关键词: 大鼠
肠粘膜屏障(精选三篇)
肠粘膜屏障 篇1
关键词:乳果糖,门脉高压,大鼠,肠粘膜屏障
目前, 在国内伴随抗生素的广泛应用以及其在临床治疗有效性的降低, 因而非抗菌性药物在肝硬化门脉高压患者肠道菌群易位及抗内毒素血症方面的作用已受到越来越多的关注和重视。本研究旨在观察微生态制剂乳果糖对门脉高压大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用, 为微生态制剂的临床应用提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
乳果糖 (荷兰苏威药业) ;多克隆兔抗Occludin抗体 (美国Zymed labs公司) ;SP免疫组化试剂盒 (北京中杉金桥公司) ;内毒素的测定鳌试剂盒 (上海伊华医学科技有限公司) 。
1.2 动物及分组
普通雄性SD大鼠 (华中科技大学同济医学院实验动物中心提供) 150~170g/只, 共50只。建立四氯化碳门脉高压模型, 存活36只大鼠随机分为:治疗组 (12只) 、对照组 (12只) 和模型组 (12只) 。治疗组即乳果糖组:灌服乳果糖5m L/kg, 每日2次, 直至大鼠排稀便 (共10d) ;对照组:仅应用等同剂量的葡萄糖;模型组:予以正常饮用水。
1.3 标本处理
第11日, 以1.0m L/kg体重肌肉注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠, 腹主动脉采血做肝功能测定;留取标本浸泡于10%福尔马林液中固定, 常规石蜡包埋、切片 (5μm) , 备常规HE、Masson及免疫组化染色;送新鲜标本电镜检查和细菌易位研究。
1.3.1 细菌易位的研究
取肝、脾、肾 (各约0.2 g) 和肠系膜淋巴结一颗, 称重后分别制成5%组织匀浆, 各取50u L分别置于肠道需氧培养基、肠道厌氧培养基和肠杆菌科细菌培养基在35℃培养箱中培养48~72h, 计数细菌菌落。凡是组织匀浆中培养出3个或3个以上的菌落即为细菌移位阳性[1]。
1.3.2 肝功能测定
腹主动脉采血, 采用全自动生化仪进行AST、ALT、TBLL、ALB测定来反映肝功能的损伤情况。
1.3.3 内毒素测定
腹主动脉采血0.2m L置于肝素抗凝管中, 3000rpm离心10min分离血浆, 内毒素的测定采用改良的偶氮基质显色法[2], 鳌试剂盒由上海伊华医学科技有限公司提供。所有实验器材均采用去热原处理。
注:与治疗组比较, *P<0.01
1.3.4 病理、电镜检查
取回肠末端肠壁组织用10%福尔马林溶液固定, 做HE切片染色、Masson染色, 光镜下观察病理改变;另取回盲部肠壁组织, 制成约1mm×1mm×1mm大小固定于于2%戊二醛溶液中, 送超微病理电镜下观察肠黏膜病变。
1.3.5 肠黏膜紧密连接蛋白免疫组织化学测定
取末端回肠组织病理切片, 兔抗大鼠Occludin抗体, 1:200稀释, SP试剂盒购自北京中杉金桥生物公司, 按照操作说明进行SP3步法免疫组化染色, 阴性对照以0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 代替一抗, 其余步骤不变;应用光学显微镜、多媒体彩色病理图文分析系统PHIAS~1000, 通过光学显微镜放大400倍, 每张切片随机选取5个视野, 摄取图像并输入图像分析系统内, 取均值, 测定其光密度, 并计算阳性显色面积占测量窗内的百分比。
1.4 统计学方法
数据采用均数±标准差表示。应用统计软件SPSS 12.0分析, 进行χ2检验、方差分析和t检验。P<0.05为差异具有显著性意义。
2 结果
2.1 组织病理学观察
模型组与对照组可见肠粘膜充血、水肿, 小肠肠壁明显变薄, 黏膜下炎性细胞浸润增多, 粘液分泌增多, 固有膜内可见点状出血灶。电镜下, 可见小肠黏膜上皮细胞微绒毛明显缩短、稀疏、部分断裂、扭曲、倒伏、脱落, 肠上皮细胞间紧密连接结构模糊, 细胞间隙增大, 线粒体基质减少, 部分嵴断裂, 粗面内质网肿胀, 结构不清。治疗组肠组织充血、水肿及炎性细胞浸润情况明显改善, 绒毛倒伏情况好转。
