乳果糖对门脉高压大鼠肠粘膜屏障功能保护作用的研究

关键词：

目前, 在国内伴随抗生素的广泛应用以及其在临床治疗有效性的降低, 因而非抗菌性药物在肝硬化门脉高压患者肠道菌群易位及抗内毒素血症方面的作用已受到越来越多的关注和重视。本研究旨在观察微生态制剂乳果糖对门脉高压大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用, 为微生态制剂的临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

乳果糖 (荷兰苏威药业) ;多克隆兔抗Occludin抗体 (美国Zymed labs公司) ;SP免疫组化试剂盒 (北京中杉金桥公司) ;内毒素的测定鳌试剂盒 (上海伊华医学科技有限公司) 。

1.2 动物及分组

普通雄性SD大鼠 (华中科技大学同济医学院实验动物中心提供) 150~170g/只, 共50只。建立四氯化碳门脉高压模型, 存活36只大鼠随机分为:治疗组 (12只) 、对照组 (12只) 和模型组 (12只) 。治疗组即乳果糖组:灌服乳果糖5m L/kg, 每日2次, 直至大鼠排稀便 (共10d) ;对照组:仅应用等同剂量的葡萄糖;模型组:予以正常饮用水。

1.3 标本处理

第11日, 以1.0m L/kg体重肌肉注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠, 腹主动脉采血做肝功能测定;留取标本浸泡于10%福尔马林液中固定, 常规石蜡包埋、切片 (5μm) , 备常规HE、Masson及免疫组化染色;送新鲜标本电镜检查和细菌易位研究。

1.3.1 细菌易位的研究

取肝、脾、肾 (各约0.2 g) 和肠系膜淋巴结一颗, 称重后分别制成5%组织匀浆, 各取50u L分别置于肠道需氧培养基、肠道厌氧培养基和肠杆菌科细菌培养基在35℃培养箱中培养48~72h, 计数细菌菌落。凡是组织匀浆中培养出3个或3个以上的菌落即为细菌移位阳性[1]。

1.3.2 肝功能测定

腹主动脉采血, 采用全自动生化仪进行AST、ALT、TBLL、ALB测定来反映肝功能的损伤情况。

1.3.3 内毒素测定

腹主动脉采血0.2m L置于肝素抗凝管中, 3000rpm离心10min分离血浆, 内毒素的测定采用改良的偶氮基质显色法[2], 鳌试剂盒由上海伊华医学科技有限公司提供。所有实验器材均采用去热原处理。

注:与治疗组比较, *P<0.01

1.3.4 病理、电镜检查

取回肠末端肠壁组织用10%福尔马林溶液固定, 做HE切片染色、Masson染色, 光镜下观察病理改变;另取回盲部肠壁组织, 制成约1mm×1mm×1mm大小固定于于2%戊二醛溶液中, 送超微病理电镜下观察肠黏膜病变。

1.3.5 肠黏膜紧密连接蛋白免疫组织化学测定

取末端回肠组织病理切片, 兔抗大鼠Occludin抗体, 1:200稀释, SP试剂盒购自北京中杉金桥生物公司, 按照操作说明进行SP3步法免疫组化染色, 阴性对照以0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 代替一抗, 其余步骤不变;应用光学显微镜、多媒体彩色病理图文分析系统PHIAS~1000, 通过光学显微镜放大400倍, 每张切片随机选取5个视野, 摄取图像并输入图像分析系统内, 取均值, 测定其光密度, 并计算阳性显色面积占测量窗内的百分比。

1.4 统计学方法

数据采用均数±标准差表示。应用统计软件SPSS 12.0分析, 进行χ2检验、方差分析和t检验。P<0.05为差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 组织病理学观察

模型组与对照组可见肠粘膜充血、水肿, 小肠肠壁明显变薄, 黏膜下炎性细胞浸润增多, 粘液分泌增多, 固有膜内可见点状出血灶。电镜下, 可见小肠黏膜上皮细胞微绒毛明显缩短、稀疏、部分断裂、扭曲、倒伏、脱落, 肠上皮细胞间紧密连接结构模糊, 细胞间隙增大, 线粒体基质减少, 部分嵴断裂, 粗面内质网肿胀, 结构不清。治疗组肠组织充血、水肿及炎性细胞浸润情况明显改善, 绒毛倒伏情况好转。

2.2 细菌易位情况

乳果糖治疗后, 细菌易位率较模型组和对照组明显减少 (P<0.05) , 见表1。

注:与治疗组比较, *P<0.01

注:与治疗组比较, *P<0.01

2.3 肝功能各组血清肝功能水平 (表2)

2.4 内毒素各组血清内毒素水平 (表3)

2.5 肠黏膜跨膜结合蛋白表达 (表4)

