关键词： 树花
混合氨基酸的分离（精选六篇）
混合氨基酸的分离 篇1
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
灰树花(Grifola frondosa)GF-932菌株由作者实验室分离驯化,保存于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏号CGMCC No.1709。
1.1.2 试剂
Q Sepharose FF(Amersham)、蛋白 Marker(2-212 kDa,NEB)、PNGase F(NEB),其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
中空纤维微滤膜组件(MOF,天津膜天膜科技有限公司);中空纤维超滤膜组件(VEOS,天津膜天膜科技有限公司);PP-6蠕动泵(常州市科健蠕动泵厂);FD-ID-55冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);离子交换柱(20mm×300mm);HD-3紫外检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);BT-200恒流泵(上海沪西分析仪器厂);DYY-10型电泳仪(北京市六一仪器厂);TS-8型脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
1.1.4 培养基
斜面培养基:PDA培养基。
种子培养基:葡萄糖10g,玉米粉2.5g,蛋白胨1.5g,酵母粉0.75g,KH2PO4 0.25g,MgSO4 0.5g,水1 000mL,pH自然。
生产用培养基:马铃薯14g,麸皮28g,葡萄糖28g,玉米粉12g,蛋白胨4.2g,酵母膏2.1g,KH2PO4 0.7g,MgSO4 1.4g,水1 000mL,pH自然。
1.2 方法
1.2.1 灰树花菌丝粉的制备
将斜面培养的菌种接种于无菌种子培养基中,28℃摇床(100r/min)培养3d,获得种子液。将种子液以4%的接种量经一级种子罐(50L)、二级种子罐(500L)和发酵罐(5 000L)逐级培养,培养温度为28℃,搅拌速度为200 r/min,通气量为0.5vvm,培养时间各为24h、24h、48h,发酵液离心后,洗涤菌丝体沉淀,干燥、备用。
1.2.2 蛋白聚糖的提取
取100g灰树花菌丝粉,分别经80%乙醇,于80℃水浴脱脂;水,沸水浴提取;1.0mol/L NaOH,4℃提取,离心后收集滤饼,回收乙醇。滤饼再经1.0mol/L NaOH,50℃水浴提取1.5h,重复一次,离心后合并两次热碱提取的上清液,得到蛋白聚糖粗提液。粗提液经乙酸中和、离心、微滤、超滤浓缩、醇沉,干燥后即为灰树花蛋白聚糖粗品。
1.2.3 蛋白聚糖的分离纯化
将灰树花蛋白聚糖粗品配成1%的水溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤,采用Q Sepharose FF离子交换层析纯化,洗脱液依次为含0、0.1、0.4、1.0mol/L NaCl的Tris-HCl溶液,收集各蛋白聚糖组分。将各组分分别超滤脱盐,至浓缩液电导率在100μS/cm以下,真空冷冻干燥,获得蛋白聚糖GFPⅠ、GFPⅡ、GFPⅢ。
1.2.4 蛋白聚糖含量的测定
1.2.4.1 糖含量的测定:
采用苯酚-硫酸法[6,7]进行测定。
1.2.4.2 蛋白质含量的测定:
采用Lowry法[8,9,10]进行测定。
1.2.5 蛋白聚糖的SDS-PAGE分离
将蛋白聚糖及经过PNGase F 酶切的样品,进行SDS-PAGE电泳分离、检测。电泳采用pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲体系,6%浓缩胶,16%分离胶,上样量40～80μg,考马斯亮蓝R-250染色。以标准分子量蛋白为标准,将各蛋白迁移率对分子量的对数作图,获得一条标准曲线,根据目的蛋白的迁移率从标准曲线上求得分子量。
1.2.6 蛋白聚糖的纯度及相对分子量的测定
采用高效液相色谱法鉴定蛋白聚糖粗品和GFPⅢ的纯度,样品液浓度为2mg/ml,分析条件为:OHpak SB-804 HQ凝胶色谱柱,进样量20μL,流动相为0.02%NaN3水溶液,流速0.5mL/min,柱温35℃,示差折光检测器。根据保留时间得到测定曲线,并采用GPC软件分析样品的重均相对分子量。
1.2.7 氨基酸组成分析
依据GB/T18246-2000,采用氨基酸分析仪对灰树花菌丝粉及蛋白聚糖GFPⅢ的18种氨基酸进行分析,由农业部食品质量监督检验测试中心(济南)完成。
2 结果与分析
2.1 灰树花蛋白聚糖的提取与分离纯化
采用碱提法提取的蛋白聚糖,经脱色、超滤浓缩、除游离蛋白、醇沉后粗干品为浅棕黄色絮状,得率为1.13%(见表1),极易溶于水,不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。取1.13g粗样经Q Sepharose FF离子交换层析纯化后,得到GFPⅠ、GFPⅡ和GFPⅢ三个组分,得率分别为7.48%、24.55%、17.52%。
2.2 蛋白聚糖含量测定
