关键词：
氨基糖苷（精选八篇）
氨基糖苷 篇1
1 氨基糖苷类药物的品种及特征
1.1 氨基糖苷类药物的品种
氨基糖苷类药物含硫酸链霉素、硫酸双氢链霉素、硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸 (盐酸) 大观霉素、硫酸安普霉素、硫酸卡那霉素、硫酸庆大小诺霉素[1]。除硫酸卡那霉素、硫酸庆大小诺霉素外, 其他都有药物残留限量的规定, 使用了以上药物的畜禽产品, 如果其药物残留含量超出限量规定, 则违反相关法律法规。兽药残留超标给我国的动物性食品出口带来很大的经济损失, 兽药残留已经成为国际贸易的绿色壁垒或技术壁垒。
1.2 氨基糖苷类药物特征
(1) 均为有机碱, 能与酸形成盐, 其水溶性好, 性质稳定。 (2) 属杀菌性抗生素, 对需氧革兰氏阴性杆菌作用强, 对厌氧菌无效, 对革兰氏阳性菌作用较弱, 但金黄色葡萄菌较敏感。 (3) 内服极少吸收, 几乎完全从粪便排出, 可作为肠道感染用药, 注射给药迅速而完全[2]。氨基糖苷类的主要作用是抑制细菌蛋白质的合成过程, 可使细菌胞膜的通透性增强, 使胞内物质外渗导致细菌死亡。此类药物为静止期杀菌药。
2 氨基糖苷类药物残留的危害
畜产品药物残留的危害性主要表现在3个方面:一是对人类的健康产生直接危害;二是对动物健康产生危害, 影响畜牧业的发展;三是对国际贸易产生负面影响[3]。
2.1 较强的肾毒性
氨基糖苷类药物主要损害近曲小管上皮细胞, 出现蛋白尿、管型尿、红细胞尿, 严重时出现肾功能减退, 其损害程度与剂量大小、疗程长短成正比, 对动物体造成较大伤害。
2.2 较大的耳毒性
此类抗生素的毒性普遍较大, 主要表现是对第八对颅神经包括前庭和听神经损害[4]。早期的损害可逆, 超过一定程度则不可逆。即氨基糖苷类抗生素使用过量可以引起耳聋。对某些需有敏捷听觉的犬应慎用。
2.3 对神经肌肉阻滞的作用
此类药物可抑制乙酰胆碱的释放, 并与Ca离子络合, 促进神经肌肉接头的阻滞作用。其症状为心肌抑制和呼吸衰竭, 以新霉素、链霉素和卡那霉素较多发生。
2.4 损害肠道的吸收功能
内服可能损害肠壁茸毛而影响肠道对脂肪、蛋白质、糖、铁等的吸收。亦可引起肠道菌群失调, 发生厌氧菌或真菌的二重感染, 动物中兔易发, 忌用。人类长期食用这类残留超标的畜产品将直接造成伤害。
3 氨基糖苷类药物的限量规定
1994年, 农业部首次制定并发布了兽药的最高残留限量标准。2002年又对该标准进行了修订、更新, 发布了第235号公告, 规定了“动物性食品中兽药最高残留限量”。其中氨基糖苷类药物的限量规定如下: (1) 硫酸链霉素和硫酸双氢链霉素在牛奶中的最高残留限量为200μg/kg;在肌肉, 脂肪和肝中的最高残留限量为600μg/kg;在肾脏中的最高残留限量为1 000μg/kg。 (2) 硫酸庆大霉素在牛奶中的最高残留限量为200μg/kg;在牛/猪的肌肉和脂肪中的最高残留限量为100μg/kg, 在肝中的最高残留限量为2 000μg/kg, 在肾中的最高残留限量为5 000μg/kg;在鸡/火鸡的可食性组织的最高残留限量为100μg/kg。 (3) 硫酸新霉素在牛、羊、猪、鸡、火鸡、鸭的肌肉、脂肪、肝中的最高残留限量为500μg/kg, 在肾中的最高残留限量为10 000μg/kg;在牛、羊奶中的最高残留限量为500μg/kg;在鸡蛋中的最高残留限量为500μg/kg。 (4) 硫酸 (盐酸) 大观霉素在牛、羊、猪、鸡的肌肉中的最高残留限量为500μg/kg, 在脂肪、肝的最高残留限量为2 000μg/kg, 在肾中的最高残留限量为5 000μg/kg;在牛奶中的最高残留限量为200μg/kg;在鸡蛋中的最高残留限量为2 000μg/kg。 (5) 硫酸安普霉素禁用于产奶羊及产蛋鸡, 仅限于猪、兔口服使用, 在猪肾中的最高残留限量为100μg/kg。
4 降低氨基糖苷类药物残留的措施
把兽药残留降低到最低限度, 保证动物性食品安全, 这是一项长期而艰巨的任务, 关系到各方面的工作, 从合理使用兽药的角度出发应注意如下主要事项。
4.1 坚持用药记录制度
养殖户必须严格执行兽药使用的登记制度, 对使用兽药的品种、剂型、剂量、给药途径、疗程或添加时间等进行登记, 以备检查和溯源。
4.2 严格遵守休药期规定
药物的休药期受剂型、剂量和给药途径的影响, 联合用药由于药动学的相互作用也会影响药物在体内的消除时间, 遵守休药期规定是降低药物残留的最有效办法。
4.3 避免标签外用药
药物的标签外应用是指标签说明书以外的任何应用, 它包括动物种属、适应症、给药途径、剂量和疗效。一般情况下, 食品动物禁止标签外应用。在某些特殊情况下需要标签外用药时 (如增加剂量) , 必须采取适当的措施避免动物产品的兽药残留, 以保证消费者的安全。
4.4 给足饮水
由于氨基糖苷类主要从尿中排除, 为避免药物积聚, 损害肾小管, 应给患畜足量饮水。
4.5 注意敏感动物
猫对氨基糖苷类的前庭效应极为敏感, 虽为非食品动物, 用药时亦应慎酌。
4.6 孕畜慎用
氨基糖苷类能透过胎盘, 进入胎儿体内, 注射本类药物可能引起新生畜的听觉受损或产生肾毒性, 孕畜慎用。
此外, 《英国兽药典》也收载有硫酸安普霉素[5], 由于其毒性大, 我国禁用于产奶羊及产蛋鸡, 仅限于猪、兔口服使用。
5 结语
氨基糖苷类药物是兽医临床使用较为普遍的抗生素, 同时又具有较大的毒性, 因此使用中必须严格按规范执行, 将药物残留降低到限量范围内, 切实保障人类食用畜产品的安全。
参考文献
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[4]周自永, 王世祥, 等.新编常用药物手册[M] (第二版) ·北京:金盾出版社, 1994.6:446.
