兔病毒性出血症病毒

关键词： 血症 病毒性 病毒

兔病毒性出血症病毒（精选八篇）

兔病毒性出血症病毒 篇1

1 材料与方法

1.1 病料与毒株

兔肝脏、脾脏、肺脏, 采自山东省高青某兔场的病死兔, 兔病毒性出血症病毒标准毒株AV34, 购自中国兽医药品监察所。

1.2 试验动物

无兔病毒性出血症抗体的健康青壮年兔 (体重约为2 kg) , 购自诸城本明兔业发展有限公司。

1.3 试剂与培养基

rTaq DNA聚合酶 (5U/μL) 、dNTP、DL-2 000 Marker, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;普通琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板, 均按配方自制。

1.4 兔抗兔病毒性出血症高免血清的制备

用兔病毒性出血症病毒标准毒株AV34按照《兔病毒性出血症灭活疫苗制造及检验规程》制备疫苗半成品, 加等量弗氏完全佐剂混匀乳化制成油乳剂, 皮下注射2只成年家兔, 1 mL/只;2周后以疫苗半成品与等量弗氏不完全佐剂制成油乳剂于皮下注射, 1 mL/只;第4周后再以无佐剂半成品于皮下注射, 1 mL/只;5周后采血, 在37 ℃温箱中感作30 min;4 ℃放置过夜;分离血清, 3 000 r/min离心30 min;取上清液, 测定其效价后-80 ℃保存, 备用。

1.5 细菌的分离

无菌取病死兔心脏、肝脏、脾脏接种于普通琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血琼脂平板, 分别置于37 ℃ CO2培养箱和37 ℃恒温箱中培养, 观察有无细菌生长。

1.6 病毒的分离

将病死兔肝脏、脾脏、肺脏在灭菌的研钵内充分研磨, 用灭菌生理盐水制成1∶3乳剂, 反复冻融3次, 8 000 r/min离心30 min;取上清液4 ℃保存, 备用。

1.7 RT-PCR鉴定

根据GenBank报道的RHDV基因组序列, 应用Premier Primer 5.0软件辅助设计1对引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 试验用浓度为20 pmol/μL。序列为RHDV1 5′-CGTGCTGAGCCAGATGTA-3′, RHDV2 5′-GGTTGCAGTCCCACTATTT-3′, 理论扩增片段长486 bp。

提取RNA的具体方法如下:取1.6中的上清液200 μL, 加入1 000 μL Trizol, 充分混匀, 室温静止5 min;加入200 μL氯仿, 剧烈振荡15 s;15～30 ℃静止3 min, 4 ℃、12 000 r/min离心15 min, 将上清液移至另一离心管中;加入500 μL异丙醇, 混匀后, 15～30 ℃静止10 min, 4 ℃、12 000 r/min离心10 min;弃上清液后, 加入1 000 μL 75%乙醇, 混匀, 4 ℃、12 000 r/min离心5 min;弃上清液, 待离心管中残留的乙醇风干后, 加入15 μL DEPC处理的水溶解沉淀, 即含病毒RNA。

反转录合成cDNA第一链:取RNA 4 μL, RHDV2 4 μL, DEPC H2O 4 μL, 5×Reaction Buffer 4 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, RNain 1 μL, M-MuLV 1 μL 吹打混匀, 42 ℃ 60 min, 然后70 ℃ 10 min。

PCR扩增体系:上述反转录产物4 μL, 上、下游引物各2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, Taq酶0.5 μL, 加双蒸水至50 μL。并设双蒸水为模板的阴性对照。PCR循环参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 共30个循环;最后72 ℃延伸10 min。取反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测, 并送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序, 测序结果用DNAStar软件进行分析。

1.8 病毒的血凝试验与血凝抑制试验

采集人的O型抗凝血, 2 000 r/min离心10 min;弃上清液, 用生理盐水洗涤4次, 最后一次以3 000 r/min离心10 min;取压积红细胞配成1.0%的新鲜红细胞悬液, 4 ℃保存, 备用。

取上述分离病毒上清液按照常规试验方法进行血凝试验与血凝抑制试验。

1.9 动物回归试验

选择健康青年兔8只, 分为2组, 每组4只。取病兔肝脏、脾脏的组织悬液, 每毫升添加青霉素4 000 IU、链霉素4 mg, 置4 ℃作用24 h;经检验确定无菌后, 给第1组兔皮下注射, 1 mL/只;第2组兔皮下注射灭菌生理盐水作对照。2组试验兔均隔离饲养, 观察1周以上, 记录发病死亡情况。解剖死亡兔, 观察病理变化。取有眼观病变的死亡兔心脏、肝脏、脾脏等进行细菌学检查, 并按上述方法进行RT-PCR检测。

2 结果

2.1 细菌的分离结果

结果表明, 普通琼脂平板、巧克力琼脂平板, 麦康凯琼脂平板、血琼脂平板培养基上均无细菌生长。

2.2 RT-PCR鉴定结果 (见图1)

1.DL-2 000 Marker;2.阴性对照;3, 4.病料PCR产物。

由图1可知, 病毒分离上清液扩增出486 bp大小的特异性条带, 与预期结果一致, 而阴性对照则未出现条带。初步说明试验分离的病毒为RHDV。

2.3 PCR产物测序结果 (见图2)

经DNAStar软件分析, 该测序结果与目的片段序列同源性为100%, 充分证明试验分离的病毒为RHDV。

2.4 病毒血凝试验与血凝抑制试验结果

病毒血凝试验结果表明, 该分离病毒上清液能够凝集人的O型红细胞, 血凝价为29。由此说明, 待检材料中存在对人的O型新鲜红细胞产生凝集作用的血凝素。 而用已知RHDV标准毒株所制备的阳性血清进行血凝抑制试验, 结果上述分离病毒上清液对人的O型红细胞的血凝作用能够被该阳性血清所抑制, 因此说明上述病料中含有RHDV。

2.5 动物回归试验结果

第1组4只试验兔全部在24～48 h发病死亡, 发病多在夜间, 发病初期多呈现最急性型症状, 如突然发病, 迅速死亡, 几乎没有其他任何明显症状, 有的甚至死前还在进食, 突然抽搐几下立即死亡。发病中期, 病兔精神萎靡, 皮毛粗乱、无光泽, 食欲减退, 渴欲增加, 迅速消瘦。濒死时有短期兴奋, 在笼舍内狂奔乱窜, 继而出现抽搐、角弓反张、全身颤抖, 倒向一侧后四肢划动, 惨叫几声, 昏迷后死亡。少数兔在死亡时从鼻孔流出带血泡沫或血液, 肛门松弛 (周围被毛被少量淡黄色黏液沾污) , 有的病兔粪球上也附有这种黏液。病兔体温都很高, 一般都升到41 ℃以上。 第2组4只试验兔均健康, 未见发病。