灰树花蛋白聚糖的糖含量测定采用苯酚-硫酸法。该方法不仅适合于单糖、寡糖和多糖定性和定量分析,而且可用于各种糖复合物如糖蛋白、糖肽和糖脂中总糖的定性分析中,尚未见该法用于中性糖蛋白中总糖定量分析[11]。蛋白质含量测定采用Lowry法,此法经Folin-酚试剂法改良而来,是蛋白质含量测定常用的方法之一。本研究测定的糖和蛋白含量结果见表2,粗蛋白聚糖、GFPⅠ、GFPⅡ、GFPⅢ糖含量分别为:19.61%、43.69%、40.88%、28.33%,蛋白含量分别为:67.34%、40.42%、34.65%、51.19%。由于GFPⅠ得率较低,故只进行了此项测定。
2.3 SDS-PAGE电泳结果
蛋白聚糖是β-葡聚糖与蛋白质结合而成的缀合物,分子量较大,利用PNGase F可将结合蛋白切分下来,在SDS-PAGE电泳后形成明显的蛋白条带。由图1可见,蛋白聚糖GFPⅢ在凝胶上缘呈现单一谱带,且其结合蛋白同样在凝胶中呈现单一谱带,只是酶切不完全,仍留有较少的蛋白聚糖。而蛋白聚糖GFPⅡ在凝胶中只模糊的呈现了蛋白谱带。由此说明GFPⅢ纯化效果较好,达到了电泳级纯度。由标准曲线可求得GFPⅢ的分子量约为33.0kDa。
2.4 GFPⅢ的纯度及相对分子量的测定
经HPLC分析,蛋白聚糖粗品在谱图中呈现一个主要的蛋白聚糖不对称峰(图2),出峰时间为12.8～19min之间,最高峰在15.65min,纯度较高。而GFPⅢ却呈现出一单一对称主峰(图3),出峰时间为12.5～17.5min之间,最高峰在15.29min,纯度为93.61%,与蛋白聚糖粗品检测结果极为相似,表明GFPⅢ已经被纯化,经GPC软件分析得出重均相对分子量(Mr)为150kDa,为分子量较大,成分均一的蛋白聚糖。
2.5 氨基酸组成分析
由表3可见,灰树花脱脂菌丝粉和GFPⅢ的中18种氨基酸含量高低顺序基本一致,其中Asp、Glu、Leu、Ala和Lys含量较高,而Cys、Try含量较低;氨基酸总和分别为33.51和66.60g/100g。GFPⅢ中必需氨基酸(Lys、Try、Met、Thr、Phe、Ile、Leu、Val)总量为26.14g/100g,呈味氨基酸总量(Glu、Asp、Ala、Gly)为25.43g/100g。
3 讨论
灰树花是一种药食两用的大型真菌,具有很高的营养价值以及重大疾病预防和治疗的作用。目前灰树花的研究大多是集中在多糖的提取和功能上[12],而对灰树花蛋白聚糖的研究鲜有报道。周昌艳[13]、徐泽平[14]等虽然提出了灰树花蛋白聚糖的制备方法,但对其组成成分和结构研究的深入程度仍不及其他真菌多糖。在徐泽平[14]所述的制备方法中,以无机盐诱导菌丝体自溶后,经过酶解、离心,获得粗提液,再超滤脱盐和浓缩,干燥获得蛋白聚糖,虽然有较高的含量,但没有进一步分离纯化。因此,本研究在灰树花蛋白聚糖现有制备工艺的基础上,进行了进一步的分离纯化及氨基酸组成分析,为其生物活性研究及产业化开发打下坚实的基础。
本研究以灰树花菌丝粉为原料,通过脱脂、热水提取去除杂多糖、冷碱提取去除非目的碱溶性多糖后,再经50℃热碱提取获得了灰树花蛋白聚糖粗体液。粗体液依次经0.2μm的微滤膜去除大分子和胶体类物质,截留分子量10KD的超滤膜进行脱盐,离子交换层析法进行分离纯化,最终获得GFPⅠ、GFPⅡ和GFPⅢ三个组分。为进一步检测蛋白聚糖的分离纯化效果,本研究首先进行了SDS-PAGE电泳分析,由结果可知,蛋白聚糖GFPⅢ被有效地分离纯化出来,其结合蛋白呈现单一谱带,蛋白分子量约为33.0kDa。其次对GFPⅢ进行了HPLC分析,得到一单一对称主峰,纯度为93.61%,重均相对分子量(Mr)为150kDa,表明已经获得GFPⅢ纯品。说明微滤、超滤技术和离子交换层析法适合本样品的分离纯化,得到了蛋白含量较高、分子量较大、纯度较高的蛋白聚糖,为以后的工业化生产提供理论依据。
同时对GFPⅢ进行了氨基酸组成分析,据农业部食品质量监督检验测试中心(济南)检验,GFPⅢ所含18种氨基酸总量为66.60g/100g,其中8种必需氨基酸和4种呈味氨基酸含量较高,分别为26.14g/100g和25.43 g/100g,具有重要的研究和应用价值。
4 结论
混合氨基酸的分离 篇2
【实验目的】
1.2.3.掌握离子交换树脂分离氨基酸的基本原理； 掌握离子交换柱层析法的基本操作；
掌握氨基酸和茚三酮显色反应机理及洗脱曲线的绘制。
【实验原理】
1.离子交换层析原理
离子交换层析是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法.离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.树脂一般都制成球形的颗粒.阳离子交换树脂含有的酸性基团如磺酸基(一S03H),磷酸基(一P03H),亚磷酸基(一PO2H),羧基(一COOH),酚羟基(一OH)等,可解离出H离子,当溶液中含有其他阳离子时,例如在酸性环境中的氨基酸阳离子,它们可以和H离子发生交换而“结合”在树脂上
本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和碱性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，由于pH低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子，吸附在树脂上；又由于pH高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。在pH12条件下，因pH高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
2.茚三酮反应机理
