西红花苷对氧化性低密度脂蛋白致内皮细胞损伤的保护作用

关键词：红花浓缩实验

1 实验材料

1.1 实验药物

浓缩到每m L相当于3.338g生药西红花水提物。获取过程:新疆西红花200g, 水2500m L, 加热到沸腾, 然后提取1.0h, 然后对混合液过滤, 最后把滤液浓缩提纯到实验所需浓度。

1.2 实验动物

大鼠乳鼠:出生5~7d的Wistar。

1.3 实验试剂

氧化低密度脂蛋白, 乙酸乙酯, α-苯基-N-叔丁基氮氧化物。

1.4 实验仪器

超净工作台, MCO-15AC型CO2培养箱, H2S-H型恒温水浴振荡器, LDZ4-0.8型离心机, MK型倒置显微镜, QL-901旋涡混合器, ESR200D-SRC型电子自旋共振波谱仪。

2 实验方法及过程

2.1 培养大鼠原代心肌微血管内皮细胞 (r CMEC)

首先进行大鼠的原代培养r C M E C, 然后再进行传代培养, 传代培养前需先进行r C M E C鉴定, 培养出的第三代细胞用于实验[1]。

2.2 实验方法

(1) 配制自旋捕获剂PBN:取温浴无菌PBS, 把准确称取的PBN放入其中进行溶解, 然后把其置于磁力搅拌器上进行搅拌, 搅拌时间30min左右, 成为200mmol.L-1, PH=7.4的PBN饱和溶液, 实验时候把饱和溶液加入到等量的培养基中, 最后得到浓度为100mmol.L-1的PBN溶液, 作为电子自旋捕获剂。 (2) 自由基的捕集及内皮细胞培养:把内皮细胞以每孔0.8m L接种于24孔板, 密度为1.5×105个/m L, 24h细胞贴壁后, 把其分为空白对照组、模型对照组、西红花水提物组等6组。各组共同孵育24h。然后, 各组均换成100μg.m L-1的ox-LDL的无血清培养基0.25m L, 同时将终浓度为100mmol.L-1的PBN0.25m L加入各组, 并小心吹打均匀。于37℃时, 孵育45min, 然后把培养板取出来, 用细胞刀, 小心刮取细胞, 将收集到的细胞悬液置于于5m LEP管中, 尽快提取送检[2]。 (3) 自由基的提取过程把0.4m L乙酸乙酯加入到每个EP管中, 混匀。3000rpm, 离心10min;把上层无色液体60μL小心吸取到样品管中, 放入ESR波谱仪中测定。测定条件:X波段, 400G的扫描宽度, 3385G的中心磁场, 3.2G的调制幅度, 20m W的微波功率, 增益:4×105, 室温下测温。

2.3 数据分析

以均值±标准差形式表示结果, 采用方差分析 (ANOVA) 进行多组间比较, 统计学显著性设定P<0.05。

3 结果

用各组谱线第二峰的高度来表示每组细胞自由基与PBN形成的自旋加合物信号的相对强度。实验发现与空白组比较, 模型组中自旋加合物信号峰值明显较高, 具有显著性差异, 而各个西红花给药组信号峰值呈现了不同程度降低, 500μg.m L-1和20μg.m L-1信号峰值的降低更为显著。提示西红花水提物能够减少ox-LDL损伤的微血管内皮细胞自由基生成, 具有保护内皮细胞免受氧化损伤的作用。

4 讨论

目前, 检测自由基最直接和最有效的方法和技术是电子顺磁共振 (EPR) 也叫电子自旋共振 (ESR) , 但是对自由基的要求较高, 首先自由基必须相对稳定, 而且要达到一定浓度才能用电子顺磁共振 (EPR) 技术检测。而实际上, 化学反应中及生物体系内产生的自由基大部分是不稳定的, 自旋捕集技术则因不受其限制解决了这一技术上的难题。自旋捕集技术就是为了检测和辨认短寿命自由基, 将一种不饱和的抗磁性物质加入要研究的反应体系, 生成寿命较长的自旋加合物, 便于用ESR检测[3]。

鉴于本实验是对细胞中的自由基进行检测, 难免受到血清、培养基、温度和氧气等因素的干扰, 所以选择PBN作为本实验的自旋捕集剂比较合适, 能相对客观地表现出细胞受到氧化损伤时, 氧化应激形成的自由基信号的强弱。本实验发现西红花水提物500μg.m L-1和20μg.m L-1的组细胞悬液中自由基信号明显减弱, 即模型组与对照组间有显著性差异 (P<0.05) , 进一步揭示了西红花水提物抗ox-LDL损伤的可能机制。

摘要：目的利用ox-LDL致心肌微血管内皮细胞损伤模型, 观察了西红花水提物对血管内皮细胞的保护作用。方法培养大鼠原代心肌微血管内皮细胞进行试验, 然后对观察数据方差分析 (ANOVA) 及多组间比较等。结果发现与对照模型组相比, 西红花水提物具有减少氧化产物生成、减轻ox-LDL损伤及提高抗氧化酶活性等作用, 并且组间差异具有显著性。西红花水提物100μg.mL-1的ox-LDL溶液能够降低内皮细胞存活率 (P<0.01) 。结论西红花水提物减轻内皮细胞ox-LDL损伤的作用可能通过减少自由基产生而实现, 与对照组比较, 西红花水提物500μg.mL-1和20μg.mL-1的组细胞悬液中自由基信号明显减弱。

关键词：西红花水提物,心肌微血管内皮细胞,氧化低密度脂蛋白