氨基糖苷 篇2
研究过氧化氢对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响及抑制动力学.其结果表明,过氧化氢对该酶有显著的抑制作用,随着过氧化氢浓度的增高,酶活力呈指数下降,测出可使酶活力下降50%的过氧化氢浓度(抑制半衰期,IC50)为115mmol/dm3.低浓度过氧化氢对该酶的抑制过程显示为可逆效应.采用底物反应动力学方法研究过氧化氢对该酶的抑制作用动力学并建立动力学模型,测定游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)的微观抑制速度常数k+0和k+0,并加以比较.实验结果(k+0＞k+0)表明底物对酶被过氧化氢的.抑制作用有一定保护作用.过氧化氢可能是通过氧化酶活性中心功能基团而导致酶活性的丧失.
作 者：谢进金 林建成 张继平颜雅雯 王勤 陈清西 XIE Jin-jin LIN Jian-cheng ZHANG Ji-ping YAN Ya-wen WANG Qin CHEN Qing-xi 作者单位：谢进金,XIE Jin-jin(厦门大学生命科学学院、细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建,厦门,361005;泉州师范学院生物系,福建,泉州,36)林建成,LIN Jian-cheng(厦门市妇幼保健院,福建,厦门,361005)
6岁以内儿童禁用氨基糖苷类抗生素 篇3
氨基糖苷类抗生素包括链霉素、新霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、小诺霉素、西索米星、奈替米星等，具有水溶性好、抗菌谱广、细菌耐药性低、血浆蛋白结合率低、胃肠道吸收差等特点，但是，任何一种氨基糖苷类抗生素都有轻重不等的耳毒性和肾毒性，其中，最令人关注的是氨基糖苷类抗生素的耳毒性问题。
氨基糖苷类抗生素之所以会产生耳毒性，是因为此类药物会损害第八对脑神经，可产生眩晕、耳鸣、耳聋等症状。由于小孩子很难主诉眩晕或耳鸣，因此耳毒性的早期难以察觉，结果就导致听力下降甚至耳聋。氨基糖苷类抗生素的耳毒性往往与使用剂量有关，一般剂量发生率为2.8%，大剂量时可高达44%。值得注意的是，耳毒性有很大的个体差异，有些有耳聋家族史的小儿，即使小剂量、短疗程使用氨基糖苷类抗生素，也可能发生严重的耳毒性。
为此，儿童必须慎用氨基糖苷类抗生素。2001年，中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《小儿急性呼吸道感染抗生素合理使用指南》再次明确:①6岁以内儿童禁用氨基糖苷类抗生素。②6岁以上儿童慎用氨基糖苷类抗生素，在疗效等同或有其他有效抗生素可以代替氨基糖苷类抗生素时，原则上不用氨基糖苷类抗生素。③必须使用氨基糖苷类抗生素时，应监测药物血浓度，最好同时监测听力。④药物剂量要规范，切勿超量。6岁以上儿童的细菌感染，氨基糖苷类抗生素的使用疗程不应超过10～14天。⑤氨基糖苷类抗生素不作为儿童轻、中度感染的首选抗生素，也不作为门急诊一线常规使用的抗生素。
氨基糖苷 篇4
药物不良反应 (ADR) 是指合格药品在正常用法用量的情况下出现的与用药目的无关的或意外的有害反应。氨基糖苷类药物主要作用于细菌蛋白质的合成过程, 合成异常蛋白, 阻碍已合成蛋白的释放, 使细菌细胞膜通透性增加导致一些生理物质的外漏引起细菌死亡, 为一静止期杀菌剂, 且具有良好的抗生素后效应 (PAE) 。从抗菌作用的特点来看, 氨基糖苷类是一类较优良的抗菌药物, 然而该类药物的治疗浓度范围比较窄, 不良反应较常见, 限制了它在临床上的广泛使用。为此, 笔者简要介绍氨基糖苷类药物的不良反应及合理应用, 为临床提供参考, 以防此类不良反应的发生。
1 氨基糖苷类药物的不良反应
1.1 肾毒性
氨基糖苷类药物的肾毒性反应在临床上比较常见, 产生的原因主要是该药物以原形由肾脏排泄, 并通过细胞膜吞饮作用使药物大量蓄积在肾皮质而导致[1]。主要损害部位为近曲肾小管上皮细胞, 但不影响肾小球, 临床表现在可见蛋白尿、管型尿、尿中红细胞、肾小球过滤减少, 严重者可发生氮质血症及无尿等。肾小管的损害程度与药物剂量大小、疗程长短呈正比, 大多数为可逆, 停药后可逐渐恢复, 用药期间应密切监测药物血药浓度。
1.2 耳毒性
耳毒性的机制主要与在内耳淋巴液中药物浓度较高有关, 在临床上主要表现为:前庭功能失调和耳蜗神经损伤, 同时也与患者的肾功能有关, 肾功能减退患者使用氨基糖苷类药物易发生耳毒性, 其程度和发生率与剂量及疗程大致呈正相关。早期变化为可逆的, 但超越一定程度时即不可逆转, 为防止和减少其毒性应避免与其他耳毒性药物 (如大环内酯类药物、万古霉素) 及强效利尿药 (呋塞米、依他尼酸) 合用, 否则可增加耳毒性。
1.3 神经肌肉阻滞
氨基糖苷类药物有类似箭毒样作用, 通过抑制突触前乙酰胆碱 (Ach) 释放与阻断突触后Ach受体, 阻滞神经肌肉传导。表现为骨骼肌松弛, 心肌抑制, 血压下降, 严重时可引起呼吸骤停, 突然死亡的危险, 特别是对于肾功能不全、血钙低下或原患有重症肌无力者。
1.4 过敏反应