所有剖检病变和自然感染的病例极为相似。剖检可见上呼吸道普遍发生不同程度的充血, 严重的出现斑点状出血。尤其在气管, 可见黏膜呈弥散性鲜红或暗红色, 气管腔内含有白色或淡红色、带血的泡沫。肺脏有不同程度的充血, 有的在肺脏表面和实质内有散在的大小不一的出血斑点, 有的伴有广泛性肺充血和肺水肿, 呈现“花斑肺”外观, 切开肺叶时流出多量红色泡沫状液体。心脏扩张、淤血, 心肌变性、呈暗红色, 质地变软, 心室壁变薄。肝脏明显淤血、肿大, 呈深红色乃至紫红色, 质脆易碎, 切开时流出多量暗红色血液。胆囊肿胀, 充满稀薄胆汁。脾脏有的变化不明显, 有的淤血、肿大, 被膜紧张, 呈暗紫色, 切面结构模糊, 实质易于刮脱。肾脏呈“大红肾”外观, 两肾肿大, 呈弥散性鲜红色或暗红色, 皮质可见有散在的针尖状出血点。胃肠内多有食物, 胃黏膜脱落。小肠黏膜充血、出血。膀胱多有积尿。受损部位的淋巴结肿大、充血、出血。脑和脑膜血管淤血扩张。

取死亡兔心脏、肝脏、脾脏做细菌学检查, 结果4只均为阴性。

经PCR检验, 结果为RHDV阳性, 证实第1组4只试验兔全部死于RHD。

3 结论与讨论

根据细菌学检验、RT-PCR试验、病毒的血凝和血凝抑制试验以及动物试验结果可确诊此次疾病为RHD。对病料进行了病毒分离与鉴定, 成功获得1株RHDV。

RHDV属杯状病毒科兔病毒属, 基因组为单股正链线形RNA, 由约7 437个核苷酸组成。迄今所发现的RHDV均属于同一种血清型, 与杯状病毒科的其他成员没有交叉反应, 与其他杯状病毒相比, 最显著的特点是具有血凝性, 能凝集人的各型红细胞, 尤其对人的O型红细胞凝集作用更强[4]。

RHD只发生于兔, 各种品种和不同性别的兔均能感染发病, 是对兔危害最为严重的传染病之一, 应引起高度重视。临床上应注意RHD与巴氏杆菌病、魏氏梭菌病的鉴别诊断, 以免误诊。巴氏杆菌引起的败血症多呈散发性流行或地方性流行, 无明显年龄界限, 无神经症状及鼻腔出血症状;肝脏不肿大, 间质不增宽, 但有散在性和弥漫性灰白色坏死病灶;肾脏不肿大, 无明显色泽变化;常有化脓和纤维素样胸膜肺炎变化。根据以上症状与病理变化可进行初步鉴别诊断, 确诊主要根据2个病的病原特性不同 (兔瘟的病原是病毒, 巴氏杆菌病的病原是两端染色较深、有芽孢的革兰阴性菌) 。兔魏氏梭菌病病原为两端稍钝圆、无鞭毛的革兰阳性大杆菌。兔魏氏梭菌病以急性腹泻和盲肠浆膜有鲜红色出血斑为特征, 从粪便中可分离出肠毒素;以肝脏病料做红细胞凝集反应, 结果为阴性, 不能凝集人的O型红细胞。

参考文献

[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社, 2001.

[2]田浪, 王红宁, 李建文, 等.一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析[J].畜牧兽医学报, 2006, 37 (10) :1078-1083.

[3]牛家强, 曾群辉, 郎洪武, 等.兔病毒性出血症病毒西藏分离株毒力的测定[J].畜牧与兽医, 2006, 38 (8) :44-45.

兔病毒性出血症病毒 篇2

关键词：兔出血症病毒；炎性因子；荧光定量PCR；外周血；脾脏；肝脏

中图分类号： S852.65；S858.291文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0238-03

收稿日期：2016-01-20

基金项目：现代农业产业技术体系建设兔体系病毒病预防与控制岗位专项（编号：CARS-44-C-1）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）；江苏省自然科学基金（编号：BK20140740）。

作者简介：仇汝龙（1988—），男，山东济宁人，硕士研究生，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究。E-mail：qrl8891@163.com。

通信作者：王芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病致病机制及防控技术的研究。E-mail：rwangfang@126.com。

兔出血症（RHD）是对野兔和家兔具有高度传染性的疾病，其病原是兔出血症病毒（RHDV），属于杯状病毒家族的兔病毒属[1]。感染兔出血症病毒的成年兔在48～72 h内死亡[2]，死亡原因主要为肝脏快速衰竭并伴随强烈的炎症反应。在免疫反应中，调节炎症反应的正是信号通路及细胞因子。

细胞因子是调节性蛋白，在调节免疫反应中的细胞反应阶段有着重要的作用，包括淋巴细胞的激活、增殖、分化、存活和凋亡[3]。它们是低分子量蛋白，主要是由淋巴细胞、抗原呈递细胞、单核细胞、内皮细胞和纤维细胞等分泌。细胞因子可分为不同的类别，比如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和趋化因子等。细胞因子相互作用，施展极化效应于T细胞并且调整免疫反应[4]。CD4+亚群（Th细胞）根据自身所分泌的细胞因子，分为Th1和Th2亚群。Th1细胞分泌IFN-γ、淋巴毒素和IL-2，可以刺激炎症反应，比如迟发型超敏反应，促进补体的产生和细胞毒性T细胞分化。Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-10等，调节体液免疫反应[5-6]。多数研究证明宿主感染的程度以Th1和Th2细胞为基础[7]。IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α等[8-11]兔细胞因子序列的发表，促使检测兔细胞因子的分子生物学试验的产生。荧光定量PCR具有敏感性和结果快速性，可以作为检测细胞因子的方法。本研究通过荧光定量的方法，检测感染RHDV兔体内病毒拷贝数和炎性因子的变化，为研究兔出血症病毒的感染及致病机制奠定基础。

1材料与方法

1.1病毒和试验兔

兔出血症病毒（由江苏省农业科学院兽医研究所保存）；新西兰成年白兔40只，购自南京金陵种兔场。

1.2主要试剂和仪器

Trizol RNAiso plus，反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和荧光定量试剂SYBR Premix EX Taq，均购自Takara公司。pMD18-T Vector和大肠杆菌DH5α均购自南京基天生物公司，荧光定量机器Stepone 7300，人外周血淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品有限责任公司。

1.3引物

炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的检测引物[12]见表1，VP60模板引物及VP60检测引物建立标准曲线和检测样品[13]。引物由Invitrogen公司合成。