2.2 细菌易位情况
乳果糖治疗后, 细菌易位率较模型组和对照组明显减少 (P<0.05) , 见表1。
注:与治疗组比较, *P<0.01
注:与治疗组比较, *P<0.01
2.3 肝功能各组血清肝功能水平 (表2)
2.4 内毒素各组血清内毒素水平 (表3)
2.5 肠黏膜跨膜结合蛋白表达 (表4)
3 讨论
肠粘膜屏障是由机械屏障、化学屏障、生物屏障以及免疫屏障共同构成。在肠粘膜机械屏障组成成份中, 肠上皮细胞及其紧密连接是最重要的组成部分。在正常情况下, 肠黏膜屏障阻止了肠道细菌、内毒素向肠外移位, 在保护机体免受食物抗原、微生物及其产生的有害代谢产物的损害, 保持机体内环境的稳定方面起重要作用[3]。而肝硬化时, 肠道内的具有高效选择性功能的屏障系统即肠黏膜屏障会发生一系列改变, 尤其是伴有门脉高压合并腹水时。肠道通透性显著增加, 早期可先于肠黏膜形态的明显变化而出现细菌移位和形成内毒素血症[4~5]。已知肠道的选择性屏障功能 (细菌移位、肠道通透性) 与紧密连接的生物学特征和开放程度密切相关。肠上皮跨膜结合蛋白Occludin是构成紧密连接的主要结构蛋白之一[6~7]。Occludin水平的检测不仅可以反映肠道菌群紊乱情况下致病菌对肠道紧密连接及肠道屏障的破坏情况, 也反映了二者的恢复程度。目前, 在国内伴随抗生素的广泛应用以及其在临床治疗有效性的降低, 因而非抗菌性药物在肝硬化门脉高压患者肠道菌群易位及抗内毒素血症方面的作用已受到越来越多的关注和重视。
从西安城墙谈到胃粘膜屏障 篇2
凡是在西安工作、生活的人,相信对西安城墙都有一份特殊的感情,因为那是古城的标志!它始建于唐末,明洪武七年(1374年)又花了4年时间扩修成今日全貌:从外向内有数道防线。首先是环绕城墙外的护城河,在那挥刀舞剑的时代是难以逾越的鸿沟;往内有一宽阔地带,可布各种障碍及陷阱;继而是雄伟、坚实而平整的城墙,据说当时砖与砖都是用糯米汤调泥沙粘结的;城墙内则有车马道,为守护城墙者提供有力的后勤支援和调配、补充兵力。
面对这层层关卡,道道防线,我们猛然想起,它不正像胃粘膜屏障吗?
胃一日三餐要消化各种各样的食物,逢年过节更是“超负荷”运转,要消化多少食物!可是,它为什么不会消化自己呢?在门诊,我们经常遇到病人因药物、食物或其他因素,造成胃的急性损伤,发生呕血、腹痛……但仅过2~3天之后,即使用最精确的电子胃镜仔细复查,也看不到受过伤的痕迹。胃为什么好得这样快呢?
原来,胃拥有一套完整的屏障系统。大家不妨跟着胃镜往胃壁探个究竟吧。我们大都有过呕吐的经历。在呕吐开始时,先会吐出一些粘粘的液体,它是胃液的一种成分。因为它比较稀薄,可以在胃内流动,所以又叫“流动粘液”(相当于“护城河”)。它像润滑剂一样,润滑和软化食物,以减少胃壁和食物间的摩擦。
让胃镜再往里走!又是一层粘液,很粘稠,紧附在粘膜表面,医生常称为“粘液罩”(相当于“宽阔地带”)。大家平常处理猪肚时,用刀刮下来的那一层,就是粘液罩,它把胃粘膜和胃腔中的盐酸隔离开了!在它的下面,每个胃粘膜细胞都在不停地制造、分泌碳酸氢盐,犹如潺潺流出的泉水,不断地中和接触到胃粘膜的盐酸,使胃粘膜不受酸侵蚀。
胃粘膜上皮细胞呈立方形,排列整齐,一个紧挨着一个(相当于砌城墙的“砖”)。在细胞表面有薄薄一层磷脂覆盖,就像涂上了防水漆一样。在细胞之间,除了某些矿物质等可以通过外,可以说是“天衣无缝”。由于能得到充分的氧气和营养供应,这些细胞再生能力很强,一旦受到损伤,数小时内即开始修复。
再往深处,即达胃粘膜细胞下层(相当于“车马道”)。这里有着立体结构的血管系统。在神经纤维和胃肠道激素的调控下,血液供应十分丰富。这一部分可说是“后勤供应”系统,也是调控中心。
至此,四层关卡,再加上“后勤供应”系统,共同构成了“胃粘膜屏障”,使胃不但能完成繁重的日常工作,而且有点小损害也能自行修补,还不会消化自身。
肠黏膜屏障的研究进展 篇3
1 肠黏膜屏障功能