以皮疹、药疹、血管神经性水肿为常见[2]。偶尔可发生过敏性休克, 发生率虽低, 一旦发生病死率高, 约占发生者的20%, 因此使用前应询问病史。
1.5 其他
此外, 部分药物还可产生二重感染、造血系统毒性反应及肝功能损害等, 表现为食欲下降、恶心、恶吐, 少数还出现粒细胞, 白细胞减少及黄疸, 停药可恢复正常。
2 氨基糖苷类药物的合理应用
2.1 严格掌握适应证
防止药物滥用, 不宜作抗感染常规用药, 疗程不宜过长, 特别是严密观察不良反应的早期表现, 做到及时停药换药, 避免不良反应的出现。
2.2 注意不良反应的特点
耳毒性和肾毒性是氨基糖苷类药物最主要的不良反应, 一旦出现, 应立即处理。氨基糖苷类药物主要经肾脏排泄, 严重肾功能不全者应慎重并减量使用, 妊娠早期禁用 (以免药物通过胎盘而损害胎儿听神经造成先天性耳聋) , 哺乳期妇女不宜使用, 如必须应用宜暂停哺乳。
2.3 给药方法的影响
大部分氨基糖苷类药物具有浓度依赖性和抗生素后效应 (PAE) [3], 其每天1次给药所引起的毒性反应低于1d多次给药或持续静脉给药, 对肾皮质的药物蓄积量也低, 但因氨基糖苷类药物的毒性反应与机体的状态有关, 老年人或有其他严重全身疾病的患者仍以多次给药为宜。
2.4 注意药物相互作用
氨基糖苷类药物与其他药物联合使用可产生协同作用, 也可产生拮抗作用, 如氨基糖苷类和β-内酰胺类药物联合应用时抗菌活性和PAE均呈协同效应而抗胆碱酯酶药 (新斯的明) , 可以拮抗某些氨基糖苷类药物的神经肌肉阻滞作用[4]。在临床应用中应加强病种与氨基糖苷类药物的选择, 防止滥用, 注意药物之间的相互作用, 在保证疗效的同时避免配伍禁忌的发生, 以促进临床安全合理用药。
3 小 结
近年来, 随着各种高效低毒抗菌药物不断进入临床, 加上存在确切的耳毒性和肾毒性等不良反应, 氨基糖苷类药物的临床应用受到一定的限制。但其疗效确切、给药方便、价格低廉等优点, 仍然是临床上很重要的的抗感染药物, 甚至在与β-内酰胺类抗菌药物或万古霉素等糖肽类抗菌药物联合使用中用于治疗需氧革兰阴性杆菌和阳性菌所致的严重感染中有着不可替代的地位[5]。氨基糖苷类药物的不良反应对人体所造成的损害, 既可能是短暂的可逆性的功能损害, 也可能为长期的不可逆的器官性病变。为减少其不良反应, 发挥最大的临床疗效, 我们必须严格遵守合理应用抗菌药物的原则, 深入了解氨基糖苷类药物的抗菌谱、药动学、药效学以及患者自身的具体病情进行合理用药, 一旦发生不良反应立即停药, 妥善处理, 避免不良后果的发生, 保证患者的用药安全。
参考文献
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氨基糖苷 篇5
为了解我院产ESBLs肺炎克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶基因存在状况,现对35株分离自患者的肺炎克雷伯菌进行aac(3)-Ⅰ,aac(3)-Ⅱ,aac(6')-Ⅰ,aac(6')-Ⅱ,ant(3")-Ⅰ,ant(2")-Ⅰ共6种氨基糖苷类修饰酶基因检测研究。现报告如下:
1材料与方法
1.1菌株来源与鉴定
35株肺炎克雷伯菌均分离自我院住院患者2004年1月-2006年3月医院感者各种标本。其中痰液14份,血液16份,中段尿3份,咽拭子2份。采用美国Dade MicroScan公司微生物鉴定系统菌种。
1.2药敏试验
采用符合美国临床实验室标准化委员会NCCLs2004年版要求的美国Dade公司Walkaway-40全自动微生物鉴定系统进行检测,并进行ESBLs确认试验。质控菌株为:大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC 700603。购自卫生部临检中心。
1.3 AMEs基因检测
采用聚合酶链反应(PCR)法。6种AEMs基因引物序列见表1[5]。
PCR摸板提取:挑菌落少许置内含100ul生理盐水的0.5ml离心管内,15000(rmp)离心5分钟,吸取上清液,加裂解液A 50ul,B 2ul,混匀置55℃水浴消化1h,改置95℃水浴灭活5分钟。15000(rmp)30s,上清液即为扩增的模板液。总反应体积20ul(其中模板液5ul)。热循环参数均为93℃预变性2分钟,然后93℃30S-55℃30S-72℃60S,循环35周期,最后一个72℃延长至2分钟。产物经2%琼脂糖凝胶电泳,出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性,并摄像保存。
2结果
2.1抗菌药物敏感性试验结果见表2。
2.2 AMEs基因检测结果
本组35株KPN共有26株(74.3%)检出氨基糖苷类修饰酶基因,其中aac(3)-Ⅰ阳性4株(11.8%),aac(3)-Ⅱ阳性7株(20.6%),aac(6')-Ⅰ阳性13株(37.1%),aac(6')-Ⅱ阳性7株(20%),ant(3")-Ⅰ阳性11株(31.4%),ant(2")-Ⅰ阳性12株(34.3%)。携带1种AMEs基因的有7株,携带2种AMEs基因的有11株,携带3种AMEs基因的有7株,携带4种AMEs基因的有1株。部分PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1,2.