1.4试验动物分组和取样

将40只新西兰兔分为5组，每组5只攻毒兔和3只对照兔，兔攻毒采用颈部皮下注射0.5 mL HA为28 RHDV的肝悬液。5组兔分别在攻毒后6、12、24、30、36 h取样后杀死。血液通过心脏采血，采集后立即分离淋巴细胞和血清，肝脏和脾脏则保存于-70 ℃备用。

1.5RNA的提取及反转录

1.5.1炎性因子RNA提取外周血淋巴细胞、肝脏和脾脏的RNA提取采用Trizol法。按照6、12、24、30、36 h取样，取外周血3 mL采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞后提取RNA。肝脏和脾脏则称取0.5g匀浆提取RNA。提取的RNA进行反转录。

1.5.2病毒RNA提取病毒拷贝数的定量，采用外周血血清提取RNA，组织则采用0.5 g肝脏和脾脏的匀浆上清液来提取RNA[14]。提取的RNA进行反转录。

1.6熒光定量PCR检测和计算

1.6.1炎性因子的检测炎性因子检测的荧光定量体系：SYBR Mix 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX 0.4 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环40次；熔解曲线默认设置。分析数据：细胞因子数据分析采用2-ΔΔCT方法，计算相对表达水平。

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1.6.2病毒拷贝数的检测病毒拷贝数的检测需要进行绝对定量，定量体系和程序见“1.6.1”节。结果根据标准曲线计算。

2结果与分析

2.1外周血淋巴细胞的炎性因子和外周血病毒拷贝数

感染RHDV的兔外周血中的病毒拷贝数迅速上升，导致病毒随血液在兔体内传播（图1-A）。炎性因子IL-6和TNF-α表达水平则持续上升直到36 h（图1-B和图1-C），说明炎症反应加剧，而抗炎因子IL-10作为最重要的保护性因子，在外周血淋巴细胞中并没有检测出其mRNA的表达。IFN-γ在感染病毒的外周血中持续下调（图1-D）。

2.2肝脏炎性因子和病毒拷贝数

肝脏作为RHDV感染中急性衰竭的部位，病毒拷贝数快速上升直到36 h（图2-A），炎性因子IL-6和TNF-α也快速上升，表明炎症反应加剧，IL-6相对表达水平在30 h达到最大值，之后则相对表达水平大大降低（图2-B和图2-C）。不同于外周血，抗炎因子IL-10在肝脏中相对表达水平持续处于上调的趋势（图2-D）。IFN-γ在肝脏30 h则有短暂的上调（图2-E）。

2.3脾脏细胞因子和病毒拷贝数

兔体感染RHDV后，脾脏内病毒的拷贝数也持续上升并在30 h达到较高水平（图3-A）。炎性因子IL-6和TNF-α同肝脏一样，处于较高水平的表达（图3-B和图3-C），不同的是脾脏IL-6持续升高直到36 h。抗炎因子IL-10表达水平也有上调，在30 h达到最大值（图3-D）。脾脏的IFN-γ相对表达水平与肝脏相似在30 h都有短暂的上调，然后迅速下調（图3-E）。

3讨论

近年来的研究表明，炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α等）的急性升高在“暴发性肝脏衰竭” 中有着重要作用，是RHDV感染引起重症炎症反应的关键因素。对炎性因子的研究，可以阐述细胞免疫在RHDV感染病毒清除和肝损伤中的作用，深化免疫损伤理论认识，为发展特异性免疫治疗手段提供了科学依据。炎性因子作为调节性因子存在于整个免疫反应阶段，通过荧光定量PCR对炎性因子的跟踪检测可以对RHDV感染引发的炎症反应进行深入的研究和了解。

本研究发现，通过实时荧光定量PCR的方法，对感染RHDV的兔体内病毒拷贝数和炎性因子进行检测，结合感染后不同时间点的相关结果分析，可以对RHDV感染兔体后的体内传播和引发的炎症反应有较为深刻的了解。

兔出血症病毒在感染成年兔后，体内病毒随血液到达全身，并且快速增殖直到36 h，作为靶器官的肝脏和脾脏内病毒积累量快速上升。病毒量在靶器官增多的同时，炎性因子IL-6和TNF-α的相对表达水平在外周血、肝脏和脾脏中都大幅度上调，暗示炎症反应的加剧。随着炎症反应的加剧，保护性抗炎因子IL-10相对表达水平也有一定程度的上调，以调节炎症反应。但是炎症反应一直处于加剧的趋势，说明炎症反应没有得到有效的控制。肝脏和脾脏中具有抗病毒能力的IFN-γ虽然有一定程度的上调，并不能阻止病毒在两者中的增殖。感染兔出血症病毒的兔体内暴发炎症反应，导致免疫反应的失衡，抗炎因子无法起到保护作用，从而导致肝脏等组织器官衰竭和死亡[15]。总之，感染RHDV的兔体内炎症反应的不断加剧，病毒的快速增殖和在靶器官的不断积累可能最终是导致兔快速死亡的重要原因。本研究为兔出血症病毒感染和致病机制的研究奠定了基础。

参考文献：

[1]Granzow H，Weiland F，Strebelow H G，et al. Rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV）：ultrastructure and biochemical studies of typical and core-like particles present in liver homogenates[J]. Virus Research，1996，41（2）：163-172.

[2]Ohlinger V F，Haas B，Meyers G，et al. Identification and characterization of the virus causing rabbit hemorrhagic disease[J]. Journal of Virology，1990，64（7）：3331-3336.

[3]Giulietti A，Overbergh L，Valckx D，et al. An overview of real-time quantitative PCR：applications to quantify cytokine gene expression[J]. Methods，2001，25（4）：386-401.

[4]Boeuf P，Vigan-Womas I，Jublot D，et al. CyProQuant-PCR：a real time RT-PCR technique for profiling human cytokines，based on external RNA standards，readily automatable for clinical use[J]. Bmc Immunology，2005，6（1）：1-14.[5]Abbas A K，Murphy K M，Sher A . Functional diversity of helper T lymphoctes[J]. Nature，1996，383（6603）：787-793.

[6]Mena A，Ioannou X P，Kessel A V，et al. Th1/Th2 biasing effects of vaccination in cattle as determined by real-time PCR[J]. Journal of Immunological Methods，2002，263（1/2）：11-21.

nlc202309040406

[7]Dinarello C A. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock[J]. Chest，1997，112（6）：321-329.

[8]Cannon J G，Clark B D，Wingfield P，et al. Rabbit IL-1 Cloning，expression，biologic properties，and transcription during endotoxemia[J]. Journal of Immunology，1989，142（7）：2299-2306.

[9]Shakhov A N，Kuprash D V，Azizov M M，et al. Structural analysis of the rabbit TNF locus，containing the genes encoding TNF-β（lymphotoxin） and TNF-α（tumor necrosis factor）[J]. Gene，1990，95（2）：215-221.