在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。该反应颜色产物在570nm处有最大吸收峰。
【仪器与试剂】
1.仪器：
层析柱（20cmX1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管玻璃棒烧杯等常用器材。
2.试剂： A．732型阳离子交换树脂
B．2mol/L氢氧化钠溶液
1mol/L氢氧化钠溶液
0.01mol/L氢氧化钠溶液 C．2mol/L盐酸溶液
D．混合氢基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸均配制成2 mg／mL的柠檬酸缓冲液溶液。将上述天冬氨酸、赖氨酸溶液按1：1.5的比例混合 E．柠檬酸缓冲液（pH5.3，钠离子浓度为0.45mol/L）F．茚三酮显色剂
【实验步骤】
1.树脂的处理（小老师完成）
将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。（检验中性用试纸即可）
2.树脂的转型与保存（小老师完成）
以1mol/L氢氧化钠溶液浸泡处理后的树脂1h，使树脂转化为Na型，用蒸馏水洗至中性，多余树脂放入1mol/L氢氧化钠溶液保存，需使用的用欲使用缓冲溶液浸泡。
3.装柱
取（20cm X 1cm）层析柱，检验气密性。验得气密性良好后，将柱垂直夹于铁架上。用夹子夹紧柱底出口处橡皮管，在柱顶放一漏斗并向柱内加入2-3cm高的缓冲溶液。用小烧杯取少量树脂及浸泡液，将其搅拌成悬浮状，通过漏斗缓慢倒入柱内。待树脂在底部沉降时，慢慢打开出口夹子，放出少许液体，持续加入树脂，直至树脂高度达到10cm。
注意：装好的柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，否则倒回烧杯，重新装柱。整个过程液面不可低于树脂床面。
4.平衡
层析柱装好后，缓慢加入适量缓冲液至液面高于树脂面2-3cm。取一烧杯盛有25ml缓冲液，装好柱子，柱上端胶皮管通过恒流泵浸入烧杯液面以下，柱下端置另一烧杯收集洗出液。后开启泵，调节流速，以0.5ml/min（10滴/min）流速进行平衡，待25ml缓冲液基本用尽时即可加样。平衡过程大约40-50分钟。
5.加样
关闭恒流泵，打开层析柱上端，缓慢打开柱底出口夹子，放出层析柱内液体至层析柱内液体凹液面与树脂上表面约距1mm，立即关闭出口。由上端缓慢加入氨基酸混合液0.5ml（用吸量管沿柱壁四周均匀加入）。加样后打开止水夹，使液缓慢流出至凹液面与树脂上表面约距1mm，立即关闭止水夹。再加入0.5ml缓冲液（用吸量管沿柱壁四周均匀加入），打开止水夹，使液体缓慢流出至凹液面与树脂上表面再次约距1mm，重复此加入缓冲液操作2-3次，最后加缓冲液至液面高于柱顶2cm左右。
6.洗脱
将层析柱装好并使下端对准部分收集器上的一号小试管口，用PH5.3柠檬酸钠缓冲溶液以0.5ml/min（10滴每分钟）流速开始洗脱，小试管收集洗脱液，每管收集1ml，收集10管后，关闭恒流泵，同时夹住下端，改用0.01mol/L氢氧化钠溶液洗脱，同法继续收集11-35管。收集完毕后，关闭止水夹和恒流泵。(实验时柱内液体不可流干，柱子气密性不好时易出现流干情况)7.氨基酸色谱的测定
向各管收集液中加入2.5ml柠檬酸钠缓冲溶液，混匀后加入1ml茚三酮显色剂，在沸水中加热15min，取出冷却10min。以收集液第1管为空白，测定570nm波长处各管的光吸收值。以光吸收值为纵坐标，以洗脱管号（洗脱体积）为横坐标绘制氨基酸色谱图。（比色时请戴手套，避免将液体粘在手上或衣服上，实验完毕后请将树脂倒入指定回收处，并清洗所有实验用具）
8.树脂的回收与再生（小老师完成）
树脂回收后，用1mol/L氢氧化钠洗涤浸泡，再用蒸馏水洗至中性后，可再次使用。
【数据处理】
以光吸收值为纵坐标，洗脱管号（洗脱体积）为横坐标绘制氨基酸色谱图。
基于卷积混合的确定性信号盲分离 篇3
[关键词] 盲信号,卷积混合
[Abstract] It is well known that signals that are i.i.d are the basic assumption that most Blind soure separation algorithms of convolutive mixture make. During the simulation, it is required that the mixed signals are prewhitened. Few articles have discussed the problem that blind source separation of the determined of under the convolutive mixture. In this article, blind sources separation of determined signals, such as single frequency signal, will be discussed. And at last, we can see that althogh determined signals can not satisfy the condition—i.i.d, these signals can also be separated, if having enough bandwith.