[M:分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:阳性对照,N:阴性对照,S:标本阳性]
[M:分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:阳性对照,N:阴性对照,S:标本阳性]
3讨论
超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)是由质粒介导的能使细菌对三代头孢菌素,青霉素类及单酰胺类抗生素耐药的一类酶,ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生[6]。由于第三代头孢菌素的大量使用,肠杆菌科细菌ESBLs的产生率显著增高并广泛传播[7]。肺炎克雷伯菌为其代表菌属。ESBLs在菌株间的转移和传播使其耐药性成为突出问题。
本实验35株KPN均为产ESBLs菌株,药敏试验显示对氨基糖苷类,喹诺酮类,β-内酰胺类均有不同程度的耐药。其中氨基糖苷类的耐药率为12%～57%,6种氨基糖苷类修饰酶基因检出率为11.4%～37.1%。共有26株检出氨基糖苷类修饰酶基因(74.3%)。本文氨基糖苷类修饰酶基因检出率高于药物敏感试验的耐药率。这可能与经修饰后的抗菌药物仍具有相当的抗菌活性有关[8]。
一株KPN可携带一种或多种AMEs基因,但部分菌株即使获得多个基因,并不都对3种氨基糖苷类药物表现出更强的耐药性,这可能由于AMEs基因的表达程度,细菌的产酶量和不同抗菌药物的抗菌活性及其对酶的稳定性差异所致[9]。其中有9株未检出AMEs基因,但4株表现为耐药,可能存在其他AMEs基因或耐药机制。不同的氨基糖苷类可为同一种酶钝化,而同一种抗生素又可为多种酶钝化。另外,不同抗生素被修饰的速度不同,其产生耐药情况不同,如妥布霉素被修饰的速度仅为庆大霉素的1/4,故临床产aac(3)AMEs的菌株对庆大霉素耐药,但对妥布霉素仍敏感[10]。
综上所述,细菌耐药机制较为复杂,有待进一步研究,而对耐药基因的研究为耐药性监测提供了分子生物学依据,对指导临床合理使用抗生素具有重要的意义。
摘要：目的了解临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肺炎克雷伯菌的耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因的存在状况。方法对临床分离的35株产ESBLs肺炎克雷伯菌采用聚合酶链反应技术(PCR)检测6种氨基糖苷类修饰酶aac(3)-Ⅰ,aac(3)-Ⅱ,aac(6')-Ⅰ,aac(6')-Ⅱ,ant(3")-Ⅰ,ant(2")-Ⅰ。结果该35株肺炎克雷伯菌检出:aac(3)-Ⅰ阳性4株(11.8%),aac(3)-Ⅱ阳性7株(20.6%),aac(6')-Ⅰ阳性13株(37.1%),aac(6')-Ⅱ阳性7株(20%),ant(3")-Ⅰ阳性11株(31.4%),ant(2")-Ⅰ阳性12株(34.3%)。共有26株(74.3%)检出AMEs。同一菌株可产生两种或两种以上的氨基糖苷类修饰酶基因。结论临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶基因携带率高。
关键词：肺炎克雷伯菌,氨基糖苷类修饰酶,基因
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氨基糖苷 篇6
关键词：氨基糖苷类抗生素,联合用药,不良反应
氨基甙类抗生素系指化学结构中含有二个或三个氨基糖分子和一个氨基脂环由配糖键相连接而成的含多个阳离子的甙类抗生素, 如庆大霉素、丁胺卡那霉素、西索米星、奈替米星等。其特点为性质稳定, 抗菌谱广, 故应用广泛。联合用药较多, 缺乏一定合理性, 先分析如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2009年3月至2010年2月, 随机抽查应用抗生素病历1200份, 其中联合应用氨基糖苷类抗生素220份;男126例, 女94例;年龄16~78岁, 平均57.8岁;其中60岁以上46例;疾病种类:消化道感染及手术86例, 呼吸系34例, 泌尿系26例, 骨科及外伤64例, 肿瘤及其他30例。
1.2 方法
根据《抗菌药物临床应用指导原则》和有关合理用药的规定, 分别统计氨基糖苷类抗生素与β-内酰胺类, 大环内酯类, 四环素类, 喹诺酮类, 抗肿瘤药及其他药物的联合应用, 并进行相关合理性分析。
2 结果
2.1 氨基糖苷类抗生素与其他药物联合应用分类
氨基糖苷类之间合用4例;与β-内酰胺类抗生素合用90例;与大环内酯类合用60例, 与喹诺酮类合用26例;与抗肿瘤药合用18例;与利尿剂等合用22例。