1.1 肠黏膜屏障
肠黏膜屏障包括机械屏障、生物屏障、免疫屏障和化学屏障[1]。肖氏等总结前人经验, 提出具有高度抵御性能的肠黏膜屏障必须符合3个基本解剖和生理条件: (1) 连续完整和健康的肠黏膜上皮构成的机械屏障; (2) 不断更新和维持的肠道黏液层, 并由此提供的健全免疫系统; (3) 正常大量的肠道厌氧菌群存在, 防止致病微生物在肠道黏膜的定植[2]。
1.2 肠黏膜屏障功能障碍及其检测手段
1.2.1 肠黏膜屏障功能障碍的机制。
大量动物实验和临床研究证实, 在烧伤、休克、重症胰腺炎等病理状态下, 肠道可发生不同程度的组织学和超微结构的改变, 包括肠黏膜及黏膜下水肿、绒毛变短、肠上皮细胞分化、增殖加快, 甚至肠道细胞坏死、凋亡[3], 从而导致肠黏膜屏障功能的损伤。引发损伤的机制如下: (1) 肠黏膜缺血及再灌注损伤。机体在遭受严重创伤、烧伤等情况下, 全身血量重新分配。研究显示:全身血量减少10%, 即可导致胃肠道血流减少40%, 胃肠道最早发生缺血, 又最迟得到恢复, 容易受损直至衰竭[4]。 (2) 肠黏膜应激性损伤。在严重创伤、重症全身性疾病等应激状态下, 各种神经、免疫和内分泌机制作用于肠上皮, 导致肠黏膜屏障功能改变, 进而导致肠黏膜屏障的损伤[5]。可引起肠黏膜缺血和过氧化损伤, 继而出现黏膜细胞损害、糜烂和出血。 (3) 营养不良。营养障碍可引起肠细胞DNA含量减少, 蛋白质合成及细胞增生下降, 肠腔内黏液层变薄, 导致黏膜萎缩及所继发的肠黏膜酶活性下降, 肠黏膜免疫功能受损。蛋白质-热量营养不良同时又可以降低机体蛋白质水平, 引起淋巴细胞减少、免疫球蛋白水平下降、巨噬细胞功能不良, 甚至影响肠道和全身的免疫功能。 (4) 细菌易位及内毒素损伤。长期、大量广谱抗生素的使用可造成肠道菌群紊乱, 肠道的生物屏障减弱, 使致病菌定植、繁殖并呈优势生长。它们通过产生蛋白酶及毒素等抑制上皮细胞蛋白质合成, 使绒毛受损[6], 从而损伤肠黏膜屏障, 发生菌群易位。内毒素是存在于革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖, 当机体受到严重创伤、烧伤、感染及长期静脉营养时, 肠屏障功能下降, 肠腔内大量内毒素向肠外组织迁移的过程称为内毒素易位。内毒素可激活补体及系列细胞因子, 同时损伤肝脏库弗细胞导致黏膜下水肿、肠绒毛顶部细胞坏死、肠通透性增加, 从而进一步破坏肠黏膜屏障功能[7]。
1.2.2 肠屏障功能障碍的检测手段。
(1) 机械屏障。机械屏障由肠道黏液层、肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成。肠黏膜上皮细胞是肠屏障中最重要的部分, 因此, 目前主要针对肠黏膜上皮细胞进行一系列检测。 (1) 肠通透性检测。口服或静脉给予示踪物, 然后根据示踪物通过肠黏膜上皮细胞的剂量大小反映肠黏膜的通透性。用于检测肠黏膜通透性的示踪物主要有放射性同位素类、辣根过氧化物酶 (HRP) 和蛋白质类、聚乙二醇 (PEGS) 及糖类等四类。用于检测的糖类主要是单糖和双糖。乳果糖和甘露醇在体内不代谢, 受肠腔内渗透压影响较小, 从肠腔吸收入血后由尿中排除, 可留取一定时间内的尿液进行检测, 并且尿乳果糖和甘露醇比值 (L/M) 与绒毛萎缩之间有较好的相关性[8]。该试验具有操作简单、对机体无损伤以及对肠道损伤敏感等优点, 因此目前临床检测肠黏膜通透性最常用L/M。 (2) 肠黏膜形态学检查。肠黏膜形态学检查有一定的创伤性, 但通过一般光镜等可以直接观察黏膜上皮细胞形态改变、绒毛厚度、隐窝深度等, 可直接从结构上反映肠黏膜通透性的改变。 (3) 血液指标检测。a血内毒素。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 成分, 正常情况下机体肠腔内含有大量细菌和内毒素。当肠屏障功能障碍时, 内毒素穿过肠黏膜, 进入血循环, 形成内毒素血症。