细胞黏附因子-1

关键词： 母婴

细胞黏附因子-1（精选八篇）

细胞黏附因子-1 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年1月~2012年6月在我院产科住院妊娠满28~37周分娩的PROM孕妇80例为观察组, 平均年龄 (28.98±3.36) 岁。根据胎膜破裂的时间, 再分为足月PROM组 (发生在孕37周前) 与未足月PROM组 (发生在孕37周及37周后) , 其中足月PROM组49例, 平均年龄 (28.98±3.20) 岁, 未足月PROM组31例, 平均年龄 (28.97±3.65) 岁。选取同期住院未临产、因骨盆狭窄和 (或) 社会因素而行选择性剖宫产的正常孕妇40例为对照组, 平均年龄 (28.68±3.43) 岁, 两组均为单胎初产。两组一般资料比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 孕妇血清标本的采集

所有孕妇取血时均无宫缩, 取肘静脉血5 m L分离血清, -40℃冰箱中保存待测。

1.2.2 胎膜标本的采集

胎盘娩出后取离胎膜破口5 cm以上的胎膜组织2 cm×3 cm×0.5 cm, 10%甲醛固定, 常规石蜡包埋, 室温保存待病理学检测。

1.2.3 检测方法

IL-6、IACM-1试剂盒由北京邦定公司提供, 采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测。按试剂盒的说明书配制试剂和缓冲液, 拟合标准曲线, 测定并换算出样本中出IL-6、IACM-1水平的含量。

1.3 诊断标准

1.3.1 PROM诊断标准

(1) 孕妇自觉有大量液体自阴道流出, 阴道窥器见液体自宫颈流出或后穹隆较多积液中见胎脂样物质; (2) 阴道液p H>7; (3) 阴道液涂片烘干后镜检可见羊齿植物状结晶; (4) 羊膜镜直视胎儿先露部分, 看不到前羊膜囊[4]。

1.3.2 胎盘绒毛膜羊膜炎病理诊断标准

绒毛膜及羊膜组织中中性粒细胞浸润每高倍视野5~10个为轻度;11~30个为中度;>30个为重度[5]。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差表示, 多组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组各亚组与对照组血清IL-6、IACM-1比较

本研究结果提示, 观察组孕妇血清IL-6、IACM-1浓度高于对照组, 未足月PROM组血清IL-6、IACM-1浓度高于足月PROM组, 差异均有高度统计学意义 (均P<0.01) 。见表1。

注:与对照组比较, *P<0.01;与足月PROM组比较, ◆P<0.01

2.2 观察组内不同绒毛膜羊膜炎组IL-6、IACM-1比较

将观察组按绒毛膜羊膜炎病理程度分为PROM未感染组、PROM轻度感染组和PROM中度感染组, 比较各组母血IL-6、IACM-1水平。其中, PROM中度感染组母血IL-6、IACM-1水平高于PROM未感染组及PROM轻度感染组, 差异均有高度统计学意义 (均P<0.01) ;观察组内PROM未感染组与观察组内PROM胎膜绒毛膜羊膜炎轻度感染组母血IL-6、IACM-1水平差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

注:与PROM未感染组比较, ◆P<0.01;与PROM轻度感染组, △P<0.01

3 讨论

PROM是妊娠中晚期常见的产科并发症, 其中母体生殖道感染及其引起的宫内感染是其发生的主要原因。有研究指出一旦胎膜破裂超过24 h, 胎儿可能受到阴道菌群的上行感染导致羊膜、脐带以及胎盘炎症, 胎儿可能吸入被感染的羊水发生全身感染导致死胎、早产或新生儿败血症[6]。PROM与感染关系密切且与新生儿的发病率与死亡率有关, 我国新生儿败血症的死亡率高达12.0%~20.5%, 所以密切监测及预防PROM患者宫内感染是降低新生儿感染率的一项重要措施。

目前用于监测PROM是否存在感染常用的临床指标包括:母体体温、心率、白细胞计数、C反应蛋白 (CRP) 、阴道分泌物味臭、脓性等指标, 这些指标出现晚且多数孕妇呈现亚临床表现症状不典型, 给早期诊断带来许多困难。绒毛膜羊膜炎的临床征象常出现在宫内感染的晚期且组织学上有绒毛膜羊膜炎的患者中仅有25%出现临床征象[7], 所以寻找有效的预测感染监测指标是目前亟待解决的关键问题, 有研究认为, CRP对预测PROM并发新生儿感染有一定的特异性和敏感性, 对绒毛膜羊膜炎的预测价值高[8], 但也有研究指出新生儿感染与CRP、白细胞及中性粒细胞值无明显相关性[9]。

IL-6属于由单核细胞、内皮细胞、巨噬细胞等产生的炎症细胞因子, 参与机体炎性反应和创伤愈合。正常妊娠妇女由于宫内蜕膜和绒毛组织富含单核细胞成为其羊水及血中IL-6的重要来源。病理情况下如羊膜腔感染发生时除蜕膜和绒毛以外大量的炎症细胞将产生更多的IL-6[10]。本研究结果提示, 观察组孕妇血清IL-6浓度高于对照组, 观察组未足月PROM组孕妇血清IL-6浓度高于观察组足月PROM组, 差异均有高度统计学意义 (P<0.01) 。将观察组按绒毛膜羊膜炎病理程度分为PROM未感染组、PROM轻度感染组和PROM中度感染组, 比较各组母血IL-6、IACM-1水平。其中, PROM中度感染组母血IL-6、水平高于PROM未感染组及PROM轻度感染组, 差异均有高度统计学意义 (P<0.01) ;观察组内PROM未感染组与观察组内PROM胎膜绒毛膜羊膜炎轻度感染组母血IL-6水平差异无统计学意义 (P>0.05) , 说明IL-6升高是羊膜腔感染的标志, IL-6的升高出现临床症状之前并且随破膜时间延长病原体入侵机会增加感染加重其含量也会逐渐增加[11]。

细胞黏附因子-1 篇2

关键词： 家蚕；miRNAs；丝腺转录因子；SGF-1；功能鉴定

中图分类号： S881.2；Q78 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0053-06

microRNAs（miRNAs）作为重要的基因转录后表达调控因子，参与包括发育、代谢、疾病发生等各种重要的生理过程。目前国内外在家蚕miRNAs上开展了相关研究，进行了家蚕miRNAs的鉴定、表达谱分析以及功能预测。至2014年6月，miRBase数据库（http：//www.mirbase.org/）21版本中已记录223个物种的35 828条成熟体miRNAs，并且其数量还在不断增长，其中，在家蚕中共发现487个miRNAs 前体和563个成熟体miRNAs。

大多数miRNAs主要通过与靶基因mRNA 3′端非翻译区（3′UTR）的互补配对，在mRNA或翻译水平负调控靶基因表达[1，2]。目前研究表明，miRNA 的负调控作用不仅存在于靶mRNA 的3′UTR 区，也可发生在5′UTR区[3]。前人研究认为，所有的miRNAs调控作用都是负调控，但Vasudevan等研究发现miRNA具有激活基因表达的作用[4]。Hussain等也通过试验证明除了常见的下调靶基因转录水平，miRNAs能够上调靶基因的转录水平[5]。Miyoshi等还证实了miRNAs除了能够作用于3′UTR外，还能够结合在靶基因的其他位置[6-7]。

miRNA和转录因子（transcription factors，TFs）一样，都能够在转录水平独立调控靶基因的表达水平，而越来越多的研究证明这两者之间能够通过相互作用更精准地对靶基因进行表达调控。通过计算机分析预测，Enright等指出在众多 miRNAs 的潜在靶基因中，TFs作为靶基因的可能性比一般基因大约高出2倍[8]。Cui等在研究基因调控中miRNAs与TFs的相互关系方面也作出了贡献，认为miRNAs更可能靶向含有大量TFs结合位点的基因，而这些基因通常也具有相对更多的miRNAs结合位点[9]。