[Key words] Blind source, Convolutive mixture
一、引言
盲信号的混合模型一般可分为两种,瞬时混合模型和卷积混合模型。瞬时混合没有考虑到信号的延迟,而卷积混合则考虑了延迟,所以卷积混合模型更接近于实际情况。大部分卷积混合情况下的盲分离算法都引入有限冲激响应滤波器,然后估计滤波器的系数,达到盲分离的目的。
Amari[1]在1997年提出了一种自然梯度下降法解决了卷积混合模型下的盲信号分离问题。设有两个统计独立的信号源,并且服从统计独立分布(i.i.d)。令,则卷积混合模型可以表示为:
(1)
其中
,,。
Amari提出的基于自然梯度的快速算法采用直接网路结构,即 (2)
其中。算法的数学表达式为:
(3)
其中,表示共轭转置,是与信号源概率密度相关的一个非线性函数。信号达到分离时
C(z)=PD(z) (4)
是一个排列阵,为一个对角矩阵。
上面的算法可以将语音信号分离出来, 但由于假设信号为i.i.d 序列,所以没有对确定性信号进行讨论。本文首先讨论单频信号的盲分离问题,然后讨论宽带信号的情况,最后给出一般性结论。
二、单频信号的盲分离问题
从频域的角度来看卷积混合情况下的盲信号分离问题,(1)式和(2)式写为:
,(5)
对于不同的频率, 卷积混合可以分解为频域内不同频率信号的瞬时混合。信号分离的结果是在不同的频率上,信号到达分离。
现在考虑单频信号源,频率为。在频域内,只在处有值,混合信号只包含的正确信息,所以在频域中,盲分离算法仅在频率处对信号进行分离,而在其他频率处不能分离。从时域角度看,不能对单频信号进行分离。
三、宽带信号的盲分离
假设信号源是一个宽带信号,频率范围为。由上一节的讨论可知,混合信号能包含的正确信息,所以盲分离盲分离算法能在一定频率范围内得到正确的。如果带宽足够,信号将在大部分频率处得到分离,体现在时域,盲分离算法可以将卷积混合的信号分离。
四、计算机仿真
盲分离算法用Amari 提出的算法(3)。假设有两个信号源,取如下:
定义误差函数:
,其中,为式(4)中的排列阵。
1.单频信号的盲分离
为频率为的正弦信号,为抽样频率;为均匀分布的白噪声。由图1可得算法不收敛,由图2可以看出,在频域下信号仅在频率处分离,所以在时域下,信号分离效果不好(由图3可见)。
2.宽带信号的盲分离仿真
为线性调频信号,;为均匀分布的白噪声。由图4可见,算法收敛性比单频信号有很大的提高。频域下,信号在大部分频率得到分离,如图5所示,信号在高频分离效果不好是因为线性调频信号的能量主要集中在低频。从时域看,信号基本上达到了分离,如图6所示。
五.结论
虽然大部分基于卷积混合模型的盲分离算法都要求信号预白化,但这些算法也可以用于确定性信号。对于窄带信号,由于卷积混合信号只包含很小频率范围内混合矩阵的信息,所以信号的分离效果不好;对于宽带信号,在大部分频率范围内混合信号包含混合矩阵的信息,所以分离效果较好。实际上对信号进行预白化就是增加信号的带宽,使混合信号包含尽可能多的混合矩阵的信息。
参考文献
S.Amari, S.Douglas, A.Cichocki and H. Yang, “Novel On-line Adaptive Learning Algorithms for Blind Deconvolution Using The Natural Gradient Approach”. Proc. 11th IFAC Symp. On System Identification, July 1997.
A. Bell and T. Sejnowski, “An information-Maximization Aproach to Blind Separation and Blind Deconvolution”. Neural Computation, 7(6):1129-1159,1995.
混合氨基酸的分离 篇4
1 材料和方法
1.1 材料。
(1) 大孔吸附树脂。HP20 (日本三菱) 、D2820、D3520、AB-8、X-5均为化工厂产品。 (2) 检测设备。紫外分光光度计、高效液相色谱仪, 硅胶板。1.2方法。 (1) 标准曲线的制作。取不同量的7ACA或CPC溶液用1mol/L的PH8.0的磷酸缓冲液稀释到5ml, 混匀后, 紫外分光光度计检测。 (2) 不同PH值条件下大孔吸附树脂的静态吸附。分别称取4等分的湿树脂, 分装于具塞三角瓶中, 各加等量的7ACA或CPC, 再用PH2.5、6、8的0.1mol/L磷酸缓冲液补足到20ml, 30℃缓慢摇动4h后过滤, 测定上清残液含量, 计算吸附量。 (3) 等温吸附线的制作。称取若干份等量的树脂分装于具塞三角瓶中其中份烘干计算树脂含水量, 分别加入不同浓度的7ACA或CPC, 磷酸缓冲液补足到20ml, 30℃缓慢摇动4h后过滤, 测定残液含量计算吸附量。 (4) 流失曲线与最大吸附量。样品7ACA或CPC上柱后, 分部收集流出液, 紫外分光光度计测OD值, 蒸馏水冲洗柱子后, 用甲醇水溶液解吸, 测定收集液OD值, 计算最大吸附量。
2 结果
2.1 不同值条件下树脂的静态吸附。
选择PH2.5、6、8共3种溶液条件下树脂对7ACA或CPC的吸附, 以期找到7ACA和CPC两者吸附条件差异较大、吸附量较高的树脂检测表明, 多数吸附树脂在PH2.5、8时CPC吸附量较高, PH6.0时较低, 而7ACA相反。比较5种树脂, HP20差异较大, 因此, 选择HP20吸附树脂进一步探索其动态吸附条件。2.2吸附等温线。HP20大孔吸附树脂对CPC、7ACA的吸附都属于单分子层吸附等温线。