[10]Isono T，Nagano Y，Seto A. Expression of the interferon-gamma and interleukin-10 genes in rabbit HTLV-Ⅰ-transformed T-cell lines[J]. Immunogenetics，1996，44（4）：306-308.

[11]Perkins H，Van L B C，Kerr P. The complete cDNA sequences of IL-2，IL-4，IL-6 AND IL-10 from the European rabbit （Oryctolagus cuniculus）[J]. Cytokine，2000，12（6）：555-565.

[12]Liu W K，Dang R Y，Wang X L. Development of a SYBR-based real-time PCR to detect rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV） and analyze its tissue distribution in experimentally infected rabbits[J]. Virol Sin，2015，30（3）：228-30.

[13]Espino A M，Rivera F. Quantitation of cytokine mRNA by real-time RT-PCR during a vaccination trial in a rabbit model of fascioliasis[J]. Vet Parasitol，2010，169（1/2）：82-92.

[14]Duarte M D，Carvalho C L，Barros S C，et al. A real time Taqman RT-PCR for the detection of rabbit hemorrhagic disease virus 2 （RHDV2）[J]. J Virol Methods，2015，219：90-5.

[15]Abrantes J，Loo W V D，Pendu J L，et al. Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）：a review[J]. Veterinary Research，2012，43（6）：162-172.黃银云，胡新岗，郭广富，等. 樱桃谷肉鸭大肠杆菌病PCR鉴定及治疗药物筛选与应用[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：241-243.

兔病毒性出血症的防治 篇3

1 流行病学

本病只发生于家兔和野兔。各种品种和不分性别的兔都可感染发病, 长毛兔的易感性高于皮肉兔。60日龄以上的青年兔和成年兔的易感性高于2个月龄以内的仔兔。未断奶的幼兔很少发病死亡。

病兔、隐性感染兔和带毒的野兔是传染来源, 它们通过粪便、皮肤、呼吸和生殖道排毒。除直接接触传染外, 也可通过被污染的饲料、饮水、灰尘、用具、兔毛、环境及饲养管理人员、毛皮商人和兽医的手、衣服、鞋子等的间接接触传播。消化道、呼吸道是主要的传播途径, 皮下、肌肉、静脉注射、配种、腹腔注射等均可感染发病。

本病在新疫区多呈爆发性流行。成年兔、肥壮兔和良种兔中的发病率和病死率都高达90~95%, 甚至100%。来势猛, 传播快, 从第一只感染兔倒毙到最后一只兔死亡, 历时往往仅8~10d。本病一年四季都可发生, 但北方一般以冬、春寒冷季节多发。这可能与气候寒冷, 饲料单一, 兔体抵抗力下降有关。

2 临床症状

潜伏期自然感染2~3d, 人工接种38~72h。根据自然发病经过, 一般可分为最急性型、急性型和慢性型。

2.1 最急性型

多发生在流行初期。突然发病, 迅速死亡, 几乎没有什么明显的症状。一般在感染后10~12h, 体温升高到41℃, 约稽留6~8h而死。有的死前还在吃食, 突然抽搐几下即刻死亡。

2.2 急性型

多在流行中期发生。感染后24~40h, 体温升高到41℃以上, 病兔食欲减退, 渴欲增加, 精神沉郁, 迅速消瘦。死前有短期兴奋、挣扎、狂奔、咬笼架, 继而前肢俯伏, 后肢支起, 全身颤抖, 倒向一侧, 四肢划动, 惨叫几声而死, 死亡兔呈角弓反张姿势, 尸僵较快, 少数病死兔鼻孔中流出泡沫样血液。病程1~2d。

以上两型绝大多数发生在青年兔和成年兔。死前肛门常松弛, 肛门周围被毛有少量淡黄色粘液沾污, 粪球也附有分泌物。

2.3 慢性型

多见于疫区或流行后期, 潜伏期和病程较长。病兔体温升高到41℃左右, 精神沉郁, 被毛杂乱无光泽, 最后消瘦、衰竭死亡。有些病兔可以耐过, 但生长迟缓、发育较差, 常常带毒和从粪中排毒至少1个月之久。

3 病理变化

本病特征性病变是呈出血性败血症变化。剖检可见鼻腔、喉头和气管粘膜淤血和出血, 气管粘膜呈小点状或弥漫性出血, 而呈“红气管”外观。气管和支气管内有泡沫状血液。肺有不同程度充血, 一侧或两侧有数量不等的小米粒至绿豆大的出血斑点, 切开肺叶流出多量泡沫状液体。肝淤血、肿大、质脆, 被膜呈弥漫性坏死, 表面呈淡黄色或灰白色条纹, 切面粗糙, 流出多量暗红色血液。胆囊肿大, 充满稀薄胆汁。脾脏变化不明显或肿大2~3倍。肾淤血、肿大, 呈暗红色, 皮质有针尖大的出血点。心脏扩张淤血, 心内外膜有出血点。胸腺肿大, 并有散在性针尖至粟粒大出血点。脑膜血管明显淤血扩张。胃内积食, 胃粘膜潮红、脱落, 肠粘膜及浆膜充血及出血。肠系膜淋巴结肿大, 其他淋巴结多数充血。母兔子宫粘膜出血、淤血, 严重者子宫内有鲜血和血凝块, 子宫内胎儿死亡。有些病例眼球底部常有血肿。

组织学变化为多种器官充血、出血、坏死, 有弥漫性血管内凝血;肝细胞弥漫性变性、坏死;非化脓性脑炎;心肌纤维变性、坏死等。

4 诊断

在疫区根据流行病学特点、典型的临床症状和病理变化, 一般可以做出诊断。在新疫区要确诊可进行病原学检查和血清学试验。也可将病料做本动物感染试验。

5 防治

兔病毒性出血症的诊治 篇4

1 发病情况

发病兔2.5月龄。主诉:10日前外购一部分种兔,初期无明显症状,表现无异常,3d后出现大批病兔死亡。有部分病兔不显症而突然倒地尖叫而死,有的病兔鼻孔中流出泡沫状红色液体或鲜血。病免体温高达40.5~41℃,精神萎靡,食欲废绝;神经症状明显,卧地呈游泳状,抽搐、鸣叫而死,病程数小时。病兔腹泻,粪球带黏液,个别病例有血尿。

2 剖检变化

死兔鼻周围沾有血液(图1),剖检死兔时可发现血液凝固不良、肝脏肿胀变性(图2),脾脏肿大呈暗紫色、肾肿大呈紫红色(图3),大部分死兔的喉头和气管黏膜高度充血或出血(图4),肺高度水肿,有大小不等的出血斑点(图5)。及时剖检死兔可发现血管中有大量的血样泡沫,胃肠道有出血症状。