SGF-1是丝腺特异性细胞因子[10]，存在于中、后部丝腺。SGF-1除了在丝素重链基因（Fib-H）、丝素轻链（Fib-L）和p25基因的上游有其结合位点外，还能与丝胶Ser1基因上游的SA区域结合[11]，说明SGF-1对家蚕丝蛋白基因的表达调控具有重要的作用，特别是在细胞特异性表达方面。而SGF-1自身的表达也要受到调控，为了验证家蚕miRNAs是否对SGF-1的表达具有调控作用，本研究以SGF-1 3′UTR为序列，利用生物信息学软件预测并获得候选miRNAs，通过体外细胞转染试验进行验证，初步筛选可能调控SGF-1的候选miRNAs，为进一步研究miRNAs的功能提供依据，也为阐明蚕丝蛋白合成及调控机制积累试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

家蚕品种p50，由中国农业科学院蚕业研究所提供；E.coli DH10B菌株、昆虫BmN细胞系、重组表达载体质粒pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]和重组表達载体质粒PGL3[A3-luc-SV40]均由中国农业科学院蚕业研究所农业部蚕桑遗传与改良重点开放实验室保存。

pMD18-T、限制性内切酶、T4 DNA Ligase、Ex Taq酶、PrimeScript RT-PCR Kit、RNAiso Plus和DNA maker均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；TC-100购自Applichem公司；Fetal Bovine Serum（Qualified，Australia Origin） 购自Gibco公司；UCallM PerFectTM购自药科美公司；双报告基因荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；miRNA inhibitors由百奥迈科生物技术有限公司合成；其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团或生工生物工程（上海）有限公司；所有PCR引物合成与DNA测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 与SGF-1 3′UTR作用的候选家蚕miRNAs的获得 通过NCBI查找到家蚕SGF-1的mRNA序列，（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001043864.1），获得全长 3 078 bp 的核苷酸，其中cds全长1 049 bp，protein ID=“NP_001037329.1”，除去polyA signal，获得SGF-1基因的3′非编码区序列。通过miRBase数据库中获取家蚕已经登录的全部成熟miRNA序列。利用当前应用比较广泛的2个生物信息学预测软件RNAhybrid[12，13]（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）和RNA22[14]（http：//cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html）进行靶位点的预测，并将二者的预测结果结合起来，根据mfe的高低以及在种子区2～8个碱基互补配对的情况，筛选可能与家蚕SGF-1作用的miRNAs。

1.2.2 候选家蚕miRNAs的克隆与鉴定 分别提取家蚕幼虫期5龄3 d的中后部丝腺总RNA。以miRNAs反转录引物（RT Primer）进行反转录合成的cDNA为模板进行PCR。RT Primer的设计[15]：在通用的茎环结构序列后面加上6个miRNA的反向互補序列；PCR引物的设计：正向引物为miRNA序列的前14个碱基，并在该序列前加上4个碱基使Tm值维持在65 ℃左右，反向引物为miRNA通用引物（表1）。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，共34个循环；72 ℃ 10 min。设U6为内参基因。PCR产物经4 %琼脂糖凝胶电泳检测。回收片段大小为80 bp左右的条带，连接至pMDl8-T载体，16 ℃连接过夜后转化至E.coli DH10B，重组质粒酶切鉴定正确后进行测序。

1.2.3 重组表达质粒的构建 利用Oligo 6.0设计pri-miR-305*、pri-miR-3327*和SGF-1 3′UTR的引物。引物序列如表2所示，下划线标记部分：caagctt、ggatcc、tctaga、ggccggcc分别为HindⅢ、BamHⅠ、XbaⅠ、FseⅠ限制性酶切位点。重组载体T-pri-miRNAs和pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]分别用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行双酶切，将目的片段回收后连接到线性化的pcDNA3[ie1-egfp-SV40]上，构建重组表达载体pcDNA3[ie1-egfp-miRNA-SV40]。重组载体T-SGF-1-3′UTR和PGL3[A3-luc-SV40]分别用Xba Ⅰ和Fse Ⅰ进行双酶切，将目的片段回收后连接到线性化的PGL3[A3-luc-SV40]上，构建重组表达载体PGL3[A3-luc-SGF-1 3′UTR-SV40]。

1.2.4 BmN细胞的转染 将pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]、pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNA inhibitors和内参质粒pRL-CMV分成3组分别进行体外转染试验。第1组包含pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-SV40]和pRL-CMV3种质粒；第2组包含pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40和pRL-CMV3种质粒；第3组包含pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNAs inhibitor和pRL-CMV4种质粒。每组的质粒浓度稀释至200 ng/μL并按1 ∶ 1的比例混合。

转染方法按照文献[16-17]描述的方法进行：将2 μL/3 μL的上述质粒混合物和5 μL的Cellfectin reagent分别加入到 50 μL unsupplemented（不含胎牛血清和抗生素）TC-100培养基中；将二者轻轻混匀，室温下孵育20 min；吸去12孔细胞培养板中带血清的完全培养基（细胞密度为每个35 mm的细胞培养盘中细胞数达1.0×106～ 1.5×106个），并用unsupplemented TC-100培养基清洗细胞2次；将温育后的混合物加入到清洗后的BmN细胞中，于27 ℃恒温箱中转染 5 h；除去转染液，加入完全培养基于27 ℃恒温箱中继续培养，48 h 后进行荧光素酶活性检测。

1.2.5 荧光素酶活性检测 荧光素酶活性的检测按照Promega试剂盒双荧光素酶报告基因分析系统操作手册进行：转染48 h后，吸去细胞培养孔中的培养液；每孔中加入250 μL 1× Passive Lysis buffer（1 × PLB），使细胞充分裂解；将细胞裂解液转到1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心30 s，吸取上清至新的1.5 mL离心管中；取4 μL细胞裂解液加入含有20 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ（LAR Ⅱ）的检测管中混匀，检测管放入Promega荧光素酶检测仪（20/20 n Luminometer，Turner BioSystems）中，开始检测萤火虫荧光；加入20 μL Stop&GloTM，检测海参荧光，记录数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 候选家蚕miRNAs的序列获得及特征分析

细胞黏附因子-1 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

健康成年Wistar大鼠56只(山西医科大学实验动物中心提供),体重250～300 g,雌雄不限,随机分成阴性对照组和脑挫伤后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d组,共7组,每组8只。

1.2 材料及来源

兔抗大鼠ICAM-1抗体购自北京博鳌森生物技术有限公司,生物素标记羊抗兔抗体购自北京康为世纪生物技术有限公司,组织蛋白抽提试剂盒、蛋白定量试剂盒、发光剂均购自普利莱因技术有限公司。