3 讨论

肠粘膜屏障是由机械屏障、化学屏障、生物屏障以及免疫屏障共同构成。在肠粘膜机械屏障组成成份中, 肠上皮细胞及其紧密连接是最重要的组成部分。在正常情况下, 肠黏膜屏障阻止了肠道细菌、内毒素向肠外移位, 在保护机体免受食物抗原、微生物及其产生的有害代谢产物的损害, 保持机体内环境的稳定方面起重要作用[3]。而肝硬化时, 肠道内的具有高效选择性功能的屏障系统即肠黏膜屏障会发生一系列改变, 尤其是伴有门脉高压合并腹水时。肠道通透性显著增加, 早期可先于肠黏膜形态的明显变化而出现细菌移位和形成内毒素血症[4~5]。已知肠道的选择性屏障功能 (细菌移位、肠道通透性) 与紧密连接的生物学特征和开放程度密切相关。肠上皮跨膜结合蛋白Occludin是构成紧密连接的主要结构蛋白之一[6~7]。Occludin水平的检测不仅可以反映肠道菌群紊乱情况下致病菌对肠道紧密连接及肠道屏障的破坏情况, 也反映了二者的恢复程度。目前, 在国内伴随抗生素的广泛应用以及其在临床治疗有效性的降低, 因而非抗菌性药物在肝硬化门脉高压患者肠道菌群易位及抗内毒素血症方面的作用已受到越来越多的关注和重视。

本研究对门脉高压大鼠肠粘膜的机械屏障进行了初步研究, 并应用微生态制剂乳果糖进行干预治疗。研究发现, 门脉高压大鼠肠壁明显变薄, 肠粘膜充血、水肿, 黏膜下炎性细胞浸润增多, 粘液分泌增多, 固有膜内可见点状出血灶。电镜下, 可见小肠黏膜上皮细胞微绒毛明显缩短、稀疏、部分断裂、扭曲、倒伏、脱落, 肠上皮细胞间紧密连接结构模糊, 细胞间隙增大, 线粒体基质减少, 部分嵴断裂, 粗面内质网肿胀, 结构不清。模型组与对照组均表现出Occludin的表达降低以及出现内毒素血症。由此我们推论, 肝硬化门脉高压引起肠粘膜屏障功能受损, 可表现为紧密连接蛋白的表达下降, 从而导致肠道菌群及各种代谢产物大量移位进入肠外器官, 发生菌群移位和形成内毒素血症。后者又可进一步引起机体发生变态反应, 导致肝细胞凋亡、坏死, 由此形成恶性循环[8~10]。乳果糖属于微生态制剂益生元的一种。临床应用乳果糖预防、治疗肝性脑病己取得了非常肯定的疗效[11], 它可在选择性刺激肠道有益菌双歧杆菌及乳酸杆菌生长的同时, 抑制肠杆菌科细菌的生长, 减少有毒代谢物质的产生;同时又可刺激肠蠕动, 促进肠内有毒物质的排出。本研究发现, 经乳果糖治疗门脉高压大鼠, 其肠组织充血、水肿及炎性细胞浸润情况明显改善, 绒毛倒伏情况好转。同样发现其内毒素血症得到纠正, 肝功能改善。通过免疫组化染色发现, 肠上皮细胞紧密连接蛋白表达较模型组和对照组亦明显增高。表明, 肠道屏障功能的改善是乳果糖防治细菌移位, 改善内毒素血症和恢复肝脏功能的一个重要原因, 这同文献报道是一致的[12~13]。

摘要：目的探讨乳果糖对肝硬化门脉高压大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用。方法50只雄性SD大鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液, 制造门脉高压模型。造模后存活大鼠随机分为: (1) 治疗组; (2) 对照组; (3) 模型组。治疗组即乳果糖组, 灌服乳果糖5mL/kg, 每日2次, 直至大鼠排稀便 (共10d) ;对照组仅灌服葡萄糖水。11d后处死取全血及肝、脾、肾、和肠系膜淋巴结组织匀浆后作细菌培养, 测细菌易位率;采用改良的偶氮基质显色法行内毒素测定;取回肠粘膜组织行HE、Masson染色和超微病理的观察研究;采用免疫组织化学方法测定回肠末端紧密连接蛋白 (occludin) 表达水平。结果治疗组细菌易位发生率较对照组和模型组均明显降低 (P<0.05) ;与模型组、对照组比较, 治疗组肝功能显著改善 (P<0.01) ;治疗组血清内毒素水平 (0.20±0.08) Eu/mL亦明显低于对照组、模型组之 (0.33±0.06) Eu/mL、 (0.44±0.07) Eu/mL (P<0.01) ;紧密连接蛋白的表达, 治疗组与对照组、模型组比较, 亦具有显著性差异 (P<0.01) 。结论口服乳果糖可以改善肠道屏障功能, 减少门脉高压大鼠肠道菌群易位, 减轻内毒素血症, 从而一定程度上改善肝功能。

关键词：乳果糖,门脉高压,大鼠,肠粘膜屏障

参考文献

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