2.2 不良反应
耳毒性4例, 肾毒性6例, 神经肌肉麻痹3例, 过敏反应5例。
3 讨论
3.1 氨基糖苷类抗生素作用机制及特点
氨基糖苷类抗生素作用机制为直接作用于细菌核糖体, 抑制细菌蛋白质合成, 破坏细菌胞浆膜的完整性而达到杀菌作用;对各种需氧革兰阴性杆菌包括大肠埃希菌, 铜绿假单胞菌, 变形杆菌, 克雷伯菌属, 肠杆菌, 志贺杆菌, 绝缘酸杆菌属均有强大的杀菌活性;对沙雷菌属, 沙门菌属, 产碱杆菌属和嗜血杆菌属也有一定抗菌作用;对脑膜炎奈瑟菌等革兰阴性球菌作用较差;对肠球菌和厌氧菌不敏感。氨基糖苷类抗生素杀菌特点是:杀菌速率和杀菌持续时间与浓度呈正向关;但仅对需氧菌有效, 且抗菌活性且显著强于其他类药物;具有初次接触效应, 即细菌首次接触氨基糖苷类时, 能被迅速杀死[1]。
3.2 氨基糖苷类抗生素联合应用分析
3.2.1 氨基糖甙类药物之间合用
本类药物抗菌谱相似, 具有相同的毒性反应, 对耳及肾脏的毒性成线性增加。本组4例联合用药, 因而为不合理联合用药。
3.2.2 氨基糖苷类与青霉素类或头孢菌素类合用
氨基糖苷类为静止期杀菌剂, 后二者为繁殖期杀菌剂, 此类药物联用, 产生协同作用, 但后两者与氨基糖甙类混合后, 分子内的β-内酰胺环会和氨基糖连结聚合, 使两者的抗菌性降低, 故联用时不宜同时注射, 应先用繁殖期杀菌剂, 0.5~1 h后再用静止期杀菌剂。本组联合用药90例, 毒性反应虽不明显, 但氨基糖甙在和头孢菌素联合使用会增加对肾脏的副作用, 联用时应注意患者的情况, 密切监测肾功能的改变。
3.2.3 与大环内酯类抗生素合用
氨基糖甙类和大环内酯类合用可能对链球菌有协同作用。可使大环内酯类药物作用加强。但大剂量的大环内酯类药物应用后会引起耳鸣和暂时性听觉障碍, 且伴有肾功能减退。两者合用时应注意是否有耳鸣和听觉障碍症状, 若有此症状应立即停药, 否则会造成耳聋。本组2例出现耳鸣, 停药后症状消失。
3.2.4 氨基糖苷类与喹诺酮类合用
二者均为杀菌剂, 且对革兰阴性菌作用较强, 不主张二者联合, 一般提倡与青霉素或头孢类合用。
3.2.5 氨基糖苷类和抗肿瘤药、钙剂及其他合用
钙剂能与庆大霉素竞争血浆蛋白的结合部位, 可使游离型的庆大霉素增多, 而致使药物作用和毒性均增强。同时可以引起游离钙减少, 诱发神经肌肉接头病变, 导致无力和麻痹。抗肿瘤药如顺铂、紫杉醇等均有不同程度的肾毒性和耳毒性作用, 应注意检测。
3.3 氨基糖苷类药物的不良反应
3.3.1 肾毒性
氨基糖苷类抗生素是诱发药源性肾衰的最常见原因, 此类药物虽经肾小球滤过, 但对肾组织有极高亲和力, 通过细胞膜吞饮方式而大量聚集在肾皮质, 导致肾小管, 尤其是近曲小管上皮细胞溶酶体膜破裂, 线粒体损坏, 钙调节转运过程受阻, 则引起肾小管肿胀, 严重产生急性坏死[2]。本组6例出现肾毒性表现。肾毒性与剂量、疗效长短呈正向关系, 尿液变化一般在用药后3~6 d发生, 大多数为可逆性, 停药后可逐渐恢复, 应用时应及时检测肾功能变化。
3.3.2 耳毒性
该药物对第Ⅷ对脑神经选择性损害部位不同, 临床表现也不同。可分为:①耳蜗神经损害, 出现耳胀满感、头晕、耳鸣、听力下降, 甚至耳聋;②前庭功能失调, 可出现平衡失调、眩晕、恶心、呕吐、眼球阵颤。但这两类症状并非绝对, 有可能两者兼有。有时临床自觉症状不明显, 需要仪器检查前庭功能或听力才可发现, 这些“亚临床耳毒性反应”的发生率约为10%~20%[3]。
3.3.3 神经肌肉阻滞
氨基糖苷类药物产生神经肌肉阻滞的机制是由于药物抑制突触前的乙酰胆碱 (Ach) 释放与阻断突触后的Ach受体所致。这一现象虽然少见, 但危险性较大。临床表现为手足麻木, 舌颤, 甚至全身抽搐, 有时很难与脑膜炎惊厥相区别。氨基糖苷类与肌肉松弛药安定等合用可加重反应。
3.3.4 造血系统毒性反应
丁胺卡那霉素, 卡那霉素、庆大霉素可引起白细胞减少。当与抗肿瘤药及非甾体类消炎药等联合应用时, 毒性反应加剧。
3.3.5 过敏性反应
临床表现主要为过敏性休克, 皮疹, 过敏性紫癜, 血管神经性水肿, 过敏致死。喹诺酮类药物具有光敏反应, 二者联合过敏反应机率增加。
4 防治对策
氨基糖苷类药物具有明显的耳毒性和肾毒性等, 为减少不良反应及对毒副作用, 临床医生必须掌握氨基糖苷类药物的适应证、禁忌证, 药代动力学和不良反应。注意配伍用药, 两种氨基糖苷类抗生素不宜同时应用或前后连续局部或全身应用;不宜与其他耳、肾毒性药物合用;及早发现不良反应, 及时停药并采取相应治疗。
总之, 氨基糖苷类药物具有耳、肾毒性, 联合用药时以增加疗效, 降低毒副作用为原则。
参考文献
[1]杨宝峰, 苏定冯.药理学.人民卫生出版社, 2003:416-419.