3 治疗方法

立即封锁兔场,隔离病兔,死兔深埋,笼具、兔舍及环境彻底消毒;个别病兔皮下、肌肉注射抗兔瘟高免血清有量2ml/kg·次。对未感染兔紧急预防注射,2~3ml/只。

4 防治心得

一例兔病毒性出血症的诊治 篇5

1 发病情况

2011年3月12号, 我县某兔场徐某带3只死兔和病兔前来我院就诊, 主诉:该养兔场饲养獭兔300多只, 体重及日龄大小不一, 0.5～1.5kg。但多数为3个月左右的幼兔, 断奶后免疫过兔三联疫苗, 发病前一天晚上兔群吃食正常, 无异常情况, 第2天早上发现有死獭兔8只并有部分发病兔。该兔场因地处山区, 气候环境较好, 周围饲养獭兔的并不多, 但该场已饲养獭兔多年, 属于建场较早的老场。

2 临床症状

病程一般12～48h, 患兔精神萎顿、不爱活动、食欲减退、喜饮水、呼吸迫促、体温达41℃。临死前表现为在笼中狂奔、常咬笼, 倒地后, 四肢划动, 抽搐或惨叫, 很快死亡。少数死兔鼻孔流出少量泡沫状血液。肛门松弛, 周围被少量淡黄色胶样物沾污, 粪球上有淡黄色胶样物黏着。

3 病理变化

剖检病死獭兔病理变化以肺和气管内有淡红色泡沫为主要特征。全身器官有瘀血、出血、水肿。气管黏膜有散发性鲜红或暗红斑点, 呈红色指环样, 气管腔内含有淡红色带血泡沫。脑瘀血、水肿, 有针尖至绿豆大的出血点, 呈弥散状。胃黏膜下血管扩张、充血、胃内容物多, 胃黏膜上有出血点。肝瘀血、肿大、质脆, 色暗红或红黄色, 部分有出血点或灰白色病灶。胆囊肿大, 充满胆汁。肾肿大, 色暗红、紫红或紫黑色, 被膜下可见出血点、灰白色斑点, 质脆、切口外翻。肠系膜上淋巴结肿大, 切面有出血点。膀胱内充满黄褐色尿液。脑下有出血斑块。非典型病例以胸腺肿大、出血为特征。肺部和器官出血, 肝变性。肾肿大、出血。直肠内有胶冻样黏液, 从肛门流出淡黄色黏液。

4 实验室诊断

4.1 细菌学检查

取无菌采集病兔肺脏、肝脏组织做触片镜检, 并分别接种于鲜血琼脂平板和肉汤, 置37℃温箱培养24h。对无菌采集病兔肺脏、肝脏组织做触片镜检, 没能发现有细菌;接种的鲜血琼脂平板和肉汤, 置37℃温箱培养24h后, 鲜血琼脂平板无菌落长出, 肉汤无浑浊及颜色变化。

4.2 红细胞凝集试验

将无菌采集的病死兔肝脏、脾脏, 在乳钵内内研磨成1:10的混悬液, 冻融1次后, 4000转/min离心15min, 取上清液备用。另取健康兔的肝脏, 依上法制成悬液, 作为对照。对病死兔的肝脏分别作为独立的样本进行了试验, 其红细胞凝集效价均在10×24以上, 其中最高的达10×26。健康兔对照组无血凝性。

4.3 动物回归试验

将6只试验用兔分为2组, 实验组4只, 每只按照1m L/kg.bw, 肌肉注射经加双抗处理后的病料混悬液;对照组2只, 每只按照1m L/kg.bw, 肌肉注射生理盐水, 隔离饲养观察。试验组4只兔分别在接种后40h、44h、56、60h发生死亡, 症状与病理变化与送检病死兔相同, 并且出现尖叫和咬笼情况。

5 诊断

通过临床症状、病理剖检和实验室诊断, 可以确定该兔场此次发病为兔病毒性出血症。

6 治疗措施

6.1 将病兔隔离, 重病者扑杀, 将死兔及尸体深埋或销毁。

用齐鲁奥埃特或齐鲁消毒剂对环境、地面、兔笼、用具、饲槽等消毒。

6.2 全群紧急注射兔瘟疫苗, 使用4～5倍量兔瘟疫苗进行注射, 每注射一只兔换一个针头。

5d左右控制疫情。或用高免血清每兔皮下注射4～6mL, 7～10d后再注射疫苗, 3d左右控制病情发展。发病期间应加强隔离消毒。发病兔使用抗菌药物治疗无效。6.3板蓝根注射液2mL、维生素C注射液2mL, 肌肉注射;聚肌胞注射液1mg、维生素C注射液500mg, 醋酸可的松注射液50mg, 肌肉注射。同时板蓝根冲剂水冲后, 自由饮用。

7 体会

7.1 对本病没有特效治疗药物, 应以预防为主。

笔者建议在兔30日龄时用兔瘟、巴氏杆菌二联苗注射1次, 2mL/只;60日龄时注射兔瘟、巴氏杆菌病二联苗1次, 2mL/只;种兔5～6个月注射1次。

7.2 在发病期, 为防止本病的扩散, 要严格封锁, 场

内隔离病兔, 应注意对死兔的处理, 不要随便丢弃, 死兔应深埋或烧毁, 更不要剥皮吃肉;带毒的病兔应绝对隔离, 排泄物及一切饲养用具有均需彻底消毒, 以免病毒扩散。

7.3 严禁外来人员进入兔舍, 特别是收兔皮兔毛的收购人员严禁进入兔舍, 以防疫病带入。

其他人员进入兔舍, 必须更衣, 换鞋消毒后, 方能入内。

7.4 严格检疫, 引种时必须了解当地疫情, 不到疫区引种兔。

兔病毒性出血症检测方法的研究进展 篇6

1 RHDV的概述

RHDV属于杯状病毒科( Caliciviridae) 兔病毒属( Lagovirus) ,与杯状病毒科的其他成员,如猫杯状病毒( FCV) 、诺沃克病毒( NV) 等没有交叉反应,成熟的病毒粒子为球形颗粒,无囊膜,呈二十面体立体对称。病毒基因组为单股正链RNA,全长约7 437 bp,含有2 个开放阅读框,分别编码多聚蛋白与小结构蛋白,其中RHDV衣壳蛋白VP60 由ORFⅠ的3'端部分序列编码,基因片段大小为1 740 bp,是主要的结构蛋白,在病毒诱导机体的免疫保护应答中起主要作用,其核苷酸极端保守,用原核系统表达的VP60 蛋白可作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。在病毒性出血症检测方面,自1984 年以来相继建立了一系列抗原、抗体检测方法。如电镜检测、血清学检测及分子生物学等方法。整体而言,血清学检测方法的敏感性不如分子生物学,且前者的假阳性和假阴性比率也比后者高。

