似性为98.1%,这和周小愿等[14]和徐进等[15]的研究结果一致,表明中国GSIV多个流行毒株是同一种GSIV病毒。