1.3 模型制备和取材

参照Feeney法[3]建立大鼠闭合性脑挫伤,大鼠称重后,10%水合氯醛(0.3 m L/100 g)腹腔麻醉,常规消毒铺巾,褪毛,正中线切开头部皮肤,分离骨膜,在人字缝前方3 mm,颅骨中线左侧3 mm处,钻直径5 mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完整,用自制的硬性打击垫放入骨窗,以50 g砝码在40 cm处落下打击一次;对照组仅切开头皮,钻孔等,不受自由落体物打击,然后直接处死取出脑组织,实验组大鼠分别在伤后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d处死,于挫伤部位取出脑组织,然后分别称取100 g脑组织,放在液氮里密封存。

1.4 方法

本实验采用Western blot方法对大鼠脑挫伤后不同时间段ICAM-1的表达进行检测,从液氮中取出称重好的组织,加入蛋白裂解液,匀浆机中充分快速匀浆,在4℃提取蛋白后备用,加1︰2的样品缓冲液混匀,沸水浴5 min,取出样品混合液,对照组用加样缓冲液代替蛋白质样品,加在8%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离蛋白质,然后用半干式电转移法将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用封闭液浸泡,4℃过夜,取出滴加一抗,4℃过夜,用TBST溶液冲洗5 min×4次,滴加生物素标记的羊抗兔抗体,室温孵育2.5 h,TBST溶液充分淋洗5 min×4次,PBS淋洗10 min×4次,然后发光显影,固定[4,5,6,7]。

1.5 图像分析及统计学方法

用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图像进行分析,以条带积分光密度值(integrate optical density,IOD)作为I-CAM-1的相对量。用SPSS 13.0软件对所得的数据进行组内和组间的方差分析,统计方法为方差分析,计量资料采用均数±标准差表示,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫印迹结果图像分析结果

大鼠脑挫伤后1 h可见条带明显增宽,到72 h条带增至最宽,到7 d还可见条带比阴性对照组略宽(图1),经内参β-actin的校正,使用Image-Pro Plus 6.0分析软件对ICAM-1免疫印迹条带进行分析,以条带IOD作为ICAM-1的相对量,可见大鼠脑挫伤后1 h就有少量的ICAM-1表达,24 h后逐渐增多,到72 h达到最高峰,其后下降,伤后7 d仍有表达,且高于对照组水平。见表1。

2.2 数据处理

统计学结果显示:各实验组与对照组分别对比,差异均有统计学意义(均P<0.05),而各实验组之间两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

3 讨论

脑挫伤是指头部外力作用引起的脑组织出血性坏死,这是脑损伤中最常见的一种损伤,也是颅脑损伤中导致死亡的原因之一,研究表明[8],组织损伤后会引起一系列的炎性反应。黏附因子是在炎性反应过程中起重要的作用的因子,它是由细胞产生、存在于细胞表面、介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子,主要由3组黏附因子组成,分别是选择素家族,免疫球蛋白家族,钙粘蛋白家族,其中起核心作用的是ICAM-1,ICAM-1是免疫球蛋白家族的重要成员,介导多种炎性因子与血管内皮细胞的黏附。许多研究表明[9],颅脑损伤后ICAM-1的表达增多,白细胞与血管内皮细胞间黏附力增强,白细胞通过内皮细胞间隙可进入周围脑组织,释放大量炎性介质和细胞因子,其中许多细胞因子可直接或间接调节ICAM-1在炎症反应中的表达,使其表达增多,其中包括核转录因子(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素1β(IL-1β)等多种细胞因子。

本实验运用Western blot方法对ICAM-1蛋白表达进行观测,实验结果显示,大鼠脑挫伤后脑组织中ICAM-1蛋白表达在损伤1 h后开始有微量的增多,24 h明显增多,在72 h到达顶峰,其后下降,7 d后仍有表达,且高于对照组水平,可见其表达有一定的规律性,分析原因可能为:脑组织挫伤后,ICAM-1在脑血管内皮细胞上的表达开始增多,使得白细胞与血管内皮细胞的黏附力不断增强,随着时间的延长,白细胞跨过内皮细胞间隙进入周围组织,释放多种炎性因子,内皮细胞可在多种细胞因子如NF-κB、TNF等刺激下诱导ICAM-1的表达增多,在72 h达到高峰,随着损伤时间的延长,组织细胞自我修复,炎性反应消退,细胞因子逐渐减少,使得ICAM-1的表达逐渐下降。ICAM-1在脑挫伤过程中随着时间的延长产生规律性的变化,可以为法医学中脑挫伤早期损伤时间推断提供一定的依据。

摘要：目的 观察大鼠脑挫伤后不同时间段细胞间黏附因子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达变化规律。方法 参照Feeney法建立大鼠闭合性脑挫伤模型,将实验大鼠分为对照组和脑挫伤后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d组,共7组,每组8只,运用Western blot方法检测脑挫伤组织中ICAM-1的表达。结果 大鼠脑挫伤1 h可见ICAM-1有少量表达,伤后24 h表达明显增多,72 h达到高峰,其后下降,伤后7 d仍有表达,且高于对照组水平。各实验组与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),各实验组两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 大鼠脑挫伤后ICAM-1表达随着时间的变化表达呈现一定的规律性,可为推断脑挫伤早期损伤时间提供一定的参考依据。

关键词：脑挫伤,损伤时间,细胞间黏附因子1,法医学

参考文献

[1]Feuerstein GZ,Wang X,Barone,FC.The role of cytokines in the neu-ropathology of stroke and neurotrama[J].Neuroimmunomodulation,1998,(3-4):143-159.

[2]Grady MS,Cody RF Jr,Maris DO,et al.P-selectin blockade followingfluid-percussion injury:behavioral and immunochemical sequelae[J]JNeurotrauma,1999,16(1):13-25.

[3]张荣军,游潮,蔡博文,等.Feeney法建立大鼠闭合性脑损伤模型及评估[J].中国修复重建外科杂志,2005,19(12):1015-1018.

[4]李雷波,李梅,廖志钢,等.大鼠皮肤挫裂创细胞间粘附因子-1的表达al activation[J].中国法医学杂志,2003,18(3):77-80.

[5]周官恩,刘宗超,饶明俐,等.实验性脑出血后ICAM-1和IL-1的表达与p38MAPK通路关系研究[J].中风与神经疾病杂志,2011,28(1):18-20.

[6]ShenA,Yang J,GuY,et al.Lipopolysaccharide-evoked activation ofp38and JNK leads to an increase in ICAM-1 expression in Schwann cells ofsciatic nerves[J].FEBS J,2008,275(17):4343-4353.

[7]Wang CX,Shuaib A.Involvement of inflammatory cytokines in centralnervous system injury[J].ProgNeurobio,l 2002,67(2):161-172.

[8]王翀,朱贤立,赵洪洋,等.ICAM-1在大鼠弥漫性脑损伤后的脑组织水肿中得表达及其意义[J].中国临床神经外科杂志,2006,11(4):219-221.