[2]胡华成, 刘丽诗.氨基糖苷类抗生素不良反应.医师进修杂志, 2005, 28 (11) :3-4.
氨基糖苷 篇7
关键词：槐猪,精液,N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 (NAGase) ,功能基团,化学修饰
槐猪是广泛分布于闽西南山区的一个优良地方猪品种, 具有耐粗饲、母性好、抗逆性强及肉质风味独特等优点。槐猪作为一种珍贵的生猪品种资源, 对畜牧业可持续发展具有重要作用, 是今后生猪改良的物质基础, 已被列入福建省国家级畜禽品种资源保护名录[1,2]。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 (EC3.3.1.52, 简称NAGase) , 是普遍存在于脊椎动物生殖器官及雄性精液中一种重要的水解酶类, 具有较高的酶活性, 主要水解β-1, 4-糖苷键连接的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷键[3,4,5], 不仅参与糖类物质的分解代谢, 还是糖蛋白、糖脂生物合成中寡糖链的修饰酶, 同时还与糖蛋白的降解有关, 还在精卵结合过程中发挥重要作用[6,7]。试验以地方特色猪品种槐猪精液为材料, 分离、纯化与槐猪生殖、生理密切相关的NAGase, 采用动力学方法及化学修饰法探讨酶活性中心解离基团的性质及必需基团的种类, 对了解酶分子侧链基团的空间构象与酶生物活性的相关性具有重要意义, 为进一步开展酶分子的基因组学及催化作用机理研究提供有效的结构基础, 同时为深入研究槐猪精液中NAGase酶活力的调控作用对精液品质和受精过程的影响提供依据。
1 材料
槐猪精液, 采自福建省上杭县绿琦槐猪育种场;对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷 (p NP-NAG) , 由上海医药工业研究院生产;N-溴代琥珀酰亚胺 (NBS) 、溴代乙酸 (Ac Br) , 由上海阿拉丁试剂有限公司生产;对-氯汞苯甲酸 (PCMB) , 由Carl Roth生产;二巯基苏糖醇 (DTT) 、乙酰丙酮 (AA) 、甲醛 (HCHO) , 由SCRC国药集团化学试剂有限公司生产;其余试剂均为国产AR试剂, 所有溶液均以重蒸水配制。
2 方法
2.1 蛋白质浓度的测定
参照Folin-酚试剂法[8]测定蛋白质含量, 以牛血清白蛋白作为标准蛋白。
2.2 酶活力的测定
参照参考文献[9]的方法稍有改动, 测活p H值为5.7, 以对-硝基酚 (p NP) 作为产物对照。酶活力单位 (U) 定义:在37℃条件下, 每升溶液中每分钟催化产生1μmol p NP所需的酶量。
2.3 酶的提取
取于-20℃条件下保存的猪精液若干, 放置于4℃条件下解冻, 超声破碎精子细胞, 通过纱网过滤去除胶状物获得原精浆。按1∶1的比例加入4℃预冷的0.01 mol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris) -HCl缓冲液 (p H值为7.4, 内含0.2 mol/L Na Cl) 抽提离心, 得到酶的提取液。依次采用35%~70%硫酸铵分级分离、DEAE-32阴离子交换柱、Sephadex G-200分子筛柱和CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析纯化, 获得聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳单一纯的NAGase制剂。
2.4 酶活性中心解离基团性质的研究
2.4.1 酶活性中心解
离常数p Ke值的测定以p NP-NAG为底物, 固定反应温度为37℃, 在0.2 mol/L不同p H值 (4.76, 4.94, 5.12, 5.30, 5.48, 5.60) 的Na Ac-HAc测活体系中, 通过改变底物[S]浓度, 研究p H值对酶催化底物水解反应动力学参数的影响。以Lineweaver-Burk双倒数法作图, 比较不同p H值对酶催化反应动力学参数的影响, 判断其作用机理。以p H值为横坐标, p Km或lg Vm值为纵坐标进行二次作图, 可求出酶活性中心解离常数p Ke值。
2.4.2 酶活性中心解离热焓ΔHo的测定
按照2.4.1的方法, 改变反应温度 (35~45℃) , 测定不同温度条件下酶活性中心解离常数p Ke值, 以p Ke值对1/T作图得线性关系, 由直线斜率可求出酶活性中心解离热焓ΔHo, 进一步确定酶活性中心的解离基团。
2.4.3酶活性中心必需基团的化学修饰
采用特异性较强的化学修饰剂与槐猪精液NAGase在特定的环境下保温处理一段时间后, 在正常测活体系下测定酶活力, 通过探讨酶的剩余活力与修饰剂的关系, 判断酶活性中心必需基团的种类。
3 结果与分析
3.1 p H值对酶催化p NP-NAG水解反应的效应
固定反应体系温度为37℃, 在不同p H值的测活体系中, 改变底物p NP-Glc NAc浓度, 测定酶促反应的初速度, 用Lineweaver-Burk双倒数法作图, 结果见图1。
1~6.表示p H值分别为4.76, 4.94, 5.12, 5.30, 5.48, 5.60。