血凝( HA) 试验和血凝抑制( HI) 试验及琼脂扩散试验等也可以用于检测抗原或抗体,与ELISA法比较,HA试验出现8% 的假阳性或假阴性,假阳性可能是由于存在非特异性血凝因子,假阴性可能是由病毒粒子衣壳蛋白降解或抑制性抗体所致。用HA试验对可疑病例进行诊断时,特别是在HA试验出现阴性结果时,应结合临床表现和其他实验室检测方法进行综合判定。HA试验不适合于污染疫苗中RHDV的检测［2］,由于有低血凝活性或无血凝性毒株的存在［3 － 4］,HA试验将逐渐被ELISA、RT - PCR等方法所取代。

2 ELISA

2. 1 斑点酶联免疫吸附试验( Dot - ELISA)

杨汉春等人以纯化RHDV为抗原,硝酸纤维素滤膜为载体,建立了Dot - ELISA,该方法的敏感性比间接血凝试验高2 ~ 5 倍。1984 年,M. Moeremans等人将Dot - ELISA与免疫金银染色法相结合,建立了固相载体上的斑点免疫金银染色法( Dot - IGS /IGSS) 。王龙涛等人用所建立的Dot - IGSS与HI试验对96 头份被检血清进行平行检测,结果Dot - IGSS和HI试验的阳性检出率分别为94% 和31% 。

2. 2 双抗体夹心法( sandwich ELISA)

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法之一。董婷等［5］采用3 种特异性抗体构建了“多克隆兔血清- 抗原蛋白- 小鼠腹水单克隆抗体- 羊抗鼠Ig G -HRP抗体”的双夹心结构,对52 份待检兔肝脏样品进行检测,结果显示: 双抗体夹心法和HA试验的阳性检出率分别为82. 7% ( 43 /52) 和75. 0% ( 39 /52) ,双抗体夹心法与HA试验的符合率为90. 7% ,双抗体夹心法的敏感性为HA试验的100 倍。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。

2. 3 间接ELISA( indirect ELISA)

李云琴等［6］以原核表达的重组VP60 蛋白作为诊断抗原,建立了检测RHDV抗体的VP60 - ELISA诊断方法,结果显示: 该方法检测的3 种常见兔病( 兔轮状病毒病、仙台病毒病和魏氏梭菌病) 的阳性血清均为阴性; 检测灵敏度为1∶12 800; 批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4. 9% 和6. 9% 。祖立闯等［7］用研制出的间接ELISA抗体检测试剂盒进行检测,当阳性对照血清稀释至12 800 倍时,检测结果仍为阳性,具有较好的敏感性。

2. 4 抗原捕获ELISA

秦海斌等人用RHDV单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,构建RHDV抗原捕获ELISA检测方法,结果表明,可特异性地检测出兔肝脏病料中的RHDV,纯化病毒的最低检出量为26 μg / L。对已知阳性样品的检测显示,抗原捕获ELISA检测的病毒效价是HA试验的3 ~ 13 倍。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。

3 免疫荧光技术

用按照常规方法制备的抗RHDV荧光抗体直接染色病兔肝脏和脾脏等组织的冰冻切片或压印片,检测病料中是否感染病毒,若冰冻切片或压印片含有病毒,则能够在荧光显微镜下观察到感染细胞内草绿色的激发荧光斑点,反之则为阴性。该方法也可以应用1% 的人“O”型红细胞吸附病料组织中的病毒,然后再进行荧光抗体染色并镜检判定是否感染RHDV。薛掌林等人用免疫荧光技术对兔肾上皮细胞( RK) 和羊睾丸细胞( ST) 培养的RHDV进行检测,结果可以准确判断病毒的存在与否及其病毒在细胞内增殖的部位,同时也可看到病毒对该细胞所引起的病变特征。用免疫荧光技术对RHDV适应细胞培养及病毒的增殖效果进行检测诊断,是一种快速、准确的方法。

4 分子生物学检测技术

4. 1 常规RT - PCR检测

用常规RT - PCR检测RHDV的报道很多［8 － 10］。程汉等［9］根据Gen Bank上公布的RHDV VP60 基因保守序列,设计了1 对特异性引物,经c DNA合成和PCR扩增,目的片段大小为586 bp,电泳结果显示,该方法能检出最小RNA浓度为2. 4 ng /μL,敏感性为HA试验8 000 倍。肖跃强等［8］根据Gen Bank中公布的RHDV全基因组序列建立了RT - PCR检测方法,结果表明: 该方法可以扩增100 拷贝数以上的模板,对兔轮状病毒与水泡性口炎病毒的检测结果均为阴性; 临床应用对比试验显示,与HA试验相比,该方法的阳性检出率由66. 7% 提升至77. 8% 。

4. 2 套式PCR检测

套式PCR又称巢式PCR,是一种变异的聚合酶链反应,使用2 对( 而非一对) PCR引物扩增完整的片段,其反应的特异性和敏感性与RT - PCR比较有极大提高。周智君等人采用套式PCR检测方法对12份RHDV样本进行检测,结果检出率为100% 。王景儒［11］构建了检测RHDV的巢式RT - PCR,结果该方法可以准确快速检测出极低含量的RHDV,对兔轮状病毒、仙台病毒、健康兔肝脏组织的扩增结果均为阴性。

4. 3 荧光定量PCR检测

荧光定量PCR技术是一种新型的核酸检测技术,在临床诊断中已经用于细菌病、病毒病及遗传性疾病的检测,具有极大的应用价值。肖跃强等［12］建立了SYBR GreenⅠ荧光染料real - time RT - PCR检测方法,该方法可检出10 拷贝数以上的模板,实际应用结果显示,该方法对疑似RHDV病料的阳性检出率为74. 8% ,而普通RT - PCR方法阳性检出率为65. 5% 。波兰学者P. Niedzwiedzka - Rystwej等［13］建立了类似的RHDV检测方法,对来自欧洲不同区域的具有不同毒力的17 种不同毒株进行检测,结果表明,实时PCR是诊断RHDV的有效方法,无需考虑毒株的特性。

张秀娥等人参照RHDV VP60 基因的保守区,设计了1 段Taq Man MGB探针和1 对引物,结果可以检测到的RHDV核酸最低量为5 pg,而且未检出其他病原的RNA。该方法能快速检测临床样品中的RHDV,适合于兔子各种脏器及肌肉组织中RHDV的检测和快速诊断。

4. 4环介导等温扩增技术( loop - mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP技术是一种全新的核酸扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术,不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测,检测成本远低于荧光定量PCR技术。原冬伟等［14］根据Gen Bank中的中国RHDV分离株VP60 基因保守序列设计合成了内、外2 对引物,在Bst DNA聚合酶的作用下完成等温核酸扩增反应,对反应条件逐一优化,并对临床样品进行检测,结果表明: 该方法简便、快速、特异性好,灵敏性较常规RT - PCR技术高100 倍; 该方法可同时扩增7 株RHDV中国分离株,说明其对检测国内RHDV分离株是有效的; 对15 份临床样品检测显示,LAMP的阳性检出率达80% ,RT - PCR的阳性检出率为60% 。由于LAMP的扩增是链置换合成,靶序列长度最好在300 bp以内,其灵敏度高,极易受污染而产生假阳性结果,故要特别注意严谨操作。