细胞黏附因子-1 篇4

关键词：核内因子κB,可溶性细胞黏附因子-1,RT-PCR

近来研究表明,炎性细胞介导的斑块破裂是发生急性心肌梗死(AMI)的重要机制[1]。稳定斑块及抑制炎性反应成为冠心病治疗的重要基础。他汀类药物除有显著降低胆固醇作用外,还有抗炎和稳定粥样斑块的作用,从而降低高危人群心血管事件发生率。本研究试图通过逆转酶剧增技术RT-PCR途径,对心梗大鼠非梗死区药物干预后外周血单核细胞NF-κB p65活性和sICAM-1水平变化作一定量分析,来探讨他汀类药物的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 心肌梗死模型建立与分组:雄性SD大鼠60只体重在(240±20) g(由郑州大学实验动物中心提供)。用开胸冠脉结扎法复制心梗模型。根据体表心电图Ⅱ导联R波高尖,ST段抬高为结扎成功。SD大鼠分为:(1)假手术组12只,前降支冠脉留置一松结而不结扎。(2) AMI组8只,前降支冠脉结扎。(3)AMI+氟伐他汀(北京诺华公司)组10只,氟伐他汀组剂量为20 mg/(kg·d),手术后24 h给予正常组、假手术组、AMI均蒸馏水灌胃,在标准饲养方法的基础上,每天对每只大鼠灌胃2 ml蒸馏水,饮水不限。

1.1.2 4周后分别处死各个组别中的大鼠取出心肌组织,作逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)进行半定量分析。

1.2 结果图像分析

PCR结果图像输入计算机,利用生物医学图像分析系统检测条带的积分灰度值,用β-acting mR-NA为内参照进行校正,各条带的灰度值与β-acting基因条带的灰度值之比半定量表示其表达水平。

1.3 统计学处理

采用软件SPSS 16.0对数据进行分析。各组数据均符合正态分布但方差不齐采用秩和检验,数据以均数±标准差表示,多组间两两比较用Bonferroni法检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组电泳图见图1～4。

注:M为marker,N正常组,J假手术组,F氟伐他汀组,F1边缘区,F2梗死区,F3心梗远端

2.2 NF-κB p65及sICAM-1 mRNA在各组中半定量表达结果见表1。

注:M为marker,N正常组,J假手术组,M1心梗边缘区,M2心梗梗死区,M3心梗远端

图注:M为marker,N正常组,J假手术组,F氟伐他汀组,F4边缘区,F5梗死区,F6心梗远端

注:M为marker,N正常组,J假手术组,M1心梗边缘区,M2梗死区,M3心梗远端。

NF-κB p65及sICAM-1 mRNA在正常组与假手术组中呈低水平表达,两组比较无统计学差异(P>0.05)。NF-κB p65及sICAM-1 mRNA在心梗组和氟伐他汀组中表达明显增强,与正常组和假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。氟伐他汀组与心梗组比较,表达水平显著下降(P<0.05)。

3 讨论

近年来研究表明,炎症反应是动脉粥样硬化的核心因素[1]。研究表明,他汀类药物具有调脂以外广泛的非降脂药理作用即多效性作用[2]。(1)改善血管内皮功能。(2)稳定粥样斑块,防止血栓的形成。(3)抗炎症。他汀类药物通过降低病灶中炎性细胞密度及活性、改变斑块成分、抑制炎症、稳定病灶可减少与炎症相关的缺血性事件。有研究表明sICAM-1浓度水平可作为冠心病患者死亡率高低的一个独立预测因子且与其浓度水平成正相关[3,4]。sICAM-1是重要的炎症因子。本研究结果表明NF-κB及sICAM-1浓度水平在正常组与假手术组表达无明显差异(P>0.05),且呈低水平表达或不表达。而在心梗组、氟伐他汀组浓度水平表达均明显增强(P<0.05)。氟伐他汀组相比心梗组两者表达水平明显降低且有显著差异(P<0.05)。这表明上述两者在心梗发生后呈现高水平表达(P<0.05)。在氟伐他汀干预后表达水平明显下降(P<0.05)。动物实验表明心梗后NF-κB及sICAM-1浓度水平表达强度都显著增加,两者表达存在正相关性。NF-κB是促进多种炎性细胞因子转录的关键因子,可能调控了AS血管壁中ICAM-1的转录表达。已证实,ICAM-1基因启动子上含有NF-κB结合位点,各种细胞外的刺激信号使胞浆中未活化的NF-κB激活并进入胞核,NF-κB的p50亚基的核定位序列与ICAM-1的κB位点发生特异性结合,NF-κB含有转录激活区的p65亚基能启动ICAM-1的转录,ICAM-1又可反过来进一步活化NF-κB,由此形成一个正反馈调节,二者协同参与了冠状动脉粥样硬化的发生发展[3]。

他汀类药物治疗后,NF-κB活性下降,sICAM-1表达量也下降,降低炎症反应,减少巨噬细胞浸润及炎性介质生成。独立于降脂并呈剂量依赖性方式的抗炎作用是其降低心血管事件发生的重要机制之一。Ortege等[5]首先在体外实验中发现Atorvastatin能抑制NF-KB的激活。Fluvstatin在本试验中抗炎机制亦可能是通过降低NF-κB活性进而抑制炎症反应实现。总之在急性心肌梗死患者及早应用他汀类药物稳定斑块、抑制炎症介质的释放及表达应该是对患者大有裨益的。

参考文献

[1]张运,陈文强.急性冠状动脉综合征的发病机制.中国实用内科杂志,2008(1):1005-2194.

[2]Nissen SE.High-dose statins in acute coronary syndromes.Not just lipid levels.JAMA,2004,292:13077.

[3]于运福,动脉粥样硬化中的核转录因子NF-κB.实用诊断与治疗杂志,2006,20(4):277.

[4]Jenny NS,Arnold AM,Kuller LH,et al.Soluble intracellular adhesion molecule-1 is associated with cardiovascular disease risk and mortality in older adults.J Thromb Haemost,2006,4:107-113.

细胞黏附因子-1 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年11月～2011年11月于本院进行手术治疗的62例食管癌患者为观察组,同时选取同期62例健康体检者为对照组。对照组62例健康者中,男47例,女15例;年龄42～72岁,平均(62.2±5.4)岁。观察组62例食管癌患者中,男48例,女14例;年龄41～72岁,平均(61.9±5.5)岁;TNM分期:Ⅰ期4例,Ⅱ期21例,Ⅲ期47例;鳞癌患者55例,腺癌患者7例;发病部位:中段38例,下段20例,上段4例。两组一般情况比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

将对照组与观察组术前、术后1、5、10 d的血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR水平进行检测及对比。均抽取晨起空腹血进行检测,其中,血清HSP27、HSP70、DKK-1检测均采用酶联免疫法进行,试剂盒分别为购自上海希美生物科技有限公司的人热休克蛋白27(HSP 27)ELISA试剂盒、人热休克蛋白70(HSP 70)ELISA试剂盒及人Dickkopf 1(DKK-1)ELISA试剂盒;RFER、RFIR水平则先采用酵母菌花环法检测然后进行计算得出,公式为RFER(%)=[(58℃灭活血清组C3bRR-生理盐水组C3bRR)/生理盐水组C3b RR]×100%;RFIR(%)=[(58℃灭活血清组C3bRR-室温血清组C3bRR)/58℃灭活血清组C3bRR]×100%。

注:与对照组比较,*P<0.05

注:与Ⅰ期术后同时段比较,*P<0.05

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与观察组术前、术后1、5、10 d的血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR水平比较

对两组人员的血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR水平比较显示,术前及术后观察组的血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFIR水平均高于对照组,RFER则低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组术前、术后1、5、10 d的HSP27、HSP70、DKK-1及RFIR水平持续下降,而RFER持续上升。见表1。