2.3 流失曲线和最大吸附量。
流失曲线, 在20ml HP20吸附时, CPC、7ACA几乎都在90ml流出液时开始大量泄漏。蒸馏水冲洗掉未吸附的CPC、7ACA后, 甲醇洗脱收集洗脱液测定、计算出最大吸附量:CPC为265.3mg/ml树脂, 7ACA为204.8mg/ml树脂。2.4混合液的动态吸附与解吸条件。在CPC、7ACA混合液的吸附和解吸分离时, 我们发现解吸状况与吸附时的PH值关系很大, 当吸附值为PH5或6时, 甲醇洗脱剂的PH值不管是2.8还是5, CPC、7ACA同时被洗脱而无法将两者分开, 但溶液的PH值为2.5吸附时, 则PH5或6的甲醇溶液可先把7ACA洗脱下来, 而CPC仍留在吸附树脂上, 最后用较大浓度的甲醇把CPC洗脱下来。
讨论
混合氨基酸的分离 篇5
单一植物蛋白源由于氨基酸不平衡, 含有抗营养因子, 限制其在饲料中的应用。WATANABE等[3]提出, 对替代鱼粉的植物蛋白研究应集中在多种植物蛋白的混合使用及和其他蛋白源的联合使用上, 而不应只停留在使用单一种类的蛋白源。有研究表明, 将多种除去抗营养因子的植物蛋白混合使用, 并添加晶体或包膜的限制性氨基酸可显著提高鱼粉替代饲料的效果[4,5]。斑节对虾 (Penaeus monodon) 是世界上重要的海水经济虾类, 是中国台湾、福建、广东等省重要的海水养殖对虾之一[6], 其营养学和生理学受到越来越多的研究者关注。笔者在对斑节对虾幼虾营养需求的试验中得出其对蛋白质和赖氨酸的需求量分别为40%和2.37%[7]。在此基础上, 以大豆浓缩蛋白和花生麸为混合植物蛋白源, 并添加包膜赖氨酸和蛋氨酸替代鱼粉, 研究对斑节对虾生长性能以及非特异性免疫力的影响, 为斑节对虾饲料鱼粉替代提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验饲料
饲料选取大豆浓缩蛋白 (66.27%蛋白) 和花生麸 (59.33%蛋白) 为混合植物蛋白源, 分别替代对照组 (F0) 饲料中10%~50%的鱼粉并添加包膜赖氨酸和蛋氨酸[8], 配制成6种等蛋白 (40%) 和等脂 (7%) 饲料。所有原料经粉碎过60目筛后混合均匀后, 制成粒径为1.0 mm的颗粒饲料。90℃烘箱 (烘箱内放适量的清水) 烘烤2 h, 空调房内抽干, -20℃冰柜中密封保存备用。试验饲料配方和营养成分见表1。
1.2 试验对象及试验管理
试验用虾取自中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心 (海南省陵水县新村镇) , 挑选大小均匀、体质健康的斑节对虾幼虾暂养1周后随机分配到18个玻璃纤维桶内 (500 L) , 每个桶放30尾, 试验周期为56 d。试验开始后每天早上排污并补充新鲜海水, 水温29.0~31.0℃, 溶解氧质量浓度5.3~6.2 mg·L-1, 盐度28~30, 自然采光, 24 h充气。试验桶内放置饵料台, 投喂量为对虾体质量的4%~8%, 定点投喂3次 (8:00、17:00和22:00) , 投料1.5 h后观察对虾摄食情况并调整投饵量, 做好投饵记录。
1.3 生长指标测定及全虾营养成分分析
试验结束对虾先饥饿24 h, 再点数并用毛巾吸干水分后称质量 (精确到0.01 g) , 计算增重率、特定生长率、饲料系数、成活率。每桶随机采全虾10尾, -20℃冰柜中保存进行体成分测定。蛋白质采用凯氏定氮法测定 (FOSS, 2300) , 粗脂肪采用索氏抽提法 (FOSS, 2050) , 水分测定105℃烘干法, 粗灰分测定马弗炉550℃煅烧法。粗脂肪、蛋白、灰分的检测结果均以干质量计。
%
注:1.多维 (g·kg-1) :VA2.5;VD6.25;VE75;VK2.5;VB10.25;VB21.0;VB35.0;VB60.75g;VB122.5;VB52.5;叶酸0.25;生物素2.5;肌醇379;纤维素500;2.多矿 (g·kg-1) :KCl, 90 g;KI, 40 mg;Na Cl, 40 g;Cu SO4-5H2O, 3 g;Zn SO4-7H2O, 4 g;Co SO4-7H2O, 20 mg;Fe SO4-7H2O, 20 g;Mn SO4-H2O, 3 g;Mg SO4-7H2O, 124 g;Ca (HPO4) 2-2H2O, 500 g;Ca CO3, 215 g.Note:1.Vitamin premix (g·kg-1) :VA2.5;VD6.25;VE75;VK2.5;VB10.25;VB21.0;VB35.0;VB60.75g;VB122.5;VB52.5;folic acid 0.25;biotin 2.5;inosite 379;cellulose 500;2.Mineral premix (g·kg-1) :KCl, 90 g;KI, 40 mg;Na Cl, 40 g;Cu SO4-5H2O, 3g;Zn SO4-7H2O, 4 g;Co SO4-7H2O, 20 mg;Fe SO4-7H2O, 20 g;Mn SO4-H2O, 3 g;Mg SO4-7H2O, 124 g;Ca (HPO4) 2-2H2O, 500g;Ca CO3, 215 g.