5胶体金免疫层析( gold immuno - chromatographic assay,GICA)

胶体金免疫层析是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。蔡少平等［15］用胶体金标记纯化RHDV多克隆抗体,以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60 蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体( Mc Ab) A3C,将RHDV的Mc Ab和羊抗兔Ig G抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化研制成RHDV免疫胶体金试纸条。该试纸条可以检出HA试验效价为1∶10 的RHDV悬液,即HA试验为阴性的样品,该试纸条检测为阳性,其敏感性高于HA试验; 特异性试验结果显示,该试纸条不与家兔其他常见病菌发生交叉反应。用该试纸条对127 份疑似RHD家兔肝脏样品进行初步检测,同时以HA试验作为平行试验,阳性符合率为100% 。

6 结语

由于RHD对养兔业的危害极大,各国都积极采取了预防和控制该病的措施。因此,有必要建立一种高效、敏感、易行的诊断方法。做好防控重点在基层,胶体金免疫层析试纸条是一种快速、灵敏、特异的检测方法,在人类重大疾病和早孕等诊断方面已有广泛应用,该技术适用于RHDV的现场诊断,具有很好的应用前景。

摘要：兔病毒性出血症(RHD)又称出血性败血症,俗称兔瘟,是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)引起的一种发病急、死亡率高的传染病。为了更好地加强病毒的检测与防控,需要更精确、方便的检测方法以满足科研和基层的不同需要,文章对近年来RHDV检测方法的研究进展进行了综述,主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光定量PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)和胶体金免疫层析(GICA)等,以期为RHDV的防控及诊断提供参考。

兔病毒性出血症病毒 篇7

1 病原特性

(1) RHDV呈球型, 直径30nm左右, 无囊膜, 核衣壳呈20面体对称, 由32个颗粒组成, 在核衣壳上整齐地排列着中空的杯状结构。RHDV的基因组为一条单股正链的RNA分子, 由约7437个核苷酸组成。基因组含有2个开放阅读筐架 (ORF) :其中ORFl编码病毒的衣壳蛋白VP60。VP60能够自聚合形成病毒样颗粒 (VLPs) , 在病毒诱导机体的免疫保护应答起主要作用。RHDV是侵害多种组织细胞的泛嗜性病毒, 但主侵器官是肝脏, 主要靶细胞是肝细胞及血管内皮细胞。RHDV侵入细胞后先在细胞核内复制装配, 然后再向胞质及胞外扩散。 (2) 根据RHDV能够快速凝集人“O”型红细胞的特性, 可采用微量法和玻板法检测。与ELISA比较, HA出现8%的假阳性或假阴性, 假阳性可能是由于存在非特异性血凝因子, 假阴性可能是由于病毒粒子衣壳蛋白降解或抑制性抗体所致。HA对可疑病例进行诊断时, 特别在HA试验出现阴性结果时, 应结合临床表现和其它实验室检测方法做综合判定。血凝试验不适合于污染疫苗中RHDV的检测[1], 由于低血凝活性或无血凝性毒株的存在[2,3], 血凝试验将逐渐被ELISA、RT-PCR等方法所取代。

2 诊断方法进展

2.1 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法之一, 董婷等[4]采用3种特异性抗体, 形成了“多克隆兔血清-抗原蛋白-小鼠腹水单抗-羊抗鼠Ig G-HRP抗体”的双夹心结构, 对52份待检兔肝脏样品的检测结果显示:双夹心ELISA和HA试验的阳性检出率分别为82.7% (43/52) 和75.0% (39/52) , 双夹心ELISA与HA试验的符合率为90.7%, 其敏感性为HA的100倍。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。祖立闯等[5]研制的间接ELISA抗体检测试剂盒, 当阳性对照血清稀释至12800倍时, 检测结果仍为阳性, 具有较好的敏感性。秦海斌等[6]用RHDV单克隆抗体包被酶标板, 以兔多克隆抗体作为夹心抗体, 建立RHDV抗原捕获ELISA检测方法。可特异性地检测出兔肝脏病料中的RHDV, 纯化病毒的最低检出量为26μg/L。对已知阳性样品的检测显示, 捕获ELISA检测的病毒滴度是HA试验的3~13倍。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。

2.2 分子生物学检测技术

2.2.1 RT-PCR检测RHDV

常规RT-PCR检测RHDV报道很多[7,8,9], 肖跃强等[7]根据Gen Bank中公布的RHDV全基因组序列, 建立RT-PCR检测方法, 可以扩增102拷贝以上的模板, 对兔轮状病毒与水泡性口炎病毒检测结果均为阴性;临床应用对比实验显示, 与HA检测相比, 该方法检出阳性率由66.7%提升至77.8%。周智君等[10]采用套式PCR检测方法对12份RHD样本进行检测, 检出率为100%。王景儒等[11]建立的检测RHDV的巢式RT-PCR, 可以准确快速检测出极低含量的RHDV, 对兔轮状病毒、仙台病毒、健康兔肝脏组织的扩增结果均为阴性。荧光定量PCR技术, 是一种新型的核酸检测技术, 在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测, 具有极大的应用价值。肖跃强等[12]建立了SYBR GreenⅠ荧光染料real-time RT-PCR检测方法, 该方法可检出101以上拷贝数的模板, 实际应用结果显示, 该方法对疑似RHDV病料检测的阳性率为74.8%, 而普通RT-PCR方法检测的阳性率为65.5%。波兰学者P.Niedzwiedzka-Rystwej等[13]建立了类似的RHDV检测方法, 对来自欧洲不同区域的具有不同毒力的17个不同毒株检测, 研究结果表明实时PCR是诊断RHDV的有效方法, 无需考虑毒株的特性。

2.2.2 环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)

环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法, 具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术, 不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测, 检测成本远低于荧光定量PCR。原冬伟等[14]根据Gen Bank中的中国RHDV分离株VP60基因保守序列设计合成了内、外2对引物, 在Bst DNA聚合酶的作用下完成等温核酸扩增反应, 对反应条件逐一优化, 并对临床样品进行检测。结果表明, 该方法简便、快速、特异性好, 灵敏性较常规RT-PCR高100倍。该方法可同时扩增7株RHDV中国分离株, 说明其对检测国内RHDV分离株的有效性。对15份临床样品的检测结果显示, LAMP阳性检出率达80%, RT-PCR检测阳性率为60%。由于LAMP扩增是链置换合成, 靶序列长度最好在300bp以内, 由于灵敏度高, 极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作。