2.2 不同TNM分期患者术后1、5、10 d的血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR水平比较

TNMⅠ期患者术后1、5、10 d的血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR改善水平均优于Ⅱ、Ⅲ期,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

食管癌是临床发病率较高的恶性肿瘤之一,且我国是高发病率及高死亡率国家,主要与本病在诊断时大多已经为中晚期患者及早期临床表现不明显有关,而食管癌中晚期患者的治疗效果要明显差于早期患者,因此有效的预防及发病后及早的诊断治疗是决定预后的关键[3]。临床诊断中因食管癌早期患者多表现不明显,尤其是隐伏型肉眼不易见,故对其诊断更应慎重。食管癌患者机体中的某些因子会随发病及加重或转归而发生变化[4,5],而对于这种变化规律的研究对于了解其治疗效果及早期诊断均可发挥着积极的作用。

本文笔者就食管癌患者围术期血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR的变化规律进行研究,发现其在食管癌患者中呈现一定幅度的变化,对其术前、术后1、5、10 d的变化规律研究发现,术后患者血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFIR水平持续下降,而RFER持续上升,术后10 d TNM分期Ⅰ期患者的HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR水平与健康人群差异不大,而Ⅱ、Ⅲ期患者与健康人群仍存在一定差异,也从侧面反映了手术对早期患者的效果优于中、晚期患者。分析原因可能为HSP27、HSP70与肿瘤细胞的增殖等有关[6],当肿瘤细胞处于增殖状态时HSP27及HSP70则处于分泌的高水平状态;而DKK-1则在肿瘤形成的过程中发挥着一定的作用,且其水平对于预后有一定的预测作用[7];RFER及RFIR与恶性肿瘤细胞分泌抗原物质导致免疫复合物水平增高,从而影响到红细胞免疫有关[8,9]。

综上所述,笔者认为食管癌患者围术期血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR的变化规律可反映手术效果,并且对于疾病的诊断也有较为明显的价值。

参考文献

[1]王文祥,肖高明,胡星明,等.食管鳞癌组织中热休克蛋白70(HSP70)及其mRNA的表达研究[J].中国现代医学杂志,2009,19(3):358-361.

[2]李波波,李道堂,赵东波,等.食管鳞癌患者血清DKK-1的检测及其临床意义[J].国际肿瘤学杂志,2009,36(7):544-547.

[3]Yu H,Liu G,Zhao P,et al.Hormonal and Reproductive Factors andRisk of Esophageal Cancer in Chinese Postmenopausal Women:a Case-control Study[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(8):1953-1956.

[4]李书军,和宇峥,吕宝雷,等.DKK1在食管癌组织中的表达及其生物学功能[J].世界华人消化杂志,2011,19(20):2116-2122.

[5]汤忠明,陈志坚.食管癌临床分期现状[J].医学综述,2011,17(2):224-227.

[6]王文祥,陈胜喜,邬麟,等.热休克蛋白70(HSP70)在食管鳞癌组织中的表达和意义[J].中国医师杂志,2007,9(7):915-917.

[7]陈家宽,吴洲清,彭艳,等.食管癌患者外周血淋巴细胞热休克蛋白表达及其意义[J].中华实验外科杂志,2010,27(9):1195-1197.

[8]Yan W,Shih JH,Rodriguez-Canales J,et al.Identification of uniqueexpression signatures and therapeutic targets in esophageal squamouscell carcinoma[J].BMC Res Notes,2012,5(1):73-74.

细胞黏附因子-1 篇6

1 资料与方法

1.1 临床资料:根据2001年国际脓毒症定义会议制定的脓毒症诊断标准, 收集自2011年1月1日至2011年7年31日大连大学附属新华医院ICU收治的脓毒症患者50例, 其中男27例, 女23例, 年龄50~91岁, 平均 (62±15.6) 岁。以入院次序按照随机数字表法平均分成2组:对照组 (n=25) ;肝素组 (n=25) 。

1.2 治疗方法:三组患者均给予针对原发病的治疗以及充分的抗感染、营养及对症支持治疗。对照组患者在入院确诊后即给予生理盐水48 m L作为安慰剂, 用微量注射泵静脉注射持续24 h, 连续应用5 d;肝素组患者在入院确诊后即给予肝素60 mg/d, 加生理盐水配至48 m L, 微量注射泵静脉注射持续24 h, 连续应用5 d;分别于治疗前、治疗后24 h、72 h、120 h分别采外周血检测肿瘤坏死因子 (TNF-α) 、白细胞介素-1β (IL-1β) 、内皮细胞黏附分子 (VCAM-1) 、血清中循环细胞黏附分子-1 (c ICAM-1) 的水平。并进行APACHEⅡ评分。采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β、VCAM-1、c ICAM-1水平;标准试剂盒均由晶美公司提供。

注:*表示与治疗前比较有显著差异 (P<0.05) ;▲表示与对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。△表示与24 h比较有显著差异 (P<0.05) , 但与120 h比较无显著差异 (P>0.05)

注:*表示与治疗前比较有显著差异 (P<0.05) ;▲表示与对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05)

1.3 统计学方法:应用SPSS11.0统计软件, 将所有数据均进行正态性检验, 用药前后的比较采用配对t检验;不同时间点比较采用方差分析;分类资料采用卡方检验, P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 两组患者一般临床资料比较:性别、年龄及入院时APACHEⅡ分值差异无统计学意义 (P>0.05) 。具有可比性。见表1。

2.2 治疗前两组患者的血清TNF-α、IL-1β、VCAM-1、c ICAM-1水平差异无统计学意义 (P>0.05) 。治疗后两组血清TNF-α、IL-1β、VCAM-1、c ICAM-1水平明显降低 (P <0.05) , 同一时间点, 肝素组患者外周血清TNF-α、IL-1β、VCAM-1、c ICAM-1水平较对照组降低, 差异具有显著性 (P<0.05) 。见表2。

2.3 治疗后, 各时间点间比较:与24 h比较, 72 h、120 h组TNF-α、IL-1β、VCAM-1、c ICAM-1降低, 差异有统计学意义 (P <0.05) , 而120 h与72 h上述指标水平差异无统计学意义 (P >0.05) 。见表2。

2.4 患者APACHEⅡ比较:治疗前两组患者的APACHEⅡ差异无统计学意义 (P>0.05) , 说明三组患者治疗前的病情严重程度相似。治疗后, 两组患者的评分值均有所下降, 表明患者总体病情有所好转。治疗后肝素组患者的评分值与其治疗前以及与对照组比较下降差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明肝素治疗组患者的病情改善比较明显。见表3。

3 讨论

尽管有关脓毒症的抗炎治疗已近五十年, 但仍然困难重重。重症脓毒症患者血浆炎性介质呈级联放大“瀑布效应”, 炎性介质在机体损害中起了关键作用[3]。大量研究发现, 抑制白细胞等炎性细胞释放有害的细胞因子有利于改善脓毒症患者的预后。此外, 动物实验研究发现, L-选择素缺陷的大鼠可以避免脓毒血症引起的不良后果。多个临床研究均证实小剂量普通肝素可改善脓毒症患者预后。但机制尚未明确, 而较多的体外研究及动物实验提示肝素除抗凝外, 还具有明显的抗炎/抗细胞黏附的作用[4,5,6]。