式中Wt为试验结束时对虾的平均质量 (g) , W0为试验开始时对虾的平均质量 (g) , t为养殖时间 (d) , FI为试验期间对虾摄食饲料的干物质总质量 (g) , W为养殖对虾的增质量 (g) , FN为终末虾尾数, IN为初始虾尾数。
1.4酶活性的测定
每个桶随机取5尾虾的肝脏和肌肉于离心管中, 称质量记录, -80℃超低温保存, 用于免疫酶活性的测定。处理样品时加入0.7%的预冷生理盐水研磨成10%的组织匀浆, 5 000 r·min-1冷冻离心10 min, 取其上清液, 4℃保存用于免疫酶活性的测定。
肝脏和肌肉组织中超氧化物歧化酶 (SOD) 、酸性磷酸酶 (ACP) 和溶菌酶 (LSZ) 酶活性及蛋白质浓度的检测, 均采用南京建成生物研究所生产的试剂盒, 具体测定步骤参照说明书进行。组织匀浆中SOD活性定义为每毫克组织蛋白质在1 m L反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位 (U·mg-1) 。ACP活力单位定义为每克组织蛋白在37℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个活力单位 (U·g-1) 。LSZ活力测定采用比浊法, 其机理为在一定含量的浑浊菌液中, 由于LSZ能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而含量降低, 透光度增强, 故可以根据透光度变化来推测LSZ含量。
1.5 数据处理
试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析 (ANOVA) , 处理若有显著差异, 再进行Duncan's多重比较, P<0.05表示差异显著, 所有数据用平均数±标准差 (±SD) 表示。
2 结果与分析
2.1 不同鱼粉含量饲料对幼虾生长和饲料利用率的影响
投喂不同鱼粉含量饲料56 d后, 对斑节对虾幼虾的生长和饲料利用率产生了显著性影响 (表2) 。对虾的末均质量在F0组最大, 显著大于除F1组外其他各组 (P<0.05) 。增重率 (245.02%) 和特定生长率 (2.58%·d-1) 在F0组最大, 显著大于F3~F5组 (P<0.05) 。对虾对饲料的利用率在F1组最高, 显著高于F3~F5组 (P<0.05) , 而与其他各组差异不显著 (P>0.05) 。对虾的成活率在F1和F2组最高, 显著高于F3~F5组 (P<0.05) , 与其他各组无显著性差异 (P>0.05) 。
2.2 不同鱼粉含量饲料对幼虾体成分的影响
对虾摄食不同试验饲料, 其体成分没有显著性变化 (P>0.05) (表3) 。斑节对虾的虾体水分质量分数为75.91%~77.67%, 灰分质量分数为16.75%~18.88%, 粗蛋白质量分数为67.31%~68.32%, 粗脂肪质量分数为4.05%~4.75%。随着饲料中鱼粉被替代的比例升高, 虾体的蛋白质沉积成下降趋势。
2.3 不同鱼粉含量饲料对肝脏和肌肉组织中SOD、ACP和LSZ酶活性的影响
试验中通常采用测定水产动物的血清、肝脏、肌肉以及鳃丝的SOD、ACP和LSZ这3种酶活性来评估其非特异性免疫力的强弱。由于试验结束时对虾规格较小, 取血不宜操作, 鉴于对虾的血液循环系统是开放式循环系统, 故该试验取肝脏和肌肉组织用来进行免疫酶的测定, 测定结果见表4。
在对虾肝脏组织中, SOD酶活性随着饲料中鱼粉含量减少而呈现出升高趋势, 在F2组表现出最高的SOD酶活性, 显著高于对照组 (F0) (P<0.05) , 与其他各组差异不显著 (P>0.05) 。饲料中鱼粉被混合植物蛋白替代后ACP和LSZ酶活性没有发生显著性变化 (P>0.05) 。
注:同列数据上标字母不同者之间表示存在显著差异 (P<0.05) , 后表同此Note:Values in the same column with different letter are significantly different from each other (P<0.05) , the same case in the following tables.
注:同行数据字母不同者之间表示存在显著差异 (P<0.05) Note:Values in the same row with different letter are significantly different from each other (P<0.05) .