黎沾良[9]实验证明内毒素比细菌分子更小, 更容易穿过黏膜屏障, 在严重创伤、休克、大手术等应激后往往先有内毒素血症, 然后有细菌移位。血内毒素升高又加重了肠屏障功能损害, 如此形成恶性循环。测定血中内毒素含量可判断由早期肠屏障损伤导致的内毒素移位, 但不能判断革兰氏阴性杆菌种类, 且由于不同抗生素诱导菌体释放内毒素的情况不同, 准确性有一定限制, 所以对肠屏障损伤程度和后果的判定仍不够准确, 对治疗的指导意义有限[10]。b血细菌学检测。细菌移位 (Bacterial Translocation, BT) 是肠道黏膜功能障碍的突出表现[11]。外周血中发现细菌可间接推断肠黏膜屏障的破坏。血培养法阳性率低, 耗时长, 抗生素可影响培养结果, 对肠屏障损伤的诊断判定不敏感[12]。当前已有研究应用多聚酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 分子生物学方法进行血液检查。c血D-乳酸。D-乳酸是细菌发酵的代谢产物, 肠道多种细菌均可产生, 但正常情况下很少被吸收, 并且哺乳动物不具备将其快速降解的酶系统。当肠道发生急性缺血等损伤致肠黏膜绒毛顶端上皮脱落, 肠黏膜通透性增加时, 肠道中细菌产生大量D-乳酸通过受损黏膜入血, 使血浆D-乳酸水平升高, 故监测血浆D-乳酸水平可及时反映肠黏膜损害程度和通透性变化[13]。d血二胺氧化酶。二胺氧化酶 (Diamine Oxidase, DAO) 是人类和所有哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中具有高度活性的细胞内酶, 以空、回肠活性最高。该酶在小肠黏膜上层绒毛中水平高, 活性也强, 在其他组织中则水平少、活性低。肠黏膜细胞受损、坏死后该酶释放入血, 或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔内, 导致血浆和肠腔DAO活性增高[14]。由于DAO在外周血中活性稳定, 因而可通过无创测定其在外周血中变化, 反映肠黏膜状态, 其主要映肠黏膜上皮损伤与修复情况。马瑞亮等[15]观察家兔小肠末端结扎梗阻模型在不同时相梗阻肠道的病理学改变, 同时测定血清中DAO的浓度。结果证实血DAO与胃肠屏障损伤有关。e血肠脂肪酸结合蛋白。脂肪酸结合蛋白 (Fatty Acid Binding Protein, FABP) 是一组低分子量 (15kD左右) 胞液蛋白, 在长链脂肪酸通过毛细血管及乳糜管进入血循环, 即可在周围血中检出。Niewold TA等[16]通过建立猪肠系膜动脉梗塞实验动物模型, 发现小肠发生缺血性损害早期大鼠血清中IFABP即可明显升高, 提示IFABP可成为小肠缺血性损害的早期诊断的一个有用的标志物。尤其在小肠损害的可逆性阶段[17]。 (2) 免疫屏障。免疫屏障主要由肠道免疫系统的细胞群构成, 包括肠相关淋巴组织和弥散免疫细胞。前者主要指分布于肠道的集合淋巴小结, 是免疫应答的诱导和活化部位;后者是肠黏膜免疫的效应部位。分泌型IgA (sIgA) 则是胃肠道和黏膜表面的主要体液免疫成分和效应分子, 是防御病菌在肠道黏膜粘附和定植的第一道防线。 (3) 生物屏障。生物屏障由共同寄居在肠腔内或定植于肠黏膜表面的肠道常驻菌群形成。应用粪便细菌培养、粪便球杆菌比例检查或肠杆菌基因重复一致序列PCR (ERIC-PCR) 指纹图动态监测肠道菌群尤其是双歧杆菌等厌氧菌的变化, 能够反映肠道黏膜生物屏障功能。
2 目前存在的问题与展望
细菌移位的机制很多, 目前体外研究和动物模型研究中存在很多矛盾的结果。肠黏膜屏障通透性的检测方法较多, 但各种方法的灵敏性和特异性研究不多, 哪些方法联合使用可提高灵敏性和特异性仍值得探讨。有研究提示NO水平与肠黏膜通透性相关, 但NO合酶抑制剂与肠黏膜屏障功能的研究较少。能引起肠黏膜屏障功能障碍的疾病较多, 但相关危险因素尚待进一步研究。
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