TNF-α、IL-1β在一定范围内能较好的反映机体SIRS进展程度, 常作为炎性反应监测指标[8]。而I-CAM及V-CAM在活化的血管内皮细胞表达。炎症时, 活化的内皮细胞表面的I-CAM可与白细胞表面的αLβ2及巨噬细胞表面的αMβ2相结合;V-CAM则可与白细胞的α4β1整合素相结合。它们继选择素介导的白细胞与内皮细胞的黏合作用之后使在内皮上滚动的白细胞固着于炎症部位的脉管内皮, 并发生铺展, 进而分泌水解酶而穿出脉管壁[7]。故而本实验选择以上4种细胞因子作为监测炎性反应的指标。

本研究显示, 小剂量肝素治疗组患者外周血清TNF-α、IL-1β、VCAM-1、c ICAM-1的水平显著降低。从而表明, 脓毒症患者应用小剂量普通肝素有利于调控炎性反应, 抑制内皮细胞与白细胞间的黏附, 这与离体细胞实验及动物实验结果一致[4,5,6,8]。此外, 本研究还发现肝素的抗炎抗黏附作用在治疗达120 h时减弱。该结果可能与患者病情好转、炎性反应减轻有关。此时是否需继续应用肝素尚值得探讨。

本研究结果显示, 肝素组APACHEⅡ分值显著低于对照组, 说明小剂量肝素的应用能改善脓毒症患者病情。这与其降低患者体内促炎因子的水平, 抑制内皮细胞与白细胞的黏附有密切关系。但由于随访困难, 本研究缺乏远期病死率数据, 有待完善。

参考文献

[1]Kochanek KD, Murphy SL, Anderson RN, et a1.Deaths:final data for 2002[J].Natl Vital Stat Rep, 2004, 53:1-115.

[2]马晓春, 李旭.肝素在脓毒症治疗中的应用前景[J].中国危重病急救医学, 2010, 22 (9) :566-569.

[3]Damas P, Canivet JL, Croote D, et a1.Sepsis and serum cytokine concentrations[J].Crit Care Med, 1997, 25 (3) :405-412.

[4]陈松, 马晓春.肝素对脓毒症大鼠静脉血白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和血管紧张素Ⅱ表达的影响[J].中国危重病急救医学, 2010, 22 (9) :555-556.

[5]汪宗昱, 杨拔贤, 朱曦, 等.普通肝素雾化吸入对内毒素性肺损伤大鼠肺泡局部凝血及炎性反应的影响[J].中国危重病急救医学, 2011, 23 (4) :239-242.

[6]杨春华, 管向东, 陈娟, 等.肝素影响脓毒症患者组织灌注的机制研究[J].中国危重病急救医学, 2008, 20 (9) :550-552.

[7]Gao J, Zhao WX, Zhou LJ, et al.Protective effects of propofol on lipopolysaccharide-activated endothilial cell barrier dysfunction[J].Inflamm Res, 2006, 55 (10) :385-392.

细胞黏附因子-1 篇7

细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)主要存在于血管内皮细胞、单核细胞、淋巴细胞等表面,在正常情况下仅微弱表达。氧化型低密度脂蛋白、细菌及其脂多糖(LPS)和炎症因子等AS危险因素可诱导内皮细胞表达ICAM-1,介导单核细胞黏附于内皮细胞和游走至内皮下,分化为巨噬细胞,吞噬脂质成为泡沫细胞。因此,ICAM-1在AS的发生中具有重要作用[3]。本研究采用LPS刺激人内皮细胞株ECV-304为模型,观察黄连解毒汤中黄芩的主要活性成分之一黄芩素对ICAM-1表达的影响,从对黏附分子的影响角度初步探讨黄连解毒汤可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 黄芩素(上海中药标准化研究中心,含量98%);细菌内毒素(LPS,Sigma公司);Trizol(Invitrogen 公司);两步法RT-PCR试剂盒、引物(Takara公司);ECL化学发光试剂盒(Pierce公司);抗抑制蛋白κB(I-κB) p65 和β-Actin抗体(Santa Cruze公司)。PCR仪(Perkinelmer公司);紫外凝胶成像系统、蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2 细胞培养及干预实验 人血管内皮细胞株ECV-304细胞为由本室保存。用DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 U/ mL青霉素和100 μg/mL链霉素)传代培养。取生长状态良好的ECV-304细胞接种到12 孔培养板内,待细胞生长至80%融合状态后,用PBS清洗2次,更换培养液,按照分组分别加入PBS或不同浓度的黄芩素(终浓度分别为1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L)孵育1 h,然后加入LPS(终浓度1 μg/mL)进行刺激。实验分组如下:正常对照组、黄芩素组、LPS组和黄芩素加LPS组。根据实验要求在相应时间点收集细胞进行后继实验。

1.3 RT-PCR检测ICAM-1 mRNA的表达 各组细胞加入相应刺激物后继续培养8 h,用Trizol法提取细胞总RNA,用紫外分光光度计测定A260/A280为1.8~2.0。以总RNA为模板,用Oligo-d(T)18为引物反转录合成第一链cDNA,特异性引物分别扩增ICAM-1和β- Actin。ICAM-1 引物序列如下,Sense:5’-CCG AGC TCA AGT GTC TAA AG-3’,Antisense:5’-TGC CAC CAA TAT GGG AAG GC-3’,扩增长度369bp;β- Actin引物序列如下,Sense:5’-TGA ACC CTA AGG CCA ACC-3’,Antisense:5’-CCA CAG GAT TCC ATA CCC-3’,扩增长度489bp。PCR条件为94 ℃预变性4 min,然后94 ℃变性45 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循环30次,最后72 ℃延伸5 min。1.5%琼脂糖电泳PCR产物,用Qautity One软件分析ICAM-1与β- Actin的PCR产物灰度值,以二者比值来表示ICAM-1 mRNA的相对表达量。

1.4 Western Blot 检测ICAM-1和I-κB的表达 ECV-304细胞加入刺激物后继续培24 h,提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取50 μg样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳(5%的浓缩胶和10%的分离胶),转膜,5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h,加抗ICAM-1、I-κB或β-Actin单克隆抗体稀释液(1∶2 000),4 ℃孵育过夜,洗膜,加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶3 000) 37 ℃孵育1 h,ECL法显影,Qautity One软件分析条带灰度值,以目的条带与β- Actin条带的灰度比值来表示蛋白相对表达量。

1.5 统计学处理 所有数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,采用SPSS 11.0统计软件对实验结果进行ONEWAY-ANOVA检验分析。P<0.05 为有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芩素对ICAM-1 mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR结果显示,在无外源性刺激的情况下内皮细胞ECV-304 仅极低量表达ICAM-1,单独加入黄芩素对其表达无显著影响。LPS可以上调ECV-304细胞ICAM-1 mRNA的表达,而在LPS刺激前加入黄芩素进行预处理,可以显著抑制LPS诱导的ICAM-1 mRNA增高。Western Blot结果同样显示,LPS上调ICAM-1蛋白表达,黄芩素预处理抑制ICAM-1蛋白表达上调。详见图1、表1。

注:A为ICAM-1 mRNA表达情况;B为ICAM-1 蛋白表达情况;1为对照组,2为LPS组,3为LPS+1 μmol/L黄芩素组,4为LPS+10 μmol/L黄芩素组,5为 LPS+50 μmol/L黄芩素组,6为50 μmol/L黄芩素组。