摄食高鱼粉替代饲料组 (F5) 的对虾肌肉中的SOD酶活性最高, 显著高于其他各组 (P<0.05) 。然而ACP酶活性却表现出先降低再升高的趋势, 分别在F1和F5组表现出最大, 显著大于F2~F4组 (P<0.05) 。在该试验范围内, 随着饲料中鱼粉含量的降低, 肌肉中LSZ酶活性升高, 摄食F4和F5饲料组的对虾的LSZ活性显著高于F0~F3组 (P<0.05) 。
3 讨论
植物蛋白因其种类多、来源广泛、营养价值高、价格低廉已成为替代鱼粉的最佳选择, 相对于单一植物蛋白源, 混合植物蛋白替代效果更加明显[9]。笔者试验中选取的植物蛋白源主要是大豆浓缩蛋白 (SPC) 和花生麸。有研究认为豆粕是最优质的植物蛋白源之一[11], 但由于其含抗营养因子, 适口性差, 缺乏一些必需氨基酸和脂肪酸而导致其应用受到限制[12]。然而作为豆粕的衍生物SPC却被认为是对虾饲料中一种优质的鱼粉替代物[13], 因为在加工过程中, 大部分抗营养因子已经得到消除。花生麸有特殊的香味以及较好的适口性和较高的消化率, 也被认为是一种相对优质的植物蛋白源[14]。
植物蛋白通常由于缺少限制性氨基酸而使其应用受到限制, 在饲料中额外添加限制性氨基酸可以改善植物蛋白源中氨基酸不平衡现象[15]。有研究表明, 在植物蛋白饲料中添加蛋氨酸和赖氨酸, 有利于草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 和虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 的饲料利用率和生长[16]。笔者试验中通过额外添加包膜赖氨酸和蛋氨酸来平衡植物蛋白替代鱼粉所引起的氨基酸缺乏, 以提高植物蛋白替代鱼粉效果。
仲维玮等[17]用混合植物蛋白源 (棉粕、菜粕、玉米蛋白粉和蚕豆) 替代25%~75%的鱼粉而对罗非鱼 (Oreochromis aurea) 的生长未见显著性影响, 但当完全替代时其特定生长率、蛋白质效率显著降低, 饲料系数上升。HANSEN等[18]用豆粕、大豆蛋白和小麦蛋白粉替代50%鱼粉对大西洋鳕 (Gadus morhua) 的生长没有影响, 但替代75%~100%时其特定生长率显著降低, 饲料系数显著升高。棉籽粕和菜籽粕 (1∶1) 可以替代凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 饲料中22%的鱼粉而生长不受阻[19], 而微生物絮凝体粉和SPC的混合使用却完全可以替代凡纳滨对虾饲料中的鱼粉[20]。PARI-PATANANONT等[21]研究表明, 大豆浓缩蛋白可以取代斑节对虾饲料中50%的鱼粉, 而不会对对虾生长、摄食、饲料系数和成活率产生不利的影响。SUDARYONO等[22]用脱壳羽扇豆粉分别取代饲料中0、25%、50%、75%和100%的鱼粉, 得出去壳羽扇豆粉能够替代斑节对虾饲料中75%的鱼粉。而在笔者试验中, 用混合植物蛋白替代鱼粉的饲料饲喂斑节对虾56 d后, 摄食高鱼粉替代组 (F3~F5) 饲料的对虾末均质量较小, 与在试验期间观察的这几组对虾摄食较少有关。这也许是因为饲料中植物蛋白含量的增加降低了饲料的适口性。随着饲料中鱼粉含量逐渐降低, 对虾特定生长率和增重率显著降低, 由此得出混合植物蛋白能够替代饲料中20%的鱼粉, 替代比例小于其他研究成果。有报道建议对虾饲料中的动植物蛋白比应该在1∶2.0附近[23], 该试验中对虾摄食动植物蛋白比例接近1∶2.0的饲料时, 其生长性能已经受到不良影响。造成上述结果的原因也许是对虾幼虾阶段对动物性蛋白质依赖性强、植物性蛋白质饲料适口性差影响摄食以及存在抗营养因子等因素引起。因此在斑节对虾幼虾阶段的饲料中应控制植物性蛋白质的用量。
SOD、ACP和LSZ这3种酶活性的大小通常作为评价水产动物非特异性免疫力强弱的指标[24,25]。SOD属于抗氧化酶系, 其活性大小可以反映生物体生长发育、体内代谢状态以及外界环境胁迫的变化[26]。ACP是动物体内巨噬细胞溶酶体的标致酶[27], 在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢, 具有降解酶的作用, 同时它可以反映巨噬细胞被激活的程度[28]。LSZ广泛存在于各种动物的血细胞和血液中, 在免疫活动中发挥着重要作用[29]。有研究结果表明, 用植物蛋白源替代鱼粉会降低水产动物的非特异性免疫力[30,31]。但使用棉籽粕和菜籽粕混合物替代凡纳滨对虾饲料中的鱼粉后, 对虾血清中SOD活性随着替代比例上升有增加的趋势[19]。笔者试验中对虾肝脏和肌肉组织中的SOD和肌肉中LSZ酶活性随着饲料中植物蛋白含量的增加呈上升趋势, 与韩斌等[32]对凡纳滨对虾鱼粉替代试验研究结果得出对虾LSZ和SOD活性随着饲料中玉米含量的增加而上升相似, 这可能与该试验选取的植物蛋白源含抗营养因子少有关。对虾肌肉中ACP酶活性先降低再升高的趋势, 也许与对虾免疫系统的发挥机制有关。
4 结论
混合语音信号的盲分离 篇6
所谓盲源分离就是在源信号和源信号如何混合都未知的情况下,从观测到的混合信号中恢复出未知源信号。国际上关于盲源分离技术的理论总体可以分为两类:一类是关于瞬时混合信号(Instantaneous mixtures)的盲分离,另一类是卷积后混合信号(convolutive mixtures)的盲分离。盲源分离技术被成功地用在了通信、医学、图像和语音信号处理等领域。混合语音信号的分离是盲源分离技术研究初衷,也是信号处理领域中的一个难题。我们所要研究的混合语音信号盲分离问题就是用麦克风阵列或多个麦克风阵列来模仿人的耳朵,采集得到相互干扰的混叠语音信号,然后通过分离算法将混叠的语音信号相互分离开来,提取我们所感兴趣的信号。“鸡尾酒会”问题是语音盲分离问题的典型描述。它描述了在多人同时说话的嘈杂环境下,我们能够辨识感兴趣人的说话声的能力。语音混合盲分离的目标就是对经典的“鸡尾酒会”问题提供解决方法。