由图1可知, 得到一组相交于纵坐标轴上的直线, 表明在p H值为4.76~5.60区域, H+只影响米氏常数Km值, 而对最大反应速度Vm值没有影响。随着H+浓度的增加, Km值逐渐增大, 而Vm值保持不变, 酶对底物的亲和性减小, 并且在此p H值区域, 各直线交于纵轴上的一点, 说明H+对槐猪精液NA-Gase催化p NP-Glc NAc水解反应的效应表现为竞争性抑制作用。
3.2 酶活性中心的解离常数
根据3.1的结果, 在p H值为4.76~5.60区域内, H+对酶催化p NP-Glc NAc水解反应表现出竞争性抑制作用, H+和底物[S]竞争酶的底物结合部位, 参照参考文献[10], 其动力学模型可以简化为:
其动力学方程推导结果为:
。式中:Ks表示酶和底物络合物 (EHS) 的解离常数, Ke表示酶活性中心的解离常数, 为米氏常数。应用极限原理分析 (2) 可知:时, 两边取负对数得时, 两边取负对数得
根据公式 (3) 和 (4) , 以对p H值作图, 并画出斜率分别为0和1的2条切线, 其交点所对应的p H值即为酶活性中心的解离常数p Ke值, 结果见图2。
由图2可知, 槐猪精液NAGase酶活性中心解离常数p Ke值为5.29。
3.3 酶活性中心的解离热焓
不同温度 (35~45℃) 条件下测定不同p H值缓冲体系中酶催化p NP-Glc NAc水解反应的动力学参数, 根据3.2的方法求出与温度相对应的酶活性中心解离常数p Ke值, 结果见表1。
根据Vant Hoff公式积分得:
。式中:ΔHo为标准解离热焓, R为气体常数 (R=8.28×10-3k J/mol) , 以p Ke值对1/T作图得线性关系, 结果见图3。
由图3可知, 通过直线斜率可求出槐猪精液NAGase酶活性中心的标准解离热焓ΔHo为30.46 k J/mol。
3.4 酶活性中心必需基团的化学修饰
在反应体系中加入一定条件下与不同浓度的化学修饰剂保温处理30 min后的酶液, 其相对酶活力变化, 结果见表2。
%
由表2可知, 在不同浓度下, DTT、PCMB、Br Ac和NBS均能有效对酶进行修饰, 使酶活力迅速下降, 导致酶活力下降1/2所需的浓度IC50分别为1.8 mmol/L、0.3 mmol/L、96.0 mmol/L、22.0 mmol/L, 说明酶分子链内二硫键、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基及色氨酸的吲哚基是酶活性的功能基团。甲醛在低浓度下对酶的修饰作用不明显, 当其浓度达到400 mmol/L时, 酶活力仅丧失9.86%, 结果表明, 酶分子中赖氨酸的ε-氨基与酶活力存在一定的关系, 可能与维系酶活性中心的特定构象有关。而氨基酸在0~100 mmol/L范围内, 对酶活性没有明显影响, 说明精氨酸的胍基与酶活力不存在相关性。
4 讨论
不同酶的氨基酸序列是不同的, 因此酶分子中可解离基团的性质也不同。随着环境p H值的变化, 这些基团将处于不同的解离状态。侧链基团的不同解离状态既可以影响底物的结合和进一步的酶催化反应, 又可以影响酶的空间构象, 从而影响酶的催化活性。研究p H值对槐猪精液NAGase催化p NP-GlcNAc水解反应的机制, 有助于进一步了解酶活性中心解离基团的性质。
在p H值为4.76~5.60区域内, 测得与槐猪精液NAGase活性相关的可解离基团的解离常数p Ke值为5.29, 这与蛋白质分子中常见的β或γ-羧基的解离常数 (3.0~5.0) 以及组氨酸残基咪唑基的解离常数 (5.5~7.0) 很相近[10]。为进一步确定p Ke值为5.29的基团, 研究了温度对酶活性中心解离基团p Ke值的影响, 求出酶活性中心解离基团的标准解离热焓ΔHo为30.46 k J/mol, 这与组氨酸残基咪唑基的解离热焓 (28.9~31.4 k J/mol) 很相近, 在该范围内, 而远离于β或γ-羧基的解离热焓[10]。同时, NA-Gase经溴代乙酸化学修饰后酶活性丧失, 表明咪唑基是酶活性中心的必需基团之一, 这与锯缘青蟹内脏来源的NAGase所表现的结果一致[11], 因此得出槐猪精液NAGase活性中心的可解离基团是组氨酸的咪唑基。
氨基糖苷 篇8
目前国内外检测此类抗生素的方法主要有微生物法[1]、免疫分析法[2]、气相色谱法和质谱法, 液质联用法是目前检测此类抗生素最广泛的的方法[3]。但是由于氨基糖苷类药物易溶于水, 极性很强, 在C18柱上保留很弱, 且无紫外吸收, 目前使用最多的是通过加入离子对试剂增强保留, 动物源食品基质复杂, 给目标物的定性和定量检测带来很大的难度, 目前文献报道的方法前处理步骤繁琐, 整个检测周期长, 基质效应较为严重[4], 很难获得良好的峰型和分离。
本方法通过改变前处理方式, 优化质谱条件, 能够缩短检测时间, 有效去除不同基质样品带来的基质效应, 同时避免七氟丁酸等离子对试剂对仪器造成的污染及离子抑制问题。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent6460液相色谱串联三重四级杆质谱仪, 配有电喷雾 (ESI) 离子源 (美国Agilent公司) AR2140电子分析天平, KS-300EI超声波清洗器 (宁波海曙科生超声设备公司) 、Centrifug-5804R台式离心机 (德国Eppendorf) , N-EVAP 11氮吹仪 (美国Organomation associates Inc) , milli-Q纯水仪 (美国millpore公司) chun GX-274固相萃取装置, Oasis HLB SPE (3cc/6mg, 美国Waters) 。