2.2 I-κB 蛋白的检测 Western Blot结果显示,LPS诱导下ECV-304细胞I-κB被降解;LPS刺激前用黄芩素预处理可抑制I-κB降解,上调胞浆内I-κB含量,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05),说明黄芩素能抑制I-κB降解,阻碍LPS引起的巨噬细胞NF-κB信号途径活化。详见图2、表2。

注:1为对照组,2为LPS组,3为LPS+1 μmol/L黄芩素组,4为LPS+10 μmol/L黄芩素组,5为LPS+50 μmol/L黄芩素组,6为100 μmol/L黄芩素组

3 讨 论

AS是各种致病因子造成血管内皮损伤,导致单核细胞黏附和侵入血管内皮细胞,分泌多种炎症因子而引起的一种慢性炎症性反应[4]。其中,单核细胞与内皮细胞黏附,继而穿越内皮细胞层进入内皮下是AS形成的早期事件之一,其过程主要由细胞黏附分子参与[5]。血管内皮细胞表面的黏附分子ICAM-1可以和单核细胞、淋巴细胞膜上的相关受体结合,介导细胞间的黏附,并促使单核细胞迁移至内皮下分化为巨噬细胞,进一步吞噬脂质最终变为泡沫细胞[6];此外,ICAM-1还可以介导淋巴细胞在炎症局部的集聚,进一步促进AS的慢性炎症反应[3]。研究发现敲除ICAM-1基因可以减小动物AS斑块面积[7],因此,ICAM-1介导的炎症细胞与血管内皮细胞的黏附在AS发生中具有重要作用。ICAM-1的诱导性表达与刺激物激活NF-κB信号途径相关[8]。NF-κB在无外界刺激情况下与抑制蛋白I-κB结合,以无活性三聚体形式存在于细胞浆。外界刺激物激活I-κB激酶降解I-κB,使NF-κB活化进入细胞核,引起ICAM-1和其他炎症因子的表达。本研究结果证实血管内皮细胞在无刺激情况下极低量表达ICAM-1,LPS刺激可以导致血管内皮细胞I-κB降解,上调ICAM-1基因转录和蛋白表达,与Chen等[9]研究结果一致。

黄连解毒汤为唐代王焘所著《外台秘要》中所收载的清热解毒的代表方剂,由黄连、黄柏、黄芩、栀子组成,功能清热燥湿、泻火解毒。本课题组前期研究发现黄连解毒汤能减轻兔AS斑块病变程度,缩小斑块面积[2],Sekiya也得到了类似的研究结果[10]。但由于黄连解毒汤成分复杂,难以对其机制详细研究,因此本实验采用黄芩的主要有效成分黄芩素,从单核细胞和内皮细胞黏附入手,观察黄芩素对黏附分子ICAM-1表达的影响,初步探讨黄连解毒汤抗AS的可能作用机制。实验结果显示,黄芩素在转录水平和蛋白表达水平都可以抑制LPS诱导的ICAM-1表达,其作用机制可能与抑制I-κB降解,进而阻断NF-κB通路活化有关。因此,推测抑制ICAM-1表达可能是黄连解毒汤抗AS的作用机制之一。由于NF-κB通路同时介导了其他炎症因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)的表达,推测黄芩素也可以抑制这些炎症因子的表达,通过抗炎机制抑制AS斑块的形成。

摘要：目的研究黄连解毒汤有效成分黄芩素对细菌脂多糖(LPS)诱导的人血管内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和抑制蛋白κB(I-κB)表达的影响。方法分别用LPS(终浓度1μg/mL)或LPS+黄芩素(终浓度1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)处理生长良好的ECV-304细胞,用RT-PCR和WesternBlot法检测ICAM-1表达情况和I-κB含量变化。结果LPS刺激ECV-304细胞可促进I-κB降解,上调ICAM-1表达水平,与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01);黄芩素预处理能抑制LPS诱导的I-κB降解,降低ICAM-1表达水平,与LPS组比较有统计学意义(P<0.05)。结论黄芩素可通过抑制I-κB降解,影响NF-κB炎症信号途径,下调ICAM-1的表达,这可能是黄连解毒汤抗动脉粥样硬化的作用机制之一。

关键词：黄芩素,血管内皮细胞,内皮细胞细胞间黏附分子-1,抑制蛋白κB,内毒素

参考文献

[1]Braun A,Rigotti A,Trigatti BL.Myocardial infarction following atherosclerosis in murine models[J].Curr Drug Targets,2008,9(3):217-223.

[2]吴辉,刘煜德,吴伟,等.清热解毒法对肺炎衣原体感染致兔动脉粥样硬化的干预作用[J].广州中医药大学学报,2006,23(2):151-155.

[3]Dansky HM,Barlow CB,Lominska C,et al.Adhesion of monocytes to arterial endotheliumandinitiation of atherosclerosis are critical-ly dependent on vascular cell adhesion molecule-1gene dosage[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21(10):1662-1667.

[4]Ross R.Atherosclerosis is aninflammatory disease[J].Am Heart J,1999,138(5Pt2):S419-420.

[5]Blankenberg S,Barbaux S,Tiret L.Adhesion molecules and ather-osclerosis[J].Atherosclerosis,2003,170(2):191-203.

[6]Apostolo V,Eugene O,Shah,et al.Carbamylated low-density lipo-proteininduces monocyte adhesion to endothelial cells through in-tercellular adhesion molecule-1and vascular cell adhesion molecule-1[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27(4):826-832.

[7]Collins RG,Velji R,Guevara NV,et al.P-selectin or intercellular adhesion molecule(ICAM)-1deficiency substantially protects against atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J].J Exp Med,2000,191(1):189-194.

[8]Ki mI,Moon SO,Ki mSH,et al.Vascular endothelial growthfactor expression of intercellular adhesion molecule1(ICAM-1),vascular cell adhesion molecule1(VCAM-1),and E-selectinthrough nuclear factor-kappa B activationin endothelial cells[J].Biol Chem,2001,276(10):7614-7620.

[9]Chen CC,Chow MP,Huang WC,et al.Flavonoids inhibit tumor necrosis factor-alpha-induced up-regulation of intercellular adhe-sion molecule-1(ICAM-1)in respiratory epithelial cells through ac-tivator protein-1and nuclear factor-kappaB:Structure-activity rela-tionships[J].Mol Pharmacol,2004,66(3):683-693.