1卷积混合语音信号的数学模型
语音的卷积混合模型和实际环境比较接近,其混合模型表示如下:
undefined (1)
xj(k)为第j个混合信号,si是第i个源信号,hji(p)是从第i个源信号到第j个混合信号的传递函数,其阶数为P。把(1)式写为矩阵形式为:
undefined (2)
H(p)为n×m的混合矩阵。矩阵的每一个元素都是一个P阶滤波器。卷积混合信号的盲分离就是要寻求一个Q阶的m×n的分离滤波器矩阵,使得
undefined (3)
是源信号的s(k)的估计。即yi(k)=aj(sj(k)),aj(·)是一个未知的传递函数。(3)式也可写为:
undefined (4)
把(2),(3)式变换到频域分别有:
x(w)=H(w)s(w) (5)
y(w)=W(w)x(w) (6)
从(5)与(6)式可以看出,卷积混合盲分离变成了频域中的瞬时混合盲分离。因此,在频域中用瞬时混合盲分离的方法就可以求解时域中的卷积混合盲分离问题。
2 ICA基本原理
设有N个未知的的源信号Si(t),i=1～N,构成一个列向量S(t)=[S1(t),S2(t),…,SN(t)]T,其中t是离散时刻,取值为0,1,2,…。设A是一个M×N维混合矩阵,X(t)=[x1(t),x2(t),…,xM(t)]T是由M个可观察信号xi(t),i=1～M构成的列向量,三者之间满足X(t)=AS(t),M≥N。ICA所要解决的问题就是在A未知的情况下寻求一个N×N维分离矩阵W使得Y(t)=WX(t)=WAS(t),其中Y(t)=[y1(t),y2(t),…,yN(t)]T。我们把分离矩阵W称为混合矩阵A的伪逆,这是因为所估计的分离矩阵并不是A-1(这是比较理想情况),而是满足WA=PI=C,P是一置换阵,I是单位阵。这就是ICA中的不确定性问题。
ICA学习过程分为两步:第一步建立一个以W为变元的目标函数L(W),如果某个undefined能使L(W)达到极大(小)值,该undefined即为所需的解。第二步即是用一种有效的算法求undefined。按照L(W)定义的不同和求undefined的方法不同可以构成各种ICA算法。
3卷积混合语音信号的盲分离
我们知道语音信号是非平稳信号,但是它在短时间上具平稳性。因此我们可以先对语音信号进行加窗傅立叶变换(FFT)将卷积混合问题转换为频域上每个频点的瞬时BSS(blind source separation)问题。然后采用成熟的定点算法来对混合语音信号分离。
对于卷积混合模型:x(t)=A*s(t)对输入信号进行短时傅立叶变换得到:
undefined
此处w为频率,N为离散傅立叶变换的点数,ts表示窗位置,w为窗函数,如汉明窗、汉宁窗等。ΔT是移动窗的间隔时间。窗函数的长度一般比信号最稳定的持续时间要短。那么源信号和观察信号的时频域关系可以表示为:undefined。这样我们就可以在频域上用定点算法来对卷积混合语音信号分离。
定点(Fixed-point)算法也称为快速ICA(FastICA),其思路就是找一个方向,即一个权值W以使得投影WTX具有最大的非高斯性,这里的非高斯性由负墒来量度。在随机变量偶对称分布时,负熵的表达式为:
J(y)∝|E(G(y))-E(G(v))|2 (7)
其中y是零均值单位方差的随机变量,v是零均值单位方差的高斯变量。其中:
undefined
式中1≤a1≤2,把y=WTX代入(7)式可得:
W+=E[Xg(WTX)]-E[g(WTX)]W (9)
式中g(·)是G(·)的导函数。定点算法的流程为:
1) 对输入信号进行预处理,得到零均值单位方差的信号。
2) 初始化权矢量W,并归一化。
3) 对权值W进行迭代更新,既W+=E[Xg(WTX)]-E[g(WTX)]W。
4) 归一化权值W=W+/‖W+‖。
5) 若不收敛的话,则返回第三步。
4实验仿真
这里的测试语音数据我们采用了matlab提供的说话声和鸟叫声。
5总结
本文通过对语音信号进行加窗傅立叶变换(FFT)将卷积混合问题转换为频域上每个频点的瞬时性BSS问题,并采用定点(fixed-point)ICA算法对混合语音信号进行了分离。其实质就是对混合语音信号在频域上分离。频域算法相对于时域算法有很大的优越性。然而频域算法中的不确定性(Permutation和scaling)问题仍有待解决。
摘要：重点研究了卷积混合语音信号的盲分离方法。语音信号是非平稳信号,但是它在短时间上具有平稳性。因此,本文对语音信号进行加窗傅立叶变换(FFT)将卷积混合问题转换为频域上每个频点的瞬时性BSS(blind source separation)问题,采用定点(fixed-point)ICA(independent component analysis)算法对混合语音信号进行了分离,并用matlab进行了仿真。
关键词：盲分离,语音信号,ICA
参考文献
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[3]Ikeda S,Murata N.A method of ICA in Time-FrequencyDomain,International Conference on Independent Compo-nent Analysis and Signal Separation,1999,365371.