2.3 胶体金免疫层析

胶体金免疫层析 (Gold Immuno-chromatographic Assay, GICA) 是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。蔡少平等[15]用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体, 以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV-VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体 (Mc Ab, 简称单抗) A3C, 将RHDV Mc Ab和羊抗兔Ig G抗体包被在硝酸纤维素膜上, 分别作为检测线和质控线, 经条件优化研制成RHDV免疫胶体金试纸条。该试纸条可以检出红细胞凝集试验 (HA) 效价为1:10的RHDV悬液, 即HA检测为阴性的样品, 该试纸条检测为阳性, 其敏感性高于HA;特异性试验结果显示, 该试纸条不与家兔其他常见病菌发生交叉反应。应用该试纸条对127份疑似兔出血症家兔肝脏样品进行初步检测, 同时用HA做平行试验, 阳性符合率为100%。

3 疫苗研制进展

在兔瘟的防治中, 目前广泛应用的兔病毒性出血症商品疫苗, 是通过活兔攻毒制备的脏器组织灭活苗, 采取皮下或肌肉注射接种, 具有良好的免疫效果, 在接种后2周左右, HI抗体滴度可达211以上, 免疫期可达1年以上。但该途径存在因攻毒过程控制不严或病毒灭活不彻底而散毒, 体内的副反应多, 抗原量难以把握, 生物安全性低及不符合动物福利要求等诸多缺点。细胞灭活苗制备工艺简单, 培养方便快捷, 病毒可定量, 成本低廉, 安全, 高效, 不存在散毒的危险, 但至今还没有一种能够使其长期稳定传代的细胞, 也无细胞培养灭活苗问世。鉴于RHDV比较单一的血清型, 衣壳VP60蛋白在诱导宿主免疫反应中的重要作用及其相对比较保守的氨基酸序列为基因工程苗的研制提供了方便。近年来, RHDV新型疫苗的研究正是以病毒衣壳蛋白VP60为基础。目前国内外学者已在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、腺病毒以及植物等多种表达系统中成功表达了VP60蛋白[16], 所有表达产物都可以诱导机体产生免疫保护抵抗RHDV的致死攻击。但从目前RHDV基因工程疫苗的研究来看, 仍然存在一些问题比如:不可溶性及免疫效果相对较差的缺点, 生物体的安全以及生产成本的问题。而DNA疫苗和“自杀性”DNA疫苗, 可弥补此类缺陷, 有望为疫苗研制开辟新的途径。原冬伟等[17]制备DNA疫苗pc DNA-VP60, 通过间接免疫荧光试验 (IFA) 和免疫印迹试验 (Western blot) 可检测出表达的重组衣壳蛋白VP60, 通过电镜观察到VP60蛋白可自组装形成病毒样颗粒 (VLPs) , 具有似于自然颗粒的形态。在疫苗效力检验中, 用DNA疫苗免疫的兔子和商用灭活疫苗一样, 均得到全部保护。Cheng Y等[18]使用SFV复制子研究兔瘟“自杀性”DNA疫苗并评估疫苗预防RHDV的效力。实验结果表明保护率达到100%。Qiu L等[19]使用减毒沙门氏菌作为载体通过口服方式递送DNA疫苗来预防RHDV, DNA疫苗质粒pc DNA3.1-VP60, 其编码病毒衣壳蛋白VP60, 被转录到减毒沙门氏菌SL7207中。获得重组菌SL/pc DNA3.1VP60, 通过口服免疫兔子。成功的递送DNA质粒, 通过RT-PCR反应在兔肠中检测到VP60蛋白, 此外, 通过ELISA检测可诱导特异性免疫应答免疫, 兔子攻毒后得到良好的保护。

4 结论

獭兔病毒性出血症病的防控 篇8

1 发病情况

2014 年11 月下旬, 新安县一养殖户马某饲养的500 多只獭兔突然发病, 呼吸急促, 食欲减退, 死亡数量由最初的一天十几只到一天50 ~ 60 只, 呈逐渐上升趋势, 接访时已死亡150 多只。

2 临床症状

发生的病兔大部分是60 日龄左右的獭兔, 突然发病, 精神沉郁, 呼吸急促, 食欲减退, 浑身瘫软, 卧地不起, 倒地抽搐, 鸣叫几声而死, 有的兔尸呈角弓反张, 鼻孔流出鲜红色分泌物, 有的兔尸肛门周围有黄色液体粘附。

3 剖检变化

先后剖检病兔和病死兔十余只, 其病变部位是鼻腔、气管粘膜有小点状出血, 气管充满大量的泡沫状液体, 肺脏出血。心脏外膜和内膜乳头肌周围有小点状出血, 以心房和冠状血管最为严重。肝脏变性, 有出血点, 淤血肿大, 肝脏表面灰白色坏死灶。肾脏肿大, 淤血, 有出血点。脾脏淤血、肿大。胆囊增大, 充满绿色胆汁。胃粘膜脱落, 十二指肠和空肠粘膜有小点状出血。淋巴结肿大, 有针尖状出血点。

4 诊断结果

根据该病的流行特点, 结合临床症状、剖检变化, 初步诊断为兔病毒性出血症, 即兔瘟。为进一步确诊, 又采集了肝脏、肾脏、脾脏等典型病变的器官, 送到河南科技大学进行了实验室诊断, 最后确定为兔瘟。

5 防控措施

5.1 搞好养兔场的环境卫生和消毒工作, 是控制疾病发生的行之有效的措施。兔舍、兔笼、用具及周围环境、粪便等彻底清扫后, 用3% 的氢氧化钠水溶液消毒, 每天消毒2 次, 并及时隔离病兔, 将病死的獭兔作焚烧、深埋无害化处理, 以彻底切断传染源。

5.2 紧急免疫接种。对所有尚未发病的獭兔用南京某动物疫苗的兔瘟单联苗进行了紧急免疫接种, 每只接种4 m L。

5.3 及时隔离病兔。对病兔采取严格的隔离措施, 减少疫情传播。

5.4 配合药物治疗。对全场所有的獭兔用板蓝根饮水, 连用7 d。

经过以上措施, 疫情从防治开始3 d后, 除仍有少量的死亡外, 逐渐得到了控制, 5 d后开始好转, 没有再出现死亡, 整体得到了控制。

6 小结

6.1 本病发病急, 死亡率高, 传播快, 又无特效的治疗药物, 因此, 应重于预防, 平时搞好自繁自养, 严格检疫, 不从疫区引进种兔。同时, 加强饲养管理, 定期消毒, 搞好环境卫生, 禁止外人进入兔舍。

6.2 做好免疫接种工作。仔兔35 ~ 40 d用兔瘟单联苗免疫接种1 次, 55 ~ 60 d用兔瘟和巴氏杆菌二联苗再加强1 次, 以后每半年1 次。