细胞黏附因子-1 篇8

1实验材料

HUVECs细胞株:浙江省中医院陈哲研究员赠送。RPMI1640细胞培养基:美国GIBCO BRL公司,批号:040616。VCAM引物(上游引物5’ACAGGGCTCAGGGTCAG3’,下游引物5’GTTCCAGCGAGGGTCTA3’):上海生工生物有限公司合成;GAPDH引物(上游引物5’ACTTTGGCATCGTGGAGG3’,下游引物5’AAGAGTGAGTGTCGCTGT 3’):上海生工生物有限公司合成;PE-VCAM-1、TNF-α:购自杭州诺森德生物技术有限公司。

荧光定量PCR仪:美国伯乐公司Bio-RAD IQ5;FACS Calibur流式细胞仪:美国BD;CO2细胞培养箱:美国热电。

2实验方法

2.1 参麦总皂苷制备

称取红参和麦冬粉末适量,以质量比1:3混合,加入4倍75%乙醇回流提取3次,每次2小时,过滤收集乙醇,减压浓缩;残余液体用等体积乙醚萃取3次,然后用等体积水饱和正丁醇萃取4次,合并正丁醇层,减压浓缩;残余物用适量甲醇溶解,加10倍体积的丙酮,静置过滤收集沉淀,沉淀用适量丙酮和乙醚润洗,真空干燥,即得总皂苷,并以人参皂甙Re为对照品测定其中人参总皂苷含量。

2.2 细胞培养及传板

从-80℃复苏HUVEC细胞,用RPMI1640培养液,其中含100IU/ml链霉素、100IU/ml青霉素、10%胎牛血清,稀释培养于50ml玻璃培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养;24小时后换液1次,继续培养,待细胞铺满瓶底90%时,用0.15%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化传代;取第4代细胞用于后续实验研究。取指数生长期的HUVEC细胞,胰酶消化后RPMI1640培养基稀释接种6孔板,每孔接种2ml,约含1.2×105个细胞,静置培养适当时间后加药处理。

2.3 TNF-α诱导浓度确定

上述传板细胞静置培养,待细胞汇集80%后,用系列浓度梯度的TNF-α处理24小时。

2.4 药物处理

上述传板细胞静置培养,待细胞汇集80%后,按下述组别,分别加药处理:A组(空白对照),不做任何处理;B、C、D和E组分别用适当浓度(20ng/ml)TNF-α处理,其中C、D、E组分别同时用25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml参麦总皂苷处理;F、G和H分别用25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml参麦总皂苷处理;继续于37℃、5%CO2培养箱中静置培养24小时。

2.5 观察指标及测定方法

2.5.1 VCAM-1基因表达检测

荧光定量PCR。

2.5.1.1 总RNA提取及反转录

胰酶消化,分别收集上述各处理组细胞,按TRIzol Reagent说明书提取总RNA,溶解于DEPC处理水中。取1μg总RNA,在20μl体系中以Oligo(dT)18为引物,用AMV逆转录酶合成第一链cDNA。

2.5.1.2 荧光定量PCR分析

取2μl逆转录产物为模板,在20μl体系中进行荧光定量PCR反应。反应条件:94℃3分钟;循环参数:94℃30秒;50～55℃ 30秒;72℃ 30秒,循环40次;最后延伸72℃ 3分钟,进行溶解曲线分析。每个样品重复3次,与内参基因均一化消除实验误差后取平均值。

2.5.2 VCAM-1蛋白表达检测

流式细胞仪检测。

2.6 数据分析

实验结果以undefined表示,采用SPSS11.0软件进行分析。不同处理组与对照组间采用0ne-way ANOVA进行分析,P<0.05表示差异具有显著的统计学意义。

3实验结果

3.1 参麦总皂苷提取及含量测定结果

称取红参100g和麦冬300g混合,用上述方法提取到参麦总皂甙7.5g,得率分别为1.9%,测得1.0mg参麦总皂甙中人参总皂甙含量约为0.55mg。

3.2 TNF-α对HUVEC细胞VCAM-1基因转录的影响

见图1。

从图1可以看出,TNF-α可显著提高HUVEC细胞的VCAM-1基因表达,且表达量随处理浓度提高而增强,但20ng/ml处理组和30ng/ml处理组比较没有显著性差异,为此,确定20ng/ml为TNF-α处理浓度用于后续实验研究。

3.3 参麦总皂苷对HUVEC细胞VCAM-1基因表达的影响

见表1。

与未加TNF-α比较△P<0.05,△△P<0.01与空白组比较,*P<0.05**P<0.01;

以20ng/ml TNF-α处理HUVEC细胞24小时后,VCAM-1基因表达显著提高,不同浓度的参麦总皂苷处理后,均对TNF-α诱导的VCAM-1基因表达有一定抑制作用,尤其50μg/ml以上浓度处理组具有显著性抑制作用;但不同浓度参麦总皂苷对正常HUVEC细胞中VCAM-1基因表达无明显作用。

3.4 参麦总皂苷对HUVEC细胞VCAM-1蛋白表达的影响

同VCAM-1基因转录结果类似,20ng/ml TNF-α处理后VCAM-1蛋白表达显著提高,而参麦总皂苷可以剂量依赖性抑制TNF-α的诱导表达作用,其中100μg/ml处理组抑制率达33.5%,但同样对正常的HUVEC细胞VCAM-1蛋白表达无明显影响。

与未加TNF-α比较△P<0.05△△P<0.01;与空白组比较*P<0.05,**P<0.01

4讨论

研究表明,VCAM-1在正常组织细胞上表达很少或不表达,但在很多肿瘤组织中异常高表达[6,7];同时,研究结果提示,细胞黏附分子表达的异常升高与肿瘤的恶变、侵袭、转移密切相关[8]。肿瘤细胞不仅自身可以大量表达、分泌VCAM-1,作用于血管内皮细胞,并促使血管内皮细胞增殖、迁移形成新生血管;同时肿瘤细胞还可以通过表达TNF-α、IL-1等炎症因子,诱导血管内皮细胞大量表达VCAM-1,使肿瘤细胞能够与其黏附,并通过相互作用实现浸润、转移[2]。为此,抑制细胞黏附分子异常表达是抗肿瘤转移的靶点。

已有不少文献报道表明,参麦对肿瘤诱导的血管生成有抑制作用,本实验室研究确证参麦总皂苷对条件培养液诱导的HUVEC增殖、迁移有抑制作用,为其抗血管生成的有效部位。本文实验结果进一步揭示,参麦总皂苷对炎症因子TNF-α诱导的细胞黏附分子VCAM-1异常表达,无论是在mRNA水平还是蛋白质水平均呈现剂量依赖性抑制作用,其可能分子机理为抑制TNF-α信号通路,从而抑制VCAM-1基因转录和表达。因此,参麦总皂苷不仅可以抑制肿瘤血管生成,而且还可以通过抑制肿瘤细胞转移实现抗肿瘤作用。

参考文献

[1]Nicolson GL.Organ specificity of tumor metastasis:Role of preferen-tial adhesion,invasion and growth of malignant cells at specific sec-ondary sites.Cancer Metastasis Rev,1988,7(2):143.

[2]Okada T,Hawley RG,Kodaka M,et al.Significance of VLA-4-VCAM-1interaction and CD44for transendothelial invasion in a bone marrow metastatic myeloma model.Clin Exp Metastasis,1999,17(7):623.

[3]钱晓萍,刘宝瑞,胡静,等.参麦注射液联合羟基喜树碱抑制血管生成作用的实验研究.中国癌症杂志,2006,16(11):953.

[4]钱晓萍,马亚军,胡静,等.参麦注射液联合多西他赛对荷瘤裸鼠肿瘤血管生长的抑制作用及其机制.中国癌症杂志,2009,19(4):252.

[5]何富乐,胡美兰.大剂量参麦针减轻恶性肿瘤化疗后毒副反应的临床观察.中国中医药科技,2007,14(6):454.

[6]Charpin C,Garcia S,Andrac L,et al.VCAM(IGSF)adhesion mole-cule expression in breast carcinomas detected by automated andquantitative immunocytochemical assays.Hum Pathol.,1998,29(9):896.

[7]钟华,顾方六.细胞黏附分子在恶性肾肿瘤中的表达.中华泌尿外科杂志,1996,17(2):70.