乙腈, 色谱纯。甲酸, 色谱纯。三氯乙酸:纯度≥99%。10种标准品 (纯度90.0%~100%) :Dr.Ehrenstorfer德国。分别称取10mg氨基糖苷类药物标准品, 用水溶解, 配置成浓度为100μg/m L的标准储备液, 于-18℃避光保存。用空白基质样品配置成不同浓度系列的混合标准工作溶液 (现配现用) 。
1.2 实验条件
1.2.1 样品前处理
称取样品约5.00g (精确至1 mg) , 置于50.0m L离心管中, 加入10.0m L5%三氯乙酸, 涡旋30s, 超声提取15min, 10 000r/min离心, 1min, 倒出上清液于50m L离心管, 残渣重复提取一遍, 合并上清液, 备用。
净化:分别用3.0m L甲醇, 3m L水, 3m L5%三氯乙酸淋洗后, 准确将20m L提取液放入小柱, 先用5m L水溶液淋洗, 再用6m L甲醇洗脱, 收集洗脱液于试管中, 氮吹至近干, 用0.1%甲酸乙腈 (3+7) 定容至1.0m L, 漩涡混匀, 过0.22μm微孔滤膜, 液相色谱-质谱/质谱测定。
1.2.2 色谱条件
色谱柱:SILICA SG80 S5;2.0mm i.d.×150mm
流动相:A:0.1%甲酸 (5mol/L乙酸铵) B:CH3CN, 0.1%HCOOH
B%70% (0min) ->70% (2min) ->10% (6min) ->10% (8min) ->70% (12min)
流速:0.3m L/min
温度:35℃
进样量:5μL
1.2.3 质谱条件
离子源:电喷雾离子源 (ESI+) 。
喷雾压力:40psi。
干燥气流速:10L/min。
干燥气温度:350℃。
毛细管电压:4 000V。
*:定量离子对。
2 结果与讨论
2.1 提取和净化条件的优化
动物肌肉组织和牛奶样品基质复杂, 有很多内容源性的物质干扰分析测定, 因此, 必须对样品的提取和净化方法进行适当的优化, 我们比较了不同浓度的三氯乙酸, 发现20m L5%的三氯乙酸不仅可以充分的提取目标物, 而且也能有效的沉淀样品中的蛋白, 也防止高浓度的三氯乙酸污染质谱仪器。
Oasis HLB固相萃取柱是亲水亲酯平衡的反相萃取柱, 是一种可适用于酸性, 中性, 碱性化合物的通用性萃取柱, 实验证明Oasis HLB固相萃取柱对氨基糖苷类药物萃取效率较高, 净化效果好。本方法对洗脱液的用量和类型进行了考察, 选择甲醇作为洗脱液, 得到了理想的效果, 并优化了洗脱液的体积, 采用6m L甲醇能够完全把目标物质洗脱下来。
2.2 色谱条件的优化
由于氨基糖苷类药物易溶于水, 极性很强, 在C18柱上保留很弱, 目前国标方法中大多采用七氟丁酸等改性剂来增强该类物质的保留[4], 确实能获得分离度及对称因子较好的峰型, 但是对于仪器的污染非常严重, 会显著抑制负离子模式的响应, 仪器的背景噪音会非常高。也有相关文献采用HILIC色谱柱等亲水性色谱柱来分离此类药物, 但是笔者经过试验发现此类色谱柱重现性较差, 平衡时间长, 不利于大批量检测工作的开展。本实验采用SILICA SG80 S5色谱柱是普通硅胶柱, 采用常用的甲酸乙酸胺-乙腈体系就能获得理想的分离度和灵敏度。通过考察不同浓度乙酸铵-乙腈体系, 发现0.1%甲酸5mo L/L乙酸铵-乙腈体系分离效果和响应最好, 故以此作为流动相, 并通过优化梯度, 10种药物在15min内全部出峰, 其总离子流图详见图1。
2.3 质谱条件的优化
质谱条件的优化用直接接二通方式进行, 用0.3m L/min的流速将氨基糖苷类药物注入电喷雾离子源, 进行一级质谱分析得到相应的分子离子峰, 对分子离子峰进行二级质谱 (子离子) 扫描, 获得二级质谱信息, 然后对裂解电压及碰撞能进行优化, 使分子离子和特征子离子强度达到最佳, 然后进一步优化毛细管电压, 雾化器压力, 干燥器温度和流速等质谱参数使离子化效率达到最佳, 具体参数见表1。
2.4 线性关系和检出限的考察
在本文所确定的色谱和质谱条件下, 对氨基糖苷类药物进行测定, 用空白基质配置一系列浓度分别为20, 50, 100, 200, 500, 1 000ng/m L, 以目标物浓度为横坐标 (X) , 对应的响应值为纵坐标 (Y) , 进行线性回归, 线性回归方程、线性关系, 检出限和线性范围分别见表2。
2.6 方法回收率和精密度验证
对阴性样品分别进行3个浓度6次加标回收试验考察回收率和精密度, 结果见表3。
由表3可知, 样品平均回收率在76.5%~86.9%之间, 相对标准偏差为2.3%~4.9%, 本方法具有较高的精密度和准确度。
3 实验结论
本文建立了HPLC-MS/MS法测定动物肌肉组织和牛奶中1 0 种氨基糖苷类药物的的检测方法。优化了前处理提取, 净化, 色谱和质谱条件, 改变了氨基糖苷类抗生素在色谱柱上的保留行为, 使氨基糖苷类抗生素与其它内源性的干扰物有良好的分离。该方法简单、灵敏度高、专属性强在浓度为20~1 000ng/m L时具有良好的线性和精密度。
参考文献
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[2]王忠斌.氨基糖苷类药物多残留酶联免疫分析方法的研究[J].中国食品学报, 2008, 8 (5) :120-125.
[3]周晓溪, 姚羽.氨基糖苷类抗生素的分析方法进展[J].China pharmacist, 2004, 7 (2) :142-144.
